Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D.

Save this PDF as:
 WORD  PNG  TXT  JPG

Rozměr: px
Začít zobrazení ze stránky:

Download "Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D."

Transkript

1 Fingerprint Identifikace proteinů Proteinové mapy (2D elektroforeogramy, HPLC spektra, CZE spektra) Peptidové mapy (2D elektroforeogramy, HPLC spektra, CZE spektra, MS spektra) Charakteristické a specifické polohy skvrn, píků otisky prstů pro každý např. buněčný proteom nebo pro každý protein Identifikace proteinů v proteomice Molekulovou hmotnost nativního proteinu separovaného ELFO lze potvrdit hmotovou spektroskopií MALDI TOF, ESI TOF. Sekvenční analýza se provádí způsoby: 1.Edmanovou degradací (přímé sekvencování) a 2. hmotovou spektrometrií (nepřímé sekvencování, fingerprinting, de novo sekvencování). V obou případech p pak na základě získaných sekvencí následuje hledání v databázích proteinů Pro přímé sekvencování je nutný blotting nativního proteinu nebo jeho peptidových fragmentů (připravených in-solution štěpením a následně separovaných ELFO Schäger/von Jagow) na PVDF membránu. Po obarvení membrány amidočerní 10B se vyříznou příslušné pásy (1D) nebo skvrny (2D) a fragmenty membrány se vloží do reakční cely proteinového sekvenátoru. DIGE Diferenční 2D elektroforéza Výsledné mapy proteinů se porovnávají s kontrolními vzorky (pacienti s konkrétním onemocněním a zdraví pacienti). Po vyříznutí oblasti vykazující odlišnost je provedena analýza MS.

2 Fragmentace proteinů, polypeptidových řetězců Edmanovo odbourávání Pro analýzu Edmanovou degradací jsou nutná množství vzorku pmol, nejlépe však 200 pmol, konkurenční MS nyní zvládá fmoly (nanosprej ESI Qq TOF MS), dosud však není tolik rozšířená. Podmínkou pro úspěšnou sekvenční analýzu Edmanovou cestou je volný N-konec peptidu či proteinu. Edmanovo odbourávání Po odštěpení PTC-derivátu následuje jeho analýza (zjištění retenčního času na HPLC koloně) s detekcí při 270 nm. Běžně je takto možné získat aminokyselin z N-konce, samozřejmě s narůstající chybou (reakce není 100% ní). Za ideálních podmínek maximálně 100 aminokyselin. V automatickém proteinovém sekvenátoru (dodávají např. firmy Applied Biosystems, Shimadzu) je analyzovaný protein či peptid imobilizován. Buď na disku ze skleněných vláken (kovalentní vazba nebo adsorpce) nebo na membráně PVDF (ProSorb patrony nebo po blottingu). Reagencie ke vzorku vstupují a jsou odváděny nejlépe v plynné fázi. Doba trvání jednoho cyklu analýzy činí min. Je třeba připočítat eluci standardů aminokyselin a tzv. prázdný run. Často je však N-konec chemicky blokován (acetylace, pyroglutamová kyselina). Nevýhodou i výskyt glykosylačních míst - zde nízký výtěžek v daném cyklu. Automatizace

3 Hmotnostní spektrometrie (mass spectometry, MS) Princip ESI TOF MS a MALDI TOF MS Je metoda pro separaci látek podle rozdílů hmoty (m) a náboje (z) s využitím elektrického a magnetického pole. Určovanou fyzikální veličinou je podíl hmoty a náboje (m/z), při znalosti náboje umožňuje j určit molekulovou hmotnost. Velmi citlivá metoda, stačí několik iontů k získání měřitelného signálu, poměr m/z může být stanoven s přesností Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Původně aplikována pro malé těkavé látky, či derivatizované netěkavé látky (ionizace i paprskem elektronů ů - EI, chemická ionizace i s nosným plynem). S objevem šetrnějších technik ionizace (ESI, MALDI) je možné měřit i velké molekuly (např. proteiny, lipidové komplexy, polysacharidy). y) Matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) Laserová desorpční ionizace s pomocí matrice Metoda MALDI MS (od 1988) je rozšířeným nástrojem pro separaci přírodních látek, peptidů, proteinů a dalších bio- makromolekul (oligonukleotidy, sacharidy, lipidy). Vzorek je na nerezové destičce ukotven v netěkavé matrici (kokrystalizace). Používá se např. kyselina nikotinová nebo 2,5- dihydroxybenzoová. Vzorek (1 mg/ml) se nanese v 0.5 l na nerezovou destičku a nechá se vysušit. Pak se aplikuje 0.5 l matrice a opět se nechá vysušit. Destička se vloží do přístroje, zacílí se laserový paprsek p ( fire ), transfer energie e e způsobí ionizaci. Směrovaný ě energetický impuls poskytuje vysoké výtěžky iontů intaktního analytu, dosahuje se subpikomolární sensitivity. SELDI surface enhanced laser desorption/ionisation array chip hmotová spektrometrie výhody jednoduchost rychlost selektivita nevýhody nízká citlivost nízká přesnost urč. m/z nízké rozlišení

4 MS je často propojena s jinými analytickými technikami: ať už separačními nebo bez separace. Vznikají tak systémy GC- MS, LC-MS, CE-MS ale i MS-MS. Kroměě tandemové MS (MS-MS) MS) mohou být spojeny ažž tři i více analyzátorů ( multiple MS). První vybírá studované látky ze směsi, druhý je fragmentuje, třetí analyzuje vzniklé fragmenty. Pro identifikaci látek ve složitých směsích; nikoli na základě m/z, ale podle fragmentačních obrazů ( patterns ). Ve spojení s chromato či elfo metodou slouží MS jako detektor s vysokým rozlišením. Taková on-line analýza pak dává okamžité výsledky na rozdíl od off-line detekce. Klíčové je propojení přístrojů. LC-MS v biochemii pro peptidy a proteiny, GC-MS pro těkavé LMW látky, CE-MS široký záběr od LMW po proteiny, DNA, viry etc. vyříznout proužek rozřezat omýt Příprava vzorku (redukce) (alkylace) štěpení proteasou proč redukce a alkylace? rozvolnění ě S-S S vazeb trypsin denaturace > lepší proteolýza agresivní proteasa ochrana oxidovaných reziduí Cys vysoká primární specificita, it nízká sekundární prům. m/z fragmentu ~ 1.5 kda štěpí: DTT, dithiothreitol arginyl-x, lysyl-x; ale ne X=prolyl KONTAMINACE! keratiny (kůže, vlasy, srst, vlna) detergenty (SDS, Triton atp.) ) IAA, jódoctová kys. Identifikace pomocí HPLC-ESI-MS/MS 1. Štěpení proteinu trypsinem 3. MS vybraného štěpu protein II (16 kd) 3 fragmenty (2 kd, 6 kd, 8 kd) 2. Separace peptidů chromatografií (HPLC) UV abs Time (min) 5. Určení části sekvence.. M G A D D H D K L.. 6. Srovnávání s databázemi, identifikace 2,5 kd Hledáním v databázi je pak proteinový vzorek identifikován, nebo se zjistí, že jde o protein, který dosud v databázi není. Předpodkladem pro vyhledávání jsou naměřené přesné m/z hodnoty peptidových fragmentů, použítí specifické proteasy a přesná m/z intaktního proteinu. Pro štěpení se používají endoproteasy, tedy proteolytické enzymy, které štěpíě uvnitř ř proteinové molekuly. l Důrazů se klade na specifitu použité proteasy, používají se proto vysoce specifické enzymy, jako je trypsin z hovězího či vepřového pankreatu (EC ) nebo Lys C proteasa z Bacillus licheniformis (EC ). Trypsin štěpí za bazickými zbytky y Arg a Lys, proteasa Lys C za zbytkem Lysinu. Podobně Glu C proteasa ze Staphylococcus aureus V8 (EC ) štěpí za Glu. Specificky lze štěpitě chemicky použitím í CNBr. m/z 4. MS/MS spektrum m/z další fragmentace

5 Identifikace proteinů peptide fingerprinting štěpení proteázou (trypsinem) protein I (12 kd) DNA (i EST), proteinová databáze 2 fragmenty (4 kd, 8 kd) protein II (16 kd) 3 fragmenty (2 kd, 6 kd, 8 kd) generování teoretických trypsinových štěpů ze známých či předpokládaných proteinových sekvencí Peptide Mass Fingerprinting - PMF, MALDI TOF MS masses (m/z) ELSDIAR QLLLTADDR PHSHPALTPEQK PHSHPALTPEQKK GILAADESTGSIAKR LQSIGTENTEWENRR IGENHTPSALAIMENANVLAR YTPSGQAGAAASESLFISNHAY MALDI ToF Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D protein I m/z protein II m/z Bioinformatika pro MS organismy se sekvenovaným genomem e PMF, statistická shoda predikovaných m/z tryptických peptidů (in silico digest) s experimentálními i PC programy MASCOT (firma Matrixscience), SEQUEST, ProteinProspector organismy s nesekvenovaným genomem protein a: 3, 5, 9, 12 kd protein b: 2, 7, 9 kd protein c: 4, 8 kd protein d: 3, 9, 12 kd protein e: 2, 6, 8 kd Srovnání experimentálně stanovených velikostí peptidů s teoretickými štěpy hledání na základě evoluční homologie proteinových sekvencí MS BLAST: MS driven Best Local Alignment Search Tool MultiTag (S. Sunyaev et al., Anal. Chem. 2003, in press) Charakterizace ko- a posttranslačních modifikací v proteinech s použitím MS fosforylace, sulfatace, glykosylace, N-koncové modifikace Význam: důležité pro regulaci buněčné distribuce a modulaci funkcí proteinů. Př. fosforylace - přenos signálu v buňce, glykosylace - vliv na funkční, strukturní a imunologické vlastnosti proteinů. Výhoda MALDI MS analýzy v tomto případě spočívá ve velké přesnosti určení molekulové hmotnosti, citlivosti a rozlišení. Typický protokol pro analýzu proteinové modifikace začíná štěpením vzorku, enzymobe modifikaci. Pak se analyzuje rozdíl v molekulové hmotnosti určitého peptidu spočítané na základě sekvence a odečtené z MS spektra. Pro složitost některých směsíě je výhodnější použít MALDI PSD MS/MS nebo LC MS.

6 MALDI MS pro studium vyšší struktury proteinů Studium prostorové struktury proteinů (zvl. terciární a kvarterní) má význam z důvodu těsného vztahu struktura - funkce. Poznání struktury tedy může poskytnout informace o funkci proteinu. Pro studium struktury proteinů se běžně používá řada spektro- skopických metod (Krystalografie - difrakce paprsků X, NMR spektroskopie a další). Dávají poměrně jasné výsledky, ale jejich nevýhodou může být zejména časová náročnost a nároky na vyšší množství materiálu. Poskytují rovněž značná množství dat, jejichž vyhodnocování je opět náročné. Technikou MS je možné studovat například přístupnost určitých povrchových regionů proteinů s použiím metody zvané protein mass fingerprinting (PMF).

7 Ověření účinnosti separace, čistoty a charakterizace produktů Oveření čistoty proteinů, peptidů a polysacharidů a jejich charakterizace pomocí HPLC (iontová, SEC, afinitní chromatografie, hydrofobní) Ověření čistoty proteinů, polypeptidů pomocí elektroforézy Volba separační metody (výtěžek, časová náročnost, nabohacení) srážení, vysolování na počátku, kdy je koncentrace produktu vysoká (> 1mg/ml) IEC separace látek podle náboje, změna kapalné fáze (equilibrace), zakoncentrování? (objem eluentu), optimalizace podmínek separace, kapacita kolon přiměřená, relativně levná GPC - separace látek podle Mr a tvaru, odsolení, změna kapalné fáze (equilibrace), šetrná, levná, jednoduchá, nezávislé na koncentraci produktu, typu kapalné fáze x zdlouhavá, zředění látky, malá kapacita kolon (1% Vt), často řadíme po vysolování HIC metoda silně závislá na experimentálních podmínkách, optimalizace podmínek (návaznost separačních kroků), objem vzorku pouze 1 5 % V kolony, vysoká kapacita, cena přiměřená AC (IAC) vysoce specifická metoda, vysoká kapacita, snižuje počty separačních kroků, cena různá podle typu ligandu, regenerace kolony Purifikace biopolymerů Cíl: získat co nejlepší výsledek (čistota, aktivita, množství) Vstupní podmínky: dostupnost materiálu, typ vstupního materiálu stabilita produktu nároky na čistotu Nároky na čistotu: terapeutické účely (> 99%) farmaceutický průmysl diagnostické testy (20 90%) výzkum, katalýza reakcí potravinářství kosmetický průmysl (70 90%) ultračisté té analytické standardy d (95 99%) Počet purifikačních kroků: minimalizace ace ztrát, časová á a finanční náročnost by měla odpovídat nárokům na čistotu a účelu využití, možnost automatizace Řazení separačních kroků techniky s vysokou kapacitou techniky s nízkou kapacitou za sebou metody separující látky na jiném principu (Mr, náboj, povrchové vlastnosti apod.) produkt jedné metody by měl být výchozím materiálem pro další (po vysolování nejde IEC bez GPC) (IEC a AC vyžadují definované složení kapalné fáze) předcházet tvorbě dimerů, polymerů, agregátů vliv agregátů na účinnost separace (přídavek detergentů?)

