TECHNIKY PCR. PCR - polymerase chain reaction -polymerázová řetězová reakce

Transkript

1 TECHNIKY PCR PCR - polymerase chain reaction -polymerázová řetězová reakce Přehled Molekulárně-biologický úvod, DNA struktura, replikace, DNA polymerasa Princip procesu PCR Optimalizace PCR Typy PCR Aplikace PCR a využití v praxi

2 Komponenty nukleových kyselin Nukleotid DNA deoxyguanosid monofosfát (dgmp) Koncept párování bazí je striktně konzervativní Cytosine Guanine From Dr. John C. Perez, Professor and Director of the Natural Toxins Research Initiative, Texas A&M

3 Deoxyribosa a fosfát dávají DNA řetězci směr 5 end 3 end konce dsdna nejsou stejné T A HO jednotlivé řetězce duplexu jsou k sobě komplementární 3 2 G C DNA rětězce duplexu mohou být denaturována a znovu spojena T A G C OH 3 end 5 end T m (melting temperature) je teplota při kteréje dsdna z poloviny denaturována Tm je závislá na: složení bazí rozpouštědle iontové síle ph délce DNA Singer, M., and P. Berg Genes and Genomes. University Science Books, Mill Valley, CA. p. 49

4 DNA replikace in vivo vyžaduje několik enzymů separace řetězců syntéza krátkých RNA primerů syntéza dvou nových DNA helixů podílí se enzymy: DNA primasa helikasa DNA polymerasa DNA ligasa SSB-proteiny Vlastnosti DNA polymerasy 1. POLYMERASOVÁ AKTIVITA Replikace probíhá vždy ve směru od 5 na 3 konec Nový nukleotid je přidáván tedy vždy na 3 OH konec. 2. 3'-5' exonukleasová aktivita -opravná funkce proofreading 3. 5 exonukleasová aktivita - odštěpuje RNA primer

5 DNA replikace in vitro vyžaduje pouze jeden enzym DNA Polymerasa 1957 Arthur Kornberg dokázal existenci DNA polymerasy - DNA polymerase I in vitro polymerasa vyžaduje pouze: 4 deoxynukleotidy trifosfáty dsdna templát primer - ssdna nebo RNA s volnou 3'-OH Syntéza obou řetězců specifické dsdna in vitro 5 3 TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3 5 Forward primer dntps 5 3 TTGAGAAAGGAATAAGC DNA POL AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3 5

6 Syntéza obou řetězců specifické dsdna in vitro 5 3 TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC DNA POL TCTTTAGCTCATATACG 3 5 dntps Reverse primer 5 3 GCATATACTCGATTTCT 5 3 TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3 5 PCR: Co to je? Polymerase Chain Reaction: znamená amplifikace (mnohonásobná replikace) relativně krátkých úseků specifické DNA Základní nástroj molekulární biologie se vzrůstájícím významem i v dalších oborech (botanika, kriminalistika) The idea Ghobind Khorana 1971 Kary Mullis 1983 Nobelova cena 1993 poprvé provedená mnohonásobná in vitro replikacevezkumavce

7 Jak funguje PCR Řetězová reakce vychází z DNA replikace Spočívá v opakování cyklů denaturace (separace dsdna), navázání primerů a elongace primerů (syntéza nového vlákna DNA) pomocí změn teploty potřeba silného enzymu (polymerasy) který je schopen pracovat při vysokých teplotách termofilní organismy objeveny začátkem 70tých let Jak funguje PCR Polymerasa izolovaná z termofilní baktérie (Thermus aquaticus, Pyrococcus furiosus) zkr. TAQ, PFU Polymerasa až s objevem a použitím TERMOSTABILNÍ POLYMERASY získala PCR na významu

8 PCR komponenty Templátová DNA vzorek k amplifikaci Primery krátké specifické úseky DNA zaručující specifitu amplifikace datp, dttp, dctp, dgtp volné stavební jednotky DNA Thermostabilní DNA polymerasa (e.g., Taq, Pfu) Pufr a soli (KCl, MgCl2) Proces PCR Velký nadbytek primeru, dntps a Taq POL k DNA templátu

9 Problémy: PCR je velmi citlivá na kontaminace Častý problém - nespecifická amplifikace Polymerasa pracuje i při nízkých teplotách (e.g., během nastavování reakce) Hot start PCR je řešení (protilátka proti Taq) Amplifikace je často možná i pro ne zcela známou sekvenci primerů např. DNA jiného biologického druhu Degenerované primery (multiple verze s různými bázemi v klíčové pozici (tryptofan + methionin): stupeň degenerace: prettyfly protein má kód degenerovaný na 11 pozicích tzn. (4)(2)(4)(2)(4)(4)(2)(2)(2)(4)(2) = krát P R E T T Y F L Y CCA CGA GAA ACA ACA TAC TTC CTA TAC G G G G G T T G T C C C C C T T T T T A T Touchdown PCR s vyšší přesností v prvních cyklech Maximální velikost produktu +/-5000 bazí pro standardní PCR: Long PCR kits mohou amplifikovat až 35 kbazí Navrhování primerů Primery by měly být bazí dlouhé Nutná znalost alespoň části sekvence amplifikované DNA 3 konec primeru je důležitý: vhodné aby zde byla G nebo C báze Procentuální zastoupení G + C by mělo být 50-60% - ovlivňuje Tm (teplota kdy se váže primer na templát) Primery v jedné reakci by měli mít srovnatelné Tm Vyvarovat se repetitivním sekvencím Tm = (G+C)x4 + (A+T)x2 Vyvarovat se komplementaritě uvnitř čimeziprimery degenerované primery max. 20 bp ideální do degenerace 250x

