Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D.

Transkript

1 Fingerprint Identifikace proteinů Proteinové mapy (2D elektroforeogramy, HPLC spektra, CZE spektra) Peptidové mapy (2D elektroforeogramy, HPLC spektra, CZE spektra, MS spektra) Charakteristické a specifické polohy skvrn, píků otisky prstů pro každý např. buněčný proteom nebo pro každý protein Identifikace proteinů v proteomice Molekulovou hmotnost nativního proteinu separovaného ELFO lze potvrdit hmotovou spektroskopií MALDI TOF, ESI TOF. Sekvenční analýza se provádí způsoby: 1.Edmanovou degradací (přímé sekvencování) a 2. hmotovou spektrometrií (nepřímé sekvencování, fingerprinting, de novo sekvencování). V obou případech p pak na základě získaných sekvencí následuje hledání v databázích proteinů Pro přímé sekvencování je nutný blotting nativního proteinu nebo jeho peptidových fragmentů (připravených in-solution štěpením a následně separovaných ELFO Schäger/von Jagow) na PVDF membránu. Po obarvení membrány amidočerní 10B se vyříznou příslušné pásy (1D) nebo skvrny (2D) a fragmenty membrány se vloží do reakční cely proteinového sekvenátoru. DIGE Diferenční 2D elektroforéza Výsledné mapy proteinů se porovnávají s kontrolními vzorky (pacienti s konkrétním onemocněním a zdraví pacienti). Po vyříznutí oblasti vykazující odlišnost je provedena analýza MS.

2 Fragmentace proteinů, polypeptidových řetězců Edmanovo odbourávání Pro analýzu Edmanovou degradací jsou nutná množství vzorku pmol, nejlépe však 200 pmol, konkurenční MS nyní zvládá fmoly (nanosprej ESI Qq TOF MS), dosud však není tolik rozšířená. Podmínkou pro úspěšnou sekvenční analýzu Edmanovou cestou je volný N-konec peptidu či proteinu. Edmanovo odbourávání Po odštěpení PTC-derivátu následuje jeho analýza (zjištění retenčního času na HPLC koloně) s detekcí při 270 nm. Běžně je takto možné získat aminokyselin z N-konce, samozřejmě s narůstající chybou (reakce není 100% ní). Za ideálních podmínek maximálně 100 aminokyselin. V automatickém proteinovém sekvenátoru (dodávají např. firmy Applied Biosystems, Shimadzu) je analyzovaný protein či peptid imobilizován. Buď na disku ze skleněných vláken (kovalentní vazba nebo adsorpce) nebo na membráně PVDF (ProSorb patrony nebo po blottingu). Reagencie ke vzorku vstupují a jsou odváděny nejlépe v plynné fázi. Doba trvání jednoho cyklu analýzy činí min. Je třeba připočítat eluci standardů aminokyselin a tzv. prázdný run. Často je však N-konec chemicky blokován (acetylace, pyroglutamová kyselina). Nevýhodou i výskyt glykosylačních míst - zde nízký výtěžek v daném cyklu. Automatizace

3 Hmotnostní spektrometrie (mass spectometry, MS) Princip ESI TOF MS a MALDI TOF MS Je metoda pro separaci látek podle rozdílů hmoty (m) a náboje (z) s využitím elektrického a magnetického pole. Určovanou fyzikální veličinou je podíl hmoty a náboje (m/z), při znalosti náboje umožňuje j určit molekulovou hmotnost. Velmi citlivá metoda, stačí několik iontů k získání měřitelného signálu, poměr m/z může být stanoven s přesností Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Původně aplikována pro malé těkavé látky, či derivatizované netěkavé látky (ionizace i paprskem elektronů ů - EI, chemická ionizace i s nosným plynem). S objevem šetrnějších technik ionizace (ESI, MALDI) je možné měřit i velké molekuly (např. proteiny, lipidové komplexy, polysacharidy). y) Matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) Laserová desorpční ionizace s pomocí matrice Metoda MALDI MS (od 1988) je rozšířeným nástrojem pro separaci přírodních látek, peptidů, proteinů a dalších bio- makromolekul (oligonukleotidy, sacharidy, lipidy). Vzorek je na nerezové destičce ukotven v netěkavé matrici (kokrystalizace). Používá se např. kyselina nikotinová nebo 2,5- dihydroxybenzoová. Vzorek (1 mg/ml) se nanese v 0.5 l na nerezovou destičku a nechá se vysušit. Pak se aplikuje 0.5 l matrice a opět se nechá vysušit. Destička se vloží do přístroje, zacílí se laserový paprsek p ( fire ), transfer energie e e způsobí ionizaci. Směrovaný ě energetický impuls poskytuje vysoké výtěžky iontů intaktního analytu, dosahuje se subpikomolární sensitivity. SELDI surface enhanced laser desorption/ionisation array chip hmotová spektrometrie výhody jednoduchost rychlost selektivita nevýhody nízká citlivost nízká přesnost urč. m/z nízké rozlišení

