PP Master Mixy PPP Master Mix 14 Plain PP Master Mix 15 Combi PPP Master Mix 16 new Plain Combi PP Master Mix 17

Transkript

1 Obsah DNA polymerázy pro PCR a pufry Taq DNA polymeráza 6 Taq DNA polymeráza Unis 7 TaqPurple DNA polymeráza 8 Taq DNA polymeráza Combi Taq DNA polymeráza 10 LA DNA Polymerases Mix 11 10x koncentrovaný PCR Blue Buffer 12 PP Master Mixy PPP Master Mix 14 Plain PP Master Mix 15 Combi PPP Master Mix 16 new Plain Combi PP Master Mix 17 qpcr Master Mixy qpcr 2x Master Mix 19 qpcr 2x Blue Master Mix 20 qpcr 2x SYBR Master Mix 21 new XLqPCR 2x SYBR Master Mix 22 new XLqPCR 2x SYBR+DMSO Master Mix 23 new SYTO9 qpcr 2x Master Mix 24 Další enzymy RNáza bez DNáz 25 MMLV reverzní transkriptáza 26 DNáza I, bez RNáz 27 Izolace DNA a RNA DNA Lego kit 29 RNA Blue RTPCR kit 30 RNA Blue 31 RNA nosi 32 DNA markery DNA marker DNA marker coloured 34 DNA marker ( po 50 pb) 35 DNA marker ( po 50 pb) coloured 35 DNA marker DNA marker coloured 36 Další materiály pro PCR PCR dntp mix 37 PCR EtOH 37 PCR Enhancer 38 PCR H 2 O 39 PCR Ultra H 2 O 39 PCR olej 40 Micro Check (kalibra ní špi ka) 40 Materiály pro elektroforézu PCR agaróza 42 PCR ethidium bromid 43 PCR vkládací pufr 43 PCR vkládací pufr Edge 43 PCR vkládací pufr Red load a Yellow load 44 Technické informace Certi kace, technické informace, objednávky a obchodní podmínky 45 Ceník 46 Poznámky 49 Obsah 3

2 O rm Spole nost TopBio, s.r.o., založena 1. listopadu 1995, se specializuje na výrobu vybraných látek, d ležitých pro široké využívání molekulárn genetických metod v ad oblastí základního i aplikovaného výzkumu a výrobní praxe. P edevším se jedná o enzymy a další látky nezbytné pro ampli kaci DNA pomocí tzv. polymerázové et zové reakce (PCR). TopBio, s.r.o. vznikla jako spinoff rma Ústavu molekulární genetiky AV R. V po áte ním období byla rma sou ástí tzv. inkubátoru Technologického centra AV R, který byl lokalizován v areálu biologických ústav AV R v Praze 4 Kr i. V roce 2002 se ást rmy p est hovala do nových prostor ve Vestci u Prahy a rozší ila výrobnu. Mezi charakteristické rysy rmy pat í ( remní desatero): 1. výroba reagens nejvyšší dosažitelné kvality, 2. náro ná výstupní kontrola, 3. zajišt ní optimálních podmínek pro skladování a p epravu výrobk a vyzna ení expira ní doby u všech výrobk, 4. rychlé a kompetentní vy izování technických dotaz v pracovní dny obvykle do 4 hod. po obdržení dotazu, 5. rychlé vy izování objednávek v celé R v pracovní dny obvykle do 24 hod. po obdržení objednávky, 6. vzhledem ke kvalit výrobk bezkonkuren ní ceny, 7. výrazné slevy p i odb rech v tšího množství výrobk, 8. široké uspokojování požadavk na platby (volba termínu platby), 9. rychlé a vst ícné vy izování reklamací, 10. d raz na inovace odrážející aktuální v decké poznatky. ZDARMA DOPRAVA PO CELÉ R ZBOŽÍ DODÁVÁME DO TOP BIO s.r.o. TOP BIO s.r.o. O firm 4

3 DNA polymerázy pro PCR a pufry Taq DNA polymeráza Taq DNA polymeráza Unis TaqPurple DNA polymeráza Taq DNA polymeráza 1.1 Combi Taq DNA polymeráza LA DNA Polymerases Mix 10x koncentrovaný PCR Blue Buffer PCR je jednou z nejvýznamn jších molekulárn genetických technik. Tato technika slouží k rychlé produkci velkého po tu kopií fragment DNA. Po adí nukleotid v DNA fragmentech vytvo ených v PCR odpovídá po adí nukleotid v templátové DNA (nap íklad genomová DNA nebo cdna). Velikost ampli kovaných úsek je vymezena oligonukleotidovými primery (o ka), které nasedají na templátovou DNA. Reak ní sm s pro PCR obsahuje: 1. teplotn rezistentní DNA polymerázu 2. pufr 3. dntp (stavebni kameny DNA) 4. templátovou DNA 5. dvojici oligonukleotidových primer V pr b hu PCR dochází k denaturaci templátové DNA, nasednutí primer a extenzi DNA od primeru ve sm ru 5 > 3. Tyto kroky PCR, které mají odlišná teplotní optima se mnohokrát opakují (obvykle 20 40x). Provedení PCR v p ístrojích (cyklerech) umož ujících automatické zm ny teploty zásadním zp sobem zjednodušuje proces ampli kace DNA fragment. Z hlediska provád ní PCR mají rozhodující význam DNA polymerázy, které jsou rezistentní k teplotám, p i kterých dochází k denaturaci DNA (94 o C). Firma TopBio dodává 6 preparát polymeráz, které mají r znou využitelnost (viz. Tabulka 1). Tyto polymerázy se kombinují s dalšími komponentami PCR reak ních sm sí. Tabulka 1 využitelnost teplotn rezistentních polymeráz TopBio provenience pro r zné typy PCR Polymerázy Taq DNA pol. Taq DNA pol. Unis TaqPurple DNA pol. Taq DNA Pol. 1.1 Combi Taq DNA pol. LA DNA pol. Mix Rutinní diagnost. PCR Tabulka 2 vlastností polymeráz Koncentrace enzymu (U/ l) PCR dlouhých fragment + Inertní barvivo P esná PCR na klonace DNA fr. + Velikost ampli kovaných fragment DNA (kbp) Hot start PCR + Použití/poznámka PCR s vysokým výt žkem DNA fragment + + Speciální aplikace Taq DNA polymeráza 5 < 2 standardní enzym pro b žné ampli kace Taq DNA polymeráza Unis TaqPurple DNA polymeráza 5 < 2 enzym pro robustn jší reakce, nutno najít optimální ed ní enzymu 1 + < 2 Taq DNA polymeráza s p ídavkem inertního barviva (lze nášet p ímo na gel, bez nutnosti p idávat vkládací pufr) Taq DNA polymeráza < 2 Taq DNA polymeráza ed ná ve sklad. pufru Combi Taq DNA polymeráza LA DNA polymerases Mix 1 < 5 Taq DNA polymeráza s monoklonární protilátkou antitaq umož uje hotstart PCR 5 < 20/40 sm s Taq DNA polymerázy a polymerázy s 3 >5 exonukleázovou aktivitou (snížená frekvence chyb) vhodná pro klonování PCR fragment + + DNA polymerázy pro PCR a pufry 5