8 Podmínky kolonové separace typ náplně (bobtnání, stabilita, chemická inertnost), parametry kolony, (s rostoucím průměrem a klesající délkou kolony klesá rozlišení, u LPLC vliv difúze na rozmývání zón) zapojení kolon v sérii recyklace vzorku rychlost průtoku (flow rate, s rostoucí rychlostí roste rozmývání zón x čas, stabilita produktu x NK) pracovní tlak, teplota ekvilibrace náplně min. mrtvé objemy objem nanášeného vzorku (flow adaptor) regenerace kolony skladování, konzervace, sterilizace Hodnocení účinnosti purifikace a kritéria čistoty 2 parametry výtěžnost (návratnost - ztráty) a stupeň přečištění (kolik balastu se odstranilo) výhoda u biologicky aktivních látek (enzymy) vždy se hodnotí biologická aktivita, objem eluentu a obsah bílkovin kritéria čistoty homogenita preparátu, krystalizace (1 pík u HPLC neznamená vždy homogenitu) ověřit si různými metodami u biologicky aktivních látek kontaminující doprovodná biol. aktivita, přítomnost izoforem (pi), pozor na proteázy hodnocení homogenity 1. rozpustnost produktu (saturační křivka s ostrým přechodem v místě nasycení roztoku) 2. analytická ultracentrifugace (60tis./ot./min, fotometricky) 3. centrifugace v gradientu hustoty (1 frakce, - čas) 4. SDS-PAGE a další elektroforetické metody 5. Imunochemické metody Kontrola stupně purifikace prvotní průběžná (tzv. postupná eliminace) finální včetně strukturní charakterizace produktu celkové množství produktu, biologická aktivita, výtěžnost, stupeň obohacení (koncentrace) Požadavky na čistotu podle účelu použití (technické, purifikované, vysoce purifikované) Technické frakcionovaná precipitace, kompromis mezi čistotou a cenou Purifikované vyšší nároky na čistotu, cena, separace více metod za sebou Vysoce purifikované vysoká cena, výzkum strukturní studie, klinická diagnostika, kalibrátory, standardy, terapeutické účely (původ) Koncentrace produktů a jejich konečná úprava zakoncentrování přečištěného produktu odpařováním (x stabilita) mrazová sublimace (lyofilizace) hygroskopický prášek (sole, ph, organická rozpouštědla) denaturace, fragmentace precipitace a resolubilizace ultrafiltrace (rychlost sedimentace, rovnováha) krystalizace (náročné, zdlouhavé)

9 Charakterizace produktů SDS-PAGE Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. molekulová hmotnost celé molekuly, dílčích podjednotek (SDS-PAGE, SEC) tvar a Mr ultracentrifugace izoelektrický bod pi - IEF spektrální vlastnosti (UV-VIS, VIS, cirkulární dichroismus, NMR spektroskopie analýza primární struktury, sekvence monomerů peptidové mapování s MS analýzou rentgenostrukturní analýza Sledování čistoty proteinů Elektroforéza dokumentuje průběh purifikačního procesu Při použití standardů o známé molekulové hmotnosti je možno zhruba stanovit molekulovou l hmotnost izolovaného proteinu (SDS elektroforézou) Prokázání identity reakcí se specifickou Ab - imunoblot uvolnit elektroelucí a následně MS analýzu ndardy Stan rek odní vzor Půvo roteiny vázané pr Nenav oteiny ované pro Eluo metoda pro sledování čistoty produktu průběžné, konečné citlivost metody μg až ng! podle typu vizualizace vizualizace všech, i kontaminujících složek široké rozmezí Mr látek - zvolit vhodnou porozitu gelu, nejlépe gradientové gely detekce kontaminace NML problematická průkaz ů produktu ve směsi (Mr, standard) průkaz rozpadových fragmentů (Mr, Imunoblot) kvantifikace (denzitometricky) omezená možnost následné MS analýzy bandů Účinnost separace směsi v gelech o různé porozitě

10 Porozita gelu a Mr separovaných látek Idealizovaná PAGE purifikace fiktivního proteinu Homogenát Frakční vysolování Iontoměničová chromatografie Molekulové síto (gelová filtrace) Afinitní chromatografie Izolace IgG1 - hyperimunní sérum Afinitní chromatografie MPC-protein A 10% gel SDS-PAGE barveno Coomasie Blue Mr serum E1 E2 Mr Purifikace trypsinu na koloně o ě s p-aminobenzamidinem a e

11 Detekce konkrétního proteinu Western blot s imunochemickou detekcí Proteinová elektroforéza (SDS-PAGE) Identifikace anti-ca I protilátek izolovaných afinitní chromatografií transfer proteinů ů z gelu na membránu = Western blot Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. W. blot Primární protilátka membrána s navázanými proteiny detekce proteinu protilátkou (komplexu primární a sekundární protilátky) vizualizace pomocí barevné reakce nebo chemiluminiscence Sekundární protilátky konjugované s enzymem či fluorescenční č značkou Hodnocení čistoty výchozího materiálu před enzymovou fragmentací Tris Tricine SDS-PAGE: gel 16,5% T, 3% C (MW 1 70 kda), detection with silver staining, positions: (1) non-digested native CA I, (2) non-digested unfolded CA I, (3) unfolded CA I digested 3 h by immobilized trypsin, (4) molecular marker ( kda) Porovnání Laemmli versus Schäger/von Jagow - separace trypsinů - Zleva standardy 29, 45, 66, 97, 116 a 200 kda; hovězí trypsin; vepřový trypsin; cytochrom c (12 kda); standardy, hovězí trypsin; vepřový trypsin; křenová peroxidasa (40 kda). Proteiny naneseny po 7 mg.

12 Vizualizace fosforylovaných proteinů - specifické barvení ProQ Diamond II Analýzy elučních frakcí pomocí SDS-PAGE a IMUNOBLOTu Z. Bílková et al., Proteomics 5, , 2005 SDS-PAGE 37 kda 25 kda PAAG gely reprezentují eluční frakce z imunosorbentu Ademtech 5B2 Ab. Čísla udávají množství proteinu v mg/band Detailní snímek gelu l barveného 180 minut a odbarvovaného přes ř noc Detekce na přístroji Molecular Imager FX (Bio Rad Laboratories): Ex/Em: 532nm/602nm Myelinový bazický protein!! (MS analýza) Eluce ph 3 Eluce ph 2,5 37 kda 25 kda Tris-Tricine-SDS-PAGE-urea pro Abeta peptidy + blotting M HA štěpená Hyaluronidázou v čase APP alfa Abeta Original CSF Eluting fraction standards Lane 1, 2 and 10: synthetic Abeta Standard mix 1-37, 1-38, 1-39, 1-40, 1-42 Lane 3: CSF (#3131) which was sent to Pardubice Lane 4: Original sample (CSF UPCE) Lane 5: Eluting fraction IP 1 Lane 6: Eluting fraction IP 1 (1:4 diluted) Lane 7: Eluting fraction IP 2 Lane 8: Eluting fraction IP 2 (1:4 diluted) Lane 9: Eluting fraction IP 2 (1:8 diltuted) Western blot, University of Duisburg (Hermann) PAA gel, 10%, 5% zaostřovací, TBE pufr ph 8,4. Separace 20 min při 125 V a 20 ma/1 gel a potom do konce 200 V a 40 ma/1 gel PrP Imunoblot 37 kda 25 kda a b Gely reprezentují eluční frakce získané z imunosorbentů Ademtech 5B2 Ab (a) a perlové celulózy 9H7 Ab (b). Průkaz PrP specificky pomocí anti-prp- HRP 3F4 (imunoblot).

13 HPLC proteinů, peptidů, polysacharidů HPLC analytické uspořádání Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Gelová permeační chromatografie Iontově výměnná chromatografie Hydrofóbní interakční chromatografie Afinitní chromatografie Reverzní HPLC Gelová permeační chromatografie v HPLC módu Rigidní nosič silikagel (povahou aniont, hydrofóbní) Semirigidní nosič PS Modifikované povrchy biokompatibilita (Silikagel modif. hydrofilním polymerem) Částice 5 10 µm, sférické Částice s uniformní porozitou Průtoky do 0,5 ml Teplota 4 C 37 C Preparativní Částice 5 10 µm Kolona 30,0 21,2 mm x 250 mm (semiprep. 7,8 mm) Průtoky 10tky ml/min Objem vzorku ml Kapacita kolony mg Recyklace vzorku Sériové řazení kolon Předkolona Analytické Částice 1,8 3,5 µm Kolona 2,5 4,6 mm x mm Průtoky 10ky µl/min Objem vzorku µl Kapacita kolony - µg Předkolona Monolitické kolony Kapilární kolony Nano-HPLC Iontově výměnná chromatografie v HPLC módu První typ v HP módu (HPIEC) Silikagelové ionexové pryskyřice Nové materiály - PS-DVB, alumina, PES-PA Pelikulární hydrofilní polymery Odolnost vůči tlaku Preparativní uspoř. - částice až 25 µm (40% hydratace) Anal. uspoř. částice 5 10 µm, menší stupeň hydratace (10 20%) Separace x eluce ph a iontová síla mob. fáze

14 RP-HPLC Nejvhodnější pro separaci proteinů, peptidů podmínky, kdy nedochází k denaturaci Závislost retence peptidů na malé změně obsahu organického modifikátoru Silikagel modifikovaný různě dlouhými alkylovými řetězci endcapping, omezená chemická stabilita! Polymerní kolony PS-DVB ph 2 12 Zirkoniové výborná chemická a tepelná stabilita Monolitické materiály Částice 5 8 µm (lze až 40 µm) Velikost pórů 90 Å 300 Å 4000 Å Příklady RP-HPLC Detekce UV-VIS (205 nm, 215 nm, 252 nm, 280 nm) Průtoky do 1 ml/min Teplota Stacionární fáze pro silně hydrofobní C4, C5 pro hydrofilní peptidy C8, C18 Organický modifikátor acetonitril, metanol, isopropanol (gradient) Alternativní stacionární fáze monolitické kolony, kapilární kolony 150 x 0,32 mm; průměr 3,5 µm, průtok 3 µl/min

15 Shrnutí. Volba separační metody (výtěžek, časová náročnost, nabohacení) srážení, vysolování na počátku, kdy je koncentrace produktu vysoká (> 1mg/ml) IEC separace látek podle náboje, změna kapalné fáze (equilibrace), optimalizace podmínek separace, kapacita kolon přiměřená, relativně ě levná GPC - separace látek podle Mr a tvaru, odsolení, změna kapalné fáze (equilibrace), šetrná, levná, jednoduchá, nezávislé na koncentraci produktu, typu kapalné fáze x zdlouhavá, zředění látky, malá kapacita kolon (1% Vt), často řadíme po vysolování HIC metoda silně závislá na experimentálních podmínkách, optimalizace podmínek (návaznost separačních kroků), objem vzorku pouze 1 5 % V kolony, vysoká kapacita, cena přiměřená AC (IAC) vysoce specifická metoda, vysoká kapacita, snižuje počty separačních kroků, cena různá podle typu ligandu, regenerace kolony Purifikace biopolymerů Cíl: získat co nejlepší výsledek (čistota, aktivita, množství) Vstupní podmínky: dostupnost materiálu, typ vstupního materiálu stabilita produktu nároky na čistotu Nároky na čistotu: terapeutické účely (> 99%) farmaceutický průmysl diagnostické testy (20 90%) výzkum, katalýza reakcí potravinářství kosmetický průmysl (70 90%) ultračisté té analytické standardy d (95 99%) Počet purifikačních kroků: minimalizace ace ztrát, časová á a finanční náročnost by měla odpovídat nárokům na čistotu a účelu využití, možnost automatizace Řazení separačních kroků techniky s vysokou kapacitou techniky s nízkou kapacitou za sebou metody separující látky na jiném principu (Mr, náboj, povrchové vlastnosti apod.) produkt jedné metody by měl být výchozím materiálem pro další (po vysolování nejde IEC bez GPC) (IEC a AC vyžadují definované složení kapalné fáze) předcházet tvorbě dimerů, polymerů, agregátů vliv agregátů na účinnost separace (přídavek detergentů?)