4 MS je často propojena s jinými analytickými technikami: ať už separačními nebo bez separace. Vznikají tak systémy GC- MS, LC-MS, CE-MS ale i MS-MS. Kroměě tandemové MS (MS-MS) MS) mohou být spojeny ažž tři i více analyzátorů ( multiple MS). První vybírá studované látky ze směsi, druhý je fragmentuje, třetí analyzuje vzniklé fragmenty. Pro identifikaci látek ve složitých směsích; nikoli na základě m/z, ale podle fragmentačních obrazů ( patterns ). Ve spojení s chromato či elfo metodou slouží MS jako detektor s vysokým rozlišením. Taková on-line analýza pak dává okamžité výsledky na rozdíl od off-line detekce. Klíčové je propojení přístrojů. LC-MS v biochemii pro peptidy a proteiny, GC-MS pro těkavé LMW látky, CE-MS široký záběr od LMW po proteiny, DNA, viry etc. vyříznout proužek rozřezat omýt Příprava vzorku (redukce) (alkylace) štěpení proteasou proč redukce a alkylace? rozvolnění ě S-S S vazeb trypsin denaturace > lepší proteolýza agresivní proteasa ochrana oxidovaných reziduí Cys vysoká primární specificita, it nízká sekundární prům. m/z fragmentu ~ 1.5 kda štěpí: DTT, dithiothreitol arginyl-x, lysyl-x; ale ne X=prolyl KONTAMINACE! keratiny (kůže, vlasy, srst, vlna) detergenty (SDS, Triton atp.) ) IAA, jódoctová kys. Identifikace pomocí HPLC-ESI-MS/MS 1. Štěpení proteinu trypsinem 3. MS vybraného štěpu protein II (16 kd) 3 fragmenty (2 kd, 6 kd, 8 kd) 2. Separace peptidů chromatografií (HPLC) UV abs Time (min) 5. Určení části sekvence.. M G A D D H D K L.. 6. Srovnávání s databázemi, identifikace 2,5 kd Hledáním v databázi je pak proteinový vzorek identifikován, nebo se zjistí, že jde o protein, který dosud v databázi není. Předpodkladem pro vyhledávání jsou naměřené přesné m/z hodnoty peptidových fragmentů, použítí specifické proteasy a přesná m/z intaktního proteinu. Pro štěpení se používají endoproteasy, tedy proteolytické enzymy, které štěpíě uvnitř ř proteinové molekuly. l Důrazů se klade na specifitu použité proteasy, používají se proto vysoce specifické enzymy, jako je trypsin z hovězího či vepřového pankreatu (EC ) nebo Lys C proteasa z Bacillus licheniformis (EC ). Trypsin štěpí za bazickými zbytky y Arg a Lys, proteasa Lys C za zbytkem Lysinu. Podobně Glu C proteasa ze Staphylococcus aureus V8 (EC ) štěpí za Glu. Specificky lze štěpitě chemicky použitím í CNBr. m/z 4. MS/MS spektrum m/z další fragmentace