4 Taq DNA polymeráza KLÍ OVÉ REAGENS PRO AMPLIFIKACI FRAGMENT DNA V PCR Taq DNA polymeráza je termostabilní enzym izolovaný z Thermus aquaticus. Tento enzym katalyzuje polymerizaci nukleotid na základ templátu a oligonukleotidového o ka ve sm ru 5 >3 v p ítomnosti ho íku a má rovn ž 5 >3 exonukleázovou aktivitu. De nice jednotky: jedna jednotka Taq DNA polymerázy je definována jako množství enzymu, které katalyzuje inkorporaci 10 nmol dttp do materiálu precipitovatelného trichloroctovou kyselinou (TCA za 30 min. p i 72 o C). Reak ní podmínky jsou: 10 mm TrisHCl (ph 8,8 p i 25 o C), 50 mm KCl, 0,1% Triton X100, 1,5 mm MgCl 2, 200 M datp, dctp, dgtp a [ 32 P]dTTP, 50 g/ml denaturované cdna, 0,5 M odpovídajícího primeru a 0,2 0,5 U enzymu v objemu 50 1 zkumavka s Taq DNA polymerázou v objemu 20 l (100 U) nebo 100 l (500 U), 1 zkumavka s 10x koncentrovaným reak ním pufrem (1,5 ml). P i požadavku na zm nu v koncentraci MgCl 2 je možno namísto 10x konc. reak ního pufru dodat set obsahující 1 zkumavku s 10x konc. reak ním pufrem bez MgCl 2 (1,5 ml) a 1 zkumavku s 25 mm MgCl 2 (0,5 ml). Skladovací pufr: 20 mm HEPES, ph 7,9, 100 mm KCl, 0,1 mm EDTA, 1 mm DTT, 0,5 mm PMSF, stabilizátor, 50% glycerol. Koncentrace: 5 U/ l. Skladování: p i teplot 20 o C. Materiál snáší opakované rozmrazování. istota: preparát je prostý nukleáz. Enzym migruje p i SDS PAGE jako jediný proužek o molekulové hmotnosti 94 kd. 10x reak ní pufr s MgCl 2 : 100 mm TrisHCl, ph 8,8 (p i 25 o C), 500 mm KCl, 1% Triton X100, 15 mm MgCl 2. Kontrola kvality: p i použití doporu eného protokolu pro p ípravu vzork (viz. níže) a vhodné kombinace DNA a primer je výsledkem PCR DNA, která po elektroforetické analýze dává jediný proužek barvitelný ethidium bromidem a má odpovídající velikost. Kontrola kvality zahrnuje atest dokumentující závislost množství výsledného produktu na množství p idané Taq DNA polymerázy. Typický výsledek atestu je uveden na obr. 1. DNA polymerázy pro PCR a pufry 6 Doporu ený protokol pro p ípravu vzork pro PCR Smíchat: 41,5 l PCR H 2 O 5 l 10x koncentrovaného reak ního pufru (dodávaného s enzymem) 1 l 10 mm dntp mix (10 mm datp, 10 mm dctp, 10 mm dgtp a 10 mm dttp) 0,5 l 50 M 5 primeru 0,5 l 50 M 3 primeru 0,5 l Taq DNA polymerázy (2,5 U) 1 l testované DNA P i testování více vzork DNA je vhodné p ipravit tzv. Master Mix, ve kterém jsou objemy jednotlivých komponent násobkem po tu vzork DNA. Master Mix je rozd len po 49 l do zkumavek a do každé z nich je p idán 1 l studované DNA. Obr. 1. Elektroforetická separace fragment DNA generovaných v PCR (Fr.) s použitím r zných koncentrací Taq DNA polymerázy. Vzniklá DNA byla analyzována v 1% agarozovém gelu a barvena ethidium bromidem (0,5 g/ml). PCR byla provedena v objemu 50 l/zkumavku a obsahovala následující množství Taq DNA polymerázy: 2,5 U (B), 1U (C), 0,5U (D). Poloha fragment DNA markeru je rovn ž uvedena (A). Ampli kovaný materiál: plasmidová DNA (1ng). T 031 Taq DNA polymeráza 100 U 700, K T 032 Taq DNA polymeráza 500 U 2.900, K T 033 Taq DNA polymeráza 5 x 500 U , K T 034 Taq DNA polymeráza 10 x 500 U , K T x konc. Taq pufr bez MgCl 2+MgCl 2 1,5 ml + 0,5 ml 60, K A B C D Fr

5 Taq DNA polymeráza Unis KLÍ OVÉ REAGENS PRO AMPLIFIKACI ZVÝŠENÉHO MNOŽSTVÍ FRAGMENT DNA V PCR Jedná se o DNA polymerázu izolovanou z Thermus Aquaticus v univerzálním skladovacím pufru. De nice jednotky: jedna jednotka Taq DNA polymerázy Unis je de nována jako množství enzymu, které katalyzuje inkorporaci 10 nmol dttp do materiálu precipitovatelného TCA za 30 min. p i 72 o C. Reak ní podmínky jsou: 10 mm TrisHCl (ph 8,8 p i 25 o C), 50 mm KCl, 0,1% Triton X100, 1,5 mm MgCl 2, 200 M datp, dctp, dgtp a [ 32 P]dTTP, 50 g/ml denaturované cdna, 0,5 M odpovídajícího primeru a 0,2 0,5 U enzymu v objemu 50 l. 1 zkumavka s Taq DNA polymerázou Unis v objemu 20 l (100 U) nebo 100 l (500 U), 1 zkumavka s 10x koncentrovaným reak ním pufrem (1,5 ml). P i požadavku na zm nu v koncentraci MgCl 2 je možno namísto 10x konc. reak ního pufru dodat set obsahující 1 zkumavku s 10x konc. reak ním pufrem bez MgCl 2 (1,5 ml) a 1 zkumavku s 25 mm MgCl 2 (0,5 ml). Koncentrace: 5 U/ l. Skladování: p i teplot 20 o C. Materiál snáší opakované rozmrazování. istota: preparát je prostý nukleáz. Enzym migruje p i SDS PAGE jako jediný proužek o molekulové hmotnosti 94 kd. Skladovací pufr: 20 mm TrisHCl, ph 8,0 (25 o C), 100 mm KCl, 0,1 mm EDTA, 1 mm DTT, 0,5% Nonidet P40, 0,5% Tween 20, 50% glycerol. 10x reak ní pufr s MgCl 2 : 100 mm TrisHCl, ph 8,8 (25 o C), 500 mm KCl, 1% Triton X100, 15 mm MgCl 2. Kontrola kvality: p i použití doporu eného protokolu pro p ípravu vzork a vhodné kombinace DNA a primer je výsledkem PCR DNA fragment, který po elektroforetické separaci a barvení pomocí ethidium bromidu dává proužek odpovídající velikosti. Doporu ený protokol: viz. Taq DNA polymeráza. Odlišný skladovací pufr umož uje využít tuto polymerázu v kombinaci s pufry, které se využívají pro speciální aplikace, v etn ampli kace dlouhých fragment DNA. Taq DNA polymeráza Unis vykazuje v n kterých kombinacích primer a DNA templát podstatn vyšší ú innost než p vodní Taq DNA polymeráza. To umož uje redukovat její množství na polovinu: 1,25 U/50 l reak ní sm si. T 036 Taq DNA polymeráza Unis 100 U 700, K T 037 Taq DNA polymeráza Unis 500 U 3.000, K T 038 Taq DNA polymeráza Unis 5 x 500 U , K T 039 Taq DNA polymeráza Unis 10 x 500 U , K DNA polymerázy pro PCR a pufry 7

6 TaqPurple DNA polymeráza DNA POLYMERÁZA Z THERMUS AQUATICUS S P ÍDAVKEM INERTNÍHO BARVIVA Ve srovnání s b žn používanými polymerázami má TaqPurple DNA polymeráza n kolik výhod: barvivo stabilizuje enzym a prodlužuje jeho životnost, koncentrace enzymu (1 U/ l) usnad uje p esn jší dávkování enzymu, barvivo a glycerol zvyšují hustotu PCR reak ní sm si, kterou lze p ímo nanášet na gel (bez požadavku na p idání vkládacího pufru), barvivo usnad uje manipulaci s enzymem a umož uje vizuální kontrolu jeho promíchání, barvivo neovliv uje reak ní podmínky PCR (v etn koncentrace Mg 2+ ), barvivo má vyšší pohyblivost než nukleotidy a tedy neinterferuje s kvanti kací DNA fragment. De nice jednotky: jedna jednotka TaqPurple DNA polymerázy je de nována jako množství enzymu, které katalyzuje inkorporaci 10 nmol dttp do materiálu precipitovatelného TCA za 30 min. p i 72 o C. Reak ní podmínky jsou: 10 mm TrisHCl (ph 8,8 p i 25 o C), 50 mm KCl, 0,1% Triton X100, 1,5 mm MgCl 2, 200 M datp, dctp, dgtp a [ 32 P]dTTP, 50 g/ml denaturované cdna, 0,5 M odpovídajícího primeru a 0,2 0,5 U enzymu v objemu 50 l. 1 zkumavka s TaqPurple DNA polymerázou v objemu 100 l (100 U) nebo 500 l (500 U) 1 zkumavka s 10x koncentrovaným reak ním pufrem (1,5 ml). P i požadavku na zm nu v koncentraci MgCl 2 je možno namísto 10x konc. reak ního pufru dodat set obsahující 1 zkumavku s 10x konc. reak ním pufrem bez MgCl 2 (1,5 ml) a 1 zkumavku s 25 mm MgCl 2 (0,5 ml). Koncentrace: 1 U/ l. Skladování: p i teplot 20 o C. Materiál snáší opakované rozmrazování. istota: preparát je prostý nukleáz. Enzym migruje p i SDS PAGE jako jediný proužek o molekulové hmotnosti 94 kd. DNA polymerázy pro PCR a pufry 8 Skladovací pufr: 20 mm TrisHCl, ph 8,0 (25 o C), 100 mm KCl, 10x reak ní pufr s MgCl 2: 100 mm TrisHCl, 0,1 mm EDTA, 1 mm DTT, 0,5% Nonidet P40, 0,5% Tween ph 8,8 (p i 25 o C), 500 mm KCl, 1% Triton 20, inertní barvivo, 50% glycerol. X100, 15 mm MgCl 2. Kontrola kvality: p i použití doporu eného protokolu pro p ípravu vzork a vhodné kombinace DNA a primer je výsledkem PCR DNA fragment, který po elektroforetické separaci a barvení pomocí ethidium bromidu dává proužek odpovídající velikosti. Doporu ený protokol pro p ípravu vzork pro PCR Smíchat: 39,5 l PCR H 2O 5 l 10x koncentrovaného reak ního pufru (dodávaného s enzymem) 1 l 10 mm dntp mix (10 mm datp, 10 mm dctp, 10 mm dgtp a 10 mm dttp) 0,5 l 50 M 5 primeru 0,5 l 50 M 3 primeru 2,5 l TaqPurple DNA polymerázy (2,5 U) 1 l testované DNA P i testování více vzork DNA je vhodné p ipravit tzv. Master Mix, ve kterém jsou objemy jednotlivých komponent násobkem po tu vzork DNA. Master Mix je rozd len po 49 l do zkumavek a do každé z nich je p idán 1 l studované DNA. T 106 TaqPurple DNA polymeráza 100 U 700, K T 107 TaqPurple DNA polymeráza 500 U 3.000, K T 108 TaqPurple DNA polymeráza 5 x 500 U , K