16 Praktické příklady Srážení síranem amonným (vysoká koncentrace soli ve vzorku) chromatografie s hydrofóbní interakcí Ionexová chromatografie (eluce vysokou iontovou silou) chromatografie s hydrofóbní interakcí Gelová chromatografie se používá na konci celé purifikační sekvence (odstranění fragmentů a komplexů) NEVHODNÉ Srážení síranem amonným a ionexová chromatografie (nutno zařadit odsolovací krok dialýza, ultrafiltrace) Ověření účinnosti separace, čistoty a charakterizace produktů Sledování průběhu separace Metoda Celková bílkovina Celková aktivita Kontrola stupně purifikace Specifická aktivita Přečištění Výtěžek extrakt % HIC % IEX % prvotní průběžná (tzv. postupná eliminace) finální včetně strukturní charakterizace produktu celkové množství produktu, biologická aktivita, výtěžnost, stupeň obohacení (koncentrace) Oveření čistoty proteinů, peptidů a polysacharidů a jejich charakterizace pomocí HPLC (iontová, SEC, afinitní chromatografie, hydrofobní) Ověření čistoty proteinů, polypeptidů pomocí elektroforézy Požadavky na čistotu podle účelu použití (technické, purifikované, vysoce purifikované) Technické frakcionovaná precipitace, kompromis mezi čistotou a cenou Purifikované vyšší nároky na čistotu, cena, separace více metod za sebou Vysoce purifikované vysoká cena, výzkum strukturní studie, klinická diagnostika, kalibrátory, standardy, terapeutické účely (původ)

17 Hodnocení účinnosti purifikace a kritéria čistoty Zakoncentrování produktů a jejich konečná úprava Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. 2 parametry výtěžnost (návratnost - ztráty) a stupeň přečištění (kolik balastu se odstranilo) výhoda u biologicky aktivních látek (enzymy) vždy se hodnotí biologická aktivita, objem eluentu a obsah bílkovin kritéria čistoty homogenita preparátu, krystalizace (1 pík u HPLC neznamená vždy homogenitu) ověřit si různými metodami u biologicky aktivních látek kontaminující doprovodná biol. aktivita, přítomnost izoforem (pi), pozor na proteázy hodnocení homogenity 1. rozpustnost produktu (saturační křivka s ostrým přechodem v místě nasycení roztoku) 2. analytická ultracentrifugace (60tis./ot./min, fotometricky) 3. centrifugace v gradientu hustoty (1 frakce, - čas) 4. SDS-PAGE a další elektroforetické metody 5. Imunochemické metody Charakterizace produktů molekulová hmotnost celé molekuly, dílčích podjednotek (SDS-PAGE, SEC) tvar a Mr ultracentrifugace izoelektrický bod pi - IEF spektrální vlastnosti (UV-VIS, VIS, cirkulární dichroismus, NMR spektroskopie analýza primární struktury, sekvence monomerů peptidové mapování s MS analýzou rentgenostrukturní analýza zakoncentrování přečištěného produktu odpařováním (x stabilita) mrazová sublimace (lyofilizace) hygroskopický prášek (sole, ph, organická rozpouštědla) denaturace, fragmentace precipitace a resolubilizace ultrafiltrace (rychlost sedimentace, rovnováha) krystalizace (náročné, zdlouhavé) Elektromigrační metody

18 Princip elektroforézy Separační metoda využívající různé pohyblivosti různých iontů (složek směsi) ) ve stejnosměrném (homogenním) elektrickém poli. Pohyblivost separovaných iontů závisí také na: použitém elektrolytu (kapalné fázi) chemické vlastnosti a porozita nosiče Většinu biologicky zajímavých látek lze ve vodném prostředí převést ř na elektricky k nabité částice. Metodika: disociace, změna ph, adsorpce iontů jiného druhu, chemickou vazbou - tvorbou tzv. ionogenních komplexů. Jevy doprovázející elektroforézu Produkce Jouleova tepla S rostoucím napětím (Ohm Ohmův zákon) roste elektrický proud: I = U/R. Pokud el. proud nekoná mechanickou nebo chemickou práci, energie se bez užitku přeměňuje na teplo: Jouleovo teplo Chlazení gelů u vysokonapěťové elektroforézy voda, termostat, led Elektroendoosmóza Uplatňuje u kapilární elektroforézy. Stěny kapilár jsou vyrobeny z kremičitého skla a vlivem disociacei silanolových l skupin mají záporný náboj. K záporným nábojům se váží pozitivně nabité ionty ( counterions counterions ), vytváří stacionární vrstvu (Sternova Sternova). V následující vrstvě jsou však tyto ionty již mobilní (Guy-Chapmanova vrstva). Elektroendoosmóza na vnitřním povrchu kapiláry v místě styku s vodivým roztokem vzniká elektrická dvojvrstva pevná část (stěna kapiláry) je nabitá nepohyblivým plošným záporným elektrickým nábojem z kapalné části se kladné ionty připojí ke stěně kapiláry (dvojvrtva), ionty se pohybují k anodě pohyblivá vrstvička se žene kapilárou a strhne sebou celý průřez kapaliny v kapiláře roztok putuje kapilárou celý najednou (u elektroforézy putují jen ionty).

19 Typy elektroseparačních metod Zónová elektroforéza - Elektroforéza na nosiči Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Volná elektroforéza Zónová elektroforéza Isoelektrická fokusace Kapilární elektroforéza Vertikální x Horizontální Vertikální x Horizontální 1D nebo 2D rozměrná Nativní x Denaturační podmínky Analytická x Preparativní Gelová elektroforéza vertikální horizontální provádí se na hydrofilních porézních nosičích, nerozpustných ve vodě, s minimální i adsorpční č schopností, zabraňuje ň zpětnému mísení í rozdělených složek Nosiče Papírová elektroforéza nosičem elektrolytu l t je chromatografický papír analýza bílkovin; dělení nízkomolekulárních látek, aminokyselin Elektroforéza na tenké vrstvě nosičem elektrolytu (H2O + pufr) je vrstva silikagelu nebo škrobu na skleněné podložce. Gelová elektroforéza agar, agaróza, PAAG, porozita gelu gradient porozity gradient ph Provedení: plošné, v trubičkách, vertikální, horizontální Aparatury pro trubičkové gely

20 Kombinovaná elektroforéza dělení je využito (kromě.el.náboje) ještě dalších odlišností např. velikosti a molární hmotnosti iontů. Nosičem elektrolytu je obvykle gel (porozita gelu) př. SDS-PAGE elektroforéza dělení látek podle Mr (zvýšení účinnosti separace, citlivosti detekce) 2D elektroforéza kombinace izoleektrické fokuzace s gelovou chromatografií Elektrochromatografie dvourozměrná jeden směr chromatografie, druhý směr elektroforéza, Elektrodialýza, Elektroultrafiltrace, Elektrodesorpce eluce složek afinitní chromatografie elektrickým polem. Blotting (Western blotting, Immunoblotting) Dva hlavní typy PAAG elektroforézy Nativní gelová (nedenaturační) elektroforéza Probíhá bez denaturačních činidel. Proteiny migrují gelem podle svého celkového náboje velikosti a tvaru a podle velikosti pórů v gelu. SDS gelová elektroforéza Proteiny jsou denaturovány dodecylsíranem sodným (SDS) a β- merkaptoetanolem (zruší disulfidické vazby). Pohyblivost závisí na molekulové l hmotnosti polypeptidových řetězců (Mr) Vhodná pro analýzu makromolekulárních komplexů. Akrylamidový gel: pevná a inertní matrix ideální pro separaci proteinů Menší velikost pórů než u agarosy Použití 1. pro účely analytické i preparativní (méně) 2. k separaci velkých molekul (proteiny nebo NK) 3. k separaci menších molekul (cukry, peptidy nukleotidy) Faktory ovlivňující pohyblivost látky 1. Celkový povrchový náboj separované látky 2. Velikost a tvar molekuly 3. Porosita gelu 4. ph a složení elektrolytu Proteiny jsou tepelně denaturovány ve vzorkovém pufru obsahujícím dodecyl sulfát sodný (SDS) SDS)- zachována je tak pouze jejich primární struktura (var 2 3 min.) Denaturované proteiny mají vláknitý tvar a stejný záporný náboj daný vazbou SDS migrace tedy závisí pouze na jejich molekulové l hmotnosti ti Aniontový detergent, solubilizuje uje a denaturujeuje proteiny Většina proteinů váže SDS ve stejném poměru, asi 1,4 g SDS/g proteinu

21 PAA gelová elektroforéza - PAGE Gel z polymerovaného akrylamidu Polymer vytváří síť (podle koncentrace akrylamidu určitá velikost ok sítě) Molekuly se dělí podle své velkosti (malé rychleji, velké pomaleji). Laemmliho diskontinuální systém Používá se dvou gelů tzv. zaostřovacího ( stacking ) gelu nahoře a separačního ( running ) gelu dole. Liší se hodnoty ph 6, 8 a 8, 3 elektrodový pufr se pak liší od obou gelových pufrů. Mobilita separovaných proteinů mezi a) mobilitou iontu ve stacking gelu Cl-, tzv. leading ion = vedoucí Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Co obsahuje vzorkový pufr pro SDS-PAGE? Tris pufr utváří vhodné ph SDS (dodecyl sulfát sodný) detergent poskytující proteinům negativní náboj Glycerol vzhledem ke své vyšší specifické hmotnosti zajišťuje klesnutí vzorku ke dnu jamky v gelu po nanesení Bromophenol Blue barvivo umižňující sledovat průběh elektroforézy (pohyb čela v gelu) 2-ME (DTT) b) mobilitou iontu v katodovém pufru (glycin, pk 9.6, tzv. trailing ion = zakončující). Ionty i proteiny migrují do zaostřovacího gelu (5%) koncentrují se do velmi úzké zóny Barvení proteinových gelů stříbrem Coomassie blue Fluorescenční barviva RI Specifické barvení pro fosfo-, glyko-

22 Molekulová hmotnost proteinů velikost měřena v daltonech (Da) či kilodaltonech (kda) Dalton = jednotka atomové hmotnosti ti Separace látek podle jejich Mr = přibližně se rovná hmotnosti atomu H (1,66 x g) = definován také jako 1/16 hmotnosti ti atomu O Průměrná aminokyselina = 110 Da Průměrný nukleotid leotidový ový pár = 649 Da Gel 10%, Mr marker pozice 5 Nanesení vzorku Určování molekulové hmotnosti proteinů

23 Účinnost separace směsi v gelech o různé porozitě Porozita gelu a Mr separovaných látek Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. PAGE elektroforézy - modifikace 1) Nativní (různé ph, pufry Tris, MES, MOPS, HEPES) 2) SDS-PAGE tris/tricine pro proteiny menší než 14 kda (urea) 3) SDS-PAGE tris/borát/edta elektroforéza pro gp, SDS se neváže na cukerné k é složkyl 4) Afinoforéza polymer modifikovaný látkou vykazující afinitu k jedné ze separovaných složek (např. lektinová, chelatační) 5) Imunoelektroforéza, Imunofixace PAGE elektroforéza preparativní verze

24 Izoelektrická fokuzace Preparativní IEF Provádí se v chlazených vertikálních skleněných kolonách, které jsou naplněny roztokem amfolytů - stabilizováno gradientem sacharosy (viz centrifugace), Ficol, Perkol. Na konci separace se kolona vypustí do zkumavek ve sběrači frakcí. Zařízení Rotofor (Bio-Rad) membranový systém zón brání smísení separovaných vzorků Izoelektrická fokuzace Isoelektická fokusace se provádí buď v trubičkách nebo v plochých gelech, stripech. Hotové IEF gely s amfolyty y nebo immobiliny se dodávají komerčně spolu s přístroji pro auomatizovanou IEF. Vzorky se obvykle nanášejí na katodové straně. Denaturující podmínky při IEF - 9 M močovina nebo neionogenní detergenty (Triton X-100). Využití: stanovení pi, kontrola homogenity, isoenzymy Separace izoenzymů ( pi)

25 Dvojrozměrná (2D) elektroforéza proteinů Kombinuje použití IEF a SDS-PAGE pro účely studia proteomu, vypracováno O Farrellem v 70. letech., Umožňuje rozlišení až proteinů. 2D gelová elektroforéza Rozdělí současně stovky i tisíce proteinů Proteiny jsou rozprostřeny na ploše Proteiny se nejprve rozdělí podle jejich pi v gradientu ph Proteiny se nejprve rozdělí podle jejich pi v gradientu ph. Po separaci v prvním rozměru je provedena elektroforéza v gelu. Proteiny migrují ve druhém rozměru v závislosti na své velikosti. Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Separace izoforem ( pi) Blotting proteinů a nukleových kyselin blotting (angl. blot = skvrna, kaňka, česky přenos) pásy separované látky (např. SDS-PAGE) se přenášejí elektroforézou na membránu (NC, PVDF), kde jsou uchyceny adsorpcí nebo kovalentní vazbou. DNA analýza (Southern blotting, Southern 1975) RNA analýza (Northern blotting, Alwine et al., 1977) PROT analýza (Western blotting, Towbin et al., 1979) 1. fáze: klasická SDS-PAGE (separace podle Mr) 2. fáze: blotování působením elektrického proudu dojde k přeblotování proteinů z gelu do membrány 3. fáze: vyvíjení vizualizace přenesených proteinů, nespecifické nebo specifické barvení Ponceau S, Fast Green nebo Amidočerni10 B.