5 Identifikace proteinů peptide fingerprinting štěpení proteázou (trypsinem) protein I (12 kd) DNA (i EST), proteinová databáze 2 fragmenty (4 kd, 8 kd) protein II (16 kd) 3 fragmenty (2 kd, 6 kd, 8 kd) generování teoretických trypsinových štěpů ze známých či předpokládaných proteinových sekvencí Peptide Mass Fingerprinting - PMF, MALDI TOF MS masses (m/z) ELSDIAR QLLLTADDR PHSHPALTPEQK PHSHPALTPEQKK GILAADESTGSIAKR LQSIGTENTEWENRR IGENHTPSALAIMENANVLAR YTPSGQAGAAASESLFISNHAY MALDI ToF Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D protein I m/z protein II m/z Bioinformatika pro MS organismy se sekvenovaným genomem e PMF, statistická shoda predikovaných m/z tryptických peptidů (in silico digest) s experimentálními i PC programy MASCOT (firma Matrixscience), SEQUEST, ProteinProspector organismy s nesekvenovaným genomem protein a: 3, 5, 9, 12 kd protein b: 2, 7, 9 kd protein c: 4, 8 kd protein d: 3, 9, 12 kd protein e: 2, 6, 8 kd Srovnání experimentálně stanovených velikostí peptidů s teoretickými štěpy hledání na základě evoluční homologie proteinových sekvencí MS BLAST: MS driven Best Local Alignment Search Tool MultiTag (S. Sunyaev et al., Anal. Chem. 2003, in press) Charakterizace ko- a posttranslačních modifikací v proteinech s použitím MS fosforylace, sulfatace, glykosylace, N-koncové modifikace Význam: důležité pro regulaci buněčné distribuce a modulaci funkcí proteinů. Př. fosforylace - přenos signálu v buňce, glykosylace - vliv na funkční, strukturní a imunologické vlastnosti proteinů. Výhoda MALDI MS analýzy v tomto případě spočívá ve velké přesnosti určení molekulové hmotnosti, citlivosti a rozlišení. Typický protokol pro analýzu proteinové modifikace začíná štěpením vzorku, enzymobe modifikaci. Pak se analyzuje rozdíl v molekulové hmotnosti určitého peptidu spočítané na základě sekvence a odečtené z MS spektra. Pro složitost některých směsíě je výhodnější použít MALDI PSD MS/MS nebo LC MS.

6 MALDI MS pro studium vyšší struktury proteinů Studium prostorové struktury proteinů (zvl. terciární a kvarterní) má význam z důvodu těsného vztahu struktura - funkce. Poznání struktury tedy může poskytnout informace o funkci proteinu. Pro studium struktury proteinů se běžně používá řada spektro- skopických metod (Krystalografie - difrakce paprsků X, NMR spektroskopie a další). Dávají poměrně jasné výsledky, ale jejich nevýhodou může být zejména časová náročnost a nároky na vyšší množství materiálu. Poskytují rovněž značná množství dat, jejichž vyhodnocování je opět náročné. Technikou MS je možné studovat například přístupnost určitých povrchových regionů proteinů s použiím metody zvané protein mass fingerprinting (PMF).

7 Ověření účinnosti separace, čistoty a charakterizace produktů Oveření čistoty proteinů, peptidů a polysacharidů a jejich charakterizace pomocí HPLC (iontová, SEC, afinitní chromatografie, hydrofobní) Ověření čistoty proteinů, polypeptidů pomocí elektroforézy Volba separační metody (výtěžek, časová náročnost, nabohacení) srážení, vysolování na počátku, kdy je koncentrace produktu vysoká (> 1mg/ml) IEC separace látek podle náboje, změna kapalné fáze (equilibrace), zakoncentrování? (objem eluentu), optimalizace podmínek separace, kapacita kolon přiměřená, relativně levná GPC - separace látek podle Mr a tvaru, odsolení, změna kapalné fáze (equilibrace), šetrná, levná, jednoduchá, nezávislé na koncentraci produktu, typu kapalné fáze x zdlouhavá, zředění látky, malá kapacita kolon (1% Vt), často řadíme po vysolování HIC metoda silně závislá na experimentálních podmínkách, optimalizace podmínek (návaznost separačních kroků), objem vzorku pouze 1 5 % V kolony, vysoká kapacita, cena přiměřená AC (IAC) vysoce specifická metoda, vysoká kapacita, snižuje počty separačních kroků, cena různá podle typu ligandu, regenerace kolony Purifikace biopolymerů Cíl: získat co nejlepší výsledek (čistota, aktivita, množství) Vstupní podmínky: dostupnost materiálu, typ vstupního materiálu stabilita produktu nároky na čistotu Nároky na čistotu: terapeutické účely (> 99%) farmaceutický průmysl diagnostické testy (20 90%) výzkum, katalýza reakcí potravinářství kosmetický průmysl (70 90%) ultračisté té analytické standardy d (95 99%) Počet purifikačních kroků: minimalizace ace ztrát, časová á a finanční náročnost by měla odpovídat nárokům na čistotu a účelu využití, možnost automatizace Řazení separačních kroků techniky s vysokou kapacitou techniky s nízkou kapacitou za sebou metody separující látky na jiném principu (Mr, náboj, povrchové vlastnosti apod.) produkt jedné metody by měl být výchozím materiálem pro další (po vysolování nejde IEC bez GPC) (IEC a AC vyžadují definované složení kapalné fáze) předcházet tvorbě dimerů, polymerů, agregátů vliv agregátů na účinnost separace (přídavek detergentů?)