7 Taq DNA polymeráza 1.1 KLÍ OVÉ REAGENS PRO AMPLIFIKACI FRAGMENT DNA V PCR Jedná se o DNA polymerázu izolovanou z Thermus aquaticus o koncentraci 1 U/ l. Snížená koncentrace enzymu usnad uje p esn jší dávkování. Enzym se dodává s 10x koncentrovaným reak ním Blue Bufferem (1,5 ml). De nice jednotky: jedna jednotka Taq DNA polymerázy 1.1 je de nována jako množství enzymu, které katalyzuje inkorporaci 10 nmol dttp do materiálu precipitovatelného TCA za 30 min. p i 72 o C. Reak ní podmínky jsou: 10 mm TrisHCl (ph 8,8 p i 25 o C), 50 mm KCl, 0,1% Triton X100, 1,5 mm MgCl 2, 200 M datp, dctp, dgtp a [ 32 P]dTTP, 50 g/ml denaturované cdna, 0,5 M odpovídajícího primeru a 0,2 0,5 U enzymu v objemu 50 l. 1 zkumavka s Taq DNA polymerázou 1.1 v objemu 100 l (100 U) nebo 500 l (500 U) 1 zkumavka s 10x koncentrovaným reak ním Blue Bufferem (1,5 ml). Koncentrace: 1 U/ l. Skladování: p i teplot 20 o C. Materiál snáší opakované rozmrazování. P i požadavku na zm nu v koncentraci MgCl 2 je možno namísto 10x konc. reak ního Blue Bufferu dodat set obsahující 1 zkumavku s 10x konc. reak ním Blue Bufferem bez MgCl 2 (1,5 ml) a 1 zkumavku s 25 mm MgCl 2 (0,5 ml). Skladovací pufr: 20 mm TrisHCl, ph 8,0 (25 o C), 100 mm KCl, 0,1 mm EDTA, 1 mm DTT, 0,5% Nonidet P40, 0,5% Tween 20, 50% glycerol. istota: preparát je prostý nukleáz. Enzym migruje p i SDS PAGE jako jediný proužek o molekulové hmotnosti 94 kd. 10x reak ní PCR Blue Buffer s MgCl 2 : 750 mm TrisHCl, ph 8,8 (25 o C), 200 mm (NH 4) 2SO 4, 0,1% Tween 20, 25 mm MgCl 2. Kontrola kvality: p i použití doporu eného protokolu pro p ípravu vzork a vhodné kombinace DNA a primer je výsledkem PCR DNA fragment, který po elektroforetické separaci a barvení pomocí ethidium bromidu dává proužek odpovídající velikosti. Doporu ený protokol: odlišný skladovací pufr umož uje využít tuto polymerázu v kombinaci s pufry, které se využívají pro speciální aplikace, v etn ampli kace dlouhých fragment DNA. Taq DNA polymeráza 1.1 vykazuje v n kterých kombinacích primer a DNA templát podstatn vyšší ú innost než p vodní Taq DNA polymeráza. To umož uje redukovat její množství na polovinu (1,25 U/50 l reak ní sm si). T 111 TaqPurple DNA polymeráza U 590, K T 112 TaqPurple DNA polymeráza U 2.190, K T 113 TaqPurple DNA polymeráza x 500 U 8.950, K T 114 TaqPurple DNA polymeráza x 500 U , K DNA polymerázy pro PCR a pufry 9

8 Combi Taq DNA polymeráza TAQ DNA POLYMERÁZA S MONOKLONÁLNÍ PROTILÁTKOU ANTITAQ Protilátka blokuje enzymovou aktivitu Taq DNA polymerázy a tím znemož uje zahájení polymerázové reakce p ed vlastní PCR. P i denaturaci DNA v prvním cyklu PCR dochází k irreverzibilní teplotní inaktivaci protilátky a tím k odblokování enzymatické aktivity Taq DNA polymerázy. Tato tzv. hot start PCR je vhodná všude tam, kde dochází k nežádoucí ampli kaci nespeci ckých fragment DNA, k nízké ampli kaci DNA fragment, pop ípad k tvorb artefakt vznikajících ampli kací kombinovaných primer. Oblast využití Combi Taq DNA polymerázy zahrnuje ampli kace komplexních genomických nebo cdna templát, nízkých po t templát ve velkém po tu termálních cykl (>35) anebo použití mnoho etných pár primer v téže reak ní sm si. De nice jednotky: jedna jednotka Combi Taq DNA polymerázy je de nována jako množství enzymu, které katalyzuje inkorporaci 10 nmol dttp do materiálu precipitovatelného TCA za 30 min. p i 72 o C. Reak ní podmínky jsou: 10 mm TrisHCl (ph 8,8 p i 25 o C), 50 mm KCl, 0,1% Triton X100, 1,5 mm MgCl 2, 200 M datp, dctp, dgtp a [ 32 P]dTTP, 50 g/ml denaturované cdna, 0,5 M odpovídajícího primeru a 0,2 0,5 U enzymu v objemu 50 l. 1 zkumavka s Combi Taq DNA polymerázou v objemu 100 l (100 U) nebo 500 l (500 U), 1 zkumavka s 10x koncentrovaným reak ním pufrem (1,5 ml). P i požadavku na zm nu v koncentraci MgCl 2 je možno namísto 10x konc. reak ního pufru dodat set obsahující 1 zkumavku s 10x konc. reak ním pufrem bez MgCl 2 (1,5 ml) a 1 zkumavku s 25 mm MgCl 2 (0,5 ml). Skladovací pufr: 20 mm TrisHCl, ph 8,0 (25 o C),100 mm KCl, 0,1 mm EDTA, 1 mm DTT, 0,5% Nonidet P40, 0,5% Tween 20, 50% glycerol. Koncentrace: 1 U/ l Skladování: p i teplot 20 o C. Materiál snáší opakované rozmrazování. istota: preparát je prostý nukleáz. Enzym migruje p i SDS PAGE jako jediný proužek o relativní molekulové hmotnosti 94 kd. Protilátka v neredukujícím prost edí putuje jako jediný proužek o relativní hmotnosti 155 kda. 10x reak ní PCR s MgCl 2: 100 mm Tris HCl, ph 8,8 (25 o C), 500 mm KCl, 1% Triton X100, 15 mm MgCl 2. DNA polymerázy pro PCR a pufry 10 Kontrola kvality: p i použití doporu eného protokolu pro p ípravu vzork a vhodné kombinace DNA a primer je výsledkem PCR DNA fragment, který po elektroforetické separaci a barvení pomocí ethidium bromidu dává proužek odpovídající velikosti. C 204 Combi Taq DNA polymeráza 100 U 1.000, K C 205 Combi Taq DNA polymeráza 500 U 4.000, K C 206 Combi Taq DNA polymeráza 5 x 500 U , K