26 Sestava při blotování Detekce konkrétního proteinu Western blot s imunochemickou detekcí Proteinová elektroforéza (SDS-PAGE) W. blot transfer proteinů ů z gelu na membránu = Western blot detekce proteinu protilátkou (komplexu primární a sekundární protilátky) vizualizace pomocí barevné reakce nebo chemiluminiscence Rozdělení metod blottingu podle provedení Difúzní blotting - prostá difúze v tanku s přenosovým pufrem, dlouhá doba hodin, velkou nevýhodou difuze do stran - zhoršení rozlišení vlastní elektroforetické separace. Kapilární blotting - celá jednotka je zatížena, suchý papír nasává kapilárními silami pufr, vzorek je tak tažen z gelu na membránu. Trvá zhruba 12 hodin. Vakuový blotting - místo kapilárních sil vzorek tažen vakuem. Podstatně rychlejší (30 min). Výhodou též ostřejší pásy (potlačení difuze). Elektroblotting - nejrychlejší a nejúčinnější metoda. Hnací silou je v tomto případě síla elektrického kéh pole. Podle provedení se rozlišuje tzv. tankový (tank, wet) blotting a polosuchý (semi-dry) blotting. Jediný pro vysokomolekulární biopolymery. Elektroblotting Primární protilátka membrána s navázanými proteiny Sekundární protilátky konjugované s enzymem, fluor. značkou, ale i koloidním zlatem, radioaktivně, luminiscenčně. Detekce glykoproteinů Schiffovou reakcí, alcianovou modří, vazbou lektinů.

27 SDS-PAGE široké uplatnění čistota produktu průběžné, konečné monitorování citlivost metody μg až ng! podle typu vizualizace vizualizace všech, i kontaminujících složek x imunoblott (identifikace) široké rozmezí Mr látek - zvolit vhodnou porozitu gelu, nejlépe gradientové gely detekce kontaminace NML problematická průkaz produktu ve směsi (Mr, standard) průkaz rozpadových fragmentů (Mr, Imunoblot) kvantifikace (denzitometricky) omezená možnost následné MS analýzy bandů Idealizovaná PAGE purifikace fiktivního proteinu Homogenát Frakční vysolování Iontoměničová chromatografie Molekulové síto (gelová filtrace) Afinitní chromatografie Sledování čistoty proteinů Elektroforéza dokumentuje průběh purifikačního procesu Při použití standardů o známé molekulové hmotnosti je možno zhruba stanovit molekulovou l hmotnost izolovaného proteinu (SDS elektroforézou) Prokázání identity reakcí se specifickou Ab - imunoblot uvolnit elektroelucí a následně MS analýzu Izolace IgG1 - hyperimunní sérum Afinitní chromatografie MPC-protein A 10% gel SDS-PAGE barveno Coomasie Blue ndardy Stan rek odní vzor Půvo roteiny vázané pr Nenav oteiny ované pro Eluo Mr serum E1 E2 Mr

28 Purifikace trypsinu na koloně o ě s p-aminobenzamidinem a e Hodnocení čistoty výchozího materiálu před enzymovou fragmentací Tris Tricine SDS-PAGE: Tricine gel 16,5% T, 3% C (MW 1 70 kda), detection with silver staining, positions: (1) non-digested native CA I, (2) non-digested unfolded CA I, (3) unfolded CA I digested 3 h by immobilized trypsin, (4) molecularlar marker ( kda) Identifikace anti-ca I protilátek izolovaných afinitní chromatografií Vizualizace fosforylovaných proteinů - specifické barvení ProQ Diamond II Čísla udávají množství proteinu v mg/band Detailní snímek gelu l barveného 180 minut a odbarvovaného přes ř noc Detekce na přístroji Molecular Imager FX (Bio Rad Laboratories): Ex/Em: 532nm/602nm

29 Tris-Tricine Tricine-SDS-PAGE-urea pro Abeta peptidy + blotting M1 APP alfa Analýzy elučních frakcí pomocí SDS-PAGE a IMUNOBLOTu SDS-PAGE 37 kda 25 kda 37 kda Myelinový bazický PAAG gely reprezentují eluční protein!! (MS analýza) 25 kda frakce z imunosorbentu Ademtech 5B2 Ab. Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D Abeta Original CSF Eluting fraction standards Lane 1, 2 and 10: synthetic Abeta Standard mix 1-37, 1-38, 1-39, 1-40, 1-42 Lane 3: CSF (#3131) which was sent to Pardubice Lane 4: Original sample (CSF UPCE) Lane 5: Eluting fraction IP 1 Lane 6: Eluting fraction IP 1 (1:4 diluted) Lane 7: Eluting fraction IP 2 Lane 8: Eluting fraction IP 2 (1:4 diluted) Lane 9: Eluting fraction IP 2 (1:8 diltuted) Western blot, University of Duisburg (Hermann) HA štěpená Hyaluronidázou v čase PAA gel, 10%, 5% zaostřovací, TBE pufr ph 8,4. Separace 20 min při 125 V a 20 ma/1 gel a potom 200 V a 40 ma/1 gel a PrP 37 kda 25 kda Eluce ph 3 Eluce ph 2,5 HPLC proteinů, peptidů, polysacharidů Gelová permeační chromatografie Iontově výměnná chromatografie Hydrofóbní interakční chromatografie Afinitní chromatografie RP-HPLC b Imunoblot Gely reprezentují eluční frakce získané z imunosorbentů Ademtech 5B2 Ab (a) a perlové celulózy 9H7 Ab (b). Průkaz PrP specificky pomocí anti-prp- HRP 3F4 (imunoblot).

30 HPLC analytické uspořádání Preparativní Částice 5 10 µm Kolona 30,0 21,2 mm x 250 mm (semiprep. 7,8 mm) Průtoky 10tky ml/min Objem vzorku ml Kapacita kolony mg Recyklace vzorku Sériové řazení kolon Předkolona Iontově výměnná chromatografie v HPLC módu První typ v HP módu (HPIEC) Silikagelové ionexové pryskyřice Nové materiály - PS-DVB, alumina, PES-PA Pelikulární hydrofilní polymery Odolnost vůči tlaku Analytické Částice 1,8 3,5 µm Kolona 2,5 4,6 mm x mm Průtoky 10ky µl/min Objem vzorku µll Kapacita kolony - µg Předkolona Monolitické kolony Kapilární kolony Nano-HPLC Preparativní uspoř. - částice až 25 µm (40% hydratace) Anal. uspoř. ř částice 5 10 µm, menší stupeň ň hydratace (10 20%) Separace x eluce ph a iontová síla mob. fáze Gelová permeační chromatografie v HPLC módu Rigidní nosič silikagel (povahou aniont, hydrofóbní) Semirigidní nosič PS Modifikované povrchy biokompatibilita (Silikagel modif. hydrofilním polymerem) Částice 5 10 µm, sférické Částice s uniformní porozitou Průtoky do 0,5 ml Teplota 4 C 37 C Kombinace SEC (IEC) + ELFA

31 RP-HPLC RP-HPLC Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Nejvhodnější pro separaci proteinů, peptidů podmínky, kdy nedochází k denaturaci Závislost retence peptidů na malé změně obsahu organického modifikátoru Silikagel modifikovaný různě dlouhými alkylovými řetězci endcapping, omezená chemická stabilita! Polymerní kolony PS-DVB ph 2 12 Zirkoniové výborná chemická a tepelná stabilita Monolitické materiály Částice 5 8 µm (lze až 40 µm) ) Velikost pórů 90 Å 300 Å 4000 Å Výsledek purifikace Detekce UV-VIS (205 nm, 215 nm, 252 nm, 280 nm) Průtoky do 1 ml/min Teplota Stacionární fáze pro silně hydrofobní C4, C5 pro hydrofilní peptidy C8, C18 Organický modifikátor acetonitril, metanol, isopropanol p (gradient) Alternativní stacionární fáze monolitické kolony, kapilární kolony 150 x 0,32 mm; průměr 3,5 µm, průtok 3 µl/min Identifikace proteinů Březen 2011

32 Identifikace proteinů v proteomice A) Molekulovou hmotnost a identifikace analytu ELFO (Imunoblot) + MS (MALDI TOF, ESI TOF) B) Identifikace tzv. sekvenční analýza 1. Edmanovou degradací (přímé sekvencování) 2. Hmotovou spektrometrií (nepřímé sekvencování, fingerprinting, de novo sekvencování) + Informační databáze DIGE Diferenční 2D elektroforéza Fingerprint Proteinové mapy 2D elektroforeogramy, HPLC spektra, CZE spektra Peptidové mapy 2D elektroforeogramy, HPLC spektra, CZE spektra, MS spektra Charakteristické a specifické polohy skvrn, píků otisky prstů pro každý např. buněčný proteom nebo pro každý protein Fragmentace proteinů, polypeptidových řetězců Výsledné mapy proteinů se porovnávají s kontrolními vzorky (pacienti s konkrétním onemocněním a zdraví pacienti). Po vyříznutí oblasti vykazující odlišnost je provedena analýza MS.

33 Edmanovo odbourávání množství vzorku min pmol, opt. 200 pmol konkurenční MS nyní zvládá fmoly (nanosprej ESI Qq TOF MS) Podmínkou je volný N-konec peptidu či proteinu. Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Často je však N-konec chemicky blokován (acetylace, pyroglutamová kyselina). Nevýhodou i výskyt glykosylačních míst zde nízký Nevýhodou i výskyt glykosylačních míst - zde nízký výtěžek v daném cyklu. Edmanovo odbourávání možné získat aminokyselin z N-konce, samozřejmě s narůstající chybou (reakce není 100% ní). Za ideálních podmínek maximálně 100 aminokyselin. V automatickém proteinovém sekvenátoru (dodávají např. firmy Applied Biosystems, Shimadzu) je analyzovaný protein či peptid imobilizován. Buď na disku ze skleněných vláken (kovalentní vazba nebo adsorpce) nebo na membráně PVDF (ProSorb patrony nebo po blottingu). Reagencie ke vzorku vstupují a jsou odváděny nejlépe v plynné fázi. Doba trvání jednoho cyklu analýzy činí min. Je třeba připočítat eluci standardů aminokyselin a tzv. prázdný run. Po odštěpení PTC-derivátu následuje jeho analýza (zjištění retenčního času na HPLC koloně) s detekcí při 270 nm. Hmotnostní spektrometrie (MS) Automatizace Je metoda pro separaci látek podle rozdílů hmoty (m) a náboje (z) s využitím elektrického a magnetického pole. Určovanou fyzikální veličinou je podíl hmoty a náboje (m/z), při znalosti náboje umožňuje určit molekulovou hmotnost. Velmi citlivá metoda, stačí několik iontů k získání měřitelného signálu, poměr m/z může být stanoven s přesností techniky ionizace (ESI, MALDI) - lze měřit i velké molekuly (např. proteiny, lipidové komplexy, polysacharidy).