8 Podmínky kolonové separace typ náplně (bobtnání, stabilita, chemická inertnost), parametry kolony, (s rostoucím průměrem a klesající délkou kolony klesá rozlišení, u LPLC vliv difúze na rozmývání zón) zapojení kolon v sérii recyklace vzorku rychlost průtoku (flow rate, s rostoucí rychlostí roste rozmývání zón x čas, stabilita produktu x NK) pracovní tlak, teplota ekvilibrace náplně min. mrtvé objemy objem nanášeného vzorku (flow adaptor) regenerace kolony skladování, konzervace, sterilizace Hodnocení účinnosti purifikace a kritéria čistoty 2 parametry výtěžnost (návratnost - ztráty) a stupeň přečištění (kolik balastu se odstranilo) výhoda u biologicky aktivních látek (enzymy) vždy se hodnotí biologická aktivita, objem eluentu a obsah bílkovin kritéria čistoty homogenita preparátu, krystalizace (1 pík u HPLC neznamená vždy homogenitu) ověřit si různými metodami u biologicky aktivních látek kontaminující doprovodná biol. aktivita, přítomnost izoforem (pi), pozor na proteázy hodnocení homogenity 1. rozpustnost produktu (saturační křivka s ostrým přechodem v místě nasycení roztoku) 2. analytická ultracentrifugace (60tis./ot./min, fotometricky) 3. centrifugace v gradientu hustoty (1 frakce, - čas) 4. SDS-PAGE a další elektroforetické metody 5. Imunochemické metody Kontrola stupně purifikace prvotní průběžná (tzv. postupná eliminace) finální včetně strukturní charakterizace produktu celkové množství produktu, biologická aktivita, výtěžnost, stupeň obohacení (koncentrace) Požadavky na čistotu podle účelu použití (technické, purifikované, vysoce purifikované) Technické frakcionovaná precipitace, kompromis mezi čistotou a cenou Purifikované vyšší nároky na čistotu, cena, separace více metod za sebou Vysoce purifikované vysoká cena, výzkum strukturní studie, klinická diagnostika, kalibrátory, standardy, terapeutické účely (původ) Koncentrace produktů a jejich konečná úprava zakoncentrování přečištěného produktu odpařováním (x stabilita) mrazová sublimace (lyofilizace) hygroskopický prášek (sole, ph, organická rozpouštědla) denaturace, fragmentace precipitace a resolubilizace ultrafiltrace (rychlost sedimentace, rovnováha) krystalizace (náročné, zdlouhavé)

9 Charakterizace produktů SDS-PAGE Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. molekulová hmotnost celé molekuly, dílčích podjednotek (SDS-PAGE, SEC) tvar a Mr ultracentrifugace izoelektrický bod pi - IEF spektrální vlastnosti (UV-VIS, VIS, cirkulární dichroismus, NMR spektroskopie analýza primární struktury, sekvence monomerů peptidové mapování s MS analýzou rentgenostrukturní analýza Sledování čistoty proteinů Elektroforéza dokumentuje průběh purifikačního procesu Při použití standardů o známé molekulové hmotnosti je možno zhruba stanovit molekulovou l hmotnost izolovaného proteinu (SDS elektroforézou) Prokázání identity reakcí se specifickou Ab - imunoblot uvolnit elektroelucí a následně MS analýzu ndardy Stan rek odní vzor Půvo roteiny vázané pr Nenav oteiny ované pro Eluo metoda pro sledování čistoty produktu průběžné, konečné citlivost metody μg až ng! podle typu vizualizace vizualizace všech, i kontaminujících složek široké rozmezí Mr látek - zvolit vhodnou porozitu gelu, nejlépe gradientové gely detekce kontaminace NML problematická průkaz ů produktu ve směsi (Mr, standard) průkaz rozpadových fragmentů (Mr, Imunoblot) kvantifikace (denzitometricky) omezená možnost následné MS analýzy bandů Účinnost separace směsi v gelech o různé porozitě