9 LA DNA Polymerases Mix KLÍ OVÉ REAGENS PRO AMPLIFIKACI DLOUHÝCH FRAGMENT DNA (AŽ 40 KB) Jedná se o unikátní sm s DNA polymerázy Unis a další polymerázy s 3 >5 exonukleázovou aktivitou, která umož uje provád t ampli kaci genomové DNA až do velikosti 20 kb a plasmidové (fágové) DNA až do velikosti 40 kb tzv. LA (Long and Accurate) PCR. Mimo ádná ampli ka ní ú innost uvedeného systému jej p edur uje i k b žné PCR, kde jiné systémy selhávají, nebo kde je požadavek na snížený výskyt chyb (pro klonování). Systém lze doporu it i pro RTPCR. De nice jednotky: jedna jednotka LA DNA Polymerases Mix je de nována jako množství enzymu, které katalyzuje inkorporaci 10 nmol dttp do materiálu precipitovatelného TCA za 30 min. p i 72 o C. Reak ní podmínky jsou: 10 mm TrisHCl (ph 8,8 p i 25 o C), 50 mm KCl, 0,1% Triton X100, 1,5 mm MgCl 2, 200 M datp, dctp, dgtp a [ 32 P]dTTP, 50 g/ml denaturované cdna, 0,5 M odpovídajícího primeru a 0,2 0,5 U enzymu v objemu 50 l. 1 zkumavka LA DNA Polymerases Mix v objemu 20 l (100 U) nebo 100 l (500 U), 1 zkumavka obsahující 1,5 ml 10x koncentrovaného LA PCR reak ního pufru, 1 zkumavka DMSO, podrobný návod na provád ní LA PCR. Koncentrace: 5 U/ l. Skladování: p i teplot 20 o C. Materiál snáší opakované rozmrazování. P i požadavku na zm nu v koncentraci MgCl 2 je možno namísto 10x konc. reak ního LA PCR pufru dodat set obsahující 1 zkumavku s 10x konc. reak ním LA PCR pufrem bez MgCl 2 (1,5 ml) a 1 zkumavku s 25 mm MgCl 2 (0,5 ml). istota: preparát je prostý RNáz a DNáz. Skladovací pufr: 20 mm TrisHCl, ph 8,0 (25 o C), 100 mm KCl, 10x reak ní pufr s MgCl2: 500 mm TrisHCl, 0,1 mm EDTA, 1 mm DTT, 0,5% Nonidet P40, 0,5% Tween 20, ph 9,3 (25 o C), 150 mm (NH 4) 2SO 4, 1% Tween 50% glycerol. 20, 22,5 mm MgCl 2. Kontrola kvality: p i použití doporu eného protokolu pro p ípravu vzork a vhodné kombinace DNA a primer je výsledkem PCR DNA fragment, který po elektroforetické separaci a barvení pomocí ethidium bromidu dává proužek odpovídající velikosti. L 071 LA DNA Polymerases Mix 100 U 1.000, K L 072 LA DNA Polymerases Mix 500 U 3.500, K L 073 LA DNA Polymerases Mix 5 x 500 U , K L x konc. LA PCR pufr bez MgCl 2+MgCl 2 1,5 ml + 0,5 ml 60, K DNA polymerázy pro PCR a pufry 11

10 10x koncentrovaný PCR Blue Buffer Jedná se o reak ní pufr pro PCR, jehož základem je síran amonný, který je v ad p ípad výhodn jší než d íve používané pufry s KCl. Optimální kone ná koncentrace MgCl 2 bývá vyšší (obvykle 2,5 mm) než p i použití klasického reak ního pufru s KCl, který má optimum obvykle p i 1,5 mm MgCl 2. Navíc PCR Blue Buffer má širší rozmezí optimálních koncentrací MgCl 2. Složení: PCR Blue Buffer se dodává 10x koncentrovaný: 750 mm TrisHCl, ph 8,8 (p i 25 o C), 200 mm (NH 4) 2SO 4, 0,1% Tween 20, 25 mm MgCl 2. 1 zkumavka 10x koncentrovného PCR Blue Bufferu, 10x konc. PCR Blue Buffer se dodává i bez MgCl 2 a 25mM MgCl 2 je dodáván zvláš. Tato varianta usnad uje optimalizaci reak ních podmínek. Skladování: p i teplot 20 o C. Materiál snáší opakované rozmrazování. PCR Blue Buffer lze použít pro Taq DNA polymerázu, Taq DNA polymerázu Unis, TaqPurple DNA polymerázu, Taq DNA polymerázu 1.1 i Combi Taq DNA polymerázu. DNA polymerázy pro PCR a pufry T x konc. PCR Blue Buffer Complete 1,5 ml 50, K T x konc. PCR Blue Buffer bez MgCl 2+MgCl 2 1,5 ml + 0,5 ml 60, K 12

11 PP Master Mixy new PPP Master Mix Plain PP Master Mix Combi PPP Master Mix Plain Combi PP Master Mix PP Master Mixy p edstavují novou generaci produkt pro p ípravu rychlé a spolehlivé PCR. Obsahují všechny komponenty PCR s výjimkou primer a DNA. Jejich hlavní p edností je: 1) nevyžadují smíchávání malých množství jednotlivých komponent PCR, 2) obsahují všechny komponenty optimalizované z hlediska vzájemné kompatibility, 3) obsahují aditiva, která zjednodušují skladování, p epravu i ú innost PCR. Všechny tyto parametry zvyšují reproducibilitu výsledk PCR test. V sou asné dob jsou k dispozici následující typy 2x koncentrovaných PCR Master Mix, které se liší svým složením a využitelností (viz. tabulka 3). Tabulka 3 využitelnost reak ních sm sí TopBio provenience pro r zné typy PCR Rutinní diagnost. PCR PCR dlouhých fragment PCR reak ní sm s bez DNA a primer PPP Master Mix PPP M. Mix bez MgCl 2 Plain PP Master Mix Combi PPP Master Mix Plain Combi PP M. Mix P esná PCR na klonace DNA fr. Hot start PCR + + PCR s vysokým výt žkem DNA fragment Speciální aplikace Tabulka 4 vlastností PP Master Mix PPP Master Mix Koncentrace enzymu (U/ l) Inertní barvivo Velikost ampli kovaných fragment DNA (kbp) Použití/poznámka 0,1 + < 2 umožnuje optimalizované a standardní PCR obsahuje inertní barvivo (lze nanášet p ímo na gel, bez nutnosti p idávat vkládací pufr) PPP Master 0,1 + < 2 MgCl 2 se dodává separátn Mix bez MgCl 2 obsahuje inertní barvivo (lze nanášet p ímo na gel, bez nutnosti p idávat vkládací pufr) Plain PP Master Mix Combi PPP Master Mix Plain Combi PP Master Mix 0,1 < 2 neobsahuje barvivo a je vhodný pro analýzu DNA fragment s využitím automatických detektor 0,1 + < 2 obsahuje monoklonální protilátku antitaq s p ídavkem inertního barviva (lze nanášet p ímo na gel, bez nutnosti p idávat vkládací pufr) antitaq protilátka zajiš uje hot start PCR a odstra uje nežádoucí nespeci cké ampli kace 0,1 < 2 obsahuje monoklonální protilátku antitaq tím, že neobsahuje barvivo je vhodný pro analýzu DNA fragment s využitím spektrofotometr PP Master Mixy 13