34 Princip ESI TOF MS a MALDI TOF MS SELDI surface enhanced laser desorption/ionisationionisation array chip hmotová spektrometrie výhody jednoduchost rychlost selektivita nevýhody nízká citlivost nízká přesnost urč. m/z nízké rozlišení Matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) Laserová desorpční ionizace s pomocí matrice Metoda MALDI MS (od 1988) je rozšířeným nástrojem pro separaci přírodních látek, peptidů, proteinů a dalších bio- makromolekul (oligonukleotidy oligonukleotidy, sacharidy, lipidy). Vzorek na nerezové destičce ukotven v netěkavé matrici i (kokrystalizace). k Používá se např. ř kyselina nikotinová nebo 2,5-dihydroxybenzoová. Destička se vloží do přístroje, zacílí se laserový paprsek ( fire ), transfer energie způsobí ionizaci. MS je často propojena s jinými analytickými technikami: GC-MS, LC-MS, CE-MS ale i MS-MS (Interphase) Kromě tandemové MS (MS-MS) mohou být spojeny až tři i více analyzátorů ( multiple MS). 1) Výběr studované látky ze směsi 2) Fragmentace 3) Analýza fragmentů Kombinace s chromato či elfo metodou slouží MS jako detektor s vysokým rozlišením - on-line analýza (x off- line detekce). Klíčové je propojení přístrojů. LC-MS v biochemii pro peptidy a proteiny. Spřažení - ESI x MALDI

35 Identifikace pomocí HPLC-ESI-MS/MS 1. Štěpení proteinu trypsinem 3. MS vybraného štěpu Identifikace proteinů peptide fingerprinting štěpení proteázou (trypsinem) MALDI ToF protein I (12 kd) 2 fragmenty (4 kd, 8 kd) protein II (16 kd) 3 fragmenty (2 kd, 6 kd, 8 kd) protein I m/z protein II m/z protein II (16 kd) 3 fragmenty (2 kd, 6 kd, 8 kd) 2. Separace peptidů chromatografií (HPLC) UV abs Time (min) 5. Určení části sekvence.. M G A D D H D K L.. 6. Srovnávání s databázemi, identifikace 2,5 kd m/z 4. MS/MS spektrum m/z DNA (i EST), proteinová databáze generování teoretických trypsinových štěpů ze známých či předpokládaných proteinových sekvencí protein a: 3, 5, 9, 12 kd protein b: 2, 7, 9 kd protein c: 4, 8 kd protein d: 3, 9, 12 kd protein e: 2, 6, 8 kd další fragmentace Srovnání experimentálně stanovených velikostí peptidů s teoretickými štěpy vyříznout proužek rozřezat omýt Příprava vzorku (redukce) (alkylace) štěpení proteasou proč redukce a alkylace? rozvolnění ě S-S S vazeb trypsin denaturace > lepší proteolýza agresivní proteasa ochrana oxidovaných reziduí Cys vysoká primární specificita, it nízká sekundární prům. m/z fragmentu ~ 1.5 kda štěpí: DTT, dithiothreitol arginyl-x, lysyl-x; ale ne X=prolyl KONTAMINACE! keratiny (kůže, vlasy, srst, vlna) detergenty (SDS, Triton atp.) ) IAA, jódoctová kys. Peptide Mass Fingerprinting - PMF, MALDI TOF MS masses (m/z) ELSDIAR QLLLTADDR PHSHPALTPEQK PHSHPALTPEQKK GILAADESTGSIAKR LQSIGTENTEWENRR IGENHTPSALAIMENANVLAR YTPSGQAGAAASESLFISNHAY

36 Bioinformatika pro MS organismy se sekvenovaným e genomem e PMF, statistická shoda predikovaných m/z tryptických peptidů (in silico digest) s experimentálními i PC programy MASCOT (firma Matrixscience), SEQUEST, ProteinProspector organismy s nesekvenovaným genomem hledání na základě evoluční homologie proteinových sekvencí Charakterizace ko- a posttranslačních modifikací v proteinech s použitím MS SEC + Q TOF MASS Charakterizace ko- a posttranslačních modifikací v proteinech s použitím MS fosforylace, sulfatace, glykosylace, N-koncové modifikace Význam: důležité pro regulaci buněčné distribuce ib a modulaci funkcí proteinů. Př. fosforylace - přenos signálu v buňce, glykosylace - vliv na funkční, strukturní a imunologické vlastnosti proteinů. Výhoda MALDI MS (FT ICR MS) analýzy v tomto případě spočívá ve velké přesnosti určení molekulové hmotnosti, citlivosti ti a rozlišení. Protokol pro analýzu proteinové modifikace 1) štěpením vzorku 2) enzymové modifikaci. Pak se analyzuje rozdíl v Mr určitého peptidu spočítané na základě sekvence a odečtené z MS spektra.

37 Děkuji za pozornost cz Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D.

38 Metody izolace a purifikace produktů Zdroje proteinů, polysacharidů a jiných. mikroorganismy (bakterie, kvasinky, plísně, řasy) živočišné tkáně (myši, krysy, králíci, jateční zvířata orgány, krev, člověk tělní tekutiny (krev plasmin, thrombin, specifické protilátky...; moč urokinasa...) rostlinná pletiva tělní tekutiny savců obrazová příloha Škola molekulárních biotechnologií Profession, Olomouc, březen 2011 Bílková Zuzana Cíl izolace Získání biopolymeru (proteiny, polysacharidy, glykoproteiny.) definované čistoty Zachování biologické aktivity Získat produkt o patřičné čistotě s vynaložením přiměřeného (optimálního) úsilí a přiměřeného množství peněz Výchozí materiál - úskalí Komplexnost biologické matrice ( (velké množství doprovodných odných bílkovin a jiných látek) Malá množství cílového produktu Labilita biologické aktivity produktu Strukturní labilita

39 Rozbíjení buněk, tkání, homogenizace Zásady pro práci s biologickým materiálem Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Separační metody A. Separace založené na velikosti molekul (dialýza a ultrafiltrace, centrifugace v hustotním gradientu, gelová filtrační chromatografie) B. Separace založené na rozdílech rozpustnosti proteinů (izoelektrická precipitace, vysolování neutrálními solemi, frakcionace organickými rozpouštědly) C. Separace založené na základě povrchového náboje (elektroforetické metody, iontově výměnná chromatografie, afinitní chromatografie) 1. Pokud možno zpracovat co nejdříve 2. V případě potřeby zmrazit ( 20;C, 80 o C) 3. Rozmražování co nejrychleji j x postupně p zvyšovat teplotu? 4. Nízká teplota při izolaci 5. Vhodné ph + iontová síla 6. Vhodná koncentrace bílkoviny 7. Zabránit pěnění 8. Omezení proteolytické aktivity (směs inhibitorů) 9. Přídavek specifických látek (např. ř ME, EDTA...) Separační metody Centrifugace a ultracentrifugace Membránové separace (ultrafiltrace, dialýza) Selektivní precipitace Iontově výměnná chromatografie (IEC) Chromatografie na molekulových sítech (SEC) Hydrofóbní chromatografie (HIC) Afinitní chromatografie (AC, IAC, HPIAC) Preparativní elektromigrační techniky

40 Frakcionovaná precipitace - vysolování Hydrofilní aminokyseliny interagují s molekulami vody a vytvářejí s ní vodíkové můstky (čím více hydrofilních skupin, tím více je protein rozpustný) Přidání soli do roztoku odebírá proteinu vodní plášť Interakce protein/protein je silnější než protein/roztok Molekuly l proteinu koagulují (agregují) díky hydrofóbním interakcím Selektivní precipitace Separace založené na rozdílné rozpustnosti proteinů Rozpustnost proteinu prudce stoupá, je-li v roztoku o ph nižším nebo v ph vyšším než pi proteinu (molekuly mají stejné náboje a odpuzují se). nost rozpustn vsolování I vysolování Při vysoké iontové síle se protein kompletně vysráží (mezi 39 a 75 %). Precipitace Selektivní precipitace 1) rozpustnost globulárních proteinů ovlivňuje ph 2) při ph = pi je rozpustnost nejnižší, molekuly mají tendenci se shlukovat mají 0 náboj 3) protein má celkový povrchový náboj buď kladný nebo záporný (NH + 3 nebo COO - postranních řetězců aminokyselin v proteinu) 4) princip izoelektrické precipitace - každý protein má jiné pi a vysráží se ze směsi proteinů v roztoku, který má ph = jeho pi. ph roztoku je nižší náboj proteinu pi Bílkoviny aktivní v nativním stavu, srážením ke změnám konformace molekuly (porušení fyz.-chem.vlastností chem.vlastností), musí biol. aktivita zajištěna návratem do fyziol. Podmínek Nezaměňovat s denaturací - Ireverzibilní precipitace sole těžkých kovů, koncentrované minerální kyseliny, y, orga- nické kyseliny, teplo Látky používané pro separaci bílkovin EtOH, NaCl, (NH 4 4) 2 SO 4 - rozpustnost se málo mění s teplotou, saturovaný roztok 4 M - hustota 1,235g/cm 3 umožňuje centrifugaci agregovaných bílkovin (hustota 1,29 g/cm 3 ), levný, čistý Filtrace nahrazena centrifugací ph roztoku je vyšší náboj proteinu + -

PROTOKOL WESTERN BLOT

PROTOKOL WESTERN BLOT WESTERN BLOT 1. PŘÍPRAVA ELEKTROFORETICKÉ APARATURY Saponátem a vodou se důkladně umyjí skla, plastové vložky a hřebínek, poté se důkladně opláchnou deionizovanou/destilovanou vodou a etanolem a nechají

Více

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Vysokoúčinná kapalinová chromatografie HPLC High Performance Liquid Chromatography Vysokoúčinná...X... Vysoceúčinná kapalinová chromatografie RRLC Rapid Resolution Liquid Chromatography Rychle rozlišovací

Více

Látky obsahují aminoskupinu

Látky obsahují aminoskupinu Látky obsahují aminoskupinu pro aminy a aminokyseliny se běžně používají derivatizace (viz kapitola o derivatizaci), peptidy lze detekovat přímo při krátkých UV vlnových délkách (amidická vazba 200 nm),

Více

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MELAMINU A KYSELINY KYANUROVÉ METODOU LC-MS

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MELAMINU A KYSELINY KYANUROVÉ METODOU LC-MS Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU MELAMINU A KYSELINY KYANUROVÉ METODOU LC-MS 1 Rozsah a účel Postup je určen pro stanovení obsahu melaminu a kyseliny kyanurové v krmivech. 2 Princip

Více

Detekce a detektory část 2

Detekce a detektory část 2 Detekce a detektory část 2 Ivan Mikšík Fyziologický ústav AV ČR, v.v.i. Praha Spojení (spřažení) hmotnostní spektrometrie a separačních technik Analýza složitých směsí (nejdříve separace, poté analýza)

Více

V organismu se bílkoviny nedají nahradit žádnými jinými sloučeninami, jen jako zdroj energie je mohou nahradit sacharidy a lipidy.

V organismu se bílkoviny nedají nahradit žádnými jinými sloučeninami, jen jako zdroj energie je mohou nahradit sacharidy a lipidy. BÍLKOVINY Bílkoviny jsou biomakromolekulární látky, které se skládají z velkého počtu aminokyselinových zbytků. Vytvářejí látkový základ života všech organismů. V tkáních vyšších organismů a člověka je

Více

Separační metody SEPARAČNÍ (DĚLÍCÍ) METODY CHROMATOGRAFIE ROZDĚLENÍ SEPARAČNÍCH METOD. www.natur.cuni.cz/~suchan. Jana Sobotníková

Separační metody SEPARAČNÍ (DĚLÍCÍ) METODY CHROMATOGRAFIE ROZDĚLENÍ SEPARAČNÍCH METOD. www.natur.cuni.cz/~suchan. Jana Sobotníková Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Katedra analytické chemie Separační metody Jana Sobotníková tel.: 221951230 e-mail: jana.sobotnikova@natur.cuni.cz www.natur.cuni.cz/~suchan *přednášky

Více

BÍLKOVINY HLÍZ BRAMBOR

BÍLKOVINY HLÍZ BRAMBOR Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích ZEMĚDĚLSKÁ FAKULTA BÍLKOVINY HLÍZ BRAMBOR jejich izolace a možnosti uplatnění Jan Bárta a kol. 19. května 2015, České Budějovice Kancelář transferu technologií

Více

PROTEOMIKA 6-8. 12. 2006

PROTEOMIKA 6-8. 12. 2006 PROTEOMIKA 6-8. 12. 2006 Středa: Čtvrtek: Pátek: Co je proteomika? Nástroje 2D elektroforéza IEF SDS PAGE Barvení Digesce Čištění peptidů Omezení 2D Zpracování Obrazu, Analýza 2D gelů (Dr. J. Pánek, AVČR)

Více

Laboratoř ze speciální analýzy potravin II. Úloha 3 - Plynová chromatografie (GC-MS)

Laboratoř ze speciální analýzy potravin II. Úloha 3 - Plynová chromatografie (GC-MS) 1 Úvod... 1 2 Cíle úlohy... 2 3 Předpokládané znalosti... 2 4 Autotest základních znalostí... 2 5 Základy práce se systémem GC-MS (EI)... 3 5.1 Parametry plynového chromatografu... 3 5.2 Základní charakteristiky

Více

Chromatografie Královna analýz

Chromatografie Královna analýz Chromatografie Královna analýz Monika Klusáčková monika.klusackova@jh-inst.cas.cz Ústav fyzikální chemie J.Heyrovského, AVČR, v.v.i. Analytická chemie Jaké látky se nachází ve vzorku? kvalitativní složení

Více

Zdroje iont používané v hmotnostní spektrometrii. Miloslav Šanda

Zdroje iont používané v hmotnostní spektrometrii. Miloslav Šanda Zdroje iont používané v hmotnostní spektrometrii Miloslav Šanda Ionizace v MS Hmotnostní spektrometrie je fyzikáln chemická metoda, pi které se provádí separace iont podle jejich hmotnosti a náboje m/z

Více

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KARCINOMU PANKREATU

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KARCINOMU PANKREATU Úvod IntellMed, s.r.o., Václavské náměstí 820/41, 110 00 Praha 1 DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KARCINOMU PANKREATU Jednou z nejvhodnějších metod pro detekci minimální reziduální

Více

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU Úvod IntellMed, s.r.o., Václavské náměstí 820/41, 110 00 Praha 1 DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU Jednou z nejvhodnějších metod pro detekci minimální

Více

ZŠ ÚnO, Bratří Čapků 1332

ZŠ ÚnO, Bratří Čapků 1332 Animovaná chemie Top-Hit Analytická chemie Analýza anorganických látek Důkaz aniontů Důkaz kationtů Důkaz kyslíku Důkaz vody Gravimetrická analýza Hmotnostní spektroskopie Chemická analýza Nukleární magnetická

Více

Vlastnosti peptidů a proteinů a jejich implikace pro vývoj HPLC metod... 23 Parametry mobilní a stacionární fáze... 23 Detekce peptidů a proteinů

Vlastnosti peptidů a proteinů a jejich implikace pro vývoj HPLC metod... 23 Parametry mobilní a stacionární fáze... 23 Detekce peptidů a proteinů Obsah METODY PURIFIKACE PRODUKTŮ... 5 Selektivní precipitace... 5 Chromatografické metody... 6 Afinitní purifikace... 8 Iontově výměnná chromatografie... 9 Gelová filtrace... 10 Hydrofobní chromatografie...