10 Navrhování primerů Příklad navržení primerů: Konvence: DNA se vždy zapisuje ve směru od 5 ku 3 konci Cílová sekvence: (priming místo podtrženo): 5 TATAAGCCATAACGATATTGCTGAGTCAAGTCCACATATC ATATGGATGAGAAATGCTTGTGGAGCTGATGTTGATTTGG AGAGACTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC AAACCAGTTAAAGAGTGTGCCAGTAGAG 3 Forward Primer: 5 ATG GAT GAG AAA TGC TTG TG 3 Reverse Primer: 5 ACT GGC ACA CTC TTT AAC TGG 3 Praktické provedení PCR objem v mikrozkumavce: ųl složení: Templátová DNA ng Primery pmols 10mM Tris-CL ph 9.0, 50 mm KCl MgCl mm 50 ųm každého nukleotidu datp, dgtp, dttp, dctp 2 jednotky Taq polymerasy

11 Praktické provedení PCR Počáteční denaturace 94 o C 3-5 min denaturace 94 o C 30 sec annealing ~55 o C 30 sec prodlužování 72 o C 1min/kilobáze počet cyklů x Praktické provedení PCR agarozová elektroforéza

12 Praktické provedení PCR PCR se provádí v termocyklerech kovový blok z ušlechtilého kovu snadné programování vyhřívané víko PCR Optimalizace Složka AnnealingTeplota - Tm Nízká specificita Vysoká specificita MgCl 2 KCl Enzym, Primer ph Formamid nespecificky látky ovlivňující kvalitu PCR: formamid, DMSO, betain atd. Nespecifická amplifikace

13 Základní typy PCR RT PCR (reverse transcriptase PCR) vlastní PCR předchází syntéza cdna z mrna pomocí RT jako primer slouží GSP (gene specific primer) oligo dt random hexamer primer hledání nových genů tvorba cdna knihoven hledání mutací zjišťování síly exprese různých genů RACE PCR (rapid amplification of cdna ends) vychází z RT-PCR používá se k hledání celé sekvence nového genu nutná alespoň částečná znalost sekvence hledaného genu vhodné pro klonování genů a jeho následnou funkční expresi (GMO)

14 inverzní PCR Amplifikace neznámých segmentů DNA asymetrická PCR sekvenace DNA, příprava hybridizačních sond amplifikuje pouze jeden řetězec dsdna SEKVENCOVÁNÍ DNA SEKVENCOVÁNÍ DNA automatické sekvenátory využívající asymetrické PCR jednozkumavková reakce PCR s jedním primerem a dideoxyribonukleotidy (ddatp, ddgtp, ddctp, ddttp) dideoxyribonukleotidy značené 4 fluorescenčními markery velice citlivé elektroforetické rozdělení v kapiláře fluorometr s automatickým vyhodnocením

15 multiplex PCR více amplifikací v jedné zkumavce lékařská diagnostika nested PCR 2 po sobě jdoucí PCR zvyšování specificity PCR LA-PCR (long and accurate) amplifikace dlouhých úseků, polymerasové kokteily např. Taq + Pfu polymerasa (180:1) Pwo polymerasa z Pyroccocus woesei DeepVent polymerasa z Termococcus litoralis (hlubokomořská baktérie) DNA polymeráza 5-3 exonukleázová aktivita 3-5 exonukleázová aktivita délka produktu frekvence chyby Taq + 3 kb 10-4 Pfu + 3 kb 1.3 x 10-6 Pwo + 3 kb 3.3 x 10-6 DeepVent + 12 kb 3.0 x 10-5 long PCR koktejl kb 2.0 x 10-6 PROCESIVITA: jak dlouho se enzym udrží na vlákně STABILITA: kolik minut při denaturační teplotě např Taq 9 min při 97.5 C Pwo 2 hod při 100 C DeepVent 8hod při 100 C

16 in situ RT PCR lokalizace translace a exprese genů real time PCR slouží k přesné kvantifikaci amplifikovaného produktu využití fluorescence interkalačních barviv (etbr) fluorimetr je součástí termocykleru main.cfm##

17 Využití REAL TIME PCR pro detekci jednobodové mutace (lékařská diagnostika) Aplikace PCR a využití v praxi

18 Aplikace PCR a využití v praxi DIAGNOSTIKA V MEDICÍNĚ 1. detekce virových a bakteriálních onemocnění Aplikace PCR a využití v praxi DIAGNOSTIKA V MEDICÍNĚ 2. detekce geneticky vrozených chorob (mutace DNA) - AS PCR alelicky specifická PCR primer navržen tak, že mutace odpovídá konci primeru fragmenty DNA s nespárovanými konci se pohybují v elektrickém poli pomaleji - Real time PCR pomocí fluorescenční sondy odpovídající mutaci Např. detekce cystické fibrózy, choroba je podmíněná třínukleotidovou delecí v genu CFTR cystic fibrosis transmembrane regulator

19 Aplikace PCR a využití v praxi KRIMINALISTIKA VNRT variable number of tandem repeat vyskytují se na různých lokusech chromozomů a v populací kolísají mezi jedinci v počtu opakování mezi 4-40x např. GTGTGTGT Aplikace PCR a využití v praxi ANALÝZA POTRAVIN molekulárně-genetické zhodnocení surovin živočišného a rostlinného původu, které byly vyprodukovány klasickým pěstováním (chovem) nebo s použitím genového inženýrství průkaz falšování potravin druhovou záměnou (rostlinného i živočišného původu) identifikace mikroorganismů kontaminující potraviny nebo geneticky změněných mikroorganismů používaných jako startovací nebo ochranné kultury v produkci potravin. EVOLUČNÍ BIOLOGIE ORNITOLOGIE skot ovce prase koza TEST