10 Porozita gelu a Mr separovaných látek Idealizovaná PAGE purifikace fiktivního proteinu Homogenát Frakční vysolování Iontoměničová chromatografie Molekulové síto (gelová filtrace) Afinitní chromatografie Izolace IgG1 - hyperimunní sérum Afinitní chromatografie MPC-protein A 10% gel SDS-PAGE barveno Coomasie Blue Mr serum E1 E2 Mr Purifikace trypsinu na koloně o ě s p-aminobenzamidinem a e

11 Detekce konkrétního proteinu Western blot s imunochemickou detekcí Proteinová elektroforéza (SDS-PAGE) Identifikace anti-ca I protilátek izolovaných afinitní chromatografií transfer proteinů ů z gelu na membránu = Western blot Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. W. blot Primární protilátka membrána s navázanými proteiny detekce proteinu protilátkou (komplexu primární a sekundární protilátky) vizualizace pomocí barevné reakce nebo chemiluminiscence Sekundární protilátky konjugované s enzymem či fluorescenční č značkou Hodnocení čistoty výchozího materiálu před enzymovou fragmentací Tris Tricine SDS-PAGE: gel 16,5% T, 3% C (MW 1 70 kda), detection with silver staining, positions: (1) non-digested native CA I, (2) non-digested unfolded CA I, (3) unfolded CA I digested 3 h by immobilized trypsin, (4) molecular marker ( kda) Porovnání Laemmli versus Schäger/von Jagow - separace trypsinů - Zleva standardy 29, 45, 66, 97, 116 a 200 kda; hovězí trypsin; vepřový trypsin; cytochrom c (12 kda); standardy, hovězí trypsin; vepřový trypsin; křenová peroxidasa (40 kda). Proteiny naneseny po 7 mg.

12 Vizualizace fosforylovaných proteinů - specifické barvení ProQ Diamond II Analýzy elučních frakcí pomocí SDS-PAGE a IMUNOBLOTu Z. Bílková et al., Proteomics 5, , 2005 SDS-PAGE 37 kda 25 kda PAAG gely reprezentují eluční frakce z imunosorbentu Ademtech 5B2 Ab. Čísla udávají množství proteinu v mg/band Detailní snímek gelu l barveného 180 minut a odbarvovaného přes ř noc Detekce na přístroji Molecular Imager FX (Bio Rad Laboratories): Ex/Em: 532nm/602nm Myelinový bazický protein!! (MS analýza) Eluce ph 3 Eluce ph 2,5 37 kda 25 kda Tris-Tricine-SDS-PAGE-urea pro Abeta peptidy + blotting M HA štěpená Hyaluronidázou v čase APP alfa Abeta Original CSF Eluting fraction standards Lane 1, 2 and 10: synthetic Abeta Standard mix 1-37, 1-38, 1-39, 1-40, 1-42 Lane 3: CSF (#3131) which was sent to Pardubice Lane 4: Original sample (CSF UPCE) Lane 5: Eluting fraction IP 1 Lane 6: Eluting fraction IP 1 (1:4 diluted) Lane 7: Eluting fraction IP 2 Lane 8: Eluting fraction IP 2 (1:4 diluted) Lane 9: Eluting fraction IP 2 (1:8 diltuted) Western blot, University of Duisburg (Hermann) PAA gel, 10%, 5% zaostřovací, TBE pufr ph 8,4. Separace 20 min při 125 V a 20 ma/1 gel a potom do konce 200 V a 40 ma/1 gel PrP Imunoblot 37 kda 25 kda a b Gely reprezentují eluční frakce získané z imunosorbentů Ademtech 5B2 Ab (a) a perlové celulózy 9H7 Ab (b). Průkaz PrP specificky pomocí anti-prp- HRP 3F4 (imunoblot).