Více

Princip ionexové chromatografie a analýza aminokyselin

Princip ionexové chromatografie a analýza aminokyselin Princip ionexové chromatografie a analýza aminokyselin Teoretická část: vysvětlení principu ionexové (iontové) chromatografie, příprava vzorku pro analýzu aminokyselin (kyselá a alkalická hydrolýza), derivatizace

Více

Interakce proteinu p53 s genomovou DNA v kontextu chromatinu glioblastoma buněk

Interakce proteinu p53 s genomovou DNA v kontextu chromatinu glioblastoma buněk MASARYKOVA UNIVERZITA V BRNĚ Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie Interakce proteinu p53 s genomovou DNA v kontextu chromatinu glioblastoma buněk

Více

Analýza kofeinu v kávě pomocí kapalinové chromatografie

Analýza kofeinu v kávě pomocí kapalinové chromatografie Analýza kofeinu v kávě pomocí kapalinové chromatografie Kofein (obr.1) se jako přírodní alkaloid vyskytuje v mnoha rostlinách (např. fazolích, kakaových bobech, černém čaji apod.) avšak nejvíce je spojován

Více

Praktický kurz Monitorování hladiny metalothioneinu po působení iontů těžkých kovů Vyhodnocení měření

Praktický kurz Monitorování hladiny metalothioneinu po působení iontů těžkých kovů Vyhodnocení měření Laboratoř Metalomiky a Nanotechnologií Praktický kurz Monitorování hladiny metalothioneinu po působení iontů těžkých kovů Vyhodnocení měření Vyučující: Ing. et Ing. David Hynek, Ph.D., Prof. Ing. René

Více

Sbohem, paní Bradfordová

Sbohem, paní Bradfordová Sbohem, paní Bradfordová aneb IČ spektroskopie ve službách kvantifikace proteinů Mgr. Stanislav Kukla Merck spol. s r. o. Agenda 1 Zhodnocení současných možností kvantifikace proteinů Bradfordové metoda

Více

Tabulace učebního plánu. Obecná chemie. Vzdělávací obsah pro vyučovací předmět : Ročník: 1.ročník a kvinta

Tabulace učebního plánu. Obecná chemie. Vzdělávací obsah pro vyučovací předmět : Ročník: 1.ročník a kvinta Tabulace učebního plánu Vzdělávací obsah pro vyučovací předmět : CHEMIE Ročník: 1.ročník a kvinta Obecná Bezpečnost práce Názvosloví anorganických sloučenin Zná pravidla bezpečnosti práce a dodržuje je.

Více

Studijní materiál. Úvod do problematiky extrakčních metod. Vypracoval: RNDr. Ivana Borkovcová, Ph.D.

Studijní materiál. Úvod do problematiky extrakčních metod. Vypracoval: RNDr. Ivana Borkovcová, Ph.D. Studijní materiál Úvod do problematiky extrakčních metod Vypracoval: RNDr. Ivana Borkovcová, Ph.D. Úvod do problematiky extrakčních metod Definice, co je to extrakce separační proces v kontaktu jsou dvě

Více

Hmotnostní spektrometrie peptidů ů a proteinů Petr Halada Mikrobiologický ústav AV ČR halada@biomed.cas.cz Proč chceme znát molekulovou hmotnost? Všechny prvky a molekuly jsou charakterizovány 2 základními

Více

Výukový materiál zpracován v rámci projektu EU peníze školám Registrační číslo projektu: CZ.1.07/1.5.00/34.0996

Výukový materiál zpracován v rámci projektu EU peníze školám Registrační číslo projektu: CZ.1.07/1.5.00/34.0996 Výukový materiál zpracován v rámci projektu EU peníze školám Registrační číslo projektu: CZ.1.07/1.5.00/34.0996 Šablona: III/2 č. materiálu: VY_32_INOVACE_CHE_413 Jméno autora: Mgr. Alena Krejčíková Třída/ročník:

Více

Absorpční spektroskopie při biologické analýze molekul

Absorpční spektroskopie při biologické analýze molekul Absorpční spektroskopie při biologické analýze molekul Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii Ctirad Hofr 8.11.2007 7 1 UV spektroskopie DNA a proteinů Všechny atomy absorbují v UV oblasti

Více

Výukové texty pro předmět Měřící technika (KKS/MT) na téma Podklady k principu měření hodnoty ph a vodivosti kapalin

Výukové texty pro předmět Měřící technika (KKS/MT) na téma Podklady k principu měření hodnoty ph a vodivosti kapalin Výukové texty pro předmět Měřící technika (KKS/MT) na téma Podklady k principu měření hodnoty ph a vodivosti kapalin Autor: Doc. Ing. Josef Formánek, Ph.D. Podklady k principu měření hodnoty ph a vodivosti

Více

Lodish et al, Molecular Cell Biology, 4-6 vydání Alberts et al, Molecular Biology of the Cell, 4 vydání

Lodish et al, Molecular Cell Biology, 4-6 vydání Alberts et al, Molecular Biology of the Cell, 4 vydání Lodish et al, Molecular Cell Biology, 4-6 vydání Alberts et al, Molecular Biology of the Cell, 4 vydání http://web.natur.cuni.cz/~zdenap/zdenateachingnf.html CHEMICKÉ SLOŽENÍ BUŇKY BUŇKA: 99 % C, H, N,

Více

Diagnostické metody v lékařské mikrobiologii

Diagnostické metody v lékařské mikrobiologii Diagnostické metody v lékařské mikrobiologii Výuková prezentace z: Lékařské mikrobiologie Jan Smíšek ÚLM 3. LF UK 2009 Princip identifikace Soubor znaků s rozdílnou diskriminační hodnotou Základní problémy

Více

Eva Benešová. Dýchací řetězec

Eva Benešová. Dýchací řetězec Eva Benešová Dýchací řetězec Dýchací řetězec Během oxidace látek vstupujících do různých metabolických cyklů (glykolýza, CC, beta-oxidace MK) vznikají NADH a FADH 2, které následně vstupují do DŘ. V DŘ

Více

NÁSTŘIKOVÉ TECHNIKY KAPILÁRNÍ KOLONY

NÁSTŘIKOVÉ TECHNIKY KAPILÁRNÍ KOLONY NÁSTŘIKOVÉ TECHNIKY KAPILÁRNÍ KOLONY BLESKOVĚ ODPAŘUJÍCÍ (Vaporization Injection) Split Splitless On-Column CHLADNÉ (Cool Injection) nástřik velkých objemů (LVI) On-Column On-Column-SVE PTV NÁSTŘIKOVÉ

Více

OBSAH 1. ÚVOD... 5 2. SEPARAČNÍ TECHNIKY BIOMAKROMOLEKUL...

OBSAH 1. ÚVOD... 5 2. SEPARAČNÍ TECHNIKY BIOMAKROMOLEKUL... OBSAH 1. ÚVOD...5 2. SEPARAČNÍ TECHNIKY BIOMAKROMOLEKUL...8 2.1 FÁZOVÉ SEPARACE...8 2.1.1 Klasické separační techniky...8 2.1.2 Extrakce do dvoufázových vodných systémů...15 2.2 MEMBRÁNOVÉ PROCESY...21

Více

Uhlíkové struktury vázající ionty těžkých kovů

Uhlíkové struktury vázající ionty těžkých kovů Uhlíkové struktury vázající ionty těžkých kovů 7. června/june 2013 9:30 h 17:30 h Laboratoř metalomiky a nanotechnologií, Mendelova univerzita v Brně a Středoevropský technologický institut Budova D, Zemědělská

Více

Aminokyseliny, proteiny, enzymologie

Aminokyseliny, proteiny, enzymologie Aminokyseliny, proteiny, enzymologie Aminokyseliny Co to je? Organické látky karboxylové kyseliny, které mají na sousedním uhlíku navázanou aminoskupinu Jak to vypadá? K čemu je to dobré? AK jsou stavební

Více

Molekulární diagnostika

Molekulární diagnostika Molekulární diagnostika Odry 11. 11. 2010 Michal Pohludka, Ph.D. Buňka základní jednotka živé hmoty Všechny v současnosti známé buňky se vyvinuly ze společného předka, tedy buňky, která žila asi před 3,5-3,8

Více

ZŠ ÚnO, Bratří Čapků 1332

ZŠ ÚnO, Bratří Čapků 1332 Úvodní obrazovka Menu (vlevo nahoře) Návrat na hlavní stránku Obsah Výsledky Poznámky Záložky edunet Konec Chemie 1 (pro 12-16 let) LangMaster Obsah (střední část) výběr tématu - dvojklikem v seznamu témat

Více

Využití membránových procesů při zpracování syrovátky

Využití membránových procesů při zpracování syrovátky Seminář Membránové procesy v mlékárenství Pardubice 7. 5. 2013 Využití membránových procesů při zpracování syrovátky Jiří Štětina Ústav mléka, tuků a kosmetiky Osnova Charakterizace syrovátky přehled membránových

Více

V. letní škola metod molekulární biologie nukleových kyselin a genomiky 16. - 20. 6. 2014. Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat AF MENDELU

V. letní škola metod molekulární biologie nukleových kyselin a genomiky 16. - 20. 6. 2014. Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat AF MENDELU V. letní škola metod molekulární biologie nukleových kyselin a genomiky 16. - 20. 6. 2014 Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat AF MENDELU Zemědělská 1, Budova A, 4. patro (učebny dle programu)

Více

Typizace amyloidóz pomocí laserové mikrodisekce a hmotnostní spektrometrie

Typizace amyloidóz pomocí laserové mikrodisekce a hmotnostní spektrometrie Typizace amyloidóz pomocí laserové mikrodisekce a hmotnostní spektrometrie Dušan Holub Laboratoř experimentální medicíny, Ústav molekulární a translační medicíny Lékařské fakulty Univerzity Palackého v

Více

Písemná zpráva zadavatele

Písemná zpráva zadavatele Písemná zpráva zadavatele veřejné zakázky zadávané dle zákona č. 137/2006 Sb., o veřejných zakázkách, ve znění účinném ke dni zahájení zadávacího řízení (dále jen ZVZ ). Veřejná zakázka Název: Ostatní

Více

Ing. Libor Vodehnal, AITEC s.r.o., Ledeč nad Sázavou

Ing. Libor Vodehnal, AITEC s.r.o., Ledeč nad Sázavou Základní parametry procesů likvidace odpadních vod s obsahem těžkých kovů Ing. Libor Vodehnal, AITEC s.r.o., Ledeč nad Sázavou Technologie likvidace OV z obsahem těžkých kovů lze rozdělit na 3 skupiny:

Více

CHEMIE. Pracovní list č. 10 - žákovská verze Téma: Bílkoviny. Mgr. Lenka Horutová

CHEMIE. Pracovní list č. 10 - žákovská verze Téma: Bílkoviny. Mgr. Lenka Horutová www.projektsako.cz CHEMIE Pracovní list č. 10 - žákovská verze Téma: Bílkoviny Lektor: Mgr. Lenka Horutová Projekt: Student a konkurenceschopnost Reg. číslo: CZ.1.07/1.1.07/03.0075 Teorie: Název proteiny