12 PPP Master Mix TAQPURPLE DNA POLYMERÁZA PCR MASTER MIX Umož uje po všech stránkách optimalizované a standardní provád ní PCR, umož uje rychlou p ípravu reak ní sm si bez nutnosti rozmrazování jednotlivých komponent; sta í dodat primery, DNA a doplnit H 2O (sou ástí dodávky), obsahuje reak ní pufr, který zvyšuje ú innost i speci citu PCR a zajiš uje širší rozmezí optimálních koncentrací MgCl 2, obsahuje stabilizátory, které umož ují kratkodobé skladování p i 4 o C, obsahuje aditiva, která umož ují p ímou elektroforézu ampli kovaného produktu, bez nutnosti p idávat vkládací pufr, obsahuje barvivo, které usnad uje manipulaci se vzorky a vizuální kontrolu homogenity; barvivo má vyšší pohyblivost než nukleotidy a tedy neinterferuje s kvanti kovatelností PCR produkt, vzorky mohou být snadno reampli kovány (nested PCR), protože barvivo nemá vliv na pr b h ampli kace, PPP Master Mix je mimo ádn vhodný pro rutinní vyšet ování v tších po t vzork. K PPP Master Mixu v originální zkumavce (0,5 ml) je možné p idat požadované primery (nap. 2 x 40 l) a PCR H 2O (380 l). Vlastní p ípravu PCR lze pak omezit pouze na smíchání ástí této reak ní sm si (nap. 24 l) s analyzovanou DNA (1 l). Složení: PPP Master Mix se dodává 2x koncentrovaný: 150 mm TrisHCl, ph 8,8 (25 o C), 40 mm (NH 4) 2SO 4, 0,02% Tween 20, 5 mm MgCl 2, 400 M datp, 400 M dctp, 400 M dgtp, 400 M dttp, 100 U/ml TaqPurple DNA polymerázy, stabilizátory a aditiva. Sou ástí dodávky je PCR H 2O. 1 zkumavka 500 l PPP Master Mixu (na 40 reakcí po 25 l), 1 zkumavka 1,5 ml H 2O. Skladování: p i teplot 20 o C, krátkodob (dny) p i teplot 4 o C. Materiál snáší opakované rozmrazování. istota: preparát je prostý nukleáz. Enzym migruje p i SDS PAGE jako jediný proužek o molekulové hmotnosti 94 kd. Kontrola kvality: každá šarže PPP Master Mixu je testována na ampli kaci genu o jedné kopii v genomové DNA. PP Master Mixy 14 P 124 PPP Master Mix (1 zk.) 40 reakcí 690, K P 125 PPP Master Mix (5 zk.) 200 reakcí 2.490, K P 126 PPP Master Mix (25 zk.) 1000 reakcí 9.990, K V p ípad požadavku na zm ny v koncentraci Mg 2+ lze dodat PPP Master Mix bez MgCl 2 a MgCl 2 separátn. P 134 PPP Master Mix bez MgCl 2+MgCl 2 (1 zk.) 40 reakcí 690, K P 135 PPP Master Mix bez MgCl 2+MgCl 2 (5 zk.) 200 reakcí 2.490, K P 136 PPP Master Mix bez MgCl 2+MgCl 2 (25 zk.) 1000 reakcí 9.990, K

13 Plain PP Master Mix TAQ DNA POLYMERÁZA PCR MASTER MIX BEZ BARVIVA Plain PP Master Mix je obdobou PPP Master Mixu, ale neobsahuje barvivo. Umož uje po všech stránkách optimalizované a standartní provád ní PCR, obsahuje reak ní pufr, který zvyšuje ú innost i speci citu PCR a zajiš uje širší rozmezí optimálních koncetrací MgCl 2, umož uje rychlejší p ípravu reak ní sm si bez nutnosti rozmrazování jednotlivých komponent; sta í dodat primery, DNA a doplnit H 2 O (sou ástí dodávky), obsahuje stabilizátory, které umož ují krátkodobé skladování p i 4 o C, obsahuje aditiva, která umož ují p ímou elektroforézu ampli kovaného produktu, bez nutnosti p idávat vkládací pufr, vzorky mohou být snadno reampli kovány (nested PCR), nebo aditiva nemají vliv na pr b h ampli kace, je mimo ádn vhodný pro rutinní analýzu produkt PCR reakcí pomocí automatických detektor (kapilární chromatogra e, realtime PCR a další). K Plain PP Master Mixu v originální zkumavce (0,5 ml) je možné p idat požadované primery (nap. 2 x 40 l) a PCR H 2 O (380 l). Vlastní p ípravu PCR lze pak omezit pouze na smíchání ásti této reak ní sm si (nap. 24 l) s analyzovanou DNA (1 l). Složení: Plain PP Master Mix se dodává 2x koncentrovaný: 150 mm TrisHCl, ph 8,8 (25 o C), 40 mm (NH 4 ) 2 SO 4, 0,02% Tween 20, 5 mm MgCl 2, 400 M datp, 400 M dctp, 400 M dgtp, 400 M dttp, 100 U/ml Taq DNA polymerázy, stabilizátory a aditiva. 1 zkumavka s 500 l Plain PP Master Mixu (na 40 reakcí po 25 l), 1 zkumavka s 1,5 ml H 2 O. Skladování: p i teplot 20 o C, krátkodob (dny) p i teplot 4 o C. Materiál snáší opakované rozmrazování. istota: preparát je prostý nukleáz. Enzym migruje p i SDS PAGE jako jediný proužek o molekulové hmotnosti 94 kd. Kontrola kvality: každá šarže Plain PP Master Mixu je testována na ampli kaci genu o jedné kopii v genomové DNA. P 201 Plain PP Master Mix (1 zk.) 40 reakcí 690, K P 202 Plain PP Master Mix (5 zk.) 200 reakcí 2.490, K P 203 Plain PP Master Mix (25 zk.) 1000 reakcí 9.990, K PP Master Mixy 15

14 Combi PPP Master Mix TAQPURPLE DNA POLYMERÁZA PCR MASTER MIX S MONOKLONÁLNÍ PROTILÁTKOU ANTITAQ Umož uje po všech stránkách optimalizované a standardní provád ní PCR, obsahuje reak ní pufr, který zvyšuje ú innost i speci citu PCR a zajiš uje širší rozmezí optimálních koncentrací MgCl 2, umož uje rychlejší p ípravu reak ní sm si bez nutnosti rozmrazování jednotlivých komponent; sta í dodat primery, DNA a doplnit H 2O (sou ástí dodávky), obsahuje aditiva, která umož ují p ímou elektroforézu ampli kovaného produktu, bez nutnosti p idávat vkládací pufr, obsahuje antitaq monoklonální protilátku speci ckou pro Taq DNA polymerázu, která umož uje tzv. hot start PCR, obsahuje barvivo, které usnad uje manipulaci a vizuální kontrolu homogenity vzork ; p i elektroforéze má barvivo vyšší pohyblivost než nukleotidy a tedy neinterferuje s kvanti kovatelností PCR produkt, vzorky mohou být snadno reampli kovány (nested PCR), nebo aditiva nemají vliv na pr b h ampli kace, má široké využití p i ampli kaci komplexních genomických nebo cdna templát, nízkých po t templát a p i použití mnoho etných pár primer v téže reak ní sm si. Protilátka blokuje enzymatickou aktivitu Taq DNA polymerázy a tím znemož uje zahájení polymerázové reakce p ed vlastní PCR. P i denaturaci DNA dochází sou asn k irreverzibilní teplotní inaktivaci protilátky a tím k odblokování enzymatické aktivity DNA polymerázy. Tato tzv. hot start PCR je zvlášt vhodná všude tam, kde dochází k nežádoucí ampli kaci nespeci ckých fragment DNA, k nízké ampli kaci DNA fragment, pop ípad k tvorb artefakt vznikajících ampli kací kombinovaných primer. (viz obr. 2 ) Taq mab + Control mab sp. frag. Obr. 2. Vliv monoklonální protilátky antitaq na ampli kaci cdna fragment pomocí RTPCR. Bun ná mrna byla izolována pomocí reagens RNA Blue a p evedena na cdna pomocí MMLV reverzní transkriptázy. Získaná cdna byla následn ampli kována pomocí Combi PPP Master Mixu, obsahující antitaq monoklonální protilátku (+ Taq mab), nebo kontrolního PPP Master Mixu s kontrolní monoklonální protilátkou (+ Control mab). Testované vzorky byly z bun k divokého typu (1,4), heterozygot (2,5) nebo homozygot defektních v expresi studované mrna (3,6). Ampli kované vzorky byly frakcionovány elektroforézou na agarózovém gelu s p ídavkem ethidium bromidu. Pouze vzorky obsahující cílovou mrna vykazovaly o ekávaný DNA fragment (sp. frag.). Složení: Combi PPP Master Mix se dodává 2x koncentrovaný: 150 mm TrisHCl, ph 8,8 (25 o C), 40 mm (NH 4) 2SO 4, 0,02% Tween 20, 5 mm MgCl 2, 400 M datp, 400 M dctp, 400 M dgtp, 400 M dttp, 100 U/ml TaqPurple DNA polymerázy, monoklonální antitaq DNA polymeráza (38 nm), stabilizátory a aditiva. 1 zkumavka 500 l Combi PPP Master Mixu (na 40 reakcí po 25 l), 1 zkumavka 1,5 ml H 2 O. Skladování: p i teplot 20 o C. Materiál snáší opakované rozmrazování. istota: preparát je prostý nukleáz. Enzym migruje p i SDS PAGE jako jediný proužek o molekulové hmotnosti 94 kd. PP Master Mixy 16 Kontrola kvality: každá šarže Combi PPP Master Mixu je testována na amplifikaci genu o jedné kopii v genomové DNA. C 208 Combi PPP Master Mix (1 zk.) 40 reakcí 790, K C 209 Combi PPP Master Mix (5 zk.) 200 reakcí 2.990, K C 210 Combi PPP Master Mix (25 zk.) 1000 reakcí , K

