Rizika nanomateriálů

Transkript

1 Zuzana Filipová, Jana Kukutschová, Miroslav Mašláň Rizika nanomateriálů Nanotechnologie a nanomateriály v současnosti představují nové, převratné možnosti rozvoje v mnoha oborech lidské činnosti. Očekává se, že tyto nové technologie a materiály přinesou revoluci v medicíně, kde díky své velikosti vykazují nanomateriály schopnost vstupovat do jednotlivých buněk, a tak působit například jako nosiče léčiv nebo kontrastní látky v lékařské diagnostice. Mnoho z procesů a produktů informačních technologií, stejně tak jako počítačový průmysl, se již bez nanotechnologií neobejde. Nanotechnologie začaly být využívány v mnoha spotřebitelských produktech ke zlepšení jejich povrchových vlastností, jako je např. otěruvzdornost, trvanlivost, optické vlastnosti. Tyto materiály slibují velký potenciál v potravinářství, zejména v obalových materiálech. V posledních letech přešla příprava nanomateriálů z laboratoří do průmyslové výroby, čímž významně vzrostlo množství produkovaných nanomateriálů. Bez existujících omezení, legislativy nařizující definovat rizika spojená s expozicí nanomateriálům a doporučení pro bezpečnou manipulaci se však pro zajištění bezpečného rozvoje neobejdeme. Jako každá nová technologie představují nanotechnologie velký přínos, který je však rovněž doprovázen možnými environmentálními a zdravotními riziky. KATEDRA EXPERIMENTÁLNÍ FYZIKY UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky v rámci projektu Vzdělávání výzkumných pracovníků v Regionálním centru pokročilých technologií a materiálů (CZ.1.07/2.3.00/ )

2 Oponenti: doc. RNDr. Kateřina Malachová, CSc. Mgr. Kateřina Poláková, Ph.D. 1. vydání Zuzana Filipová, Jana Kukutschová, Miroslav Mašláň, 2012 Univerzita Palackého v Olomouci, 2012 Neoprávněné užití tohoto díla je porušením autorských práv a může zakládat občanskoprávní, správněprávní, popř. trestněprávní odpovědnost. ISBN

3 Obsah 1. Současný stav v oblasti nanotechnologií Aplikace nanomateriálů a nanotechnologií Bezpečnost nanotechnologií, omezení a stav legislativy Princip předběžné opatrnosti Současný stav legislativy Nanomateriály a jejich specifické vlastnosti Základní terminologie Odlišnosti nanomateriálů od konvenčních chemických látek Rozdělení částic z hlediska toxicity Expozice, příjem a translokace nanomateriálů Expozice Dávka Doba expozice Příjem nanočástic Příjem nanočástic dýchacím systémem Příjem nanočástic kožní cestou Příjem nanočástic perorální cestou Přechod bariér Průnik nanočástic do buňky Translokace částic Biodistribuce nanočástic v organismu z hlediska jejich eliminace Interakce nanomateriálů s biologickými systémy Interakce částic s biomakromolekulami v organismu Fibrilace proteinů v důsledku působení nanomateriálů Vznik korony Imunitní odpověď na vstup nanočástic do organismu Mechanismy toxického účinku nanočástic Oxidativní stres Mechanismy produkce ROS nanočásticemi Antioxidační odpověď organismu Negativní účinky ROS Buněčná odpověď na oxidativní stres Oxidativní stres a nanomateriály Akutní a chronická zánětlivá odezva Genotoxicita nanomateriálů Všeobecné mechanismy genotoxicity Genotoxický potenciál ENM Zdravotní dopady v souvislosti s expozicí nanomateriálům 64 3

4 8. Hodnocení rizik Aspekty nanomateriálů z hlediska jejich potenciálního rizika Identifikace nebezpečí Charakterizace nebezpečí pro živé organismy Hodnocení expozice Charakterizace rizik Použitá literatura 79 4

5 1. Současný stav v oblasti nanotechnologií Nanotechnologie jsou definovány jako aplikace vědeckého poznání vedoucí k syntéze, manipulaci a použití materiálů v rozmezí nm (tj. v nano-měřítku), u nichž se mohou objevovat nové vlastnosti a fenomény vzhledem k tomuto rozměru (Clift a kol. 2010). Jedná se o moderní technologie, které jsou celosvětově rozšířeny a nachází uplatnění téměř ve všech oborech lidské činnosti (Invernizzi 2011). Jsou považovány za přelomové a revoluční jako byly například nástup páry, elektřiny, biotechnologií nebo digitalizace (obr. 1) (Roco a kol. 2010b). Očekává se, že během následujících 15 let budou mít nanotechnologie dopady na celosvětovou ekonomiku, a také dopady sociální a etické. Snaha o rozvoj v nanotechnologiích dosahuje globálních rozměrů a již více než 60 zemí světa má svůj národní nanotechnologický program (Invernizzi 2011).... Obrázek 1: Oblasti vývoje společnosti v rámci průmyslové a informační revoluce (upraveno podle V průběhu posledních let se nanotechnologie rozšiřují z laboratoří do průmyslu a konkrétních aplikací, což se projevuje také ve změně jejich financování, kdy investice od soukromých firem a mezinárodních korporací převyšují veřejné zdroje financování. Očekává se, že v roce 2015 by investice do nanotechnologií na celosvětovém nanotechnologickém trhu měly dosáhnout 2,5 miliardy USD. O tuto částku v podobě investic soutěží zejména USA, EU, Japonsko a nově také Čína (Invernizzi 2011). V posledních letech prochází nanotechnologický výzkum a rozvoj značnou intenzifikací, a to díky podpoře ze stimulačních veřejných programů a soukromých investic. Projevilo se to také strmým nárůstem publikací z oblasti nanotechnologií a v rychlém patentování výsledků (v letech rostly patentové aplikace o 34 % ročně). Mezi nejvíce patentované inovace se řadí nanomateriály a nanoelektronika (Invernizzi 2011). Na základě různých aplikací se rozlišují zatím čtyři generace nanostruktur pasivní, aktivní, nanosystémy a molekulární nanosystémy (obr. 2) (Roco a kol. 2010b). Na trh a do průmyslu byly zatím uvedeny materiálové inovace na základě pasivních nanostruktur (nanopovlaky, nanočástice, nanostrukturované polymery, keramika, kovy apod.), které ve finálních výrobcích zlepšují vlastnosti daného materiálu a jejich specifické chování je v čase stabilní. Druhou generaci představují aktivní nanostruktury (cílená léčiva, umělý sval, komponenty v nanoelektronice apod.), jejichž struktura, stav, nebo vlastnosti se mohou měnit buď reversibilně nebo ireversibilně během jejich použití (Roco a kol. 2010b, Chen a Roco 2009, 5

6 IRGC 2007). Očekává se, že aktivní nanostruktury, na rozdíl od pasivních, přinesou hlavní objevy až v budoucnosti (Invernizzi 2011).... Obrázek 2: Časový přehled počátku průmyslového prototypingu a komercializace nanotechnologií čtyři generace produktů a produkčních procesů (převzato z Roco a kol. 2010b). V nanotechnologickém výzkumu, výrobě nebo aplikacích je zapojeno stále více soukromých společností. Do roku 2010 bylo evidováno (Nanowerk 2010a) 2146 společností ze 48 zemí (tento počet může však být ve skutečnosti mnohem vyšší). Mezi nejvíce zastoupené obory se řadí nanomateriály, nanobiotechnologie a nanoelektronika. Zvýšení podílu soukromého sektoru mělo za následek růst celosvětového trhu s nanotechnologiemi. Během roku 2009 bylo dosaženo několika mezníků týkajících se komercializace v nanotechnologiích. Celosvětový trh s finálními produkty vyrobenými s pomocí nanotechnologií dosáhl okolo 224 miliard USD v porovnání s rokem 2007 (135 miliard USD). Nanotechnologický intermediální trh zahrnující nezbytné produkty, jež jsou součástí finálních výrobků, dosahoval ve stejném roce 29 miliard USD. Největší podíl z těchto produktů zaujímaly různé materiály a výrobní průmyslový sektor (téměř 55 %), včetně produktů jako jsou automobily, vybavení pro průmysl, stavebnictví a konstrukční materiály. V těchto výrobcích byly obsaženy nanomateriály v podobě kompozitů, povlaků a elektronických komponentů. Elektronika a informační technologie zahrnovaly 32 % trhu včetně výrobků, jako jsou mobilní zařízení a antimikrobiální povlaky použité v elektronických zařízeních. Dalších 12 % produktů bylo ze skupiny zdravotní péče a sektoru přírodních věd - primárně se jednalo o nosiče léčiv. Okolo 1 % zaujímaly produkty z energetického a environmentálního sektoru včetně nanofiltračních membrán nebo akumulátorů (PCAST 2010). Vzrostl také počet spotřebitelských produktů, které jsou uvedeny v různých seznamech: Project of Emerging Nanotechnologies (PEN 2010) zahrnuje přes produktů z 28 zemí světa, které vstoupily na celosvětový trh do roku v Další produkty přicházejí rapidní rychlostí a předpokládá se, že v roce

7 jich bude cca 3 400, pokud bude tento trend pokračovat (v roce 2005, kdy seznam vznikl, jich bylo 54). European Voice in Standardization a European Consumers Organization ANEC vytvořily v roce 2010 dokument e 2010 NanoInventory, který ukázal, že počet produktů v seznamu od roku 2009 do roku 2010 se ztrojnásobil, ze 151 na 475 (Euroactiv 2010). German Profesional Association of Construction Industry BEUC (BGBAU 2010) vydala neúplný seznam 63 materiálů a výrobků obsahujících nanočástice zahrnující samočisticí pokryvy pro fasády, antireflexní povlaky na skla, produkty zlepšující vlastnosti dřeva (ochrana proti UV záření), cement a beton s nanočásticemi za účelem zajištění jejich rezistence vůči korozi. Současný celosvětový trh s nanoprodukty vedou USA, následovány Čínou, Japonskem a Německem. Očekává se, že během příštích 5 10 let bude v této oblasti dominovat Čína (Inverzinni 2011). Během posledních let došlo také k rapidnímu nárůstu v produkční kapacitě klíčových nanomateriálů v měřítku pod 100 nm, což je signálem, že průmysl získal přesnou kontrolu nad procesy jejich přípravy. Trend nárůstu v produkci je dobře patrný u uhlíkatých nanotrubic (CNTs) (obr. 3), které představují klíčový nanomateriál pro aplikace v mnoha odvětvích jako je elektronika, plasty, textil, biomedicína apod.... Obrázek 3: Struktura uhlíkových nanotrubic: a) fragment modelu jednostěnné uhlíkové nanotrubice, b) mnohostěnná uhlíková nanotrubice, c) jednostěnná uhlíková nanotrubice (upraveno dle Hafner a kol. 2001). Ještě před několika lety bylo velmi složité tyto nanomateriály vyrábět a byly dostupné pouze ve velmi malých množstvích. Od roku 2004 existovalo asi 65 společností, které byly schopny zajistit výrobu v množství přibližně 65 tun za rok, od roku 2007 vzrostla celosvětová produkce mnohostěnných uhlíkatých nanotrubic 7

8 na 300 tun za rok (jednostěnných na 7 tun za rok). S nárůstem produkce se následně změnila také finanční dostupnost těchto nanomateriálů. Před několika lety byly nanotrubice prodávány za USD/gram. Dnes jsou jednostěnné nanotrubice dostupné za 95 až 200 USD za gram a mnohostěnné nanotrubice za 5 až 15 USD za gram. Ostatní nanomateriály budou pravděpodobně následovat podobný trend (Inverzinni 2011). Nanomateriálová databáze Nanowerku v současné době podává zprávu o různých typech nanočástic, které jsou dnes používány a produkovány 161 výrobci (Nanowerk 2010b) Aplikace nanomateriálů a nanotechnologií Význam nanomateriálů a nanotechnologií prudce vzrůstá vzhledem k širokému aplikačnímu potenciálu a použití v různých průmyslových odvětvích, konzumních produktech a zdravotní péči. V současné době dochází k extenzivnímu průniku nanotechnologií do několika rozhodujících průmyslových odvětví: katalyzátory z nanostrukturovaných materiálů, chemický průmysl a polovodičové struktury s rozměry pod 100 nm (Inverzinni 2011). Dalším prudce rostoucím odvětvím je molekulární medicína (Roco a kol. 2010a). Očekává se, že právě v biomedicíně přinesou nanotechnologie doslova revoluci, neboť jejich produkty mají schopnost průniku k cílovým orgánům a tkáním s jejich následným ovlivněním. Některé nanomateriály jsou natolik malé, že mohou snadno pronikat dokonce do jednotlivých buněk, kde mohou fungovat jako nosiče léčiv nebo jako nosiče kontrastních látek pro zobrazování tkání nebo diagnostiku některých onemocnění (Simkó a Mattsson 2010), dále v regenerativní medicíně (hojení ran, tkáňové inženýrství) (Verma a kol. 2010) a nanobiofarmaceutice (Bosselmann a Williams 2012). Významný rozvoj nanotechnologických aplikací je také předpovídán v potravinářství, zejména ve vývoji nových obalových materiálů, aditiv, stabilizátorů či přípravě nových potravin (obr. 4) a dále při vývoji nanofiltrů pro filtraci pitné a podzemní vody (Duncan a kol. 2011, Kvasničková 2008).... Obrázek 4: Přehled aplikací nanotechnologií v potravinářství (převzato z Kvasničková 2008). 8

9 Nanotechnologie se dále uplatňují ve velmi citlivých nanosenzorech, ve fotonice, plazmonice, textilním průmyslu, automobilovém průmyslu (např. superhydrofobní vrstvy na čelních sklech, aditiva do pohonných hmot, antikorozní nátěry), při nanoremediacích (odstraňování a čištění rozsáhlých kontaminovaných oblastí) a dalších (Roco a kol 2010a). Přepokládá se, že od roku 2020 budou produkty nanotechnologií využívány téměř ve všech průmyslových sektorech a oblastech medicíny, v informačních technologiích a ochraně přírody. Nové aplikace umožní vývoj fotovoltaických zařízení s dlouhou životností či vysoce výkonných akumulátorů, které zajistí konkurenceschopnost elektromobilů, umožní vývoj nových IT systémů, potravinových a zemědělských systémů, nanosystémů, zajistí nový radikální přístup v diagnostice a léčbě rakoviny a přinesou pokrok v syntetické biologii (Roco a kol. 2010a). Posledně zmíněný obor byl popsán jako konvergence molekulární biologie, informačních technologií a nanotechnologie vedoucí k systematickému vytváření biologických systémů. Na základě některých odhadů bude již v roce 2015 pravděpodobně až pětina chemického průmyslu USA závislá na syntetické biologii ( Kolem roku 2015 by měly nanotechnologické aplikace zajistit v USA konkurenceschopnost nákladů na konverzi sluneční energie a mezi roky se v USA očekává obdobný trend i v případě odsolování mořské vody. Předpokládá se, že nanotechnologie přinesou zásadní řešení ve více než 50 % nových projektů zaměřených na problematiku zdrojů energie a vody (Roco a kol. 2010a). Z výše uvedeného výčtu aplikací je patrné, že syntetické nanomateriály se v čím dál větší míře stávají součástí každodenního života, čímž se zvyšuje rovněž pravděpodobnost jejich většího výskytu ve všech složkách životního prostředí. Tyto materiály mohou představovat možná environmentální a zdravotní rizika, která doposud nejsou zcela objasněna a vyžadují další detailní výzkum. Pro další rozvoj v oblasti nanotechnologií je také nezbytné přesně definovat bezpečnostní aspekty manipulace s nanomateriály pro minimalizaci možných rizik spojených s pracovní expozicí, ale také expozicí ostatních organismů v životním prostředí. 9

10 2. Bezpečnost nanotechnologií, omezení a stav legislativy Nanotechnologie jako každá nová technologie představují určitá rizika, která podle některých odborníků mohou být velká a nepředvídatelná (Hunt a Riediker 2011). Jedná se o rizika spojená s poškozením lidského zdraví (toxicita, teratogenita, aj.) nebo o rizika pro životní prostředí (ekotoxicita, ovlivnění biogeochemických cyklů a další). Je však nutné zmínit, že nanomateriály byly na Zemi přítomny odnepaměti jako důsledek některých přírodních procesů (vulkanická činnost a lesní požáry), nebo v posledních staletích vlivem antropogenních činností (spalování fosilních paliv, pyrometalurgie, doprava, svařování, kouření a další aktivity využívající vysokoteplotních procesů). V současné době mimořádně rychle roste použití cíleně připravených nanomateriálů v nejrůznějších oborech, a tím může vzrůstat jednak profesionální expozice osob při výrobních procesech používajících/produkujících nanomateriály nebo docházet k nekontrolovatelnému úniku nanomateriálů do životního prostředí a k expozici běžné populace. Pro nanomateriály doposud platí bezpečnostní standardy jako pro klasické chemické látky, které vykazují mnohdy nižší nebezpečnost pro zdraví a životní prostředí, už vlivem velikosti částic v jakých se nacházejí a s tím související odlišnou reaktivitou. Bezpečnostní standardy neberou v potaz specifické vlastnosti a chování nanomateriálů ani skutečnost, že na rozdíl od větších částic mohou nanočástice pronikat do řady orgánů, tkání, ale i buněk a vytvářet tam nežádoucí toxické účinky jako např. cytotoxicita, genotoxicita, imunotoxicita, nefrotoxicita, hepatotoxicita, karcinogenita a další (Topinka 2011). Téma bezpečnosti a potenciálních rizik nanomateriálů a nanotechnologií je v posledních letech velmi aktuální a široce diskutované na národních i mezinárodních úrovních (vládní orgány, akademická obec, průmyslový sektor), zejména mezi odborníky, kteří pracují v oblasti bezpečnosti, veřejného a environmentálního zdraví a nanotoxikologie. Vznikla četná konsorcia, sítě, probíhá mnoho workshopů a konferencí, a rovněž je řešena řada projektů v rámci této problematiky. U žádné nové technologie nebyl v historii tak krátký časový prostor mezi její aplikací a koordinovanou snahou o zhodnocení rizik, zahrnující expoziční testy a rozvoj metrologie, dozimetrie a také prerekvizit pro hodnocení rizik (Hunt a Riediker 2011). Z tohoto důvodu doposud nejsou dostupné informace o dlouhodobých účincích vyvolaných expozicí nanomateriálům a tyto účinky jsou v této fázi spíše na úrovni predikcí. Přehledné informace o aktuálních projektech i řešené problematice v rámci Evropské unie a projektech spolupráce mezi EU a USA jsou uvedeny v (Riedeker a Katalagarianakis 2012), další užitečné odkazy jsou na přehled v češtině na kategorie/nanotechnologie.aspx Princip předběžné opatrnosti I přes všechny výše uvedené snahy a iniciativy zatím neexistuje platná legislativa ani doporučení týkající se bezpečnosti v oblasti nanotechnologií a manipulace s nanomateriály. Po dřívějších zkušenostech s chemickými látkami jako např. 10