Více

ÚVOD DO BIOCHEMIE. Dělení : 1)Popisná = složení org., struktura a vlastnosti látek 2)Dynamická = energetické změny

ÚVOD DO BIOCHEMIE. Dělení : 1)Popisná = složení org., struktura a vlastnosti látek 2)Dynamická = energetické změny BIOCHEMIE 1 ÚVOD DO BIOCHEMIE BCH zabývá se chemickými procesy v organismu a chemickým složením živých organismů Biologie: bios = život + logos = nauka Biochemie: bios = život + chemie Dělení : Chemie

Více

Molekulová spektroskopie 1. Chemická vazba, UV/VIS

Molekulová spektroskopie 1. Chemická vazba, UV/VIS Molekulová spektroskopie 1 Chemická vazba, UV/VIS 1 Chemická vazba Silová interakce mezi dvěma atomy. Chemické vazby jsou soudržné síly působící mezi jednotlivými atomy nebo ionty v molekulách. Chemická

Více

MIKROPORÉZNÍ TECHNOLOGIE

MIKROPORÉZNÍ TECHNOLOGIE MIKROPORÉZNÍ TECHNOLOGIE Definice pojmů sdílení tepla a tepelná vodivost Základní principy MIKROPORÉZNÍ TECHNOLOGIE Definice pojmů sdílení tepla a tepelná vodivost Co je to tepelná izolace? Jednoduše řečeno

Více

Výroční zpráva Ústavu analytické chemie AV ČR za rok 1995

Výroční zpráva Ústavu analytické chemie AV ČR za rok 1995 Výroční zpráva Ústavu analytické chemie AV ČR za rok 1995 1. Vědecká činnost pracoviště a uplatnění jejích výsledků a) V roce 1995 se ústav zabýval kapilárními separačními metodami analytické chemie, analytickými

Více

Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Část 24 Speciální metody Mikro HPLC, kapilární HPLC a LC na čipu Většina v současnosti používaných kolon má vnitřní průměr 4,6 mm,

Více

Iontové zdroje I. Iontový zdroj. Data. Vzorek. Hmotnostní analyzátor. Zdroj vakua. Ionizace, vlastnosti iontových zdrojů, iontová optika

Iontové zdroje I. Iontový zdroj. Data. Vzorek. Hmotnostní analyzátor. Zdroj vakua. Ionizace, vlastnosti iontových zdrojů, iontová optika Iontové zdroje I. Ionizace, vlastnosti iontových zdrojů, iontová optika API zdroje: Iontové zdroje pracující za atm. tlaku Elektrosprej Nanoelektrosprej Chemická ionizace za atmosférického tlaku Fotoionizace

Více

Biochemie. ochrana životního prostředí analytická chemie chemická technologie Forma vzdělávání: Platnost: od 1. 9. 2009 do 31. 8.

Biochemie. ochrana životního prostředí analytická chemie chemická technologie Forma vzdělávání: Platnost: od 1. 9. 2009 do 31. 8. Studijní obor: Aplikovaná chemie Učební osnova předmětu Biochemie Zaměření: ochrana životního prostředí analytická chemie chemická technologie Forma vzdělávání: denní Celkový počet vyučovacích hodin za

Více

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE -samostatně - strukturní analýza, identifikace látek - kvalitativní i kvantitativní detekce v GC a LC - prvková analýza kombinace s ICP - pyrolýzní hmotnostní spektrometrie - analýza

Více

Membránové procesy v mlékárenském průmyslu

Membránové procesy v mlékárenském průmyslu Membránové procesy v mlékárenském průmyslu situace v ČR, jak to je rozmanité, jak to nemusí být jednoduché Ing. Jan Drbohlav, CSc., Výzkumný ústav mlékárenský drbohlav@milcom-as.cz Membránové procesy v

Více

FLUORESCENČNÍ MIKROSKOP

FLUORESCENČNÍ MIKROSKOP FLUORESCENČNÍ MIKROSKOP na gymnáziu Pierra de Coubertina v Táboře Pavla Trčková, kabinet Biologie, GPdC Tábor Co je fluorescence Fluorescence je jev spočívající v tom, že některé látky (fluorofory) po

Více

B. Výchovné a vzdělávací strategie jsou totožné se strategiemi vyučovacího předmětu Chemie

B. Výchovné a vzdělávací strategie jsou totožné se strategiemi vyučovacího předmětu Chemie 4.8.13. Cvičení z chemie Předmět Cvičení z chemie je nabízen jako volitelný předmět v sextě. Náplní předmětu je aplikace teoreticky získaných poznatků v praxi. Hlavní důraz je kladen na praktické dovednosti.

Více

CLP ANALYSIS OF MOLECULAR MARKERS DIGITAL IMAGE ANALYSIS OF ELECTROPHOEROGRAMS CZECH VERSION

CLP ANALYSIS OF MOLECULAR MARKERS DIGITAL IMAGE ANALYSIS OF ELECTROPHOEROGRAMS CZECH VERSION CLP ANALYSIS OF MOLECULAR MARKERS DIGITAL IMAGE ANALYSIS OF ELECTROPHOEROGRAMS CZECH VERSION DIGITÁLNÍ OBRAZOVÁ ANALÝZA ELEKTROFORETICKÝCH GELŮ *** Vyhodnocování získaných elektroforeogramů: Pro vyhodnocování

Více

ISOLATION OF PHOSPHOPROTEOM AND ITS APPLICATION IN STUDY OF THE EFFECT OF CYTOKININ ON PLANTS

ISOLATION OF PHOSPHOPROTEOM AND ITS APPLICATION IN STUDY OF THE EFFECT OF CYTOKININ ON PLANTS ISOLATION OF PHOSPHOPROTEOM AND ITS APPLICATION IN STUDY OF THE EFFECT OF CYTOKININ ON PLANTS IZOLACE FOSFOPROTEOMU A JEHO VYUŽITÍ PŘI STUDIU ÚČINKU CYTOKININŮ NA ROSTLINU Černý M., Brzobohatý B. Department

Více

Analýza proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie

Analýza proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie Analýza proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie Analysis of Protein Using Mass Spectrometry Dvořáková P., Hernychová L., Vojtěšek B. Regionální centrum aplikované molekulární onkologie, Masarykův onkologický

Více

Obor Aplikovaná chemie ŠVP Aplikovaná chemie, životní prostředí, farmaceutické substance Maturitní témata Chemie

Obor Aplikovaná chemie ŠVP Aplikovaná chemie, životní prostředí, farmaceutické substance Maturitní témata Chemie STŘEDNÍ ŠKOLA INFORMATIKY A SLUŽEB ELIŠKY KRÁSNOHORSKÉ 2069 DVŮR KRÁLOVÉ N. L. Obor Aplikovaná chemie ŠVP Aplikovaná chemie, životní prostředí, farmaceutické substance Maturitní témata Chemie Školní rok:

Více

Projekt realizovaný na SPŠ Nové Město nad Metují

Projekt realizovaný na SPŠ Nové Město nad Metují Projekt realizovaný na SPŠ Nové Město nad Metují s finanční podporou v Operačním programu Vzdělávání pro konkurenceschopnost Královéhradeckého kraje Modul 02 Přírodovědné předměty Hana Gajdušková 1 Viry

Více

Základy NIR spektrometrie a její praktické využití

Základy NIR spektrometrie a její praktické využití Nicolet CZ s.r.o. The world leader in serving science Základy NIR spektrometrie a její praktické využití NIR praktická metoda molekulové spektroskopie, nahrazující pracnější, časově náročnější a dražší

Více

Sylabus pro předmět Biochemie pro jakost

Sylabus pro předmět Biochemie pro jakost Sylabus pro předmět Biochemie pro jakost Kód předmětu: BCHJ Název v jazyce výuky: Biochemie pro Jakost Název česky: Biochemie pro Jakost Název anglicky: Biochemistry Počet přidělených ECTS kreditů: 6 Forma

Více

Základní škola, Ostrava Poruba, Bulharská 1532, příspěvková organizace

Základní škola, Ostrava Poruba, Bulharská 1532, příspěvková organizace Chemie - 8. ročník pozorování, pokus a bezpečnost práce Určí společné a rozdílné vlastnosti látek vlastnosti látek hustota, rozpustnost, tepelná a elektrická vodivost, vliv atmosféry na vlastnosti a stav

Více

Vzdělávání zdravotních laborantek v oblasti molekulární biologie

Vzdělávání zdravotních laborantek v oblasti molekulární biologie Vzdělávání zdravotních laborantek v oblasti molekulární biologie Beránek M., Drastíková M. Ústav klinické biochemie a diagnostiky, Lékařská fakulta UK a Fakultní nemocnice Hradec Králové beranek@lfhk.cuni.cz

Více

test zápočet průměr známka

test zápočet průměr známka Zkouškový test z FCH mikrosvěta 6. ledna 2015 VZOR/1 jméno test zápočet průměr známka Čas 90 minut. Povoleny jsou kalkulačky. Nejsou povoleny žádné písemné pomůcky. U otázek označených symbolem? uvádějte

Více

Potravinářské aplikace

Potravinářské aplikace Potravinářské aplikace Nanodisperze a nanokapsle Funkční složky (např. léky, vitaminy, antimikrobiální prostředky, antioxidanty, aromatizující látky, barviva a konzervační prostředky) jsou základními složkami

Více

Základní škola, Ostrava Poruba, Bulharská 1532, příspěvková organizace

Základní škola, Ostrava Poruba, Bulharská 1532, příspěvková organizace Chemie - 8. ročník pozorování, pokus a bezpečnost práce Určí společné a rozdílné vlastnosti látek vlastnosti látek hustota, rozpustnost, tepelná a elektrická vodivost, vliv atmosféry na vlastnosti a stav

Více

Očekávané výstupy podle RVP ZV Učivo předmětu Přesahy a vazby

Očekávané výstupy podle RVP ZV Učivo předmětu Přesahy a vazby Předmět: CHEMIE Ročník: 8. Časová dotace: 2 hodiny týdně Očekávané výstupy podle RVP ZV Učivo předmětu Přesahy a vazby Konkretizované tematické okruhy realizovaného průřezového tématu září orientuje se

Více

Biogenníaminy. pro HPLC. Dny kontroly kvality a speciálních metod HPLC Bio-Rad Lednice 8.-9. Listopadu, 2012

Biogenníaminy. pro HPLC. Dny kontroly kvality a speciálních metod HPLC Bio-Rad Lednice 8.-9. Listopadu, 2012 Bio-Rad Laboratories Munich Manufacturing Biogenníaminy pro HPLC Dny kontroly kvality a speciálních metod HPLC Bio-Rad Lednice 8.-9. Listopadu, 2012 Bio-Rad Laboratories München, Germany Biogenníaminy

Více

Elektrický proud 2. Zápisy do sešitu

Elektrický proud 2. Zápisy do sešitu Elektrický proud 2 Zápisy do sešitu Směr elektrického proudu v obvodu 1/2 V různých materiálech vedou elektrický proud různé částice: kovy volné elektrony kapaliny (roztoky) ionty plyny kladné ionty a

Více

Bílkoviny. Charakteristika a význam Aminokyseliny Peptidy Struktura bílkovin Významné bílkoviny

Bílkoviny. Charakteristika a význam Aminokyseliny Peptidy Struktura bílkovin Významné bílkoviny Bílkoviny harakteristika a význam Aminokyseliny Peptidy Struktura bílkovin Významné bílkoviny 1) harakteristika a význam Makromolekulární látky složené z velkého počtu aminokyselinových zbytků V tkáních

Více

energetického využití odpadů, odstraňování produktů energetického využití odpadů, hodnocení dopadů těchto technologií na prostředí.

energetického využití odpadů, odstraňování produktů energetického využití odpadů, hodnocení dopadů těchto technologií na prostředí. Příjemce projektu: Partner projektu: Místo realizace: Ředitel výzkumného institutu: Celkové způsobilé výdaje projektu: Dotace poskytnutá EU: Dotace ze státního rozpočtu ČR: VŠB Technická univerzita Ostrava

Více

06. Plynová chromatografie (GC)

06. Plynová chromatografie (GC) 06. Plynová chromatografie (GC) Plynová chromatografie je analytická a separační metoda, která má výsadní postavení v analýze těkavých látek. Mezi hlavní výhody této techniky patří jednoduché a rychlé

Více

Úloha č. 1 Odměřování objemů, ředění roztoků Strana 1. Úkol 1. Ředění roztoků. Teoretický úvod - viz návod

Úloha č. 1 Odměřování objemů, ředění roztoků Strana 1. Úkol 1. Ředění roztoků. Teoretický úvod - viz návod Úloha č. 1 Odměřování objemů, ředění roztoků Strana 1 Teoretický úvod Uveďte vzorec pro: výpočet směrodatné odchylky výpočet relativní chyby měření [%] Použitý materiál, pomůcky a přístroje Úkol 1. Ředění

Více

Výukový materiál zpracován v rámci projektu EU peníze školám Registrační číslo projektu: CZ.1.07/1.5.00/34.0996

Výukový materiál zpracován v rámci projektu EU peníze školám Registrační číslo projektu: CZ.1.07/1.5.00/34.0996 Výukový materiál zpracován v rámci projektu EU peníze školám Registrační číslo projektu: CZ.1.07/1.5.00/34.0996 Šablona: III/2 č. materiálu: VY_32_INOVACE_CHE_419 Jméno autora: Třída/ročník: Mgr. Alena

Více

Nutriční aspekty konzumace mléčných výrobků

Nutriční aspekty konzumace mléčných výrobků Nutriční aspekty konzumace mléčných výrobků Prof. MVDr. Lenka VORLOVÁ, Ph.D. a kolektiv FVHE VFU Brno Zlín, 2012 Mléčné výrobky mají excelentní postavení mezi výrobky živočišného původu - vyšší biologická

Více

Bílkoviny příručka pro učitele. Obecné informace:

Bílkoviny příručka pro učitele. Obecné informace: Obecné informace: Bílkoviny příručka pro učitele Téma Bílkoviny přesáhne rámec jedné vyučovací hodiny. Vyučující rozdělí téma na 2 vyučovací hodiny, zadá klasifikaci bílkovin jako samostatnou práci popř.