15 Plain Combi PP Master Mix PLAIN COMBI PP MASTER MIX JE NOVOU GENERACÍ P ÍPRAVK PRO PCR Jedná se o sm s obsahující PP (Taq DNA Polymeráza PCR) Master Mix a monoklonální protilátku antitaq. Plain Combi PP Master Mix je obdobou Combi PPP Master Mixu, ale neobsahuje barvivo. Absence barviva a p ítomnost antitaq monoklonální protilátky p edur uje tento výrobek pro PCR kde je ampli kovaná DNA m ena pomocí spektrofotometrických metod. Zvlášt vhodná je pro realtime qpcr s DNA barvivy typu SYBR Green a SYTO9. Tato reak ní sm s má z hlediska provád ní PCR adu výhod: obsahuje antitaq monoklonální protilátku, speci ckou pro Taq DNA polymerázu, která umož uje tzv. hot start PCR. Protilátka se váže na Taq DNA polymerázu a tím ji inaktivuje. V prvním cyklu denaturace DNA dochází k teplotní inaktivaci protilátky a tím k aktivaci Taq DNA polymerázy. Na rozdíl od jiných metod inaktivace Taq DNA polymerázy, tato protilátka je extremn citlivá k teplotní denaturaci a tedy není nutné prodlužovat denatura ní fázi prvního cyklu PCR, umož uje po všech stránkách optimalizované a standardní provád ní PCR, obsahuje reak ní pufr, který zvyšuje ú innost i speci citu PCR a zajiš uje širší rozmezí optimálních koncentrací MgCl 2, umož uje rychlejší p ípravu reak ní sm si bez nutnosti rozmrazování a pipetování díl ích komponent; sta í dodat primery, DNA a doplnit H 2 O (sou ástí dodávky), Komponenty balení: 1 zkumavka 0,5 ml Plain Combi PP Master Mixu (na 40 reakcí po 25 l), 1 zkumavka 1,5 ml PCR H 2 O. Koncentrace: Plain Combi PP Master Mix se dodává 2x koncentrovaný: 150 mm TrisHCl, ph 8,8, 40 mm (NH 4 ) 2 SO 4, 0,02% Tween 20, 5 mm MgCl 2, 400 M datp, 400 M dctp, 400 M dgtp, 400 M dttp, 100 U/ml Taq DNA polymerázy, monoklonální antitaq DNA polymeráza, stabilizátory a aditiva. Skladování: p i teplot 20 o C. Materiál snáší opakované rozmrazování. Kontrola kvality: každá šarže Plain Combi PP Master Mixu je testována na amplifikaci genu o jedné kopii v genomové DNA a na absenci endonukleázové aktivity [inkubace 1x koncentrovaného Plain Combi PP Master Mixu (25 l) s plasmidem puc8 (0,5 g), 4 hod. p i 37 o C]. C 211 Plain Combi PP Master Mix 40 reakcí 790, K C 212 Plain Combi PP Master Mix 200 reakcí 2.990, K C 213 Plain Combi PP Master Mix 1000 reakcí , K PP Master Mixy 17

16 qpcr Master Mixy NOVÁ GENERACE P ÍPRAVK PRO KVANTITATIVNÍ PCR qpcr 2x Master Mix qpcr 2x Blue Master Mix new new new qpcr 2x SYBR Master Mix XLqPCR 2x SYBR Master Mix XLqPCR 2x SYBR+DMSO Master Mix SYTO9 qpcr 2x Master Mix Kvantitativní PCR (qpcr), nazývaná PCR v reálném ase, je v sou asnosti nejpoužívan jší metoda pro analýzu genové exprese. qpcr vyžaduje termální cyklery, které jsou vybavené za ízením pro monitorování uorescence v jednotlivých cyklech PCR. Intenzita uorescence koreluje s množstvím DNA fragment produkovaných v pr b hu PCR. Výhodou qpcr je: 1) tvorba fragment DNA je monitorována v pr b hu PCR a tedy nevyžaduje gelovou analýzu PCR produkt, 2) umož uje kvanti kaci tvorby DNA fragment v exponenciální fázi PCR, 3) nevyžaduje manipulaci s PCR produkty a tím snižuje riziko kontaminace. Základem pro provád ní qpcr jsou kvalitní reagens. qpcr Master Mixy TopBio provenience spl ují požadavky na reagens, která jsou vhodná pro provád ní PCR. Všechny qpcr Master Mixy: umož ují po všech stránkách optimalizované a standardní provád ní qpcr, obsahují reak ní pufr s MgCl 2 v optimální koncentraci pro v tšinu PCR, umož ují rychlejší p ípravu PCR reak ních sm sí bez nutnosti rozmrazování jednotlivých komponent; sta í dodat primery, DNA a doplnit H 2O (sou ástí dodávky), obsahují a nitn puri kovanou monoklonální protilátku speci ckou pro Taq DNA polymerázu. Tato protilátka blokuje enzymatickou aktivitu Taq DNA polymerázy a tím znemož uje zahájení polymerázové reakce p ed vlastní PCR. P i denaturaci DNA v prvním cyklu PCR dochází k irreverzibilní teplotní inaktivaci protilátky a tím k odblokování enzymatické aktivity Taq DNA polymerázy. Tato tzv. hot start PCR je vhodná všude tam, kde dochází k nežádoucí ampli kaci nespeci ckých fragment DNA, k nízké ampli kaci DNA fragment, pop ípad k tvorb artefakt vznikajících ampli kací kombinovaných primer. Protilátka je inaktivována rychle p i prvním cyklu denaturace DNA b hem PCR (~1 min. p i 94 o C) a není t eba prodlužovat denatura ní krok. Tabulka 5 využitelnost qpcr Master Mix TopBio provenience pro r zné typy PCR qpcr Master Mixy Produkt Použití pro sekven. speci cké sondy Použití s DNA barvivy Hot start PCR Ampli kace DNA fragm. až 1 kb qpcr 2x Master Mix + + (vlastní) + qpcr 2x Blue Master Mix + + (vlastní) + qpcr 2x SYBR Master Mix + + XLqPCR 2x SYBR Master Mix XLqPCR 2x SYBR + DMSO M. Mix SYTO9 qpcr 2x Master Mix

17 qpcr 2x Master Mix OBSAHUJE TAQ DNA POLYMERÁZU, PUFR S MgCl 2, NUKLEOTIDY, MONOKLONÁLNÍ PROTILÁTKU ANTITAQ A NOVÁ ADITIVA Umož uje po všech stránkách optimalizované a standardní provád ní PCR a realtime qpcr, obsahuje reak ní pufr s MgCl 2 v optimální koncentraci pro v tšinu PCR, umož uje rychlejší p ípravu reak ní sm si bez nutnosti rozmrazování jednotlivých komponent; sta í dodat primery, sondu, DNA a doplnit H 2 O (sou ástí dodávky), obsahuje a nitn puri kovanou monoklonální protilátku speci ckou pro Taq DNA polymerázu, která umož uje tzv. hot start PCR. Tato protilátka blokuje enzymatickou aktivitu Taq DNA polymerázy a tím znemož uje zahájení PCR. P i denaturaci DNA v prvním cyklu PCR dochází k irreverzibilní teplotní inaktivaci protilátky a tím k odblokování enzymatické aktivity Taq DNA polymerázy. Protilátka je inaktivována rychle p i prvním cyklu denaturace DNA b hem PCR (~1 min. p i 94 o C) a není t eba prodlužovat denatura ní krok, má široké využití p i ampli kaci komplexních genomických nebo cdna templát, nízkých po t templát a p i použití mnoho etných pár primer v téže reak ní sm si, je vhodný pro použití v kombinaci se všemi b žnými detek ními sondami typu TaqMan, molecular beacons, FRET. Složení: qpcr 2x Master Mix se dodává 2x koncentrovaný: 20 mm TrisHCl, ph 8,8, 100 mm KCl, 0,2% Triton X100, 3 mm MgCl 2, 400 M datp, 400 M dctp, 400 M dgtp, 400 M dttp, 50 U/ml Taq DNA polymerázy, monoklonální antitaq DNA polymeráza (38 nm), stabilizátory a aditiva. 1 zkumavka qpcr 2x Master Mixu (na 40 reakcí po 25 l) 1 zkumavka 1,5 ml PCR H 2 0. Skladování: p i teplot 20 o C. Materiál snáší opakované rozmrazování. Kontrola kvality: každá šarže qpcr 2x Master Mixu je testována na amplifikaci genu o jedné kopii v genomové DNA pomocí p ístroje pro realtime qpcr. qpcr Fluorescence Doba (min.) íslo cyklu P 501 qpcr 2x Master Mix 40 reakcí 790, K P 502 qpcr 2x Master Mix 200 reakcí 2.990, K P 503 qpcr 2x Master Mix 1000 reakcí , K qpcr Master Mixy 19