13 HPLC proteinů, peptidů, polysacharidů HPLC analytické uspořádání Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Gelová permeační chromatografie Iontově výměnná chromatografie Hydrofóbní interakční chromatografie Afinitní chromatografie Reverzní HPLC Gelová permeační chromatografie v HPLC módu Rigidní nosič silikagel (povahou aniont, hydrofóbní) Semirigidní nosič PS Modifikované povrchy biokompatibilita (Silikagel modif. hydrofilním polymerem) Částice 5 10 µm, sférické Částice s uniformní porozitou Průtoky do 0,5 ml Teplota 4 C 37 C Preparativní Částice 5 10 µm Kolona 30,0 21,2 mm x 250 mm (semiprep. 7,8 mm) Průtoky 10tky ml/min Objem vzorku ml Kapacita kolony mg Recyklace vzorku Sériové řazení kolon Předkolona Analytické Částice 1,8 3,5 µm Kolona 2,5 4,6 mm x mm Průtoky 10ky µl/min Objem vzorku µl Kapacita kolony - µg Předkolona Monolitické kolony Kapilární kolony Nano-HPLC Iontově výměnná chromatografie v HPLC módu První typ v HP módu (HPIEC) Silikagelové ionexové pryskyřice Nové materiály - PS-DVB, alumina, PES-PA Pelikulární hydrofilní polymery Odolnost vůči tlaku Preparativní uspoř. - částice až 25 µm (40% hydratace) Anal. uspoř. částice 5 10 µm, menší stupeň hydratace (10 20%) Separace x eluce ph a iontová síla mob. fáze

14 RP-HPLC Nejvhodnější pro separaci proteinů, peptidů podmínky, kdy nedochází k denaturaci Závislost retence peptidů na malé změně obsahu organického modifikátoru Silikagel modifikovaný různě dlouhými alkylovými řetězci endcapping, omezená chemická stabilita! Polymerní kolony PS-DVB ph 2 12 Zirkoniové výborná chemická a tepelná stabilita Monolitické materiály Částice 5 8 µm (lze až 40 µm) Velikost pórů 90 Å 300 Å 4000 Å Příklady RP-HPLC Detekce UV-VIS (205 nm, 215 nm, 252 nm, 280 nm) Průtoky do 1 ml/min Teplota Stacionární fáze pro silně hydrofobní C4, C5 pro hydrofilní peptidy C8, C18 Organický modifikátor acetonitril, metanol, isopropanol (gradient) Alternativní stacionární fáze monolitické kolony, kapilární kolony 150 x 0,32 mm; průměr 3,5 µm, průtok 3 µl/min

15 Shrnutí. Volba separační metody (výtěžek, časová náročnost, nabohacení) srážení, vysolování na počátku, kdy je koncentrace produktu vysoká (> 1mg/ml) IEC separace látek podle náboje, změna kapalné fáze (equilibrace), optimalizace podmínek separace, kapacita kolon přiměřená, relativně ě levná GPC - separace látek podle Mr a tvaru, odsolení, změna kapalné fáze (equilibrace), šetrná, levná, jednoduchá, nezávislé na koncentraci produktu, typu kapalné fáze x zdlouhavá, zředění látky, malá kapacita kolon (1% Vt), často řadíme po vysolování HIC metoda silně závislá na experimentálních podmínkách, optimalizace podmínek (návaznost separačních kroků), objem vzorku pouze 1 5 % V kolony, vysoká kapacita, cena přiměřená AC (IAC) vysoce specifická metoda, vysoká kapacita, snižuje počty separačních kroků, cena různá podle typu ligandu, regenerace kolony Purifikace biopolymerů Cíl: získat co nejlepší výsledek (čistota, aktivita, množství) Vstupní podmínky: dostupnost materiálu, typ vstupního materiálu stabilita produktu nároky na čistotu Nároky na čistotu: terapeutické účely (> 99%) farmaceutický průmysl diagnostické testy (20 90%) výzkum, katalýza reakcí potravinářství kosmetický průmysl (70 90%) ultračisté té analytické standardy d (95 99%) Počet purifikačních kroků: minimalizace ace ztrát, časová á a finanční náročnost by měla odpovídat nárokům na čistotu a účelu využití, možnost automatizace Řazení separačních kroků techniky s vysokou kapacitou techniky s nízkou kapacitou za sebou metody separující látky na jiném principu (Mr, náboj, povrchové vlastnosti apod.) produkt jedné metody by měl být výchozím materiálem pro další (po vysolování nejde IEC bez GPC) (IEC a AC vyžadují definované složení kapalné fáze) předcházet tvorbě dimerů, polymerů, agregátů vliv agregátů na účinnost separace (přídavek detergentů?)