Více

cdna synthesis kit First-Strand cdna Synthesis System Verze 1.2

cdna synthesis kit First-Strand cdna Synthesis System Verze 1.2 cdna synthesis kit First-Strand cdna Synthesis System Verze 1.2 Obsah soupravy a její skladování Tato souprava pro reverzní transkripci obsahuje reagencie potřebné k provedení reverzní transkripce (RT)

Více

PREPARING, ISOLATION AND PARTICAL CHARACTERIZATION OF RECOMBINANT PROTEINS OF β-glukosidase ZM-P60.1

PREPARING, ISOLATION AND PARTICAL CHARACTERIZATION OF RECOMBINANT PROTEINS OF β-glukosidase ZM-P60.1 PREPARING, ISOLATION AND PARTICAL CHARACTERIZATION OF RECOMBINANT PROTEINS OF β-glukosidase ZM-P60.1 PŘÍPRAVA, IZOLACE A ČÁSTEČNÁ CHARAKTERIZACE REKOMBINANTNÍCH PROTEINŮ β-glukosidasy ZM-P60.1 Klimeš P.

Více

5. Příjem, asimilace a fyziologické dopady anorganického dusíku. 5. Příjem, asimilace a fyziologické dopady anorganického dusíku

5. Příjem, asimilace a fyziologické dopady anorganického dusíku. 5. Příjem, asimilace a fyziologické dopady anorganického dusíku 5. Příjem, asimilace a fyziologické dopady anorganického dusíku Zdroje dusíku dostupné v půdě: Amonné ionty + Dusičnany = největší zdroj dusíku v půdě Organický dusík (aminokyseliny, aminy, ureidy) zpracování

Více

ORGANICKÁ CHEMIE Laboratorní práce č. 9

ORGANICKÁ CHEMIE Laboratorní práce č. 9 Téma: Bílkoviny, enzymy ORGANICKÁ CHEMIE Laboratorní práce č. 9 Úkol 1: Dokažte, že mléko obsahuje bílkovinu kasein. Kasein je hlavní bílkovinou obsaženou v savčím mléce. Výroba řady mléčných výrobků je

Více

Charakteristika vyučovacího předmětu Chemie

Charakteristika vyučovacího předmětu Chemie Charakteristika vyučovacího předmětu Chemie Obsahové, časové a organizační vymezení předmětu Chemie Obsah předmětu Chemie je zaměřen na praktické využití poznatků o chemických látkách, na znalost a dodržování

Více

PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE - PERSPEKTIVNÍ ALTERNATIVA V ANALÝZE MIKROBIOLOGICKÝCH UKAZATELŮ KVALITY VOD

PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE - PERSPEKTIVNÍ ALTERNATIVA V ANALÝZE MIKROBIOLOGICKÝCH UKAZATELŮ KVALITY VOD PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE - PERSPEKTIVNÍ ALTERNATIVA V ANALÝZE MIKROBIOLOGICKÝCH UKAZATELŮ KVALITY VOD 1* P. Mikula, 1 B. Maršálek 1 Botanický ústav Akademie věd ČR, Oddělení experimentální fykologie a ekotoxikologie,

Více

APLIKACE FOTOKATALYTICKÝCH PROCESŮ PRO ČIŠTĚNÍ KONTAMINOVANÝCH VOD

APLIKACE FOTOKATALYTICKÝCH PROCESŮ PRO ČIŠTĚNÍ KONTAMINOVANÝCH VOD APLIKACE FOTOKATALYTICKÝCH PROCESŮ PRO ČIŠTĚNÍ KONTAMINOVANÝCH VOD Ywetta Maléterová Simona Krejčíková Lucie Spáčilová, Tomáš Cajthaml František Kaštánek Olga Šolcová Vysoké požadavky na kvalitu vody ve

Více

Dělení a svařování svazkem plazmatu

Dělení a svařování svazkem plazmatu Dělení a svařování svazkem plazmatu RNDr. Libor Mrňa, Ph.D. Osnova: Fyzikální podstat plazmatu Zdroje průmyslového plazmatu Dělení materiálu plazmou Svařování plazmovým svazkem Mikroplazma Co je to plazma?

Více

TUKY. Autor: Mgr. Stanislava Bubíková. Datum (období) tvorby: 15. 3. 2013. Ročník: devátý

TUKY. Autor: Mgr. Stanislava Bubíková. Datum (období) tvorby: 15. 3. 2013. Ročník: devátý TUKY Autor: Mgr. Stanislava Bubíková Datum (období) tvorby: 15. 3. 2013 Ročník: devátý Vzdělávací oblast: Člověk a příroda / Chemie / Organické sloučeniny 1 Anotace: Žáci se seznámí s lipidy. V rámci tohoto

Více

NMR spektroskopie. Úvod

NMR spektroskopie. Úvod NMR spektroskopie Úvod Zkratka NMR znamená Nukleární Magnetická Rezonance. Jde o analytickou metodu, která na základě absorpce radiofrekvenčního záření vzorkem umístěným v silném magnetickém poli poskytuje

Více

VEDENÍ ELEKTRICKÉHO PROUDU V LÁTKÁCH

VEDENÍ ELEKTRICKÉHO PROUDU V LÁTKÁCH VEDENÍ ELEKTRICKÉHO PROUDU V LÁTKÁCH Jan Hruška TV-FYZ Ahoj, tak jsme tady znovu a pokusíme se Vám vysvětlit problematiku vedení elektrického proudu v látkách. Co je to vlastně elektrický proud? Na to

Více

Falšování potravin. MVDr. Matej Pospiech, Ph.D.

Falšování potravin. MVDr. Matej Pospiech, Ph.D. Falšování potravin MVDr. Matej Pospiech, Ph.D. Mendelova univerzita, 31.10.2013 Obsah přednášky úvod, historie co považujeme za falšování specifika falšování potravin nejčastější způsoby falšování u jednotlivých

Více

Gymnázium Vysoké Mýto nám. Vaňorného 163, 566 01 Vysoké Mýto

Gymnázium Vysoké Mýto nám. Vaňorného 163, 566 01 Vysoké Mýto Gymnázium Vysoké Mýto nám. Vaňorného 163, 566 01 Vysoké Mýto SUBSTITUČNÍ DERIVÁTY KARBOXYLOVÝCH O KYSELIN R C O X karboxylových kyselin - substituce na vedlejším uhlovodíkovém řetězci aminokyseliny - hydroxykyseliny

Více

Organická chemie 3.ročník studijního oboru - kosmetické služby.

Organická chemie 3.ročník studijního oboru - kosmetické služby. Organická chemie 3.ročník studijního oboru - kosmetické služby. T-7 Funkční a substituční deriváty karboxylových kyselin Zpracováno v rámci projektu Zlepšení podmínek ke vzdělávání Registrační číslo projektu:

Více

Konečná zpráva hodnocení různých způsobů přípravy vzorků pro AMPLICOR HPV test firmy Roche

Konečná zpráva hodnocení různých způsobů přípravy vzorků pro AMPLICOR HPV test firmy Roche Konečná zpráva hodnocení různých způsobů přípravy vzorků pro AMPLICOR HPV test firmy Roche Charakteristika testu: Set AMPLICOR HPV vyráběný firmou Roche je určený pro detekci vysoko-rizikových typů lidských

Více

Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Část 19 Chirální separace Enantiomery jsou molekuly, které nejsou ztotožnitelné se svými zrcadlovými obrazy. Obě zrcadlové formy

Více

Veronika Janů Šárka Kopelentová Petr Kučera. Oddělení alergologie a klinické imunologie FNKV Praha

Veronika Janů Šárka Kopelentová Petr Kučera. Oddělení alergologie a klinické imunologie FNKV Praha Veronika Janů Šárka Kopelentová Petr Kučera Oddělení alergologie a klinické imunologie FNKV Praha interakce antigenu s protilátkou probíhá pouze v místech epitopů Jeden antigen může na svém povrchu nést

Více

DĚLÍCÍ -SEPARAČNÍ METODY

DĚLÍCÍ -SEPARAČNÍ METODY DĚLÍCÍ -SEPARAČNÍ METODY Přehled nejdůležitějších separačních metod Separační (dělící) metody patří k základním typům operací prováděných v chemické laboratoři. Tyto operace se uplatňují při izolací jednotlivých

Více

Chemická vazba. Příčinou nestability atomů a jejich ochoty tvořit vazbu je jejich elektronový obal.

Chemická vazba. Příčinou nestability atomů a jejich ochoty tvořit vazbu je jejich elektronový obal. Chemická vazba Volné atomy v přírodě jen zcela výjimečně (vzácné plyny). Atomy prvků mají snahu se navzájem slučovat a vytvářet molekuly prvků nebo sloučenin. Atomy jsou v molekulách k sobě poutány chemickou

Více

Metoda Live/Dead aneb využití fluorescenční mikroskopie v bioaugmentační praxi. Juraj Grígel Inovativní sanační technologie ve výzkumu a praxi

Metoda Live/Dead aneb využití fluorescenční mikroskopie v bioaugmentační praxi. Juraj Grígel Inovativní sanační technologie ve výzkumu a praxi Metoda Live/Dead aneb využití fluorescenční mikroskopie v bioaugmentační praxi Juraj Grígel Inovativní sanační technologie ve výzkumu a praxi Co je to vlastně ta fluorescence? Některé látky (fluorofory)

Více

Inovace profesní přípravy budoucích učitelů chemie

Inovace profesní přípravy budoucích učitelů chemie Inovace profesní přípravy budoucích učitelů chemie I n v e s t i c e d o r o z v o j e v z d ě l á v á n í CZ.1.07/2.2.00/15.0324 Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem

Více

Bílkoviny, tuky prezentace

Bílkoviny, tuky prezentace Bílkoviny, tuky prezentace VY_52_Inovace_243 Vzdělávací oblast: Člověk a příroda Vzdělávací obor: Chemie Ročník: 8, 9 Projekt EU peníze školám Operačního programu Vzdělávání pro konkurenceschopnost Bílkoviny

Více

Chemie - 8. ročník (RvTv)

Chemie - 8. ročník (RvTv) Chemie - 8. ročník (RvTv) Školní výstupy Učivo Vztahy charakterizuje chemii jako jednu z přírodních věd, rozlišuje a definuje jednotlivé chemické obory, rozlišuje látky a tělesa analyzuje fyzikální a chemické

Více

ANODA KATODA elektrolyt:

ANODA KATODA elektrolyt: Ukázky z pracovních listů 1) Naznač pomocí šipek, které částice putují k anodě a které ke katodě. Co je elektrolytem? ANODA KATODA elektrolyt: Zn 2+ Cl - Zn 2+ Zn 2+ Cl - Cl - Cl - Cl - Cl - Zn 2+ Cl -

Více

EU peníze středním školám digitální učební materiál

EU peníze středním školám digitální učební materiál EU peníze středním školám digitální učební materiál Číslo projektu: Číslo a název šablony klíčové aktivity: Tematická oblast, název DUMu: Autor: CZ.1.07/1.5.00/34.0515 III/2 Inovace a zkvalitnění výuky

Více