18 qpcr 2x Blue Master Mix OBSAHUJE TAQ DNA POLYMERÁZU, BLUE BUFFER S MgCl 2, NUKLEOTIDY, MONOKLONÁLNÍ PROTILÁTKU ANTITAQ A NOVÁ ADITIVA Umož uje po všech stránkách optimalizované a standardní provád ní PCR a realtime qpcr, obsahuje reak ní pufr se síranem amonným a s MgCl 2 v optimální koncentraci pro v tšinu PCR, umož uje rychlejší p ípravu reak ní sm si bez nutnosti rozmrazování jednotlivých komponent; sta í dodat primery, detek ní sondu, studovanou DNA (cdna) a doplnit H 2O (sou ástí dodávky), obsahuje a nitn puri kovanou monoklonální protilátku speci ckou pro Taq DNA polymerázu. Tato protilátka blokuje enzymatickou aktivitu DNA polymerázy a tím znemož uje zahájení polymerázové reakce p ed vlastní PCR. P i denaturaci DNA v prvním cyklu PCR dochází k irreverzibilní teplotní inaktivaci protilátky a tím k odblokování enzymatické aktivity DNA polymerázy. Tato tzv. hot start PCR je zvlášt vhodná všude tam, kde dochází k nežádoucí ampli kaci nespeci ckých fragment DNA, k nízké ampli kaci DNA fragment, pop ípad k tvorb artefakt vznikajících ampli kací kombinovaných primer. Protilátka je inaktivována rychle p i prvním denatura ním cyklu PCR (~ 1 min. p i 94 o C) a není nutné prodlužovat denatura ní krok, má široké využití p i ampli kaci komplexních genomických nebo cdna templát, nízkých po t templát a p i použití mnoho etných pár primer v téže reak ní sm si, je vhodná pro použití všech b žných detek ních sond (TaqMan, molecular beacons, FRET). Složení: qpcr 2x Blue Master Mix se dodává 2x koncentrovaný: 150 mm TrisHCl, ph 8,8 (p i 25 o C), 40 mm (NH 4) 2SO 4, 0,02% Tween 20, 5 mm MgCl 2, 400 M datp, 400 M dctp, 400 M dgtp, 400 M dttp, 50 U/ml Taq DNA polymerázy, monoklonální antitaq DNA polymeráza (38 nm), stabilizátory a aditiva. 1 zkumavka qpcr 2x Blue Master Mixu (na 40 reakcí po 25 l) 1 zkumavka PCR H 2 0 (1,5 ml). Skladování: p i teplot 20 o C. Materiál snáší opakované rozmrazování. Kontrola kvality: každá šarže qpcr 2x Blue Master Mixu je testována na ampli kaci genu o jedné kopii v genomové DNA pomocí p ístroje pro realtime qpcr. qpcr Doba (min.) 1000 Fluorescence 100 qpcr Master Mixy íslo cyklu P 521 qpcr 2x Blue Master Mix 40 reakcí 790, K P 522 qpcr 2x Blue Master Mix 200 reakcí 2.990, K P 523 qpcr 2x Blue Master Mix 1000 reakcí , K

19 qpcr 2x SYBR Master Mix OBSAHUJE TAQ DNA POLYMERÁZU, PUFR S MgCl 2, NUKLEOTIDY, MONOKLONÁLNÍ PROTILÁTKU ANTITAQ, SYBR GREEN A NOVÁ ADITIVA Umož uje po všech stránkách optimalizované a standardní provád ní realtime qpcr, obsahuje reak ní pufr s MgCl 2 v optimální koncentraci pro v tšinu qpcr, obsahuje uorescen ní barvivo SYBR Green, interkalující mezi báze DNA v optimální koncentraci bez negativního p sobení na ampli kaci DNA, umož uje rychlejší p ípravu reak ní sm si bez nutnosti rozmrazování jednotlivých komponent; sta í dodat primery, DNA a doplnit H 2O (sou ástí dodávky), obsahuje a nitn puri kovanou monoklonální protilátku speci ckou pro Taq DNA polymerázu, která umož uje tzv. hot start PCR. Tato protilátka blokuje enzymatickou aktivitu Taq DNA polymerázy a tím znemož uje zahájení PCR. P i denaturaci DNA v prvním cyklu PCR dochází k irreverzibilní teplotní inaktivaci protilátky a tím k odblokování enzymatické aktivity Taq DNA polymerázy. Protilátka je inaktivována rychle p i prvním cyklu denaturace DNA b hem PCR (~1 min. p i 94 o C) a není t eba prodlužovat denatura ní krok, má široké využití p i ampli kaci komplexních genomických nebo cdna templát, nízkých po t templát a p i použití mnoho etných pár primer v téže reak ní sm si. Složení: qpcr 2x SYBR Master Mix se dodává 2x koncentrovaný: 20 mm TrisHCl, ph 8,8, 100 mm KCl, 0,2% Triton X100, 3 mm MgCl 2, 400 M datp, 400 M dctp, 400 M dgtp, 400 M dttp, 50 U/ml Taq DNA polymerázy, monoklonální antitaq DNA polymeráza (38 nm), SYBR Green, stabilizátory a aditiva. 1 zkumavka qpcr 2x SYBR Master Mixu (na 40 reakcí po 25 l) 1 zkumavka 1,5 ml PCR H 20 Skladování: p i teplot 20 o C. Materiál snáší opakované rozmrazování. Kontrola kvality: každá šarže qpcr 2x SYBR Master Mixu je testována na ampli kaci genu o jedné kopii v genomové DNA pomocí p ístroje pro realtime qpcr. P 551 qpcr 2x SYBR Master Mix 40 reakcí 790, K P 552 qpcr 2x SYBR Master Mix 200 reakcí 2.990, K P 553 qpcr 2x SYBR Master Mix 1000 reakcí , K qpcr Master Mixy 21

20 XLqPCR 2x SYBR Master Mix OBSAHUJE TAQ DNA POLYMERÁZU, NOVÝ XL PUFR, NUKLEOTIDY, MONOKLONÁLNÍ PROTILÁTKU ANTITAQ, SYBR GREEN I, STABILIZÁTORY A NOVÁ ADITIVA Obsahuje nový XL reak ní pufr, který je vhodný pro tém všechny qpcr metody, s vysokou mírou tolerance r zných nárok na koncentraci Mg 2+ a který odstra uje inhibi ní efekt SYBR Green I na ampli kaci delších DNA fragment (až 1 kb); není nutné mít jiné primery než na b žnou PCR s následnou gelovou elektroforézou, umož uje po všech stránkách optimalizované a standardní provád ní realtime qpcr, obsahuje uorescen ní barvivo SYBR Green I, interkalující mezi báze DNA v optimální koncentraci bez negativního p sobení na ampli kaci DNA, umož uje rychlejší p ípravu reak ní sm si bez nutnosti rozmrazování jednotlivých komponent; sta í dodat primery, DNA a doplnit H 2 O (sou ástí dodávky), obsahuje a nitn puri kovanou monoklonální protilátku speci ckou pro Taq DNA polymerázu, která umož uje tzv. hot start PCR. Tato protilátka blokuje enzymatickou aktivitu Taq DNA polymerázy a tím znemož uje zahájení polymerázové reakce p ed vlastní PCR. P i denaturaci DNA v prvním cyklu PCR dochází k irreverzibilní teplotní inaktivaci protilátky a tím k odblokování enzymatické aktivity Taq DNA polymerázy. Protilátka je inaktivována rychle p i prvním cyklu denaturace DNA b hem PCR (~1 min. p i 94 o C). Pro aktivaci Taq DNA polymerázy není t eba prodlužovat denatura ní krok, tato tzv. hot start PCR je zvlášt vhodná všude tam, kde dochází k nežádoucí ampli kaci nespeci ckých fragment DNA, k nízké ampli kaci DNA fragment, pop ípad k tvorb artefakt vznikajících ampli kací kombinovaných primer, má široké využití p i ampli kaci komplexních genomických nebo cdna templát, nízkých po t templát a p i použití mnoho etných pár primer v téže reak ní sm si. Komponenty balení: 1 zkumavka XLqPCR 2x SYBR Master Mixu (na 40 reakcí po 25 l), 1 zkumavka 1,5 ml PCR H 2 O. Složení: dodává se 2x koncentrovaný. Obsahuje nový XL reak ní pufr s 4 mm MgSO 4, 400 M datp, 400 M dctp, 400 M dgtp, 400 M dttp, Taq DNA polymerázu (50 U/ml), monoklonální protilátku antitaq, SYBR Green I, stabilizátory a aditiva. Skladování: p i teplot 20 o C. Materiál snáší opakované rozmrazování. Kontrola kvality: každá šarže XLqPCR 2x SYBR Master Mixu je testována na amplifikaci genu o jedné kopii v genomové DNA pomocí realtime qpcr a ov ována gelovou elektroforézou. Vypo tená ú innost z edící ady 82 ng 3 ng genomové DNA/reakci je > 80%. qpcr Master Mixy 22 Obr.3 Ampli kace genomové DNA s použitím XLqPCR 2x SYBR Master Mixu. (A) Myší genomová DNA byla ed na trojkovou adou a DNA fragment (864 bp) byl ampli kován pomocí odpovídajících oligonukleotidových primer a XLqPCR 2x SYBR Master Mixu. Ct hodnoty byly získány z ampli ka ních k ivek a vynášeny proti vypo tenému po tu kopií (logq). Hodnota regresního koe cientu (R) a ú innosti (E) je rovn ž uvedena. (B) Po 40 cyklech PCR ampli kace byly vzorky frakcionovány elektroforézou v agarózovém gelu a barveny ethidium bromidem. Jednotlivé vzorky odpovídají následujícím množstvím genomové DNA/zkumavku: 1 = 0.3 ng/ l, 2 = 0.9 ng/ l, 3 = 2.7 ng/ l a 4 = 8.1 ng/ l. Šipka ozna uje pozici ampli kovaného fragmentu DNA (864 bp). P 554 XLqPCR 2x SYBR Master Mix 40 reakcí 790, K P 555 XLqPCR 2x SYBR Master Mix 200 reakcí 2.990, K P 556 XLqPCR 2x SYBR Master Mix 1000 reakcí , K