11 DDT, PCB nebo dioxiny se světová veřejnost snaží apelovat na výzkumná centra i výrobce, aby v případě nanomateriálů a nanotechnologií zachovávali princip předběžné opatrnosti, který vyzývá k tomu, aby byla očekávána možná škoda vždy a byla provedena všechna dostupná opatření pro snížení potenciálních rizik. Tam, kde existuje vědecký doklad nebo odůvodněný předpoklad o možném ohrožení lidského zdraví, by měla být přijata ochranná opatření, přestože neexistuje úplná vědecká jistota o tom, že může k nežádoucím důsledkům docházet. Tento princip je potřeba vnímat jako přechodné opatření pouze po dobu, dokud nebudou získány všechny klíčové poznatky, které umožní přijmout ekonomicky, technicky i společensky nejlepší opatření pro zajištění bezpečnosti a ochrany zdraví (potenciálně) exponovaných osob (Groso a kol. 2010, Rupová a Skřehot 2011). Bezpečnosti a rizikům nanotechnologií a nanomateriálů se celosvětově věnuje řada organizací jako je US-EPA (Environmental Protection Agency of the United States of America), OECD (Organisation for Economic Co-operation and Development), FSA (Food Standard Agency), FDA (US Food and Drug Administration), SCENIHR (Scientific Committee on Emerging and Newly Identified Health Risks), EFSA (European Food Safety Authority) aj. Tyto organizace vydávají doporučení a návrhy dokumentů týkající se posuzování bezpečnosti nanomateriálů, např. Nanotechnology White Paper zveřejněný US-EPA, ve kterém jsou specifikovány možné účinky vybraných nanomateriálů ve vztahu ke zdravotním a environmentálním rizikům, a rovněž doporučení pro zodpovědný rozvoj v oblasti nanotechnologií ( pdf) Současný stav legislativy V brzké době by měla vstoupit v platnost první omezení a regulace vztahující se přímo na nanomateriály a jejich použití. Klíčovým problémem je stále chybějící přesná definice nanomateriálů promítnutá do platné legislativy, z čehož vyplývá skutečnost, kdy pro tyto materiály nemůže platit jiná legislativa než ta, která platí pro chemické látky v bulk formě. V rámci Evropské unie platí pro nanomateriály zejména tzv. REACH (Registration, Evaluation, Authorization, and Restriction of Chemicals) (EC1907/2006, EC Reach and Nanomaterials) a CPL (Classification, Labelling and Packing of Substance and Mixtures) (EC 1907/2006). Pracovní skupiny jak při Evropské komisi, tak při OECD připravují správnou definici nanomateriálů a na základě této definice pak i metodiku pro jejich klasifikaci. Doposud není podchycena produkce nanomateriálů a rovněž neplatí žádná omezení či zákazy. Jestliže není nanomateriál jednoznačně definován, nelze odpovědět přesně na otázku, co spadá mezi nanomateriály. To samé platí pro výrobky obsahující další produkty nanotechnologií. Jedním z důvodů, proč je tak složité nalézt společnou definici pro nanomateriály i pro společné bezpečnostní standardy, je skutečnost, že se jedná z hlediska chemických a fyzikálních vlastností o nesmírně rozmanité materiály (na bázi uhlíku, elementárních kovů, jejich oxidů a dalších sloučenin), jejichž možné nežádoucí účinky závisejí na řadě parametrů (Topinka 2011). Nyní je nanomateriál definován jako materiál, který má jeden nebo více externích rozměrů v rozmezí příbližně nm (tj. v nanoměřítku), nebo 11

12 který je nanostrukturován (ISO/TS 27687:2008, Clift a kol. 2010). Jako nanoměřítko (angl. nano-scale ) je definováno velikostní rozmezí přibližně od 1 do 100 nm. Tato definice striktně vymezuje nanomateriály jedním parametrem, a to jejich velikostí. Již v minulosti se ukázalo, že striktní definice s ohledem na bezpečnost mohou přinášet problémy. Ukázalo se to v případě jílového minerálu vermikulitu, který byl těžený v oblasti Libby a obsahoval vysoce nebezpečná azbestiformní vlákna. Tento materiál však nespadal do oficiální definice azbestu, a tudíž se na něj po mnoho let nevztahovala jakákoli omezení. Aby se tedy neopakovala stejná chyba v případě nanomateriálů, měly by tvůrci regulačních opatření pracovat se seznamem devíti až deseti atributů, včetně velikosti a povrchu, a určit hraniční hodnoty, kdy daný nanomateriál vykazuje určité specifické chování, které může souviset s jeho potenciálním toxickým působením (Maynard 2011). Otázkou stále zůstává, do jaké míry se musí sledované parametry materiálu změnit, aby jej bylo potřeba podřídit dodatečným směrnicím. Jedná se o 1 % změny průměru velikosti částic materiálu, dříve považovaného za bezpečný, nebo je to 50 % změny? Na zodpovězení této otázky bude potřeba dalších studií, ale již dnes je k dispozici dostatek vědomostí k tomu, aby odborné komise začaly určovat rizikové atributy pro dané nanomateriály (Mayard 2011). V roce 2011 bylo v EU přijato doporučení týkající se nové definice nanomateriálů, ve kterém jsou zahrnuta i jejich potenciální rizika a nebezpečnost. Podle nově navržené definice (2011/696/EU) je nanomateriál přírodním materiálem, materiálem vzniklým jako vedlejší produkt nebo cíleně vyrobeným materiálem obsahujícím částice. Tyto částice jsou ve formě izolovaných částic nebo jejich agregátů/aglomerátů a 50 % nebo více částic materiálu má jeden nebo více vnějších rozměrů ve velikostním rozmezí nm. Definice zahrnuje také fullereny, grafenové vločky a jednostěnné uhlíkové nanotrubice, které často existují v rozměrech pod 1 nm minimálně v 1D. Vývoj regulací pro nanomateriály je přehledně shrnut v publikaci autorů (Duvall a Wyatt 2011), aktuální informace lze rovněž nalézt na webových stránkách a také na 12

13 3. Nanomateriály a jejich specifické vlastnosti 3.1. Základní terminologie Je všebecně přijímáno, že nanomateriál je materiálem, který má nejméně jeden rozměr mezi 1 až 100 nm (ISO/TS 27687:2010). V současné době je v rámci EU navržena širší definice pro nanomateriály (2011/696/EU ), která zahrnuje i jejich potenciální rizika. Prefix nano znamená rozměr v jednotkách 10-⁹ nm. Jednotka, která byla určena k měření daného velikostního rozmezí, se nazývá nanometr (Clif a kol. 2010). Anglickým termínem engineered nanomaterial ENM je označován materiál, který byl vyprodukován buď záměrně, nebo neúmyslně (vzhledem k jistému produkčnímu procesu). Skládá se ze strukturních a funkčních částí, které jsou umístěny uvnitř nebo na povrchu daného materiálu. Různé množství těchto částic může nabývat jeden nebo více rozměrů v rozsahu 100 nm a méně (EFSA 2011). Termínem mikroskopické nebo makroskopické formy jsou v tomto textu dle (EFSA 2011) označovány materiály, které mají rozměry mimo velikostní interval nm. Někdy je používán také anglický termín (EFSA 2011) non-nanoform, který se vztahuje k materiálu, jenž může představovat iontovou nebo molekulární formu (může být např. menší než nanoforma materiál v rozmezí nm) nebo pro kompaktní formu (např. větších rozměrů než je nanoforma). Tato kompaktní forma pak může zahrnovat i agregované nanomateriály, stejně tak chemické látky v mikro nebo makroformě (EFSA 2011). Aglomerát je skupina slabě vázaných částic nebo agregátů nebo směsi obou, kde je výsledný externí povrch podobný součtu ploch povrchů individuálních komponent. Síly, které drží tyto částice pohromadě, jsou např. van der Waalsovy síly nebo elektrostatické síly. Aglomeráty se rovněž označují jako sekundární částice a jejich původní zdroj jako primární částice (Clift a kol. 2010). Agregát je skupina pevně vázaných nebo sloučených částic nebo směsi obou, kde je výsledný externí povrch podobný součtu ploch povrchů individuálních komponent. Síly držící pohromadě částice agregátů jsou silné síly jako např. kovalentní vazby nebo kovová vazba. Agregáty se označují také jako sekundární částice a jejich původní zdroj jako primární částice (Clift a kol. 2010). Nanomateriály se, podle počtu rozměrů, v nichž nabývají hodnot pod 100 nm, mohou vyskytovat ve formě nanočástic, nanovláken a nanofilmů. Typem nanomateriálu, který má v současnosti nejširší aplikační využití a s tím plynoucí vyšší pravědopobnost expozice živých organismů, jsou nanočástice. Z tohoto důvodu bude v dalších kapitolách věnována pozornost převážně nanočásticím Odlišnosti nanomateriálů od konvenčních chemických látek Obecně se předpokládá, že právě významně odlišné a specifické fyzikálněchemické vlastnosti nanomateriálů spolu s jejich chemickým složením jsou zodpovědné za jejich samotný toxický účinek a toxikokinetiku (jejich absorpci, distribuci, biotransformaci a eliminaci v organismu), a také ovlivňují jejich osud a transformaci v životním prostředí. Zatím není zcela jasné, které charakteristiky 13

14 jsou přesně spojeny s nebezpečným potenciálem různých nanomateriálů. Tato skutečnost přináší určitou nejistotu, jaké parametry je třeba stanovovat studiemi zaměřenými na posuzování rizik spojených s expozicí nanomateriálům. Navíc pro různé typy nanomateriálů mohou být stěžejní jiné charakteristiky a např. ENM stejného chemického složení mohou vykazovat rozdílnou toxicitu v závislosti například na odlišné velikosti částic, povrchové modifikaci aj. Na dané problematice, týkající se vytyčení hlavních charakteristik, se v současnosti usilovně pracuje a postupně by měly být k dispozici určité testovací a srovnávací programy, zahrnující rovněž standardní testovací procedury (Abbott and Maynard 2010, EFSA 2011). Jisté je, že převod látek o mikro nebo makro rozměrech do velikostní formy nano může vést ke změně fyzikálně-chemických vlastností (optických, magnetických, elektrických, mechanických). Nejvýznamnější je změna fyzikálně-chemických vlastností při poklesu rozměru nanomateriálu pod 100 nm (podobné vlastnosti mohou však vykazovat i materiály, které dosahují rozměrů vyšších, tj nm). Dochází rovněž ke změně toxicity a toxikologického profilu oproti objemovému protějšku dané chemické látky (EFSA 2011). Pod pojmem toxikologický profil ENM se rozumí toxické působení nebo charakter toxických vlastností daného materiálu na základě jeho různých expozičních dob spojených s různými drahami vstupu do organismu a následnými zdravotními dopady ( definition/toxicity-profile.html). Z hlediska hlavních fyzikálně-chemických odlišností nanomateriálů od konvenčních chemických látek se jedná převážně o velikost částic a jejich povrch. S klesající velikostí částic nepřímo úměrně roste plocha jejich povrchu. Na příkladu kapiček vody lze v tabulce 1 demonstrovat změny v celkovém povrchu částic a změně Gibbsovy volné energie povrchu částic vody v závislosti na jejich velikosti. Je patrné, že pokles velikosti částic je spojen s nárůstem celkového povrchu a zvýšením volné Gibbsovy energie, která odráží reaktivitu daných částic. Gibbsova energie výrazně roste s klesající velikostí částic, což se projevuje výrazně vyšší chemickou reaktivitou menších částic (Zhao a Nalwa 2007). Poloměr Počet částic Celkový povrch Změna Gibbsovy volné [m²] energie povrchu 1 nm 10²¹ 12,57 10³ 9,16 10² 1 µm 10¹² 12,57 10⁰ 9,16 10-¹ 1 mm 10³ 12,57 10-³ 9,16 10-⁴. Tabulka 1: Změny v hlavních parametrech částic vody v závislosti na jejich velikosti (Zhao a Nalwa 2007). Reaktivita částic je v korelaci s počtem atomů/molekul na jejich povrchu. Obrázek 5 znázorňuje vztah mezi velikostí částic a počtem molekul na jejich povrchu. Vlastnosti povrchové vrstvy atomů v případě nanomateriálu, ve srovnání s materiály o větší velikosti částic, začínají postupně dominovat nad vlastnostmi objemu, což má za následek také odlišné chování daného materiálu ve vztahu k možným interakcím s živými organismy. 14

15 ... Obrázek 5: Zastoupení povrchových molekul/atomů v závislosti na velikosti částice (upraveno podle Öberdorster a kol. 2005). Dalšími významnými vlastnostmi povrchu, které mají vliv na chování částic a jejich výslednou toxicitu, je povrchový náboj, chemické složení povrchu, tvar povrchu, defekty na povrchu, porozita apod. Nanočástice mohou také obsahovat zbytky reziduí z chemických procesů syntézy, z použitých stabilizátorů, dispersních činidel, enkapsulovaného materiálu a různých úprav povrchu. Velmi důležitou vlastností částic a nanomateriálů je také jejich morfologie a fyzikální forma (zda jsou amorfní nebo krystalické), popř. zda tvoří agregáty nebo aglomeráty a jaký mají tvar (částice, trubice apod.). Z výše uvedeného textu je patrná významná odlišnost nanomateriálů od konvenčních chemických látek, což je dáno mnoha již uvedenými parametry, které se podílejí na odlišném chování nanomateriálů, včetně toxického charakteru. Z toho vyplývá nutnost zahrnout tyto parametry do toxikologických studií nanomateriálů pro potřebu interpretace základní závislosti v nanotoxikologii, tj. vztah mezi dávkou a účinkem. V tabulce 2 jsou uvedeny parametry nezbytné pro detailnější charakterizaci nanomateriálu hodnoceného v toxikologické studii ve srovnání s toxikologickým hodnocením konvenčních chemických látek (Zhao a Nalwa 2007). Klasická toxikologie Nanotoxikologie Klíčové parametry 1. Hmotnost / koncentrace 1. Hmotnost / koncentrace 2. Velikost 3. Struktura 4. Specifický povrch 5. Povrchové modifikace 6. Povrchový náboj. Tabulka 2: Stěžejní parametry pro vyjádření dávky v klasické toxikologii a nanotoxikologii (podle Zhao a Nalwa 2007). Je tedy patrné, že při hodnocení dávky nanomateriálů nelze již vycházet z klasického hmotnostního pojetí, tj. koncentračním vyjádřením (např. mg dm-³). Kromě uvedených parametrů nanomateriálů, které mohou ovlivnit výsledek dané toxikologické studie, je nutno brát v potaz také skutečnost, že testovaný materiál vlivem své zvýšené reaktivity může před samotnou aplikací v testu projít nejen fyzikálními (např. tvorba agregátů, aglomerátů, aj.), ale také chemickými změnami (např. povrchová oxidace). Tím může být testován toxický charakter již změněného materiálu a v případě zanedbání těchto změn může dojít k nesprávné interpretaci výsledků studie. V toxikologických modelech je tedy nutné brát v potaz synergické 15

16 účinky parametrů jako je dávka, tzv. nanocharakteristika (např. velikost částic, jejich povrch), expoziční dráhy, druh exponovaného organismu a další Rozdělení částic z hlediska toxicity Z hlediska toxicity se částice rozdělují na primární (cíleně syntetizované ENM) a sekundární (vznikající jako nechtěný produkt v nejrůznějších spalovacích, fyzikálních nebo chemických procesech). Sekundární částice mohou být produkovány během degradace materiálu, která nastává v některém mechanickém nebo termálním procesu, ale také interakcí primárních částic s jinými komponenty. Mezi sekundární částice patří produkty dieslových motorů, tabákový kouř a jiné. Primární částice (cíleně syntetizované) mohou vykazovat oproti nanočásticím náhodně vytvořených v prostředí homogenní tvar a rozměr. Expozice ENM může mít za následek vyšší dávky materiálu s biologicky specifickými charakteristikami (velká plocha povrchu, reaktivita apod.), dokonce i když dávka posuzovaná z hlediska množství materiálu (hmotnosti) je relativně nízká. Tato skutečnost je více patrná zejména u ENM než u přirozeně se vyskytujících nanomateriálů, vzhledem k tomu, že jejich tvar a velikost jsou řízeně kontrolovány (Abbott and Mayard 2010). Na transport a osud nanočástic v prostředí mohou mít vliv rovněž kvantové jevy a heterogenita nanomateriálu. Je třeba zdůraznit, že i přes specifické vlastnosti nanomateriálů a s nimi spojená rizika, je možné vhodnou úpravou a způsobem přípravy ENM a jejich začleněním do produktů pravděpodobnost expozice výrazně omezit. Primární i sekundární částice mohou být v prostředí transformovány do jiných fyzikálních nebo chemických forem, což s sebou přináší změnu distribuce a toxicity částic v prostředí. Příkladem takové transformace nanočástic je jejich agregace nebo aglomerace. Agregáty a aglomeráty primárních i sekundárních částic mohou být nanostrukturovány (tvořeny nanočásticemi) a dosahovat rozměrů v nanometrech anebo rozměrů několika málo mikrometrů. V každém případě jejich struktura v nanorozměrech nese nové povrchové vlastnosti (Baenza-Squiban a Lanone 2011), což může mít za následek i nové vlastnosti z hlediska toxicity těchto materiálů. Aglomeráty i agregáty po změně podmínek v prostředí (při přechodu do nového prostředí) se mohou rozpadat a znovu vznikat, což sebou přináší opět potenciální změnu v chování nanočástic a tím i případnou změnu toxicity. Aglomerace nebo agregace nanočástic ovlivňuje nejen jejich distribuci a toxicitu, ale také jejich transport a osud v životním prostředí i v lidském těle. Nanočástice, které tvoří agregáty, mohou současně vykazovat chování typické pro nanočástice i mikročástice, jako např. některé nanoprášky. Aglomerace a agregace nanomateriálů také ovlivňuje, zdali a v jak velkém rozsahu jsou organismy v životním prostředí exponovány nanomateriálům (Abbott and Mayard 2010). Na základě výše uvedených odlišností nanomateriálů od konvenčních látek je evidentní, že nanomateriály představují zcela unikátní materiály nejen z hlediska jejich pozitivních vlastností. Zcela nové vlastnosti, které tyto materiály přinášejí, přináší i zcela nové chování materiálů v životním prostředí, interakce s živými organismy a možné toxické účinky. 16

17 4. Expozice, příjem a translokace nanomateriálů Vzhledem k možným únikům nanomateriálů při výrobě nebo při kontaktu spotřebitele s produkty obsahujícími nanomateriály, během jejich životního cyklu, lze očekávat možný přímý kontakt těchto materiálů s lidským organismem, ale také s organismy ostatních živočichů a rostlin. Široké použití nanomateriálů může vést jednak k neočekávané expozici těmto materiálům (skrz inhalační, dermální, střevní či oční cestu) nebo také očekávané expozici ENM (použití v léčivech pronikajících do cílových orgánů a tkání). Významné parametry, které rozhodují o nebezpečnosti a možných důsledcích tohoto kontaktu, zahrnují způsob, jakým k tomuto kontaktu dojde (tj. druh expozice), míru příjmu daného materiálu, translokaci k cílovým místům v rámci organismu a exkreci nanomateriálu z organismu Expozice Expozice je situace charakterizovaná objektivními parametry, při které je živý organismus vystaven působení chemické látky, fyzikálnímu faktoru či biologickému agens (Rupová a Skřehot 2011). Jiným termínem lze expozici označit jako proces, kdy látka překoná vnější bariéru organismu a pronikne do něj, pak může dojít k případné intoxikaci (Patočka 2005). Při posuzování expozice je třeba uvažovat následující faktory (Baenza-Squiban a Lanone 2011): složka prostředí, ve které se částice nacházejí (tzv. expoziční média - voda, půda, vzduch, biomasa), tvar nanočástic (primárních nebo sekundárních), expoziční kontext (pracovníci, uživatelé nebo spotřebitelé), dávka nanočástic, které je organismus potenciálně vystaven, doba expozice, tedy jak dlouhou dobu je daný organismus vystaven působení určité dávky výše jmenovaného faktoru. Tyto výše uvedené faktory mohou rozhodovat o tom, zda daný nanomateriál pronikne do organismu, kam bude transportován a jaký bude mít vliv na životní pochody exponovaného jedince. Zdroje emitující nanomateriály do prostředí V současné době se mohou do prostředí uvolňovat nanomateriály, které jsou buď produkovány cíleně pro konkrétní aplikaci, nebo vznikají jako vedlejší produkty při nejrůznějších přírodních nebo antropogenních procesech, které jsou většinou spojeny s přítomností vysokých teplot. Přehledné schéma rozsahů velikostí částic emitovaných z některých přírodních a antropogenních zdrojů do prostředí je uvedno na obrázku 6. Z obrázku 6 je patrné, že uvedené zdroje lze rozdělit do dvou skupin. Jedna skupina zdrojů emituje částice o minimálních velikostech do 1 mikrometru v průměru 17