16 Praktické příklady Srážení síranem amonným (vysoká koncentrace soli ve vzorku) chromatografie s hydrofóbní interakcí Ionexová chromatografie (eluce vysokou iontovou silou) chromatografie s hydrofóbní interakcí Gelová chromatografie se používá na konci celé purifikační sekvence (odstranění fragmentů a komplexů) NEVHODNÉ Srážení síranem amonným a ionexová chromatografie (nutno zařadit odsolovací krok dialýza, ultrafiltrace) Ověření účinnosti separace, čistoty a charakterizace produktů Sledování průběhu separace Metoda Celková bílkovina Celková aktivita Kontrola stupně purifikace Specifická aktivita Přečištění Výtěžek extrakt % HIC % IEX % prvotní průběžná (tzv. postupná eliminace) finální včetně strukturní charakterizace produktu celkové množství produktu, biologická aktivita, výtěžnost, stupeň obohacení (koncentrace) Oveření čistoty proteinů, peptidů a polysacharidů a jejich charakterizace pomocí HPLC (iontová, SEC, afinitní chromatografie, hydrofobní) Ověření čistoty proteinů, polypeptidů pomocí elektroforézy Požadavky na čistotu podle účelu použití (technické, purifikované, vysoce purifikované) Technické frakcionovaná precipitace, kompromis mezi čistotou a cenou Purifikované vyšší nároky na čistotu, cena, separace více metod za sebou Vysoce purifikované vysoká cena, výzkum strukturní studie, klinická diagnostika, kalibrátory, standardy, terapeutické účely (původ)

17 Hodnocení účinnosti purifikace a kritéria čistoty Zakoncentrování produktů a jejich konečná úprava Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. 2 parametry výtěžnost (návratnost - ztráty) a stupeň přečištění (kolik balastu se odstranilo) výhoda u biologicky aktivních látek (enzymy) vždy se hodnotí biologická aktivita, objem eluentu a obsah bílkovin kritéria čistoty homogenita preparátu, krystalizace (1 pík u HPLC neznamená vždy homogenitu) ověřit si různými metodami u biologicky aktivních látek kontaminující doprovodná biol. aktivita, přítomnost izoforem (pi), pozor na proteázy hodnocení homogenity 1. rozpustnost produktu (saturační křivka s ostrým přechodem v místě nasycení roztoku) 2. analytická ultracentrifugace (60tis./ot./min, fotometricky) 3. centrifugace v gradientu hustoty (1 frakce, - čas) 4. SDS-PAGE a další elektroforetické metody 5. Imunochemické metody Charakterizace produktů molekulová hmotnost celé molekuly, dílčích podjednotek (SDS-PAGE, SEC) tvar a Mr ultracentrifugace izoelektrický bod pi - IEF spektrální vlastnosti (UV-VIS, VIS, cirkulární dichroismus, NMR spektroskopie analýza primární struktury, sekvence monomerů peptidové mapování s MS analýzou rentgenostrukturní analýza zakoncentrování přečištěného produktu odpařováním (x stabilita) mrazová sublimace (lyofilizace) hygroskopický prášek (sole, ph, organická rozpouštědla) denaturace, fragmentace precipitace a resolubilizace ultrafiltrace (rychlost sedimentace, rovnováha) krystalizace (náročné, zdlouhavé) Elektromigrační metody