21 XLqPCR 2x SYBR+DMSO Master Mix OBSAHUJE TAQ DNA POLYMERÁZU, NOVÝ XL PUFR, NUKLEOTIDY, MONOKLONÁLNÍ PROTILÁTKU ANTITAQ, SYBR GREEN I, DMSO, STABILIZÁTORY A NOVÁ ADITIVA Obsahuje nový XL reak ní pufr, který je vhodný pro tém všechny qpcr metody, s vysokou mírou tolerance r zných nárok na koncentraci Mg 2+ a který odstra uje inhibi ní efekt SYBR Green I na ampli kaci delších DNA fragment (až 1 kb); není nutné mít jiné primery než na b žnou PCR s následnou gelovou elektroforézou, obsahuje rovn ž DMSO v koncentraci, která v mnoha p ípadech zvyšuje ú innost PCR, umož uje po všech stránkách optimalizované a standardní provád ní realtime qpcr, obsahuje uorescen ní barvivo SYBR Green I, interkalující mezi báze DNA v optimální koncentraci bez negativního p sobení na ampli kaci DNA, umož uje rychlejší p ípravu reak ní sm si bez nutnosti rozmrazování jednotlivých komponent; sta í dodat primery, DNA a doplnit H 2 O (sou ástí dodávky), obsahuje a nitn puri kovanou monoklonální protilátku speci ckou pro Taq DNA polymerázu, která umož uje tzv. hot start PCR. Tato protilátka blokuje enzymatickou aktivitu Taq DNA polymerázy a tím znemož uje zahájení polymerázové reakce p ed vlastní PCR. P i denaturaci DNA v prvním cyklu PCR dochází k irreverzibilní teplotní inaktivaci protilátky a tím k odblokování enzymatické aktivity Taq DNA polymerázy. Protilátka je inaktivována rychle p i prvním cyklu denaturace DNA b hem PCR (~1 min. p i 94 o C). Pro aktivaci Taq DNA polymerázy není t eba prodlužovat denatura ní krok, tato tzv. hot start PCR je zvlášt vhodná všude tam, kde dochází k nežádoucí ampli kaci nespeci ckých fragment DNA, k nízké ampli kaci DNA fragment, pop ípad k tvorb artefakt vznikajících ampli kací kombinovaných primer, má široké využití p i ampli kaci komplexních genomických nebo cdna templát, nízkých po t templát a p i použití mnoho etných pár primer v téže reak ní sm si. Komponenty balení: 1 zkumavka XLqPCR 2x SYBR+DMSO Master Mixu (na 40 reakcí po 25 l), 1 zkumavka 1,5 ml PCR H 2 O. Složení: dodává se 2x koncentrovaný. Obsahuje nový XL reak ní pufr s 4 mm MgSO 4, 400 M datp, 400 M dctp, 400 M dgtp, 400 M dttp, Taq DNA polymerázu (50 U/ml), monoklonální protilátku antitaq, SYBR Green I, DMSO, stabilizátory a aditiva. Skladování: p i teplot 20 o C. Materiál snáší opakované rozmrazování. Kontrola kvality: každá šarže XLqPCR 2x SYBR+DMSO Master Mixu je testována na amplifikaci genu o jedné kopii v genomové DNA pomocí realtime qpcr a ov ována gelovou elektroforézou. Vypo tená ú innost z edící ady 82 ng 3 ng genomové DNA/reakci je > 80%. P 557 XLqPCR 2x SYBR+DMSO Master Mix 40 reakcí 790, K P 558 XLqPCR 2x SYBR+DMSO Master Mix 200 reakcí 2.990, K P 559 XLqPCR 2x SYBR+DMSO Master Mix 1000 reakcí , K qpcr Master Mixy 23

22 SYTO9 qpcr 2x Master Mix OBSAHUJE TAQ DNA POLYMERÁZU, NOVÝ REAK NÍ PUFR, NUKLEOTIDY, MONOKLONÁLNÍ PROTILÁTKU ANTITAQ, NOVÁ ADITIVA A FLUORESCEN NÍ BARVIVO SYTO9 Obsahuje uorescen ní barvivo 3. generace SYTO9, interkalující mezi báze DNA bez negativních vliv na PCR ampli kaci. Toto barvivo je mimo ádn vhodné pro HRM (highresolution melting) analýzu DNA amplikon. umož uje rychlejší p ípravu reak ní sm si bez nutnosti rozmrazování a pipetování jednotlivých komponent; sta í dodat primery, DNA a doplnit H 2 O (sou ástí dodávky), umož uje optimalizované a standardní provád ní realtime qpcr a následnou HRM analýzu, má široké využití p i ampli kaci komplexních genomických nebo cdna templát, nízkých po t templát a p i použití mnoho etných pár primer v téže reak ní sm si, obsahuje nový reak ní pufr TopBio provenience, který je vhodný pro tém všechny qpcr metody s vysokou mírou tolerance r zných nárok na koncentraci Mg 2+ a umož uje i ampli kaci delších DNA fragment (až 1 kb). Není nutné mít jiné primery než na b žnou PCR, obsahuje monoklonální protilátku, speci ckou pro Taq DNA polymerázu, která umož uje tzv. hotstart PCR. Protilátka se váže na Taq DNA polymerázu a tím ji inaktivuje. Protilátka je rychle inaktivována p i prvním cyklu denaturace DNA b hem PCR (~1 min. p i 94 o C) a tím dochází k aktivaci Taq DNA polymerázy. Pro aktivaci Taq DNA polymerázy není t eba prodlužovat denatura ní krok, pro detekci SYTO9 lze použít stejnou sadu optických ltr jako pro detekci SYBR Green I. Komponenty balení: 1 zkumavka SYTO9 qpcr 2x Master Mixu (na 40 reakcí po 25 l), 1 zkumavka 1,5 ml PCR H 2 O. Složení: SYTO9 PCR 2x Master Mix obsahuje reak ní pufr s 20 mm (NH 4 ) 2 SO 4, 2,5 mm MgCl 2, 400 M datp, 400 M dctp, 400 M dgtp, 400 M dttp, Taq DNA polymerázu (50 U/ml), monoklonální protilátku antitaq, DNA barvivo SYTO9, stabilizátory a aditiva. Skladování: p i teplot 20 o C. Materiál snáší opakované rozmrazování. Kontrola kvality: každá šarže SYTO9 PCR 2x Master Mixu je testována na amplifikaci genu o jedné kopii v genomové DNA pomocí realtime qpcr a ov ována gelovou elektroforézou. Vypo tená ú innost z edící ady 82 ng 3 ng genomové DNA/reakci je > 80%. qpcr Master Mixy P 591 SYTO9 qpcr 2x Master Mix 40 reakcí 790, K P 592 SYTO9 qpcr 2x Master Mix 200 reakcí 2.990, K P 593 SYTO9 qpcr 2x Master Mix 1000 reakcí , K 24