18 ... Obrázek 6: Rozsahy velikostí nanočástic z přírodních (zeleně) a antropogenních zdrojů (červeně) (upraveno podle Klouda 2010). (větrem resuspendované prachové částice, pylová zrna, prachové částice suspendované v ovzduší po vysávání, částice ze stavební činnosti, důlní prach a většina bakteriálních buněk). Druhou skupinou jsou ostatní uvedené zdroje, které emitují do prostředí částice submikronových velikostí. Je známo, že gravitační působení na tyto velikostní frakce částic je zanedbatelné, a tudíž tyto částice, poté co jsou emitovány z daného zdroje, setrvávají suspendovány v ovzduší po relativně dlouhou dobu (Kondratyev a kol. 2006). S tím souvisí také transport těchto částic na větší vzdálenosti od zdroje a rovněž větší riziko inhalační expozice. Významným zdrojem emisí nanočástic, ale také mikročástic v městských aglomeracích, je v současné době automobilová doprava. Dieslové motory emitují do ovzduší elementární uhlík ve formě sazí o velikostech okolo 50 nm (Kittelson 1998). Bylo rovněž prokázáno, že při brzdění automobilů vznikají nanočástice o velikostech od 20 nm, u nichž jsou dominantními složkami saze a oxidy železa (Kukutschová a kol. 2011). Vzhledem ke skutečnosti, že se v obou případech jedná o mobilní zdroje znečištění, je jejich kontrola mnohem obtížnější, než je to u stacionárních zdrojů (např. průmysloví znečišťovatelé). Z tohoto důvodu je v případě emisí z dopravy jediným řešením zodpovědný vývoj technologií a materiálů, které budou snižovat tyto emise nanometrových částic. Tyto částice mohou představovat významné riziko pro zdraví běžné populace. Při měření v okolí rušných cest byla stanovena koncentrace nanočástic v koncentracích řádově milionů částic na kubický centimetr. Experimentální pozorování, prováděná v různých městských oblastech s rušnou dopravou, vedou k identickému závěru, že kardiovaskulární, respirační a další onemocnění související s tímto znečištěním již překonávají průměrnou mortalitu a vyrovnávají se chronickým onemocněním způsobeným např. kouřením, které je samo o sobě zdrojem významného množství nanočástic vdechovaných do plic (Nohavica 2011). 18

19 S rozvojem nanotechnologií v posledních letech vzrostla převážně produkce klíčových ENM (OECD 2010): uhlíkových nanotrubic (jednostěnných, mnohostěnných), nanočástic na bázi kovů - oxidů železa, oxidu titaničitého, hlinitého, ceričitého, zinečnatého, nanočástic zlata a stříbra, dále nanočástic oxidu křemičitého, dentrimerů a nanojílů. Klíčové nanomateriály jsou produkovány v množství až několik tun za rok a vzhledem k tomu, že veškerá hlášení ohledně produkčních objemů, ochranných opatření fungují na principu dobrovolnosti, je velice těžké odhadnout, jaké je vlastně zatížení životního prostředí těmito nanomateriály. Cíleně vyráběné nanomateriály i produkty nanotechnologií se mohou uvolňovat do prostředí v kterékoli fázi svého životního cyklu (obr. 7) (Savolainen a kol. 2010) v podobě aerosolů, prášků, suspenzí nanočástic nebo jejich aglomerátů či agregátů mikrometrických rozměrů. Vzhledem k nekonvenčnímu chování nanomateriálů je obtížné predikovat jeho distribuci v prostředí a možnou expozici populace (Abbott a Maynard 2010).... Obrázek 7: Životní cyklus nanomateriálů v prostředí (upraveno podle Savolainen a kol. 2010). Od roku 2010 začala být otázka expozice ENM velmi aktuální, stejně tak jako vytvoření standardizovaných metod a nástrojů pro její měření, charakterizaci a hodnocení rizik. Velmi důležité jsou studie zaměřené na analýzu životního cyklu jednotlivých nanomateriálů a produktů, které je obsahují, a to z důvodu vytvoření modelů konceptů různých možností expozice populace ENM. Nezbytný je také rozvoj monitorovacích nástrojů k měření nanomateriálů v životním prostředí a jeho jednotlivých složkách, jak v územním i časovém měřítku (Abbott a Mayard 2010). Expozice nanomateriálům a nanočásticím může být posuzována v kontextu pracovních aktivit nebo každodenního běžného života. Z hlediska pracovních podmínek rozlišujeme dva typy expozice, a to jednak expozice, která souvisí s procesy, u nichž produkce nanomateriálů není hlavním cílem, ale jejichž zavedení tyto částice vytváří (pyrometalurgie, svařování, mechanické zpracování kovů a spalovací procesy), nebo pracovní expozice, která přímo souvisí s používáním nanomateri- 19

20 álů (Rupová a Skřehot 2011). Pracovníci v nanotechnologiích mohou být pak exponováni během výroby, přepravy a skladování daného materiálu nebo produktu obsahujícího daný nanomateriál (Baenza-Squiban a Lanone 2011). Mezi hlavní parametry, které ovlivňují úroveň pracovní expozice, patří charakter nanomateriálu (prášková forma, tekutá suspenze, gel atd.), metody použité k jejich syntéze (mechanické procesy, kapalná nebo plynná fáze), množství, se kterým se nakládá, doba a frekvence prací, míra uvolňování produktů do ovzduší nebo pracovní plochy (formování aerosolových kapek), používání osobních ochranných pomůcek (Rupová a Skřehot 2011). Možný životní cyklus ENM a možnosti jejich uvolňování do prostředí, včetně expozice člověka, jsou schématicky znázorněny na obrázku 7. Všechny ENM, vyráběné v daném provoze, se mohou uvolňovat do vody, půdy a ovzduší a znečišťovat tak životní prostředí buď v podobě odpadních vod, nebo emisí (právě pro aerosoly jsou dané emisní a transportní mechanismy nejlépe známé). Další znečištění nanočásticemi v prostředí může pocházet z širokého používání nanomateriálů (TiO₂, ZnO). V opalovacích krémech se používají jako ochranné látky proti UV záření. Po aplikaci krému vytvoří na pokožce tenkou vrstvu a po kontaktu s vodou mohou být smývány do vodního prostředí. Nanočástice těchto oxidů se také přidávají do nátěrových hmot a pigmentů, kde mají za úkol navozovat vzhled čistoty a vyšší bělosti, ale mohou také plnit roli funkčních aditiv zajišťující nové vlastnosti takto modifikovaných předmětů, například degradaci některých chemických látek, čímž se docílí samočistící schopnosti povrchu. Kontaminace prostředí může vést i přes tradiční procesy nakládání s odpadem např. kanalizační splašky, spalování odpadu, propouštění ze skládek apod. Následná kontaminace vody a půdy může teoreticky vést k příjmu nanočástic rostlinami a mořskými produkty pro lidskou a živočišnou spotřebu. Příjem ENMs rostlinami a vodními druhy byl ukázán v (Lin and Xing 2008, Rico a kol. 2011). Environmentální aspekty shrnuje např. SCENIHR (2007a, 2009, Klaine a kol. 2008, Shaw a Handy 2011). Existuje několik indicií ukazujících na možný příjem nanočástic rostlinným tělem (obr. 8). Z obrázku je rovněž patrné kam mohou být translokovány jednotlivé typy nanomateriálů v rámci rostlinného těla. Poměrně velké množství ENM se může dostat do prostředí cíleně při tzv. nanoremediacích, kdy jsou nanomateriály využívány k čištění a dekontaminaci poměrně rozsáhlých oblastí (půda, podzemní vody) (Karn a kol. 2009). Nanomateriály se z kontaminované půdy mohou dostávat zpět do atmosféry nebo do vodního systému s možným rizikem další expozice (Baenza-Squiban a Lanone 2011). Jedním z potenciálně významných zdrojů úniku nanomateriálů do prostředí se v budoucnu mohou stát nanotextilie, jednak vzhledem k jejich předpokládáné rozsáhlé produkci (nanotextilie o nových fukcích a vlastnostech) (Som a kol. 2011) a také prokázanému uvolňování některých nanočástic z textilních vláken během běžného používání např. nanostříbra (Gresler a kol. 2010). Kromě nanotextilií a již zmíněných zdrojů nanomateriálů existuje další velké množství spotřebitelských výrobků a jiných produktů obsahujících ENM, které mohou představovat expozici pro běžnou populaci i možný zdroj kontaminace prostředí. K uvolnění ENM z těchto výrobků pravděpodobně nedochází, pokud ENM zůstávají navázány v polymeru nebo matrici produktu, ale situace se mění, pokud dojde k po- 20

21 ... Obrázek 8: Příjem, translokace a biotransformační cesta různých nanočástic v rostlinném systému. A) Rostlina vykazuje selektivní příjem a translokaci nanočástic. B) Přenos po příčné ose v kořenové absorbční zóně ukazuje různé nanočásticové interakce během expozice (převzato z Rico a kol. 2011). škození matrice při zpracování, recyklaci nebo v případě, kdy se výrobek ocitne na konci svého životního cyklu, stává se odpadem a je buď skládkován, nebo spálen (Savolainen a kol. 2010). Další možná expozice a kontaminace prostředí může teoreticky pocházet z reziduí veterinárních léčiv, pesticidů, umělých hnojiv používajících nanomateriály. V rámci EU jsou již tyto produkty na trhu, ale používány sporadicky s tím, že ekologičtí zemědělci je mají zakázané úplně. Expozice lidí je pravděpodobně možná i přes rostlinné a živočišné potraviny (chybí data). Potraviny mohou být teoreticky kontaminovány i přes odpadní vody, které jsou aplikovány na zemědělské půdy (EFSA 2009 a 2011). Obecně lze výše uvedený postup shrnout schématem nezbytných parametrů pro komplexní charakterizaci rizik spojených s únikem ENM do prostředí a expozici živých organismů těmto materiálům (obr. 9). Expoziční kontext V současné době je nedostatek informací týkajících se expozice lidí ENM ze spotřebitelských produktů při jejich přímém používání. Hlavním důvodem je nedostatek informací týkajících se koncentrace ENM a jejich fyzikálně-chemických vlastností v produktech a tržních frakcích výrobků obsahujících ENM. I přesto je možné analyzovat faktory ovlivňující expozici spotřebitelů a také odhadnout externí expoziční hladiny (množství ENM, které mohou být potenciálně přijaty do organismu). Nejrozšířenější skupinou spotřebitelských produktů, kterým je běžná populace vystavena, jsou výrobky kosmetického průmyslu a osobní hygieny. Velmi podrobnou studii týkající se expozice německých spotřebitelů vůči této skupině 21

22 ... Obrázek 9: Schéma komplexního přístupu k charakterizaci rizik ENM (upraveno podle Zhao a Nalwa 2007). výrobků včetně faktorů, které hrají roli v rámci hladiny expozice, zpracoval Lorenz a kol Citlivou otázkou je také expozice nanočástic z potravin, zejména z potravinových obalů, které v současnosti prodělávají velmi rychlý a inzenzivní vývoj a brzy budou dostupné na trhu ve velkém množství. Pravděpodobnost a míra migrace nanočástic z obalů pravděpodobně závisí na typu ENM a obalu přenos určitých ENM byl prokázán, ale na všeobecný závěr chybí data. Dalším možným zdrojem expozice jsou profesionální oděvy a procesní vybavení používané v potravinářství, stejně tak krmiva domácích zvířat (zatím nejsou k dispozici žádné informace) (EFSA 2009). Nanomateriály se již začaly používat i ve výrobcích určených pro nejmenší děti a kojence jedná se o zubní kartáčky, kartáče na vymývání dětských lahví, plyšová zvířátka apod. ze zemí USA, Korea, Německo, Austrálie, Čína. Komercializace právě těchto produktů s sebou všeobecně nese největší rizika, neboť právě malé děti jsou nejvíce citlivé k toxickému působení škodlivých látek Dávka Pro určení toxického účinku chemických látek (stanovení vztahu dávka odezva) bývá standardně určována koncentrace dané látky a doba trvání expozice, a to za různých experimentálních podmínek a na základě těchto údajů je možno orientačně predikovat odezvu. Oproti tomu u nanočástic je, kromě stanovení dávky a doby expozice, nutné charakterizovat fyzikálně-chemické vlastnosti hodnocených nanočástic (Abbott a Maynard 2010, Teeguarden a kol. 2006). Dávka je chápána jako množství chemické látky (xenobiotika), které pronikne do organismu. Dávka toxické látky, která ještě nevyvolá pozorovatelnou změnu, je dávka podprahová. Nejmenší dávka, která již vyvolá hodnotitelnou reakci, je dávka prahová, každá dávka vyšší než prahová je dávka nadprahová (Patočka 2005). Pro vyjádření dávky nanočástic se dosud nepodařilo vydefinovat parametr popisující aplikovanou dávku tak, aby korelovala s toxicitou. Pro hodnocení expozice 22

23 bylo navrženo několik měrných jednotek a doporučuje se, že pro popis dávky by mělo být použito více z nich (EFSA 2011). Jedná se o hmotnostní koncentraci (je jediným parametrem používaným ve většině toxikologických studií, ale samotný tento parametr není vhodným meřítkem, neboť nezahrnuje specifické charakteristiky ENM). Dále je možné dávku definovat na základě počtu částic na jednotku objemu nebo plochy či specifickou plochou povrchu (poměr hmotnosti k velikosti plochy nanočástic) (EFSA 2011, Teeguarden a kol. 2006, Savolainen a kol. 2010). Specifická plocha povrchu je nezávislá na aglomeraci částic, což je důležité pro rozpoznání větších aglomerátů ENM, které by mohly být opomenuty, pokud by se pracovalo pouze s rozměrem, kterým jsou vymezeny nanomateriály dle současně používané definice (Teeguarden a kol. 2006). Tyto jednotky jsou běžně užívané nebo navržené pro užití v nanotoxikologii pro hodnocení vztahu dávka odezva v in vitro a in vivo toxikologických experimentech a jsou snadno transformovatelné podle následujících vztahů: koncentrace plochy povrchu = hmotnostní koncentrace 6 hustota částic D = # koncentrace πd 2, # koncentrace = hmotnostní koncentrace 6 hustota částic πd 3 = koncentrace plochy povrchu πd 2, kde jsou uvažovány sférické nanočástice a kde d je průměr nanočástic v cm, koncentrace plochy povrchu je uvedena v cm²/ml, hmotnostní koncentrace částic je v g/ml média a indikuje počet a hustotu nanočástic v g/cm³ (převzato z Teeguarden a kol. 2006). Při kvantitativním posuzování expozice nanočástic in vitro je možné pracovat na různých úrovních specifity s ohledem na místo působení nanočástic a mechanismus jejich toxicity. Obecně platí, že buněčná odpověď probíhá vůči materiálu, který přijde přímo do kontaktu s buňkou (doručená dávka) nebo materiálem, který je internalizován v buňce (buněčná dávka), ale ne s materiálem, který zůstává v okolním prostředí organismu nebo buňky (růstovém médiu), jak se tomu děje s částí materiálu, pokud je podán jako tzv. administrativní dávka (dávka přítomná v prostředí nebo dávka dodaná do média při toxikologických pokusech in vitro na tkáňových kulturách) (obr. 10) (Teeguarden a kol. 2006). 23

24 ... Obrázek 10: A) Dávkování nanočástic in vitro s ohledem na specifitu a relevantnost při měření dávky od aplikovaného množství nanočástic až po skutečné množství, které se dostane k buňkám nebo je do buněk internalizováno (SA angl. surface area plocha povrchu, křížek počet částic, který se vztahuje na nějakou jednotku povrchu nebo objemu). B) Alveolární epiteliální buňky (C10) rostoucí v kultuře exponované fluorescenčně značeným amorfním částicím oxidu křemičitého o velikosti 500 nm ukazují principy dle obrázku A. Buněčná membrána je označená membránově specifickým fluorescenčním markrem, který se postupně stává vnitřní součástí membránových vezikulů. B1 Dodaná dávka částic oxidu křemičitého (zbarveny zeleně) na apikálním konci buňky. B2 Částice nejsou dále vidět ve fokální rovině, ale pohybují se dovnitř buňky. B3 Částice byly přijaty do buňky a ve fokální rovině je možné pozorovat, jak se pohybují dovnitř buňky (upraveno podle Teeguarden a kol. 2006). 24

25 Dávka nanočástic, která je přímo dodána na buněčný povrch (jeho receptory) mnohem lépe indikuje skutečnou dávku, která je schopna vyvolat určitou biologickou odpověď (popř. toxický účinek). Hmotnost, plocha povrchu nebo počet částic dodaných na určité receptory na povrchu buňky lépe odrážejí dávku v místě působení než nominální koncentrace v médiu. Tato doručená dávka je v toxikologických experimentech ihned měřitelná a porovnatelná s metrikou dávek používaných pro látky částicové povahy v pokusech in vivo (na živých organismech), například doručená dávka částic na určitou plochu povrchu buňky v tkáňové kultuře in vitro s doručenou dávkou na plochu povrchu tkáně dýchací soustavy. Toto umožní určitý přehled o tom, jakou biologickou odezvu (toxický účinek) vyvolá srovnatelná dávka v in vitro a in vivo pokusech (tato odpověď nemusí být vůbec shodná či v nějaké korelaci), ale umožní také určit, jaké možné faktory, mohou mít vliv na působení daných nanočástic, či mohou zabránit jejich toxickému účinku. Tkáň dýchacího traktu při pokusech in vivo je pro inhalované nanočástice velice snadno dostupná a dle charakteru částic a určitých predikčních modelů lze odhadnout, kolik nanočástic dorazí na tkáňové receptory. Nanočástice, které pronikly do buňky endozómů, fagozómů, lysozómů, je rovněž možné vyjádřit jako dávku v podobě hmotnosti internalizovaných nanočástic, plochy jejich povrchu, počtu nanočástic nebo jejich množstvím ve specifických kompartmentech, avšak tyto parametry jsou velmi obtížně měřitelné (Teeguarden a kol. 2006). V současné době nejsou dostupné žádné informace týkající se pozaďových koncentrací uměle vyrobených nanomateriálů v jednotlivých složkách prostředí. Potenciální zdroje, které mohou emitovat tyto materiály, nejsou systematicky monitorovány. Poskytnuté informace ohledně množství produkovaných nanomateriálů popř. ošetření jejich úniku do prostředí jsou na bázi dobrovolnosti. Co se týče expozice na pracovišti, množství uvolňovaných nanočástic je velmi odlišné a závisí to na množství produkovaných nanočástic a pracovní pozici každého pracovníka daného provozu. Kvantitativní hodnocení potenciální expozice nanočástic vyžaduje nauku o měření nanočástic, tzn. nanometrologii. V současnosti se již podařilo stanovit bezpečnostní dávky pro určité nanomateriály (Rupová a Skřehot 2011, Savolainen a kol. 2010) Doba expozice Při expozici nanomateriálů je, kromě velikosti dávky, důležitá také doba trvání, po kterou působí určitý nanomateriál na daný receptor. Trvání expozice se může pohybovat v rozmezí krátkých časových úseků (několik sekund nebo minut) až po dlouhodobou expozici trvající roky. Rozlišujeme tedy expozici akutní jednorázovou (látka pronikne do organismu pouze jednou), subakutní (po dobu 4 týdnů), subchronickou (po dobu 1 až 3 měsíců), chronickou (déle než 3 měsíce) (Patočka 2005) a celoživotní (Abbott a Maynard 2010). Při opakované expozici je také důležitá frekvence expozice, tedy v jakých časových intervalech expozice probíhá a jaká je délka jednotlivých intervalů - délky působení chemické látky (nanočástic) a délky přestávek. Frekvence expozice ovlivňuje toxicitu látky v závislosti na jejím osudu v organismu. Při dostatečně dlouhých intervalech může díky metabolizaci 25

26 látky (nanočástic) na netoxické produkty nebo díky vylučování látky (nanočástic) (exkreci) dojít k tomu, že každá další expozice probíhá pod obrazem akutní jednorázové expozice. Podobně je tomu tak i v případech, kdy dochází k obnovení (reparaci) narušených biochemických pochodů, biologických struktur a tkání. Naopak při krátkých intervalech může absorbce látky být vyšší než rychlost její biotransformace a exkrece a docházet tak k hromadění (kumulaci) látky (nanočástic) v organismu. Kumulace vede k postupnému zvyšování koncentrace chemické... Obrázek 11: Faktory ovlivňující výběr expozičních kontrol pro nanomateriály zahrnují dávku nanomateriálu, fyzikální formu a dobu trvání expozice. Pokud dojde k nárůstu jakéhokoliv zmíněného faktoru, expoziční riziko se zvětšuje, stejně jako potřeba efektivnějších měření pro expoziční kontroly (převzato z NIOSH 2009). látky (nanočástic) v některých orgánech (místo kumulace), což může vést k jejich nevratnému (ireversibilnímu) poškození (Patočka 2005). Pro určité skupiny nanomateriálů může být významnější z hlediska hodnocení expozice průměr časového zatížení nad bezpečnou dobu trvání expozice než dávka vyjádřená kumulativní koncentrací (Abbott a Maynard 2010). Z hlediska toxicity vykazují nanočástice negativní účinky spíše při dlouhodobé expozici, tzn. účinky jejich působení se neprojeví ihned Příjem nanočástic Velmi důležitým faktorem, který má vliv na toxicitu nanočástic je druh expozice, tj. místo, kudy pronikne chemická látka nebo nanočástice do organismu. Toxický účinek chemické látky (nanočástice) je poté ovlivněn rychlostí nástupu toxického účinku (Patočka 2005). Nanočástice mohou přijít do přímého kontaktu s organismy přes dýchací systém (inhalační expozice), zažívacím ústrojím, tj. požitím (perorální expozice), kůží a viditelnými sliznicemi (dermální expozice), přímo do krevního řečiště poškozenou tkání či vpichem (intravenózní expozice) (Rupová a Skřehot 2011). Částice přijaté do organismu inhalační cestou se mohou přes čichový epitel nebo jinou cestou dostávat až do centrální nervové soustavy (Simkó a Mattsson 2010). Nejrychleji se do krevního oběhu dostávají látky přijaté intravenózně (obr. 12). Podobný trend přírůstku koncentrace látky v krvi je pozorován také při inhalační 26

27 expozici. Perorální expozice a dermální cesty vstupu látky do těla exponované osoby jsou typické spíše plochou křivkou s pomalým nárůstem koncentrace dané látky v krvi, avšak při dlouhodobější expozici s velmi pomalým poklesem (na rozdíl u intravenózní a inhalační expozice), což může hrát významnou roli například při dlouhodobé kožní aplikaci některých přípravků s obsahem nanočástic (Rupová a Skřehot 2011).... Obrázek 12: Rychlost změn koncentrace látky v krevním řečišti po vstupu do organismu různými expozičními drahami v závislosti na době expozice (upraveno z Rupová a Skřehot 2011) Příjem nanočástic dýchacím systémem Vzhledem k malým velikostem a nízkým hmotnostem nanomateriálů s následným zanedbatelným gravitačním působením jsou tyto materiály snadno suspendovatelné v ovzduší. Takto mohou v ovzduší setrvávat poměrně dlouho, což zvyšuje riziko inhalační expozice. Proto představuje dýchací systém pro nejrůznější nanomateriály nejpravděpodobnější a také nejsnadnější cestu vstupu do organismu (Baenza-Squiban a Lanone 2011). Vdechování částic probíhá stejným způsobem jako při vystavení působení plynů nebo par. Absorbce plícemi je velmi rychlá, protože jsou svou stavbou uzpůsobeny k efektivní výměně plynů mezi vdechovaným vzduchem a krví. Celková expozice částicím z ovzduší závisí na velikosti vdechovaných částic, jejich koncentraci, dechové frekvenci exponované osoby a na tom, zda dýchá nosem nebo ústy. Místo, kde jsou částice deponovány, závisí na vlastnostech inhalovaných nanočástic, dýchacího ústrojí a řadě dalších faktorů (Rupová a Skřehot 2011). Inhalované nanočástice jsou ve vzduchu obsaženy v podobě aerosolu, jenž představuje velmi dynamický systém a chování částic zde závisí na jejich rozměru a vlastnostech povrchu částic. Pokud se rozměr částic přibližuje velikosti molekul (případ nanočástic), jejich dynamické chování má tendenci přiblížit se chování molekul plynů a řídit se pravidlem difúzního zákona. Všeobecně se dá říci, že chování částic v aerosolu je ovlivněno různými silami, jako jsou kromě difúze také gravitace a setrvačnost. Čím více jsou částice koncentrovány, tím je 27

28 větší tendence k převládnutí difúzních sil. Částice interagují s molekulami plynu (Brownův pohyb) a pak samy sebe přemisťují náhodným difúzním pohybem. Čím jsou částice menší, tím rychleji se pohybují. Vzájemné kolize pak vedou ke vzniku agregátů a aglomerátů, čímž se mění rozměr částic, jejich reaktivita a následně další vlastnosti (Baenza-Squiban a Lanone 2011). Depozice nanočástic popř. jejich interakce se sliznicí v dýchacích cestách může nastávat v různých částech dýchací soustavy v závislosti na vnějších a vnitřních faktorech. Depozici nanočástic v dýchacím systému ovlivňuje také tvorba agregátů a aglomerátů (Baenza-Squiban a Lanone 2011). Nanočástice z různých zdrojů se mohou vázat na běžné aerosoly přítomné v ovzduší nebo naopak na sebe mohou vázat různé běžné polutanty jako např. polycyklické aromatické uhlovodíky (angl. PAHs), nebo sloučeniny kovů, čímž dochází ke změně jejich velikosti i chování. Při změně vlastností částic (vlivem agregace nebo aglomerace), se mění také mechanismy jejich ukládání na receptoru, čímž dochází ke změně účinné dávky, tj. nejmenší dávky, která již vyvolá určitou hodnotitelnou reakci v organismu. Vazba nanočástic na jiné částice znesnadňuje jejich vzájemné odlišení a změna tvaru částic nebo způsobu jejich obalení může mít nepředvídatelné toxikologické dopady (Baenza-Squiban a Lanone 2011). Velikost částic je rozhodujícím parametrem určujícím jejich průnik a depozici v dýchacím traktu. Podle oblasti respiračního traktu, do které jsou dané velikosti částic schopny proniknout, rozlišujeme několik velikostních frakcí: inhalovatelná frakce (< 100 μm) je nejširší označení všech částic, které jsou schopny vstoupit do dýchacího traktu nosem nebo ústy, thorakální frakce (< 10 μm) zahrnuje částice schopné průniku až do plic, respirabilní frakce (< 5 μm) může být transportována až do alveolární části plic, tj. do plicních sklípků. Částice větší než 10 µm jsou zachyceny v horních cestách dýchacích, odkud mohou být odstraněny vysmrkáním, vykašláním nebo mohou být spolknuty. Částice hrubé (thorakální) frakce (o velikostech 4 až 10 µm) se dostávají pod úroveň hrtanu do dolních cest dýchacích a částice o velikosti přibližně 2,5 µm pak snadno pronikají do průdušek. Částice o velikostech 1 3 µm představují vážné riziko (zejména částice vláknitého tvaru), protože se v průduškách snadno usazují a setrvávají zde po dlouhou dobu a mohou vyvolat různá onemocnění. Nejmenší částice o velikostech řádově desítek až stovek nanometrů pronikají do plicních sklípků, odkud mohou pronikat spolu s plyny do krevního oběhu (Öberdorster a kol. 2005). Tomu, co se děje s nanočásticemi v dýchací traktu, není ještě plně porozuměno, což je důvodem zavádění různých prediktivních modelů. Řada modelů popisujících ukládání nanočástic v respiračním traktu jej rozděluje z hlediska depozice do tří regionů: nosofaryngeální region (horní cesty dýchací), tracheobronchiální region (dolní cesty dýchací) a alveolární. Predikční modely byly založeny na základě dat ICPR International Comission on Radiological Protection, které popisují pravděpodobnost celkové depozice částic o velikostech více než 100 nm v aerodynamickém průměru při průchodu respiračním traktem. Součástí těchto informací 28

29 jsou rovněž data z analýz v každém ze tří regionů. Příklad distribuce jednotlivých velikostí částic deponovaných v rámci dýchacího traktu je uveden na obrázku Obrázek 13: Predikční model a regionální depozice částic v lidském respiračním traktu jako funkce velikosti částic. Přerušovaná křivka znázorňuje dýchání ústy, kontinuální nosem při běžné fyzické zátěži (převzato z Baenza-Squiban a Lanone 2011). Na základě tohoto modelu lze shrnout, že menší částice jsou ukládány v respiračním traktu s mnohem vyšší pravděpodobností, a to se specifickou distribucí v každém regionu v závislosti na velikosti deponovaných částic. Nanočástice o rozměrech kolem 5 nm se ukládají ve srovnatelné míře v každém z regionů. Depozice v horních cestách dýchacích dominuje u nanočástic menších než 5 nm, naopak částice větší než 5 nm jsou preferenčně ukládány v alveolární části plic. Maximální alveolární depozice (50 60 %) je predikována pro částice o velikosti 20 nm a celková pravděpodobnost depozice pro tyto nanočástice je 80 %. Tyto rozdíly v depozici (totální a regionální) mohou být očekávány s ohledem na následné biologické efekty nanočástic. Navíc tento model zvažuje dýchání ústy, a to i během odpočinku. Při změně fyziologických podmínek se mohou změnit i depoziční parametry, tj. při přechodu z klidového režimu do fyzické zátěže. Tento model je založen na predikci depozice pouze sférických částic. Pro predikci depozice morfologicky odlišných částic je zapotřebí tvorby nového modelu (Baenza-Squiban a Lanone 2011). Obecně platí, že v alveolární oblasti plic se deponuje až třetina všech částic menších než 100 nm. Nanočástice se deponují také v horních cestách dýchacích (až se 75% účinností), zejména pak při dýchání nosem. Osud nanočástic obsažených v aerosolu, jenž pronikají do organismu, je ovlivněn jednak rychlostí přísunu (tj. frekvencí dýchání) a jednak rychlostí jejich odbourávání (metabolismu) či vylučování (Rupová a Skřehot 2011). Čistící (obranné) mechanismy dýchacího systému Vyčištění vdechnuté substance je definováno jako kapacita orgánu danou substanci zcela eliminovat. V plicích dochází k eliminaci částic dvěma mechanismy: chemickým vyčištěním a fyzikální translokací částic (Baenza-Squiban a Lanone 2011): 29

30 Chemický způsob zahrnuje následující procesy: rozpuštění samotných částic, vyluhování, kdy dojde k odstranění pouze některých chemických složek z matrice částice, absorpci či navázání částice na protein, který umožní částici přejít do krevního oběhu a lymfatického systému. Tyto chemické čistící procesy mohou probíhat přes dýchací trakt a vykazovat různou účinnost v závislosti na vnějším a vnitřním prostředí, zejména na ph. Fyzikální translokace představuje proces, který je oproti chemickým čistícím procesům více vázán na oblast dýchacího traktu. Nanočástice mohou být eliminovány dvěma mechanismy, a to buď prostřednictvím tzv. hlenového eskalátoru nebo fagocytózou alveolárními makrofágy.... Obrázek 14: Hlenový eskalátor a potenciální cesty určující osud inhalovaných nanočástic (převzato z Zhang a kol. 2010). Hlenový eskalátor (obr. 14) je obranný systém dýchacího systému umístěný v horních cestách dýchacích. Nosní hlenová membrána a tracheobronchiální oblast jsou obdařeny velice efektivním čistícím mechanismem tvořeným epiteliálními buňkami s řasinkami (tzv. řasinkový epitel) a buňkami produkujícími mukózní hlen, na kterém se usazují částice přítomné ve vdechovaném vzduchu. Tento hlenový eskalátor posunuje pohybem řasinek pás hlenu směrem k hltanu, čímž brání dalšímu průniku částic hlouběji do dýchacích cest. Jedná se o velmi rychlý mechanismus čištění pro pevné částice, které jsou eliminovány z tracheobronchiálního regionu během 24 h. Avšak tento čistící mechanismus vykazuje nejvyšší účinnost pro částice o velikosti několika mikrometrů. Kromě výše uvedených chemických a fyzikálních procesů čistění od inhalovaných částic existují také procesy na čistě biologické úrovni. Jedná se o obranné mechanismy zajišťované speciálními buňkami imunitního systému organismu. Fagocytóza pomocí alveolárních makrofágů probíhá v alveolární části plic. Alveolární makrofágy mají schopnost pohltit částice pomocí fagocytózy, se kterými pak migrují směrem k hlenovému eskalátoru. Deponované nanočástice jsou makrofágy cíleně vyhledávány na základě jejich chemické afinity. Jedná se o nejúčinnější 30

31 mechanismus odstraňování nanočástic z organismu. Tento proces trvá několik dní a jeho efektivita závisí na velikosti deponovaných částic, vykazuje nižší účinnost pro nanočástice ve srovnání mikrometrovými částicemi.... Obrázek 15: Alveolární makrofágy a jejich umístění v plicních sklípcích (alveolech). Nákres ukazuje alveolární buňky Typu I a Typu II a alveolární makrofágy (převzato z Chiras 2001). Dalšími mechanismy, kterými mohou být nanočástice odstraněny z dýchacího traktu, představují epiteliální translokace, tj. průnik nanočástic z dýchacích cest do krevního a lymfatického systému nebo translokace přes smyslové neurony, zejména přes zakončení čichového nervu (Nervus olfactorius) v nosní sliznici. Průnik nanočástic přes zakončení čichového nervu se také označuje jako tzv. olfaktoriální dráha (Öberdorster a kol. 2005) Příjem nanočástic kožní cestou Kůže, pokud není porušena, představuje velmi účinnou bariéru vůči nanomateriálům. Pasivní transport nanočástic skrz nepoškozenou kůži je vysoce nepravděpodobný, díky matrici korneocytů (soubor zrohovatělých buněk na povrchu pokožky), dále lipidové dvouvrstvě a fyziologickému prostředí pod rohovou vrstvou (obr. 16), kde je obsaženo mnoho proteinů, které by znesnadnily proniknuvším částicím další transport (Baenza-Squiban a Lanone 2011). Lze tedy předpokládat, že dermální expozice nanomateriálům, například v kosmetice, nebude představovat vysoké riziko ve srovnání s expozicí inhalační. Přes kůži mohou poměrně snadno pronikat nanočástice lipofilní povahy, a to přes potní žlázy či podél chlupů a vlasů nebo se plně protlačí všemi vrstvami kůže (Rupová a Skřehot 2011). Pro iontové sloučeniny nebo látky nerozpustné ve vodě je velice složité tuto bariéru překonat. Způsoby penetrace nanočástic přes kůži lze tedy rozdělit na intercelulární, folikulární a transcelulární (obr. 17). Nejnebezpečnější scénář průniku nanočástic kůží by nastal v případě, kdy by nanočástice pronikly skrz epidermis až k cévnímu zakončení v dermis a mohly se tak potenciálně dostat do krevního řečiště a 31

32 ... Obrázek 16: Stavba kůže (převzato z Chiras 2001). následně dál do organismu. Avšak nepředpokládá se, že by množství nanomateriálů, které je takto schopno pronikat, bylo významně vysoké (Monterio Riviere a Riviere 2009, Borm a kol. 2006).... Obrázek 17: Penetrační cesty kůží pro aplikované substance (převzato z Borm a kol. 2006) Příjem nanočástic perorální cestou Perorální cestou mohou do organismu pronikat částice z kontaminovaných potravin, vody, a nezanedbatelnou roli zde hraje také přenos z rukou do úst. Inhalované částice, které jsou eliminovány z dýchacího traktu hlenovým eskalátorem, jsou následně polknuty, pokud nejsou vykašlány, dostávají se rovněž do trávícího traktu. Největší absorbční povrch trávicího traktu, kudy mohou nanočástice vstupovat dále do organismu, představuje stěna střeva. Velké plochy povrchu je docíleno délkou střeva a útvary nazývanými klky na povrchu stěny střeva. Další nárůst plochy představují mikroklky na apikálním konci enterocytů (buňky tvořící sliznici střeva). Sliznice střeva je pokryta jednovrstevným epitelem tvořeným enterocyty a pohárkovitými buňkami vázanými dohromady těsným spojením, které zajišťuje 32

33 ... Obrázek 18: Stěna střeva (A). Epiteliální klky pokryté jednovrstevným epitelem tvořeným enterocyty a pohárkovitými buňkami (B) s rozdílnými typy spojení, včetně těsného spojení, které zamezuje paracelulárnímu přenosu a hromadění v bazální membráně epitelu. Peyerovy pláty (C) se specializovaným epitelem obsahujícím M-buňky mezi enterocyty nad lymfoidním folikulem. Převzato z (Baenza- Squiban a Lanone 2011), vyrobeno Servier Medical Art kohezi tkání a tvoří učinnou bariéru zamezující paracelulárnímu přenosu. Hlavní funkcí enterocytů je kontrola přenosu makromolekul a mikroorganismů zároveň se živinami. Pohárkovité buňky produkují ochranou viskózní tekutinu (hlen), tvořený glykoproteinem mucinem. Hlen chrání sliznici před adhezí nebo penetrací toxinů, bakterií a antigenů. Po střevní sliznici jsou rozmístěny regiony známé jako Peyerovy pláty (hlavní složky slizniční imunity v zažívacím traktu). Jedná se o nakupeniny organizované lymfatické tkáně a intraepiteliálních lymfocytů. Na povrchu jsou kryty plochými M-buňkami. Tyto buňky mohou zprostředkovávat transport patogenních mikroorganismů a velkých molekul přes cytoplazmu od svého luminálního k bazálnímu povrchu (do krve a mízy), kde se mohou dostat do styku s makrofágy a lymfocyty Peyerových plátů. M-buňky reprezentují % z buněk v Peyerových plátech. Přes M-buňky může probíhat potenciální vstup nanočástic, protože mají velkou kapacitu pro transcytózu a mohou transportovat široké množství materiálu včetně nanočástic. Je všeobecně akceptováno, že částice menší než 1 µm mohou být fagocytovány M-buňkami a transportovány do bazálního regionu, zatímco částice větší než 5 µm jsou také fagocytovány M-buňkami, ale zůstávají lapeny v Peyerových plátech (EFSA 2009, EFSA 2011, Baenza-Squiban a Lanone 2011). Při průchodu zažívacím ústrojím jsou nanočástice vystaveny více faktorům, které mohou ovlivnit jejich fyzikálně chemické vlastnosti včetně specifických vlastností nanomateriálů, než je tomu při vstupu jinými možnými cestami. Zásadní vliv na ztrátu specifických vlastností má polknutí nanočástic a jejich interakce s trávicími enzymy a tekutinami (EFSA 2011). Fyziologický stav trávicí soustavy ovlivňuje střevní propustnost. K absorbci nanočástic dochází v Peyerových plátech a nanočástice jsou transportovány do mezenterické lymfy. Pro menší částice bez pozitivního náboje je snažší překročit ochrannou vrstvu hlenu pokrývající střevní epitelium a též snažší absorbce (EFSA 2011, Abbott a Maynard 2010). 33

34 4.5. Přechod bariér Epitelium (v dýchacím traktu, epidermis, epitelium ve střevě) tvoří fyzickou bariéru před penetrací cizích substancí do krevní a lymfatické cirkulace, a to díky účinnému a nepropustnému spojení mezi buňkami. Paracelulární přenos (mezi buňkami) je pro nanočástice vysoce nepravděpodobný, kromě patologických situací nebo kromě expozice toxickým substancím, které ovlivňují permeabilitu (propustnost) epitelia. Průnik nanočástic skrz epitelia zahrnuje transcelulární transport (tj. přes buňku).... Obrázek 19: Rozdílné typy internalizace buňkami. Endocytické cesty se liší velikostí výsledného vezikulu, povahou materiálu, který je pohlcen, mechanismem tvorby vezikulu. Ilustrace byla převzata z (Baenza-Squiban a Lanone 2011). (1) Fagocytóza zprostředkovaná receptory a vedoucí k tvorbě fagozómu, jehož obsah je degradován po fúzi s lysozómem, (2) makropinocytóza, (3) endocytóza zavislá na proteinu klatrinu, (4) kalveoly zprostředkovaná endocytóza, (5) endocytóza nezávislá na proteinu klatrinu a na kalveolech Průnik nanočástic do buňky Při pronikání nanočástic do buněk hraje klíčovou roli cytoplazmatická membrána buňky a transport částic skrz ni. Rozhoduje o tom, jaké látky a v jakém množství budou přijaty nebo vyloučeny z buňky. Reguluje, koordinuje a zároveň udržuje vnitřní prostředí buňky, jež je odlišné od prostředí mimo buňku. Cytoplazmatická membrána se skládá z fosfolipidové dvouvrstvy a proteinů. Lipidová povaha membrány blokuje přenos iontů a velkých polárních molekul. Přítomnost iontových pump, přenašečů a proteinových kanálů dovoluje selektivní transport iontů. Makromolekuly a nanočástice mohou být nakoncentrovány pouze zachycením ve vnějším prostředí buňky pomocí endocytózy, kdy je daná látka nebo nanočástice obalena a začleněna do váčku (vezikulu) z cytoplazmatické membrány. Endocytóza zahrnuje dva mechanismy: pinocytózu a fagocytózu (obr. 19, 22) (Conner a Schmidt 2003, Baenza-Squiban a Lanone 2011). 34

35 Fagocytóza je standardně zajišťována fagocyty (makrofágy, monocyty a polynukleárními neutrofily) (obr. 20) a slouží k ochraně před invazí patogenů. Během fagocytózy jsou bakterie, kvasinky, buněčný odpad a velké částice internalizovány ve fagozómech o průměru 0,1 10 µm. Následná fúze fagozómu s lysozómem enzymaticky ničí patogeny kombinovanou spoluprací oxidantů, proteáz, hydroláz, které jsou aktivní v kyselém prostředí. Složky odolné vůči této degradaci zůstanou ve fagozómech a odolávají působení těla.... Obrázek 20: Přehled krevních buněk (včetně fagocytů) (převzato z Chiras 2001). Fagocytóza začíná navázáním částice na receptor v cytoplazmatické membráně fagocytu, poté je aktivován aktin (protein v cytoskeletu buňky), který umožní vyklenutí cytoplazmatické membrány kolem částice a následné obklopení částice membránou. Schéma funkce makrofágů během fagocytózy je uvedeno na obr. 21. V závislosti na velikosti a tvaru částice se nemusí podařit částici kompletně uzavřít a vzniká tzv. frustrovaný fagozóm, který následně spouští chronickou zánětlivou reakci. Tento jev byl pozorován např. u myší, které byly exponovány uhlíkatým nanotrubicím (CNTs). Některé studie ukazují, že fagocytóza u alveolárních makrofágů v dýchacím systému je méně účinná vůči malým částicím oproti těm větším, což vede k persistenci nanočástic v alveolární oblastí dýchacího systému a následné depozici v alveolárním epitelu (Conner a Schmidt 2003, Baenza-Squiban a Lanone 2011). Pinocytóza je konstitutivní proces probíhající neustále oproti fagocytóze, která je indukovaná navázáním částic na membránový povrch. Jedná se v podstatě o příjem tekutin a roztoků, někdy jsou touto cestou přepravovány i plyny. Oproti fago- 35

36 ... Obrázek 21: Schéma funkce makrofágů. Makrofágy prezentují antigeny B-buňkám a pomocným buňkám a také fagocytují bakterie pokryté antigeny (převzato z Chiras 2001). cytóze vznikají pinocytózou velmi malé váčky. Pinocytóza není zaměřena na přepravu specifických látek, ale přijímá tekutinu včetně látek v ní rozpuštěných. Vyšší efektivnost pinocytózy je dosažena buď navázáním roztoku na cytoplazmatickou membránu (adsorbční pinocytóza), nebo pokud je roztok zachycen specifickým vysokoafinitním receptorem (receptorem zprostředkovaná pinocytóza). Na základě toho, jaký náklad je transportován a na jakém receptoru je zachycen, existují čtyři rozdílné mechanismy pinocytózy: makropinocytóza, endocytóza závislá na proteinu klatrinu, kalveoly zprostředkovaná endocytóza, endocytóza nezávislá na klatrinu a na kaveolech (Conner a Schmid 2003). Makropinocytóza: Jedná se o internalizaci velkého množství extracelulární tekutiny, která se dostane do vyklenuté části membrány, ta nakonec tekutinu zcela obklopí a vzniká makropinozóm (Conner a Schmid 2003). Vyklenutí membrány je možné díky bílkovině aktinu z cytoskeletu buňky. Endocytóza závislá na proteinu klatrinu: Endocytóza zprostředkovaná klatrinem funguje převážně u savčích buněk a zajišťuje stálý příjem základních živin, ale rovněž transport vysokoafinitních membránových receptorů a jejich ligandů. Váčky obalené klatrinem (o velikostech okolo 120 nm) jsou hojně zastoupeny v neuronech, kde má tento způsob endocytózy význam při synaptickém přenosu (Zhao a Nalwa 2007, Conner a Schmid 2003). 36

37 Kalveoly zprostředkovaná endocytóza: Vede k tvorbě malých vezikulů nazývaných kaveoly o průměru okolo 70 nm. Vyskytuje se v mikrodoménách cytoplazmatické membrány, která je bohatá na glykosfingolipidy a cholesterol. Cholesterol interaguje s membránovým proteinem kalveolinem. Ve většině buněk je tento způsob internalizace považovaný za sekundární v porovnání s endocytózou závislou na proteinu klatrinu s výjimkou endoteliových buněk. V těchto buňkách probíhá transcytóza např. sérových proteinů z krve přes kaveoly do tkání pokrytými endoteliovými buňkami (Baenza-Squiban a Lanone 2011). Endocytóza nezávislá na klatrinu a kalveolech: Vyskytuje se v lipidových mikrodoménách nebo krách cytoplazmatické membrány. V současnosti je mechanismus velmi málo pochopen (Baenza-Squiban a Lanone 2011). Po pinocytoze dochází k fúzi vezikulů s endozómem a k následné degradaci lysozómy nebo dochází k transcytóze.... Obrázek 22: Internalizační mechanismy u savčích buněk. Endocytické cesty se liší velikostí vezikulů, typem obsahu (receptory, ligandy, lipidy) a mechanismem tvorby vezikulů (převzato z Conner a Schmidt 2003). Další mechanismy Ve všech typech endocytózy je internalizovaný materiál uzavřen do vezikulu, který je oddělen od cytoplazmy buňky pomocí membrány. Nanočástice byly pozorovány v buňkách i volně v cytoplazmě, v mitochondriích a v jádře. Při inhalaci např. malých dávek nanočástic z TiO₂ u krys nebyly částice obaleny membránou v epiteliálních ani v endoteliálních buňkách, ani spojovacích tkáních či červených krvinkách. Některé studie ukazují, že díky adhezivní interakci mohou nanočástice pasivně difundovat přes plazmatickou membránu tím, že v ní vytvoří dočasně póry. Tento způsob přenosu nanočástic do buňky byl pozorován u neutrálních a nabitých fluorescenčních polystyrénových nanočástic, nanočástic zlata a TiO₂ nanočástic nalezených v červených krvinkách, u kterých neprobíhá standardní endocytický proces (Rothen-Rustishauser a kol. 2007). Pokud nanočástice vstoupí do buňky difúzním mechanismem, mohou jej v jiném preferenčním místě cytoplazmatické membrány buňky stejným mechanismem také opustit a dosáhnout tak transcytózy. Termínem transcytóza je označován přenos látky přes buňku, kdy látka vstupuje do buňky a vystupuje z ní ve stejné podobě v jiném místě epiteliální bariéry (Baenza-Squiban a Lanone 2011). 37

38 4.6. Translokace částic ENM, které jsou schopny pronikat do organismu jednou z expozičních drah, překonávají často tělní bariéry (př. bariéra krev mozek). Konvenční materiály oproti nanomateriálům nejsou schopny prostupovat hlouběji do kůže a translokovat se přes buňky tělního epitelia. Některé nanočástice mohou po inhalaci přecházet z plic do krve (označovány angl. termínem bloodborne particles ) nebo být transportovány po axonech nervových buněk do centrální nervové soustvy (tzv. axonální transport, nebo olfaktoriální dráha), popř. přecházet přes buňky epitelia a sliznici gastrointestinálního traktu, další sliznice (nosní, vaginální, v dutině ústní). Z krevního oběhu pak mohou být distribuovány dál po těle k cílovým orgánům, jako jsou játra, ledviny, slezina, lymfatické uzliny a mozek. Množství translokovaných částic může být navýšeno v případě různých patologických stavů (Abbott a Maynard 2010, Baenza-Squiban a Lanone 2011). Translokace vzduch krev Osud inhalovaných nanočástic v respiračním traktu člověka a jiných savců znázorňuje obrázek 14. Dostupné studie ukazují, že translokace skrz alveolo-kapilární bariéru je možná, ale její šíře významně závisí na nanočásticích samotných, obzvláště na jejich fyzikálně-chemických vlastnostech. Většina publikovaných studií aplikovala nanočástice v podobě jednorázové dávky. Lze si tedy představit, že při opakované expozici by množství translokovaných částic do krevního řečiště pravděpodobně bylo vyšší (Baenza-Squiban a Lanone 2011). Neurální translokace Do centrální nervové soustavy mohou být nanočástice translokovány po překonání bariéry krev mozek (BBB angl. blood brain barrier) nebo translokací po axonech čichového nervu (Nervus olfactorius) (obr. 23).... Obrázek 23: Možné cesty vstupu nanočástic do centrální nervové soustavy (převzato z Simko a Mattsson 2010). BBB chrání centrální nervovou soustavu proti pronikání xenobiotik a endogenních molekul. BBB je rozhraním mezi kapilárami a mozkovou tkání. Endote- 38

39 liální buňky mozkových kapilár, které jsou vázány velice těsným spojením, společně s přilehlými astrocyty omezují přenos většiny substancí z krevního oběhu do mozku. Pokud některé substance překročí BBB, může se to stát buď přes lipidy zprostředkovanou volnou difúzí, nebo přes receptor zprostředkovanou endocytózou. Vzhledem k tomu, že mezera ve spojení BBB je pouze 4 6 nm, předpokládá se, že nanočástice překračují spíše membránu endoteliálních buněk, než spojení mezi endoteliálními buňkami. V současné době existují nanočástice, které jsou schopny BBB překonat, a mají velký potenciál pro využití v transportu protinádorových léků, analgetik, lokálních antibiotik a genů přímo do mozku nebo mohou být využity při magnetické rezonanci (MRI) (Simkó and Mattsson 2010). Druhá cesta translokace nanočástic do CNS zahrnuje jejich zachycení čichovým epitelem v nosní dutině a následný transport po axonech čichového nervu do mozku (obr. 24). Translokace touto cestou byla pozorována u 50nm zlatých nanočástic u opic, 35nm uhlíkových nanočástic a 30nm nanočástic z oxidu manganičitého. Zejména v experimentech s MnO se zjistilo, že u krys bylo 11 % nanočástic uloženo v čichové bulvě a některé dosáhly i dále položených míst v mozku. Studie na myších s nanočásticemi TiO₂ také prokázaly transport nanočástic do mozku přes čichový epitel (Baenza-Squiban a Lanone 2011). Translokace 20nm nanočástic je u lidí 2 10 vyšší přes čichový nerv než u krys (Öberdorster a kol. 2005) a nanočástice translokované u člověka mohou vstoupit hlouběji do mozkových struktur během kratšího expozičního času než je tomu u hlodavců. Vzhledem k omezenému množství dostupných experimentálních dat je v současné době složité posoudit, zda rozsáhlá akumulace nanočástic v mozku deponovaných po olfaktoriálním transportu je opravdu reálná (Simkó and Mattsson 2010).... Obrázek 24: Místo možného průniku vdechovaných nanočástic do periferní a následně centrální nervové soustavy (převzato z Öberdorster a kol. 2005). Kožní translokace Příjem kůží je ovlivněn mnoha faktory, jako je integrita kožní bariéry, kontaminace povrchu, přítomnost kožních onemocnění (Crosera a kol. 2009). Kožní translokace je velmi pečlivě studována v případě nanočástic z TiO₂ a ZnO od té doby, co jsou používány v opalovacích krémech jako ochrana proti UV záření. V několika studiích, kde docházelo k opakované aplikaci nanočástic TiO₂ na zdravou kůži člověka a různých savců (Baenza-Squiban a Lanone 2011), zůstávaly nano- 39

40 částice na kůži nebo v horní vrstvě epidermis (stratum corneum) a nikdy nebyly prokázány ve vrstvách živých buněk v epidermis. Podobné výsledky byly dosaženy i pro nanočástice ZnO (Crosera a kol. 2009). Některé z nanočástic však mohou penetrovat kůží hlouběji než konvenční materiály a být translokovány v těle, je však důležité přesně zjistit, kdy a jak se to může stát. Některé studie ukázaly potenciál nanočástic pronikat do dermis a uložit se v regionálních mízních uzlinách. Jiné studie nepodaly důkaz, že nanočástice pronikají skrz zdravou kůži (Abbott a Maynard 2010). Nanočástice se mohou akumulovat ve vlasových folikulech a tvořit určitou rezervu persistujících nanočástic. Zatím neexistují důkazy o tom, že by nanočástice přecházely z vlasových folikulů do dermis. Současný stav poznání pro testované nanočástice jako celek ukazuje, že nanočástice ve skutečnosti mohou penetrovat přes epidermis, nebo dermis, ale kožní přenos je nepravděpodobný přes nepoškozenou kůži (Baenza-Squiban a Lanone 2011). Translokace přes placentu Možnost přechodu nanočástic z krevního oběhu přes placentární bariéru a fetotoxického působení není zatím úplně jasná (Baenza-Squiban a Lanone 2011), ale je možná (Abbott a Maynard 2010). Lze tedy shrnout, že nanočástice jsou schopny vstupovat do organismu nejsnáze po intravenózní, inhalační a perorální expozici. Tyto materiály vykazují potenciál pronikat až do krevního a lymfatického řečiště, odkud již mohou být roznášeny v rámci organismu ke kterémukoli cílovému orgánu (obr. 25). Po expozici nanočásticím byla experimentálně prokázána jejich přítomnost v mnoha orgánech (játra, levniny, srdce, kostní dřeň aj.). Organismus však je schopen tyto materiály rovněž vylučovat močí a exkrementy. Není zatím potvrzeno vylučování nanočástic potem a mateřským mlékem, avšak i tyto exkreční dráhy jsou hypoteticky možné (Öberdorster a kol. 2005).... Obrázek 25: Schéma vstupních drah nanočástic do organismu, jejich translokace a exkrece (plné potvrzené dráhy, přerušované předpokládané dráhy) (převzato z Öberdorster a kol. 2005). 40

41 4.7. Biodistribuce nanočástic v organismu z hlediska jejich eliminace Nanočástice přítomné v organismu mohou být eliminovány dvěma způsoby: močí po filtraci v ledvinách a stolicí po přenosu do jater. Nanočástice, které nemohou být eliminovány ledvinami, se koncentrují v játrech. Eliminace ledvinami zahrnuje glomerulární filtraci, tubulární sekreci a eliminaci močí (obr. 26).... Obrázek 26: Fyziologie nefronu, zajištujícího glomerulární filtraci, tubulární reabsorbci, tubulární sekreci přispívající k filtraci krve (převzato z Chiras 2001). Filtrace molekul přes glomerulární kapilární stěnu závisí na jejich velikosti. Částice o velikosti 5,5 nm mohou být filtrovány, pokud jejich průměr odpovídá průměru pórů ve vaskulárních endoteliálních buňkách. Částice větší než 8 nm zůstávají v krevním oběhu a zabývá se jimi retikulo-endoteliální systém. Pokud se rozměr částic pohybuje mezi 5,5 8 nm, záleží na elektrickém náboji (a negativním náboji kapilárních stěn), zda budou částice adsorbovány na molekuly nebo odstraněny glomerulární filtrací. Glomerulární filtrace je nejvhodnější pro částice velikosti 6 8 nm o neutrálním nebo pozitivním náboji. V tubulu nemohou být filtrované nanočástice reabsorbovány tubulárním epiteliem (Baenza-Squiban a Lanone 2011). V játrech jsou zachycovány a odstraňovány částice o velikosti nm pomocí hepatických epiteliálních buněk (hepatocytů) a Kuppfferových buněk. Hepatocyty (60 % jaterních buněk) jsou schopné endocytózy, enzymaticky degradují nanočástice a přes žluč je odstraňují z jater. Kuppfferovy buňky jsou makrofágy patřící do retikulo-endoteliálního systému (40 % jaterních buněk), které na svém povrchu nesou mnoho receptorů pro opsonizované nanočástice, jenž snadno fagocytují. Odstranění nanočástic Kuppfferovými buňkami je založeno čistě na intracelulární degradaci. Nanočástice zůstávají v Kuppfferových buňkách a následně jsou odstraněny z organismu. Nanočástice nalezené v játrech jako např. nanočástice stříbra, TiO₂ nebo fullereny pravděpodobně nejsou metabolizovány jaterními en- 41

42 zymy. Funkcionalizované nanočástice mohou v játrech ztratit svůj obal nebo být modifikovány (Baenza-Squiban a Lanone 2011). Toxické substance absorbované trávicí cestou se dostávají do jater portální žílou (obr. 27), nanočástice absorbované jinou cestou pomocí jaterní tepny. Krev dosahuje horní duté žíly přes sinosuidální kapiláry. Hepatocyty tvoří monovrstvu okolo každé kapiláry a produkují žluč. Kuppfferovy buňky jsou umístěné v sinusoidálním lumenu.... Obrázek 27: Schéma funkční jednotky jater (převzato z Baenza-Squiban a Lanone 2011). 42

43 5. Interakce nanomateriálů s biologickými systémy Nanomateriály složené z nanočástic nebo různě velkých nanostrukturovaných celků mají vysokou povrchovou energii a velice snadno reagují se složkami prostředí, ve kterém se nacházejí. Volné nanomateriály (tzn. primární částice) mají tendenci aglomerovat nebo agregovat a výsledkem jsou větší částice (tzn. sekundární částice), které si mohou zachovávat některé vlastnosti nanobjektů, např. vysoká plocha povrchu a s tím související reaktivita. Často je pozorován trend, kdy v souvislosti se shlukováním primárních částic se snižuje jejich biologická aktivita. Avšak různé modifikace povrchu nanomateriálů jako je potažení, pokrytí surfaktanty nebo ionty může zvyšovat nebo naopak bránit v tendenci nanomateriálů aglomerovat nebo agregovat. Aglomerace nebo agregace částic může významnou měrou ovlivnit jejich výsledný toxický charakter. Aglomeráty (popř. agregáty) nanomateriálů se mohou při změně podmínek prostředí nebo při přechodu do nového prostředí rozpadat a znovu vznikat, a tím se může měnit jejich biologická dostupnost a tím také toxicita. Biologickou dostupnost (biodostupnost) lze rozlišit na externí a interní. Externí biodostupnost je definována jako schopnost dané látky přecházet do roztoku a být uvolněna do různých médií (voda, půda, potraviny, aj.). Jako interní biodostupnost se označuje schopnost dané látky být absorbována živými organismy a transportována k cílovým orgánům, kde může vyvolat jisté toxické účinky (Caussy a kol. 2003). V literatuře se lze často setkat s tím, že pojmem biodostupnost jsou označovány oba výše uvedené typy, tj. externí i interní.... Obrázek 28: Změny biologické dostupnosti nanočástic (NP) interakcemi s organickými látkami (OM), anorganickými ionty (IS) a jinými toxikanty (Tox A, B) (převzato z Navarro a kol. 2008). Biodostupnost nanočástic v životním prostředí a jejich schopnost pronikat do živých organismů může být ovlivněna například přítomností různých chemických látek v prostředí (obr. 28). V půdách, kde jsou přítomny organické látky produkované půdními organismy (polysacharidy, glykoproteiny, fulvo- a huminové kyseliny) bude docházet k navázání těchto biopolymerů na nanomateriály, čímž může docházet k jejich stabilizaci v dispergované formě a snadnějšímu průniku do živých organismů. Stejně tak mohou maskovat nanočástice některé toxikanty a zvyšovat tak jejich biodostupnost. Opačný účinek, tj. snížení biodostupnosti 43

44 mohou vykazovat např. anorganické ionty, které mohou zvyšovat stupeň agregace/aglomerace částic a tím znesnadňovat průnik do organismu (Navarro a kol. 2008) Interakce částic s biomakromolekulami v organismu Biologická aktivita nanomateriálů primárně závisí na tom, jak jsou koordinovány jejich interakce s biologickými makromolekulami a jejich okolím. Chemické vlastnosti povrchu nanomateriálů a jejich velikost (zakřivení) určují, s jakými biologickými molekulami a jakým způsobem budou nanomateriály interagovat a jaký vliv budou mít tyto interakce na částice samotné i na navázané biomolekuly (př. zda dojde ke stabilizaci jejich struktury nebo naopak k destabilizaci, tzn. ke ztrátě nebo zachování funkce). Velikost částice určuje její zakřivení, tzn. čím je částice větší, tím bude mít nižší povrchové zakřivení, naopak čím je menší, tím větší je i zakřivení jejího povrchu. Nejmenší zakřivení je u planárních povrchů. Širší částice poskytují větší povrch pro kontakt adsorbovaných proteinů a interakce, které vznikají mezi proteinem a nanočásticí, jsou mnohem silnější. Vyšší stupeň interakce vede k většímu poškození struktury proteinu, než u menších částic, viz obr. 29 (Fei and Perrett 2009).... Obrázek 29: Interakce proteinů s částicemi o různých velikostech (převzato z Fei and Perrett 2009) Fibrilace proteinů v důsledku působení nanomateriálů Nanočástice mohou ovlivňovat fibrilaci (agregaci do vláken) u proteinů. U proteinu amyloidu β (protein nacházející se v neuronech mozku) je považována agregace proteinů do amyloidních vláken za patologickou známku mnoha nemocí včetně Alzheimerovy choroby nebo Parkinsonovy choroby. Tento protein je používaný jako modelový protein při studování vlivu nanočástic na fibrilogenezi proteinů a potenciální aplikaci nanočástic při ošetření neurodegenerativních onemocnění. Fibrilogeneze je nukleárně růstový proces, který vede ke konverzi monomerního amyloidu do amyloidních fibril a plaků. Tento proces je široce ovlivněn přítomností různých biologických a cizích povrchů, př. ENM, dendrimery a velkými částicemi, neboť amyloidní proteiny mají tendenci hromadit se na fázových rozhraních. Dochází v podstatě ke konformační změně nedefektního proteinu v defektní. Vliv na agregaci do amyloidních vláken má spíše chemická podstata a náboj na 44

45 povrchu nanočástice, než zakřivení povrchu a jeho koncentrace (důležitý je i poměr koncentrací proteinu a nanočástic). Různý stupeň fibrilace u proteinů byl popsán pro nanočástice zlata, u kationtových polystyrenových částic (v závislosti na poměru koncentrací mezi nanočástic a proteinem) a TiO₂. Naopak u fullerenů, polypegylovaných fosfolipidových nanomicel, popř. fluorinátových nanočástic byla zaznamenána inhibice agregace u proteinu amyloidu β, nebo jejich působení v konečném měřítku k agregaci proteinů nevedlo. Pokud jsou nanomateriály schopny inhibovat proces fibrilogeneze nebo způsobit rozpad amyloidních fibril, mají velký potenciál být použity jako léčivo pro kontrolu neurodegenerativních amyloidních onemocnění, jako je např. Alzheimerova choroba. Tendence k nukleaci byla pozorována i u β2-mikroglobulinu po působení kvantových teček nebo uhlíkatých nanotrubic v in vitro pokusech. Jedná se o velmi hojný protein v centrálním nervovém systému a vzhledem k tomu, že nanomateriály mohou migrovat po čichovém nervu do mozku, naskýtá se otázka, nakolik je toto pozorování zásadní (in vivo studie zatím nebyly provedeny) (Fei a Perrett 2009, Cabaleiro-Lago a kol. 2010, Baenza-Squiban a Lanone 2011) Vznik korony Na nanočástice přítomné v organismu se adsorbují proteiny tělních tekutin a vytvářejí kolem nich tzv. koronu. Tělní tekutiny př. krev jsou vysoce koncentrované roztoky, resp. suspenze. Koncentrace intracelulárních proteinů může dosahovat více než 300 mg/ml, což je významně vyšší podíl než ve zředěných roztocích, které se používají pro konjugaci nanomateriálů nebo biofyzikální charakterizaci. Složení korony kolem nanomateriálů je závislé na složení prostředí, ve kterém se nanomateriály právě nacházejí a na jejich fyzikálně-chemických vlastnostech (chemickém složení, vlastnostech povrchu a velikosti částic) (Baenza-Squiban a Lanone 2011, Fei a Perrett 2009, Park a Hamad Schifferli 2010, Walczyk a kol. 2010). Velké množství proteinů korony se naváže ihned po kontaktu s nanočásticemi, pak již v menším měřítku dochází k postupné výměně méně afinitních proteinů za proteiny s větší afinitou tak, aby bylo dosaženo rovnováhy s prostředím. Proteiny krevní plazmy mají různou afinitu k nanočásticím, např. albumin a fibrinogen vytvářejí mnohem silnější vazbu než apolipoprotein A. Některé makromolekuly se velice pevně vážou na nanočástice a vytvářejí kolem nich tzv. tvrdou koronu. U proteinů této korony dochází jen k pomalé výměně s volnými proteiny. Na povrchu tvrdé korony je vnější vrstva, kde jsou asociovány slabě se vázající proteiny, u kterých probíhá rychlá záměna s volnými proteiny plazmy (obr. 30). V plazmě tedy probíhá výměna proteinů mezi nanočásticemi a plazmou, mezi nanočásticemi a buňkami. Pouze u omezeného počtu a typů makromolekul dochází ke kompetici o zakřivený povrch nanočástic. Výsledná korona tak obsahuje malé množství většinou identifikovatelných proteinů, které jsou v mnoha případech odlišné od těch, které se adsorbují na rovné povrchy ze stejného materiálu. Okolo nanočástic mohou vznikat velmi trvalé korony nebo nové typy organizovaných uskupení protein-nanočástice (multimerický komplex protein-nanočástice) (Schultze a Schafer 2010). Některé nanočástice mají pouze slabou koronu, kde biomolekuly 45

46 slabě interagují s povrchem nanomateriálu, např. pegylované nanočástice (tzn. s vrstvou polyetylen glykolu) (Walczyk a kol. 2010).... Obrázek 30: Náčrt možného scénáře a) výměny/interakcí na rozhraní mezi nanočásticemi a biomolekulami na buněčné úrovni, b) struktury komplexů nanočástice-protein v plazmě (převzato z Walczyk a kol. 2010). V daném prostředí určuje korona biologickou identitu ENM. Závisí na ní, v jak velkém měřítku bude nanočástice přijímána do buněk a jaký bude osud nanočástice v organismu, její zachycení tkáněmi a podoba zánětlivé a imunologické odpovědi organismu. I malé změny v morfologii nebo ve struktuře nanomateriálů mohou mít za následek vznik rozdílných koron. Otázkou je, zda tyto rozdílné korony mohou mít také rozdílné biologické účinky. Korona může také odhalit rozdíly, které nebyly zjištěny např. morfologickými měřeními (Schultze a Schafer 2010). Rozdíly mezi biologickými tekutinami např. v koncentraci a složení proteinů vedou ke vzniku velmi rozdílných koron a také k velmi odlišnému příjmu a osudu nanočástic v organismu. Korony mají různě dlouhý čas retence v daném prostředí (od mikrosekund po hodiny). Změna lokalizace částice (např. v buňce) vede ke změně a následné obnově korony podle složení nového prostředí (nanočástice, které byly nejprve inkubovány v plazmě a poté v cytosolu buněk, obsahovaly proteiny z obou prostředí) (Ludqvist a kol. 2011). Korona má také vliv na disperzní charakteristiky nanočástic (Walczyk a kol. 2010). Z výše uvedených informací je evidentní, že korona je velmi specifická pro dané prostředí a nanočástice, naskýtá se tedy otázka, zda by kromě tvaru, velikosti a schopnosti agregace, bylo možné nanočástice klasifikovat také podle jejich biologické identity (složení korony, času zdržení, struktury korony a výměnné rychlosti korony). Nanočástice o stejné velikosti, složení korony a výměnného času molekul na koroně mohou mít stejnou biologickou identitu. Příjem a lokalizaci nanočástic je možné mapovat v průběhu času na molekulární úrovni. V časné fázi přijetí částice buňkou (1 6 h) dochází ke zvýšení produkce intracelulárních přenašečů (ROS, ATP, vápník), poté ve střední fázi (6 9 h) přecházejí nanočástice do lysozómů a mitochondrií, kde jsou spuštěny různé reakce vedoucí až ke ztrátě potenciálu na mitochondriální membráně (spotřebování ATP). V pozdní fázi (9 24 h) jsou aktivovány reakce vedoucí postupně k apoptóze, autofagocytóze nebo nekróze buňky (např. fragmentace DNA) (Fei and Perret 2010). 46

47 5.2. Imunitní odpověď na vstup nanočástic do organismu V závislosti na cestě vstupu je v ideálním případě nanočástice rozpoznána v těle jako cizorodá látka a může být opsonizována. Opsonizace znamená, že se na antigeny (cizorodé látky nebo tělesa nanočástice) naváží tzv. opsoniny (protilátky nebo složky komplementu). Opsoniny navázané na antigen (tj. nanočástici) jsou poté rozpoznány pomocí Fc receptoru na povrchu fagocytů (makrofágů nebo neutrofilů) a mohou být následně fagocytovány i s nanočásticemi. Všechny tyto interakce mají význam před počátkem zánětlivé reakce. Jiné mechanismy rovněž hrají důležitou roli, a to v závislosti na cestě vstupu, např. při vstupu respirační cestou jsou ultrajemné atmosférické částice obaleny surfaktantem a dalšími složkami přítomnými v bronchoalveolární tekutině, což způsobí jejich agregaci a snadnější rozpoznání makrofágy. Molekulární markry vylučované v průběhu zánětu cytokiny, mohou reagovat s nanočásticemi a modifikovat imunitní odpověď. Tyto interakce závisejí na typu částice a typu cytokinu (Baenza-Squiban a Lanone 2011). 47

48 6. Mechanismy toxického účinku nanočástic V případě, že dojde k průniku nanočástic do organismu některou z možných expozičních drah a další translokaci k cílovým tkáním a orgánům, mohou tyto materiály vyvolat řadu poškození biologických struktur. Vzhledem k velmi různorodým účinkům nanomateriálů na úrovni molekulární, buněčné a tkáňové bude v této kapitole věnována pozornost vybraným toxickým účinkům, jako je oxidativní stres a poškození DNA. Nanomateriály mohou penetrovat do buněk několika způsoby (obr. 19). Nanočástice mohou pronikat přímo do jádra, a to buď difúzí přes jadernou membránu (pokud jsou dostatečně malé), nebo jsou transportovány přes komplexy jaderných pórů, nebo mohou být náhodně uzavřeny v jádře při rozpuštění jaderné membrány v průběhu mitózy následujícího buněčného dělení a obnovení této membrány v dceřiných buňkách. Nanočástice v jádře mohou posléze přímo interagovat s molekulami DNA nebo proteiny asociovanými s DNA, což vede k fyzikálnímu poškození genetického materiálu. Nanočástice mohou ovlivňovat DNA přímo, ale také nepřímo, kdy interagují s buněčnými proteiny např. zahrnutými do procesu buněčného dělení (Singh a kol. 2009). Nanočástice v buňce mohou rovněž pronikat z cytosolu nebo fagozómů do lysozómů a mitochondrií. Již v časné fázi vstupu do buňky dochází ke zvýšení produkce různých přenašečů (ROS, ATP a vápník) a aktivaci různých signálních drah, které vedou k buněčným odezvám, jako je např. vznik oxidativního stresu nebo zánětu, jež rovněž v závislosti na stupni jejich intenzity mohou způsobit poškození DNA. V mitochondriích jsou spuštěny různé reakce vedoucí až ke ztrátě potenciálu na mitochondriální membráně (spotřebování ATP) (Singh a kol. 2009). Dané procesy jsou shrnuty na obrázku Obrázek 31: Nepřímé mechanismy vedoucí ke genotoxicitě (dle Singh a kol. 2009). V pozdní fázi vstupu nanočástic do buňky mohou být aktivovány reakce (např. fragmentace DNA) vedoucí postupně k apoptóze (programovaná smrt buňky), autofagocytóze nebo nekróze (Baenza-Squiban a Lanone 2011). 48

49 Po expozici nanočástic nemusí nutně dojít ke smrti buňky, ale může být pozměněna pouze její genetická informace, ať již přímým nebo nepřímým působením ENM. Buňka sice přežije, ale pro organismus jako celek má tato situace mnohem závažnější důsledky. Poškození v DNA může být zafixováno jako mutace (trvalá změna dědičné informace v DNA). Některé typy mutací mohou indukovat iniciaci karcinogeneze, pokud se týkají pohlavních buněk, může dojít k ovlivnění plodnosti a zdraví dalších generací (Singh a kol. 2009) Oxidativní stres Za klíčový mechanismus toxicity nanomateriálů je považován tzv. oxidativní stres. Mnoho studií uvádí jeho indukci po působení ultrajemných atmosférických částic, stejně tak jako některých cíleně vyrobených nanočástic (Baenza-Squiban a Lanone 2011, Singh a kol. 2009, Hubbs a kol. 2011, Xie a kol. 2011, Nel a kol. 2006). Za příznivých podmínek existuje v organismu rovnováha mezi reaktivními formami kyslíku (angl. reactive oxygen species ROS) a antioxidanty. Tato rovnováha je považována za jeden z parametrů homeostáze, neboť redoxní stav ovlivňuje celou řadu signálních molekul ( SH skupiny, NO). Pokud je tato rovnováha z nějakého důvodu porušena, vzniká tzv. oxidativní stres, který představuje porušení rovnováhy mezi vznikem a odstraňováním reaktivních forem kyslíku (obr. 32). Tento stav je vyvolán zvýšenou tvorbou kyslíkových radikálů nebo snížením kapacity antioxidativního systému. Jedná se o volné radikály (O2, HO, RO, HOO, ROO, NO ), což jsou molekuly nebo atomy, které mají ve své valenční sféře jeden nebo více nespárovaných elektronů. ROS: a) vznikají během osvitu UV, rtg a gama zářením, b) jsou produkty reakcí katalyzovaných kovy, c) jsou přítomny jako polutanty v atmosféře, d) jsou produkovány neutrofily a makrofágy během zánětlivé reakce organismu (Valko a kol. 2006). Byla prokázána schopnost ENM generovat ROS in vivo, ale také in vitro zejména po expozici UV záření nebo nanočásticím kovů (Zhao a Nalwa 2007).... Obrázek 32: Oxidativní stres je výsledkem nerovnováhy mezi hladinou antioxidantů a reaktivních kyslíkových forem (převzato z Scandalios 2005). 49

50 Produkci ROS mohou vyvolat exogenní faktory jako ozon, xenobiotika (benzo(a)- pyren), molekuly přicházející redoxním cyklem (chinony, paraquat), azbest (Baenza- Squiban a Lanone 2011). ROS mohou být produkovány endogenně (fyziologicky). Kromě již zmíněných makrofágů a neutrofilů mohou vznikat přirozeně v každé buňce organismu, dále v mitochondriálním respiračním řetězci, při metabolismu (cytochrom p450, oxidáza xantinu), v peroxyzómech, fagocytozómech, během produkce sekundárních přenašečů (lipoxygenázy, cyclooxigenázy), při autooxidaci (hemoglobin, myoglobin, redukce cytochromu c, redukce quinonů, redukce flavinů, redukce kyseliny citrónové). Pokud jsou ROS produkovány a uvolňovány kontrolovatelným způsobem, přispívají k homeostázi buněk, ovlivňují signální transdukci, regulují expresi redox-senzitivních genů. Fyziopatologické mechanismy se objevují, pokud dojde k nadprodukci ROS nebo pokud není organismus schopen ubránit se sám v důsledku nedostatku v antioxidační kapacitě (enzymy jako kataláza, glukanthonoxidáza apod.). Produkce ROS může být také vyvolána exogenními faktory. Schématicky jsou uvedené faktory a jejich možné působení znázorněny na obrázku Obrázek 33: Schéma znázorňující některé iniciátory reaktivních kyslíkových druhů (ROS) a biologické následky vedoucí k různým fyziologickým dysfunkcím, které mohou vést až k buněčné smrti (převzato z Scandalios 2005) Mechanismy produkce ROS nanočásticemi Mechanismy, kterými nanomateriály generují produkci ROS, lze rozdělit do tří hlavních skupin: produkce daná podstatou nanomateriálů, produkce vznikající interakcí s buněčnými cíli, produkce zprostředkovaná zánětlivou reakcí. a) Produkce ROS daná podstatou nanomateriálů Reaktivita přechodných kovů na povrchu nanočástic, ale také přítomnost oxidujících skupin (např. chinony) se podílí na produkci ROS. Vznik ROS katalyzovaný přítomnými kovy je označován jako Fentonova reakce, která je založena na reakci, již lze obecně označit jako reakci peroxidu vodíku (H₂O₂) s ionty kovů (Me(II)) za vzniku ROS. Reakce probíhá ve více krocích 50

51 za vzniku různých radikálů: Me² + + H₂O₂ = Me³ + + HO + HO (1) Me³ + + H₂O₂ = Me(OOH)² + + H + (2) Me(OOH)² + = Me² + + HOO (3) Reakce dvojmocných iontů kovu s peroxidem vodíku (reakce 1) je označována jako Fentonova reakce, kterou dochází ke vzniku vysoce reaktivních hydroxylových radikálů (HO ). Reakcí trojmocných iontů kovu dochází k regeneraci iontů dvojmocných (reakce 2, 3), které se opět mohou účastnit Fentonovy reakce (Martínez 2007). Kovy, které mohou vstupovat do Fentonovy reakce, jsou v literatuře označovány jako tzv. redox-aktivní a jedná se např. o Fe, Cu, Cr, Co (Jomova a Valko 2011). Elektronové transferové mechanismy ve vztahu k semikonduktivním vlastnostem některých nanokomponentů se rovněž podílejí na produkci ROS. Bioaktivací PAH a jejich nitroderivátů (nitro-pah, mnohem více genotoxické, mutagenní a karcinogenní než u jejich nesubstituovaných forem), které jsou adsorbované na povrch nanočástic, a následné zahrnutí nitroreduktázy do tohoto děje vede k přímé produkci ROS. b) Produkce ROS interakcí s buněčnými cíli Tento mechanismus zahrnuje mitochondriální změny (po distribuci a akumulaci nanočástic v mitochondriích buňky), interakce s respiračním řetězcem elektronů nebo změny enzymového mechanismu antioxidativní obrany. c) Produkce ROS zprostředkovaná zánětlivou reakcí Hlavní proces, kterým nanočástice generují oxidativní stres. O tomto procesu bude pojednáno dále v kap Následkem oxidativního stresu může být zánětlivá odpověď organismu (zánět), modulace, proliferace a diferenciace buněk nebo v konečném důsledku buněčná smrt (Nel a kol. 2006). Produkce ROS může být také spojena s genotoxicitou. Současné studie (Baenza-Squiban a Lanone 2011) uvádějí, že u nanomateriálů může být oxidativní stres centrálním faktorem jejich toxicity. Poškození může být buď přímé vlivem působení ROS v cílové tkáni, nebo nepřímé, kdy ROS vyvolají produkci zánětu a mediátorů imunitního systému dojde k aktivaci určitých signálních drah př. mitogenem aktivované protein kinázy MAPK nebo NF-kB, které společně s vyčerpáním antioxidantů vedou k uvolnění pro-zánětlivých cytokinů. Celkovými výsledky této kaskády je spuštění zánětu obranné reakce organismu, která vede k dalšímu uvolnění ROS ze zánětlivých buněk např. neutrofilů (Singh a kol. 2009). Při oxidativním stresu mohou být deaktivovány antiproteázy a současně aktivovány metaloproteázy, což vede k proteolýze a nekontrolované destrukci buněk. Aktivací transkripčních faktorů citlivých k oxidativnímu stresu začíná transkripce genů pro-zánětlivých faktorů a dochází k uvolňování mnoha zánětlivých mediátorů. Někteří autoři uvádějí, že zánět je primární odpovědí a oxidativní stres je jeho následek (Baenza-Squiban a Lanone 2011). 51

52 Částice jsou organismem přijímány jako cizí tělesa a musejí být eliminovány pomocí imunitní reakce. Před eliminací částic z těla jsou rozpoznány buňkami imunitního systému (makrofágy, popř. buňkami, které pokrývají cílovou tkáň), klíčovou roli hrají právě jejich interakce s nanočásticemi. Obě skupiny buněk mají schopnost vyvolat zánět a ten pak může akcelerovat produkci ROS a redukovat antioxidativní obrannou kapacitu organismu. Dnes jsou ROS považovány za sekundární přenašeče, jejichž hlavním úkolem je vyvolat zánět. Zánětlivá reakce udržuje a preferuje podmínky oxidativního stresu, který zpětně akceleruje přijímání a aktivaci zánětlivých buněk. Zánět a oxidativní stres spolu velice úzce souvisejí (Baenza-Squiban a Lanone 2011) Antioxidační odpověď organismu V první fázi obrany organismu dochází k eliminaci ROS a katalyzátorů jejich produkce, k ukončení propagace řetězových radikálových reakcí a k snížení produkce enzymů, které je tvoří. To se děje buď záchytem a odstraněním již vzniklých radikálů pomocí antioxidantů, nebo vyvázáním (chelatací) přechodných kovů pomocí metaloproteáz. V druhé fázi obrany dochází k syntéze antioxidantů, a to enzymů nebo neenzymatických bílkovin či nízkomolekulových antioxidantů. Ve třetí fázi dochází k nárůstu aktivity reparačních mechanismů s cílem eliminovat poškozené molekuly. Antioxidační systémy lze rozdělit na enzymatické a neenzymatické. Enzymatické antioxidační systémy vytvářejí méně toxický produkt, který předávají dále nebo přímo rozkládají a jejich aktivitu lze biochemicky stanovit (superoxiddismutáza, kataláza, thioredoxin reduktáza, glutanthionperoxidáza, hem-oxigenáza). Neenzymatické antioxidanty inaktivují radikál přeměnou na méně toxický produkt schopný exkrece nebo metabolizmu (zhášeče, lapače). Podle působení na produkci ROS se antioxidanty dělí na: a) regulující hladiny volných kovů, tím zabrání tzv. Fentonovým reakcím (extracelulární lactoferin, transferin, ceruloplazmin nebo intracelulární ferritin). b) přerušující propagaci u radikálových řetězcových reakcí (glutathion GSH/ GSSG, vitamíny A, E alfa-tokoferol, vitamín C kyselina citronová, karotenoidy) (Favier 2003) Negativní účinky ROS ROS mohou atakovat biologické makromolekuly, jako jsou sacharidy, nukleové kyseliny, lipidy a proteiny. Porušují jejich chemickou strukturu a pozměňují jejich biologické funkce. ROS reagují nespecificky, tedy mohou ovlivnit všechny molekuly, se kterými přijdou do styku, zejména nenasycené lipidy, některé aminokyseliny, aromatické složky. Výsledná poškození způsobená ROS závisí na jejich produkci. U produkce, která je sice vysoká, ale pouze dočasná, kde ROS slouží jako sekundární přenašeče, dochází k reversibilním modifikacím proteinových aktivit (u transkripčních faktorů, proteinových kináz, proteinových fosfatáz). Pokud je produkce ROS vysoká a dlouhodobá, dochází k oxidativnímu stresu, který vede 52

53 k peroxidaci lipidů, masivní a nevratné oxidaci proteinů a oxidaci DNA (změnám ve struktuře DNA). Peroxidace lipidů, což je vlastně oxidace více nenasycených mastných kyselin v buněčných membránách, může vést k poškození, případně úplné dezintegraci membrán nebo ke vzniku cytotoxických nebo mutagenních meziproduktů. U proteinů v závislosti na stupni oxidativního poškození dochází k omezení aktivity, rozbalení a ztrátě biologické aktivity nebo k překřížení s jinými proteiny popř. k fragmentaci peptidového řetězce. Z proteinů jsou vůči oxidativnímu poškození nejvíce citlivé ty, které nesou aminokyseliny s atomy síry (methionin, cystein) nebo sulfhydrylovou skupinu ( SH). Jedná se o mnoho transportních a buněčných proteinů. Hydroxylový radikál (HO ) také specificky reaguje s dvojnými vazbami aromatických aminokyselin. Peroxid vodíku je, ve srovnání s radikály, poměrně stabilní sloučeninou, proniká v tělních tekutinách i na značnou vzdálenost. S biologickými molekulami reaguje relativně pomalu. U DNA v důsledku působení ROS (zejména HO ) může dojít k: modifikacím DNA bazí (např. konverzi guaninu na 8-oxoguanin, adeninu do 8-oxoadeninu, tyminu do glykol tyminu a 5-hydroxymethyluracilu), ke zlomu jednoho nebo obou řetězců DNA, vzniku abazidických míst, adukci s produktem peroxidace lipidů nebo k překřížení s proteiny. Těmito procesy může být ovlivněna i struktura volných chromatinových proteinů, jako jsou histony nebo replikační a transkripční faktory a enzymy. Jako následek těchto poškození mohou vznikat např. mutace, následné translační chyby (chyby v přepisu do struktury proteinů) a inhibice proteosyntézy (Nel a kol. 2006, Favier 2003) Buněčná odpověď na oxidativní stres Výsledné poškození na úrovni buněk v důsledku oxidativního stresu závisí na jeho stupni (obr. 34). V buňce dochází díky aktivaci membránových receptorů k produkci ROS. Dle míry oxidativního stresu jsou aktivovány různé transkripční faktory a signalizační cesty, dochází k transkripci příslušných genů (pro antioxidační enzymy, mediátory zánětu včetně cytokinů) nebo dojde ke spuštění některé signalizační dráhy vedoucí k apoptóze buňky (Nel a kol. 2006, Favier 2003) Oxidativní stres a nanomateriály Většina dostupných studií poukazuje na těsný vztah mezi expozicí nanočásticím a oxidativním stresem (Singh a kol. 2009). Jedná se o problematiku velmi komplexní, která závisí na mnoha strukturních vlastnostech nanomateriálů, proto je třeba výsledky posuzovat pro každý typ ENM zvlášť a vyhnout se generalizování. 53

54 ... Obrázek 34: Postupné paradigma oxidativního stresu (převzato z Nel a kol. 2006). Za klíčové vlastnosti vedoucí k jeho indukci jsou považovány: chemické složení (např. přítomnost tranzitních kovových katalyzátorů), velikost částic, vlastnosti povrchu nanočástic (př. velká plocha povrchu). Indukce oxidativního stresu byla pozorována u mnoha nanomateriálů. Schopnost indukovat oxidativní stres byla prokázána u atmosferických prachových částic vznikajících jako vedlejší produkty dopravy, spalovacích procesů, aj. Jednak mohou být tyto částice fagocytovány, čímž mohou přímo vyvolat zánětlivou odpověď organismu, a také nesou na svém povrchu vysoce reaktivní elementy, jako jsou např. organické složky (PAH polycyklické aromatické uhlovodíky), chinony, kovy a jejich sloučeniny. Ultrajemné atmosférické částice (< 100 nm) indukovaly tvorbu většího množství volných radikálů než větší atmosférické částice. Může to být způsobeno velikostí povrchu menších částic a s tím souvisejícím větším množstvím zachycených kontaminantů, s čímž následně souvisí i větší produkce ROS. U některých skupin nanočástic byla pozorována větší toxicita (fragmentace chromatinu, produkce ROS) než u větších částic stejného složení (TiO₂, CeO₂). Oxidy titanu a kobaltu vyšly v in vitro pokusech toxičtější než ultrajemné atmosferické částice. Obecně se dá říci, že většina klíčových nanomateriálů je schopna v in vitro pokusech na různých buněčných kulturách (jak lidských, tak i jiných savců) indukovat oxidativní stres, tj. produkci ROS. Cytotoxicita a produkce ROS byla prokázána u různých typů nanočástic jako TiO₂, ZnO, CeO₂ a saze na lidských buněčných liniích bronchiálních buněk 16HBE, fibroblastech, NIH3T3, alveolárních epiteliárních buňkách linie SV40T2, alveolárních makrofázích, renálních epiteliálních buňkách LUC-PK1, aj. Indukce oxidativního stresu byla pozorována také u nanočástic stříbra při in vitro pokusech na buňkách epidermis (linie A431, HT1080). Docházelo rovněž k fragmentaci DNA, peroxidaci lipidů a následně apoptóze buňky v závislosti na dávce ENM. Produkce ROS byla pozorována rovněž u fullerenů, uhlíkatých nanotrubic, kvantových teček a ultrajemných atmosférických částic, pokud byly vystaveny světlu (zejména UV záření) nebo přechodným kovům. 54

55 Souběžně byla indukce oxidativního stresu prokázána v in vivo pokusech na krysách a myších. Byla pozorována i neurotoxicita po expozici nanočásticím SiO₂ u myší, generace ROS a oxidativní poškození DNA v mozku myší působením nanočástic stříbra. Také expozice samice myši nanočásticím TiO₂ pozměnilo expresní hladiny genů spojených s apoptózou a oxidativním stresem u novorozených myších mláďat (viz review Baenza-Squiban a Lanone a kol. 2011, Nel a kol. 2006, Favier 2003) Akutní a chronická zánětlivá odezva Zánět se označuje jako souhrn fyziologických reakcí na porušení integrity organismu, které vedou k ochraně proti infikování poškozeného místa, k lokalizaci poškození a zhojení. Zánět mohou vyvolávat různé antigenní podměty jako infekční mikroorganismy, ale také poranění způsobená chemickými nebo fyzikálními vlivy nebo ischemií (nedokrevností) tkáně. Odezva organismu na poškození v závislosti na jeho rozsahu a délce trvání může být místní nebo celková. Zánět může být akutní nebo chronický. Akutní zánět obvykle odeznívá bez následků, poraněná tkáň se kompletně zhojí, jedná se o fyziologickou obranu organismu. Naopak při chronickém zánětu dochází vždy v určité míře k destrukci tkáně a jejímu nahrazování vazivem, jedná se již o patologickou situaci (Chiras 2001). Běžný zánět probíhá v několika krocích, které jsou uvedeny na obr. 35 (Baenza- Squiban a Lanone 2011): 1. Rozpoznání cizorodých činitelů a spuštění obranných reakcí (první signál k zánětu dávají degranulované tkáňové žírné buňky a fagocyty, látky uvolňované z poškozených buněk, části mezibuněčné hmoty obnažené poškozením). 2. Vaskulární odpověď v cévách vedoucí k vazodilataci (tj. rozšíření cév a zvýšení jejich permeability). 3. Aktivace endoteliálních buněk a oběhových buněk v krvi, polynukleárních neutrofilů, poté monocytů, které migrují přes endotelium do tkání, kde je cizí těleso umístěno. 4. Uvolnění mediátorů preferující eliminaci cizího tělesa z těla fagocytózou. 5. Oprava poškozených tkání. Přesun od akutního k chronickému zánětu se objeví, pokud není možné eliminovat cizí těleso z těla, a jeho výsledkem jsou menší nebo větší léze (poškození orgánu nebo tkáně z vnější příčiny), kde buňky zahrnuté v zánětu zůstávají více či méně aktivované. Rychlá změna v buněčném redoxním potenciálu je považována za počáteční signály zánětu. Tyto změny jsou vztaženy k excesivní produkci ROS v tzv. sentinelových buňkách a v monocytech a také v různých epiteliálních buňkách, které rovněž mohou produkovat signál indikující zánětlivou reakci. Produkce ROS může být přímá (vyvolána nanočásticemi) nebo nepřímá (vyvolaná buňkami zánětu, zejména makrofágy) (Baenza-Squiban a Lanone 2011). Chronický zánět může být silně asociován s karcinogenezí (Singh a kol. 2009). 55

56 ... Obrázek 35: Schéma jednotlivých fází zánětlivé odezvy (převzato z Chiras 2001). Modifikace nitrobuněčného redoxního potenciálu je všeobecně spojená s aktivací běžných transkripčních faktorů, které se poté vážou se na promotory mnoha genů, kde aktivují transkripci. Jedná se o geny mnoha cytokinů a jiné zánětlivé faktory. ROS tedy nehrají roli pouze v iniciaci zánětu, ale také mají amplifikační roli, kdy zpětně aktivují procesy, které již probíhají. Izolovaně jsou za iniciaci zánětu zodpovědné také jiné signály, speciálně kinázy, které přispívají k nárůstu hladiny fosforylace (Baenza-Squiban a Lanone 2011). Faktory zánětu, včetně cytokinů, mohou rovněž způsobit poškození DNA v podobě fragmentace chromozómů, bodových mutací, tvorby DNA aduktů (viz dále), popř. inhibovat reparaci DNA apod. (Singh a kol. 2009). Nanomateriály mohou způsobit poškození DNA, a to oxidativním poškozením DNA (přes produkci ROS) nebo z důvodu uvolňování kovových iontů, ale také jako výsledek chronické zánětlivé odpovědi (Singh a kol. 2009). Mnoho studií ukázalo skutečnost, že různé nanomateriály jsou schopné vyvolat zánětlivou odpověd organismu (viz review Singh a kol. 2009, Baenza-Squiban a Lanone a kol. 2011, Riediker a Katalagarianakis 2012, Fubini a kol. 2011). 56

57 6.2. Genotoxicita nanomateriálů Genotoxicita je schopnost chemických látek pozměnit genetický materiál buňky (Xie a kol. 2011). Genetické poškození má zásadní význam při iniciaci a proliferaci karcinogeneze (Xie a kol. 2011). Genotoxický potenciál nanomateriálů velmi úzce souvisí s oxidativním stresem vyvolaným reaktivními kyslíkovými radikály a jejich schopností způsobit poškození DNA. Poškození DNA indukuje různé buněčné odezvy (zastavení buněčného cyklu, apoptózu buňky nebo opravu DNA zajištující genetickou integritu a přežití buňky). Selhání opravy DNA během replikace poškozené DNA nebo po ní může mít potenciální mutagenní nebo karcinogenní následky. Pokud je DNA poškozena, dochází k aktivaci klíčové efektorové molekuly p53 (někdy označované za ochránce genomu ), zodpovědné za zastavení buněčného cyklu a aktivaci transkripčních genů. Tyto geny řídí opravu DNA a zabrání konverzi poškození DNA do mutace (trvalé dědičné změny v DNA). Oprava DNA tedy představuje centrální mechanismus pro prevenci poškození DNA, která by mohla být fixována jako permanentní mutace (Singh a kol. 2009) Všeobecné mechanismy genotoxicity Genotoxický potenciál nanočástic představuje možnost oxidativního poškození DNA a proteinů v důsledku interakce s ROS a RNS. Mechanismy je možné rozdělit na přímé a nepřímé klastogenní mechanismy, aneugenické mechanismy a tvorbu DNA aduktů (Bota a Benaumer 2011). 1) Přímé klastogenní mechanismy Jedná se o modifikaci bazí, vznik abazických míst (míst s chybějící bazí) v molekule DNA a zlomy jednoho nebo obou řetězců. Tento mechanismus může mít karcinogenní následky, a to mutace dané vznikem lézí v závislosti na oxidaci DNA (mutace v párových bazích, delece, inzerce). Tyto mutace mohou vyústit do nádorového bujení. 2) Nepřímé klastogenní mechanismy Tento typ je primárně vztažen k peroxidaci lipidů způsobenou ROS, které generují elektrofilní nenasycené α a β aldehydy, jako je malondialdehyd (MDA) a 4-hydroxynonenal (4-HN), vedoucí k tvorbě exocyklických DNA aduktů (eteno nebo propano aduktů). 3) Aneugenické mechanismy Jedná se o vznik proteinových oxidativních lézí, jako je oxidace cysteinu nebo nitrace v důsledku RNS a jejich derivátů. Léze mohou ovlivnit komponenty mitotického aparátu (achromatického vřeténka, mikrotubulů organizující centra, kinetochorů), což může mít za následek problémy (nefunkčnost) při segregaci chomozómů a jejich migraci k pólům buňky během mitózy. 57

58 4) Tvorba DNA aduktů. V důsledku působení volných radikálů na lipidy dochází k jejich peroxidaci. Konečné produkty lipidové peroxidace (př. aldehydy) mohou reagovat s DNA. Například produkt malondialadehyd reaguje s deoxyadenosinem a deoxyguanosinem v DNA a tvoří s nimi DNA adukty (kovalentně spojená baze DNA a př. malondialdehyd) (viz obr. 36). Tyto produkty mohou být karcinogenní a mutagenní (Marnett 1999). Kromě tvorby DNA aduktů iniciovaných samotnými nanomateriály se mohou na tomto procesu podílet také PAH adsorbované na nanočástice (atmosférické nanočástice, saze). Při průniku těchto částic do cytosolu buněk tak mohou vznikat různé koncentrace mutagenních, karcinogenních a genotoxických substancí, které mohou vyvolat poškození DNA (Bota a Benaumer 2011).... Obrázek 36: Příklad M1G DNA aduktu (převzato z Martnett 1999) Genotoxický potenciál ENM Jak již bylo zmíněno, nanomateriály mohou způsobit poškození DNA buď přímou interakcí s DNA, nebo prostřednictvím tvorby ROS a indukcí oxidativního stresu nebo zánětu, tedy nepřímo. Údaje uvedené v následujícím textu týkajícím se genotoxicity nanomateriálů mají vytyčit pouze ústřední body dané problematiky (podrobněji viz review Singh a kol. 2009, Botta a Benameur 2011, Oesch a Landsiedel 2012, Xie a kol apod.). Genotoxický potenciál byl prokázán v různých testech genotoxicity pro mnoho syntetických nanomateriálů nanočástice kovů, nanočástice oxidů kovů, kvantové tečky, fullereny, vláknité nanomateriály (uhlíkaté nanotrubice, nanovlákna, nanodráty a nanotyčky) (Singh a kol. 2009, Fubini a kol. 2011). Výsledky pocházející z jednotlivých studií týkajících se testování toxicity nanomateriálů včetně genotoxicity je velmi těžké objektivně srovnat vzhledem k chybějící standardizaci v testovacích protokolech pro nanomateriály, v definici metrických jednotek i mezinárodně schválených referenčních materiálech (Oesch a Landsiedel 2012). V současné době probíhá usilovná snaha o standardizaci v potřebných oblastech a upravené protokoly nejen pro testování genotoxicity nanomateriálů a přístupy k testování jsou k dispozici, např. OECD TG 476, OECD TG 487,OECD TG 471, Lynch a kol. 2009, Byrne a kol. 2010, Gonzales a kol Porovnání výsledků z hlediska genotoxicity komplikuje také fakt, že ve vědeckých publikacích chybí nebo jsou nedostatečné informace o fyzikálně-chemických vlastnostech studovaných nanočástic, stavu aglomerace, způsobu přípravy testovaných nanočástic či je použito omezené množství testů, popř. byly použity různé testy a odlišné typy buněk a pokusných zvířat (Oesch a Landsiedel 2012). 58

59 Za hlavní faktory poukazující na genotoxicitu nanočástic mohou být považovány distribuce v tkáních, biopersistence, katalytická aktivita a schopnost indukovat zánětlivou obrannou reakci v organismu (včetně, ale ne nutně ROS) (Oesch a Landsiedel 2012). V následujícím textu je stručně popsán genotoxický potenciál vybraných typů nanomateriálů. Genotoxicita nanočástic na bázi kovů Mnoho studií zaměřených na studium genotoxicity nanočástic prokázalo po expozici těmto nanočásticím vznik mutací, chromozomálních aberací, zvýšenou frekvenci ve výměně sesterských chromatid, indukci tvorby mikrojader, zlomy v DNA řetězcích, oxidativní poškození DNA a vznik DNA aduktů (Xie a kol. 2011). Nanočástice na bázi kovů mohou buď přímo interagovat s DNA, nebo po vstupu do buňky uvolňovat ionty kovů, což může mít za následek indukci oxidativního stresu a s nim spojenou genotoxicitu (Xie a kol. 2011). Genotoxicita kovových nanočástic Nanočástice zlata Nanočástice zlata vykazují velmi odlišné charakteristiky od své konvenční formy (např. pokud jsou nanočástice zlata menší než 20 nm jsou červené a získávají katalytické vlastnosti). Do buněk se dostávají endocytózou a za 24 hod. jsou uzavřeny v lysozómech a uspořádány kolem perinukleárního regionu buňky a jsou schopny indukovat oxidativní poškození DNA jako výsledek působení oxidativního stresu a zlomy v DNA řetězcích, a to v závislosti na velikosti nanočástic a typu buněk (Singh a kol. 2009, Xie a kol. 2011). Pro stanovení jasných závěrů je nezbytné provedení více studií zaměřených na genotoxicitu nanočástic zlata. Nanočástice stříbra Obdobně jako nanočástice zlata se liší od své konvenční formy také nanočástice stříbra. Tyto nanočástice představují v současné době nejvíce komercializovaný nanomateriál, často používaný ve spotřebitelských produktech (Xie a kol. 2011). Nanočástice stříbra se vyznačují nažloutlou barvou, antibakteriálními vlastnostmi a mnohem vyšším potenciálem vyvolat oxidativní stres a zánětlivou reakci v organismu (Singh a kol. 2009). V buňce jsou nanočástice stříbra distribuovány přes cytoplazmu do lysozómů a do jádra. Mohou být genotoxické a potenciálně indukovat chromozómové aberace, tvorbu mikrojader, vznik DNA aduktů a zlomy DNA řetězců. Buňky po poškození DNA indukovaném nanočásticemi stříbra patrně zastavují buněčný cyklus v G2/M fázi kvůli opravě DNA před segregací chromozómů (Xie a kol. 2011). Dle výsledků z in vivo studií mohou nanočástice stříbra ovlivnit všechny hlavní orgány v těle (Stensberg a kol. 2011). Stejně jako v případě jiných studií zaměřených na studium genotoxicity nanočástic (viz dále) i u studií týkajících se nanočástic stříbra nejsou publikované výsledky jednotné. K tomuto nesouladu může přispívat fakt, že v publikovaných studiích byly použity různé buněčné linie, způsoby přípravy nanočástic nebo velikost testovaných částic (Xie a kol. 2011). Podrobnější údaje o studiích a výsledcích cytotoxicity a genotoxicity nanočástic stříbra jsou uvedeny např. (Singh a kol. 2009, Stensberg a kol. 2011, Xie a kol. 2011). 59

60 Nanočástice kobaltu U nanočástic kobaltu byla zaznamenána schopnost vyvolat genotoxicitu v lidských periferních krevních leukocytech. Nanočástice kobaltu patrně uvnitř buněk korodují a dochází k uvolňování iontů Co 2+ a ty mohou být patrně zodpovědné za jejich genotoxicitu (Singh a kol. 2009). Nanočástice kobaltu a chromu Nanočástice kobaltu a chromu představují další důležitý typ nanočástic, u nichž byl studován jejich potenciál vyvolat poškození DNA. Tyto částice jsou výchozím materiálem pro výrobu kyčelních implantátů. U pacientů s těmito implantáty bylo zaznamenáno, že během postupného opotřebení (otěru) implantátů docházelo k uvolňování Co-Cr nanočástic (byly nalezeny v krvi, lymfatických uzlinách, moči, kostech a játrech pacientů). Kobalt a chrom samostatně jsou Mezinárodní agenturou pro výzkum rakoviny International Agency for Research in Cancer (IARC) klasifikovány jako prokázané lidské karcinogeny. U pacientů s těmito implantáty byl prokázán větší výskyt strukturních a numerických chromozonálních aberací v periferních krevních lymfocytech. In vitro studie navíc prokázaly, že sinuviální tekutina pacientů s implantáty indukovala např. in vitro zlomy u obou řetězců DNA ve fibroblastech. Existuje zde potenciální souvislost mezi Co-Cr implantáty a zvýšeným výskytem maligních onemocnění. Pokud byly v in vitro studiích porovnávány účinky mikro a nanočástic tohoto složení, pak nanočástice vykazovaly významně vyšší míru poškození DNA než mikročástice (Singh a kol. 2009). Zde je třeba poznamenat, že velmi záleží na tom, jaký test, nanočástice, cílové buňky a podmínky pokusu byly použity. V publikovaných studiích velmi často chybí přesná fyzikálně-chemická charakteristika studovaných nanočástic a z tohoto důvodu lze experimentální výsledky jen stěží porovnat, navíc jsou tyto výsledky často protichůdné (Singh a kol. 2009). Genotoxicita nanočástic oxidů kovů Nanočástice TiO₂ Nanočástice TiO₂ jsou široce používané v průmyslových produktech, kosmetice a opalovacích krémech. Pro své fotokatalytické vlastnosti jsou aplikovány také jako dezinfekce v prostředí a odpadních vodách a při léčbě určitého typu nádorového onemocnění. Nanočástice TiO₂ jsou sice organizací FDA považovány za bezpečné při použití v opalovacích krémech, ale obavy přináší zjištění, že TiO₂ po osvitu slunečním zářením katalyzuje produkci ROS a poškození DNA in vitro a in vivo (Singh a kol. 2009). Nanočástice TiO₂ mohou být genotoxické se schopností indukovat mutace, chromozómové aberace, a/nebo zlomy v DNA řetězcích. Při studiu toxického účinku anatasu (forma TiO₂) se tento účinek jevil vyšší, pokud byly nanočástice fotoexcitovány, z toho vyplývá, že krystalová forma je důležitým faktorem genotoxicity TiO₂. Nanočástice TiO₂ mohou být mutagenní v závislosti na velikosti částic. Potenciálním mechanismem genotoxického působení nanočástic TiO₂ je indukce oxidativního stresu (Xie a kol. 2011). Detailně je toxický charakter TiO₂ (včetně genotoxicity) popsán např. v pracích (Christensen a kol. 2011), in vitro toxicita (Simon a kol. 2011, Xie a kol. 2011, Iavicoli a kol. 2012). 60

61 Nanočástice ZnO Dalšími široce používanými nanočásticemi (př. v potravinářském průmyslu) jsou nanočástice ZnO (Kvasničková 2008), které byly do nedávné doby považovány za netoxické a biokompatibilní. Nyní jsou k dispozici studie poukazující na negativní buněčnou odezvu po expozici ZnO nanočásticím z potravin (Croteau a kol. 2011, Singh a kol. 2009), po expozici z opalovacích krémů (Osmond a McCall 2010). Expozice nanočásticím ZnO (viz studie shrnuté Singh a kol 2009) byla spojena s indukcí zánětlivé odpovědi a cytotoxicitou, pouze podle jedné studie mají nanočástice ZnO potenciál poškodit DNA a mohou způsobovat tzv. foto-genotoxicitu (Dulfur a kol. 2006). Vzhledem k tomu, že v posledně jmenované studii prokazující fotogenotoxicitu nanočástic chyběly údaje o fyzikálně-chemických vlastnostech studovaných nanočástic, je třeba plně objasnit jejich genotoxicitu s ohledem na velikost a fyzikálně-chemickou charakteristiku nanočástic (Singh a kol. 2009). Nanočástice SiO₂ Mezi další široce užívané nanočástice patří nanočástice oxidu křemičitého. Je možné je rozdělit do dvou hlavních skupin na krystalické a amorfní. Tyto materiály se používají např. jako potravinová aditiva (Kvasničková 2008). Problematika přítomnosti a možných toxických účinků z potravin je shrnuta (Dekkers a kol. 2011, Napierska a kol. 2010). Nanočástice SiO₂ indukují zánět (aktivují NF-kB) a oxidativní stresovou odpověď in vivo i in vitro, ale cytotoxicita byla pozorována, pouze pokud byly aplikovány vyšší koncentrace. Nanočástice SiO₂ také mohou vstupovat do jádra buněk, kde se mohou potenciálně vázat k fosfátovému skeletu DNA. Vytvářejí internukleární proteinové agregáty vedoucí k porušení integrity buněčného jádra a k možné inhibici replikace, transkripce a proliferace buněk. Výsledky týkající se genotoxicity mohou být jako u jiných typů nanočástic někdy protichůdné př. genotoxita nm SiO₂ nanočástic na základě kometového testu nebyla prokázána, ale jiné studie poukazují na to, že nanočástice SiO₂ mají schopnost indukovat poškození chromozomů. Ke zjištění rozdílných typů genetických aberací je tedy třeba použít určitý soubor standardizovaných testů (Singh a kol. 2009). Nanočástice oxidů železa Nanočástice oxidů železa představují velmi atraktivní nanomateriály pro jejich superparamagnetické vlastnosti a velký aplikační potenciál v biomedicíně využití v MRI a pro cílovou destrukci nádorových tkání pomocí hyperthermie nebo jako nosiče léčebných agens (Šafařík a Šafaříková 2002, Gupta a Gupta 2005, Tartaj a kol. 2005). Železo je schopno indukovat karcinogenezi několika cestami s výslednou indukcí oxidačního stresu, následnou peroxidací lipidů a přímým poškozením DNA a proteinů. Pokud jsou buňky organismu přeplněny nanočásticemi oxidů železa, může tento přebytek podpořit tvorbu reaktivního hydroxylového radikálu Fentonovou reakcí (Singh a kol. 2009). Z důvodu zlepšení biokompatibility a biodistribuce jsou nanočástice oxidů železa často obalovány např. polyethylenglykolem (PEG), dextranem nebo dendrimery. Tato úprava nanočástic se poté projeví rovněž v jejich cytotoxicitě a schopnosti internalizace. Nakolik je toto potažení stabilní a zda 61

62 dochází k jeho narušení v buněčném prostředí, není zatím přesně objasněno. Na základě studií (shrnutých v Singh a kol. 2009), kde byly porovnávány toxické účinky obalených a neobalených nanočástic oxidů železa (př. nárůst malonyldialdehydu, snížení proliferace buněk apod.), je možné shrnout, že případná genotoxická odpověď závisí částečně na obalení, ale také na použitých testech pro zjištění genotoxicity nanočástic. Genotoxicita kvantových teček Jedná se o semikonduktivní nanokrystaly o vysoce žádaných optických vlastnostech vyznačujících se vyšší stabilitou než fluorescenční barvy s aplikačním potenciálem zejména v zobrazovacích metodách. Jejich jádro je tvořené potenciálně vysoce toxickými elementy jako je telurid kademnatý (CdTe) nebo selenid kademnatý (SeTe) a jádro je obvykle pokryto sulfidem zinečnatým ZnS, popř. dalším obaly (PEG) chránícími jádro před oxidací a zlepšující biokompatibilitu a bioaktivitu nanočástic (Singh a kol. 2009). Obal má vliv na cirkulaci a exkreci nanočástic z organismu (podrobněji Almeida a kol. 2011). Obalení sulfidem zinečnatým značně snižuje toxicitu obalených nanočástic oproti neobaleným. Velmi důležitá je také stabilita obalení, neboť kvantové tečky mohou degradovat za fotokatalytických a oxidačních podmínek, tedy v oxidačním prostředí buňky může dojít k uvolnění toxického materiálu. I přes tvrzení, že takto potažené nanočástice jsou biokompatibilní v biomedicínských aplikacích, je důležité vzít v úvahu, že tyto nanočástice zůstávají v organismu po relativně dlouhou dobu, tudíž jejich obal může být postupem času degradován (Singh a kol. 2009). Na základě studií (viz Singh a kol. 2009) byla prokázána u neobalených CdTe kvantových teček indukce produkce ROS s následným poškozením cytoplazmatické membrány, mitochondrií a jádra. Indukce ROS a oxidativního poškození bylo pozorováno i u obalených kvantových teček. CdSe-ZnS kvantové tečky způsobovaly fragmentaci DNA, a perturbaci jádra. V případě CdTe kvantových teček vstupovaly do jádra přes komplexy jaderných pórů a penetrovaly do jáder makrofágů, kde specificky interagovaly s pozitivně nabitými histony. Tyto nanočástice rovněž způsobily kondenzaci chromatinu a ztrátu mitochondriálních krist. I přesto, že zde existuje důkaz o tom, že kvantové tečky interagují s buněčným jádrem, zatím bylo publikováno velmi málo studií zabývajících se genotoxickým potenciálem těchto nanočástic tak, že by využili sadu testů k určení mechanismu působení na základě fyzikálně-chemických vlastností (Singh a kol. 2009, Botta a Benaumer 2011). Genotoxicita fullerenů Jedná se o nanočástice složené z čistého uhlíku, jejichž přítomnost je prokázána v prostředí, kde dochází k nedokonalému spalování paliv a toluenu vyrobeného v laboratoři. Fullereny byly rovněž nalezeny v geologických vzorcích starých několik miliard let (Singh a kol. 2009). Nyní jsou fullereny používány v kosmetickém průmyslu (omlazovací krémy) (Lorenz a kol. 2010) a dále jsou vyvíjeny aplikace pro klinickou medicínu (Singh a kol. 2009). Fullereny fungují jako lapače pro volné radikály a vykazují antioxidační vlastnosti. Jsou patrně méně toxické než saze nebo nanočástice pocházející z dieslových motorů. Fullereny jsou schopné indukovat produkci ROS s následným po- 62

63 tenciálním poškozením DNA přes mechanimus vzniku oxidativního stresu. Mohou tvořit komplexy s DNA (v systémech bez buněk), indukovat zlomy DNA řetězce, mutagenitu a poškození chromozómů (Singh a kol. 2009). I přes tyto výsledky jsou další údaje v literatuře z hlediska genotoxicity rozporuplné, a to z důvodů uvedených u výše popsaných nanomateriálů různá délka expozičního času, příprava nanomateriálů, typ buněk a ve zmiňovaných studiích rovněž chybí fyzikálněchemická charakterizace nanočástic. Z výše uvedených údajů je velmi obtížné jednoznačně zobecnit účinky těchto nanomateriálů (Singh a kol. 2009). Genotoxicita vláknitých nanomateriálů Uhlíkaté nanotrubice, nanovlákna, nanodráty a nanotyčky jsou velmi významné pro materiálové vědy pro využití v průmyslových a medicínských aplikacích a také ve spotřebitelských výrobcích. Nanotrubice o průměru několika nanometrů a délce několika mikrometrů mohou v některých ohledech následovat pravidla, která byla již zavedena pro působení azbestových vláken ukládajících se v plicích. Azbestová vlákna se vzájemně liší svou schopností vyvolat poškození plic včetně genotoxicity a karcinogenity. Tyto vlastnosti závisejí na tloušťce a délce vláken a také na jejich biopersistenci v plicích. Délka a průměr vláknitých nanomateriálů je stejně jako u azbestových vláken klíčovým faktorem v genotoxicitě těchto nanomateriálů a měla by být vždy uvedena ve studiích zaměřených na testování genotoxicity těchto nanomateriálů (Singh a kol. 2009). Výsledky týkající se genotoxicity uhlíkatých nanotrubic jsou zatím dosti protichůdné některé studie prokázaly cytotoxické působení jednostěnných i mnohostěnných CNT na několik buněčných typů, jiné studie ukazují nízkou nebo nevýznamnou buněčnou odpověď. U jednostěnných uhlíkatých nanotrubic byl prokázán nejen jejich průnik do buněk, ale také jejich lokalizace v jádře. Panuje tedy obava z jejich genotoxického působení. U mnohostěnných CNT bylo prokázáno, že způsobují nejen obdobnou zánětlivou odpověď jako azbestová vlákna, ale také tvorbu granulomat in vivo po intraperitoneálním podání, dále vývoj mezotheliomy in vivo v dlouhodobějších studiích po intraperitoneální dávce. Mnohostěnné CNT mají pravděpodobně karcinogenní potenciál, ale jeho mechanismus zatím není zcela znám. Uhlíkaté nanotrubice rovněž často obsahují nečistoty v podobě kovů a jejich sloučenin, které se rovněž mohou podílet na potenciální genotoxicitě těchto materiálů. Za centrální faktor toxicity CNT jsou považovány jejich fyzikálně-chemické vlastnosti, dále rigidita a vlastnosti povrchu (Fubini a kol. 2011, Johnston a kol. 2010). 63

64 7. Zdravotní dopady v souvislosti s expozicí nanomateriálům Vzhledem k celosvětově narůstajícímu počtu produktů s obsahem nanomateriálů na trhu lze předpokládat také zvyšující se expozici těmto synteticky vyráběným nanomateriálům. V mnoha případech se jedná o produkty každodenní potřeby a také produkty potravinářského průmyslu. Je tedy dosti pravděpodobné, že časem bude v tomto případě hrát významnou roli chronická expozice a s ní související dopady na zdraví exponovaných osob. Způsob, kterým se projeví nepříznivé působení chemické látky na organismus, bývá označován jako klinické projevy intoxikace nebo klinický obraz intoxikace. Klinické příznaky se mohou rozvíjet rychle u akutní otravy, při jednorázové či opakované expozici vysokým dávkám chemické látky. Příznaky se mohou rozvíjet pomalu u chronické otravy, kdy je organismus vystaven dlouhodobé nebo opakované expozici malým dávkám chemické látky. Pokud se látka v organismu nekumuluje a její exkrece nebo detoxikace je rychlejší než její přísun, nemůže dojít k nahromadění takového množství chemické látky v organismu, aby byl tento jejím toxickým účinkem významně ohrožen. Pokud se ale látka nedetoxikuje a je vylučována pomaleji než je její přísun do organismu nebo pokud se deponuje v určitých orgánech nebo částech organismu (např. lipofilní látky v tukové tkáni), může být dosaženo koncentrace, která bude mít toxický účinek (Patočka 2005). Při chronické intoxikaci se začínají projevovat toxické účinky chemické látky nebo jejich metabolitů tak, že postupně narůstá jejich koncentrace v tkáních, kde se kumulují a kde působí toxicky. Není tomu však tak ve všech případech. Z míst kumulace se mohou chemické látky také redistribuovat do jiných cílových míst organismu a tam působit toxicky. Chronická intoxikace může být také výsledkem kumulace více chemických látek nebo jejich metabolitů a výsledný toxický účinek proto může být důsledkem sumace nebo synergického působení účinků jednotlivých látek. Poněvadž u řady chemických látek existuje výrazná orgánová toxicita (např. neurotoxicita, nefrotoxicita, hepatotoxicita, aj.), může se projevit jejich účinek zejména v těchto místech organismu, avšak i v částech jiných. Mezi nejběžnější toxické projevy patří účinek na gastrointestinální trakt, kardiovaskulární systém, dýchací systém, játra a ledviny, imunitní systém a nervový systém. Orgánová toxicita (toxicita, kdy chemická látka působí na některé orgány více než na jiné a takové orgány se poté označují jako cílové) nemusí být vždy omezena pouze na jeden orgán. Jen zcela výjimečně mohou být poškozeny víceméně všechny orgány a poté se jedná o tzv. systémovou toxicitu (často jsou za případy této toxicity považovány případy, kdy dojde k poškození centrální nervové soustavy). Pokud se projevují příznaky pouze v místě prvního kontaktu toxické látky s biologickým systémem, jedná se o tzv. lokální toxicitu. U většiny chemických látek se jejich toxický účinek na daný biologický objekt projeví již po krátkodobé expozici nebo po krátké době latence (tj. opožděný nástup účinku). Existují však výjimky, kdy mezi expozicí a objevením se prvních příznaků intoxikace je doba latence relativně dlouhá, nebo je k vyvolání toxického účinku potřebné, aby došlo k opakované expozici. Takový druh toxické reakce 64

65 označujeme jako opožděnou toxicitu, což je ve většině případů příklad toxického působení nanočástic. Obecně pro nanočástice platí obdobné schéma, jako bylo popsáno v předchozích odstavcích pro chemické látky. Je však nutno zdůraznit, že se u nanočástic projevují určité specifické vlastnosti (zejména jejich schopnost pronikat do buněk), což vyžaduje zvláštní pozornost. Reálný toxický účinek nanočástic z hlediska jejich současných aplikací a používání spočívá spíše v chronické toxicitě nebo v opožděné toxicitě než v toxicitě akutní, kterou je třeba posuzovat s ohledem na specifické vlastnosti ENM. Klíčový mechanismus toxického působení nanočástic spočívá v indukci tvorby reaktivních kyslíkových radikálů a následném vzniku oxidativního stresu, který může vést ke genotoxickým účinkům nebo vyvolání zánětlivé odpovědi jakéhokoliv orgánu v těle (Savolainen a kol. 2010), jež se mohou projevit různými formami onemocnění (obr. 37).... Obrázek 37: Možné cesty expozice nanočásticemi a přidružená onemocnění navržené na základě in vivo a in vitro epidemiologických studií (převzato z Nejpravděpodobnější cestu vstupu ENM do organismu představuje inhalační cesta. Větší částice (kolem 10 μm) jsou zachyceny na skořepě nosní a mohou být rytmickým pohybem záchytných bičíků přemístěny ze sliznice do úst. Menší částice, zejména nanočástice, zůstávají ve vdechnutém vzduchu a postupně difundují až do plicních sklípků, kde jsou odstraňovány fagocytózou. Přitom mohou být degradovány nebo jsou vyplavovány hlenovým eskalátorem do trávícího traktu. Pokud je hlenový eskalátor přetěžován, zvětšuje se počet hlenových žláz vylučujících hleny a vzniká dispozice k bronchitidě. Je-li množství vdechnutých částic příliš vysoké (s ohledem na fagocytární činnost alveolárních makrofágů), dochází k zánětům a alveolární destrukci s následnou plicní fibrózou. Inhalované pevné 65