18 Princip elektroforézy Separační metoda využívající různé pohyblivosti různých iontů (složek směsi) ) ve stejnosměrném (homogenním) elektrickém poli. Pohyblivost separovaných iontů závisí také na: použitém elektrolytu (kapalné fázi) chemické vlastnosti a porozita nosiče Většinu biologicky zajímavých látek lze ve vodném prostředí převést ř na elektricky k nabité částice. Metodika: disociace, změna ph, adsorpce iontů jiného druhu, chemickou vazbou - tvorbou tzv. ionogenních komplexů. Jevy doprovázející elektroforézu Produkce Jouleova tepla S rostoucím napětím (Ohm Ohmův zákon) roste elektrický proud: I = U/R. Pokud el. proud nekoná mechanickou nebo chemickou práci, energie se bez užitku přeměňuje na teplo: Jouleovo teplo Chlazení gelů u vysokonapěťové elektroforézy voda, termostat, led Elektroendoosmóza Uplatňuje u kapilární elektroforézy. Stěny kapilár jsou vyrobeny z kremičitého skla a vlivem disociacei silanolových l skupin mají záporný náboj. K záporným nábojům se váží pozitivně nabité ionty ( counterions counterions ), vytváří stacionární vrstvu (Sternova Sternova). V následující vrstvě jsou však tyto ionty již mobilní (Guy-Chapmanova vrstva). Elektroendoosmóza na vnitřním povrchu kapiláry v místě styku s vodivým roztokem vzniká elektrická dvojvrstva pevná část (stěna kapiláry) je nabitá nepohyblivým plošným záporným elektrickým nábojem z kapalné části se kladné ionty připojí ke stěně kapiláry (dvojvrtva), ionty se pohybují k anodě pohyblivá vrstvička se žene kapilárou a strhne sebou celý průřez kapaliny v kapiláře roztok putuje kapilárou celý najednou (u elektroforézy putují jen ionty).

19 Typy elektroseparačních metod Zónová elektroforéza - Elektroforéza na nosiči Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Volná elektroforéza Zónová elektroforéza Isoelektrická fokusace Kapilární elektroforéza Vertikální x Horizontální Vertikální x Horizontální 1D nebo 2D rozměrná Nativní x Denaturační podmínky Analytická x Preparativní Gelová elektroforéza vertikální horizontální provádí se na hydrofilních porézních nosičích, nerozpustných ve vodě, s minimální i adsorpční č schopností, zabraňuje ň zpětnému mísení í rozdělených složek Nosiče Papírová elektroforéza nosičem elektrolytu l t je chromatografický papír analýza bílkovin; dělení nízkomolekulárních látek, aminokyselin Elektroforéza na tenké vrstvě nosičem elektrolytu (H2O + pufr) je vrstva silikagelu nebo škrobu na skleněné podložce. Gelová elektroforéza agar, agaróza, PAAG, porozita gelu gradient porozity gradient ph Provedení: plošné, v trubičkách, vertikální, horizontální Aparatury pro trubičkové gely

20 Kombinovaná elektroforéza dělení je využito (kromě.el.náboje) ještě dalších odlišností např. velikosti a molární hmotnosti iontů. Nosičem elektrolytu je obvykle gel (porozita gelu) př. SDS-PAGE elektroforéza dělení látek podle Mr (zvýšení účinnosti separace, citlivosti detekce) 2D elektroforéza kombinace izoleektrické fokuzace s gelovou chromatografií Elektrochromatografie dvourozměrná jeden směr chromatografie, druhý směr elektroforéza, Elektrodialýza, Elektroultrafiltrace, Elektrodesorpce eluce složek afinitní chromatografie elektrickým polem. Blotting (Western blotting, Immunoblotting) Dva hlavní typy PAAG elektroforézy Nativní gelová (nedenaturační) elektroforéza Probíhá bez denaturačních činidel. Proteiny migrují gelem podle svého celkového náboje velikosti a tvaru a podle velikosti pórů v gelu. SDS gelová elektroforéza Proteiny jsou denaturovány dodecylsíranem sodným (SDS) a β- merkaptoetanolem (zruší disulfidické vazby). Pohyblivost závisí na molekulové l hmotnosti polypeptidových řetězců (Mr) Vhodná pro analýzu makromolekulárních komplexů. Akrylamidový gel: pevná a inertní matrix ideální pro separaci proteinů Menší velikost pórů než u agarosy Použití 1. pro účely analytické i preparativní (méně) 2. k separaci velkých molekul (proteiny nebo NK) 3. k separaci menších molekul (cukry, peptidy nukleotidy) Faktory ovlivňující pohyblivost látky 1. Celkový povrchový náboj separované látky 2. Velikost a tvar molekuly 3. Porosita gelu 4. ph a složení elektrolytu Proteiny jsou tepelně denaturovány ve vzorkovém pufru obsahujícím dodecyl sulfát sodný (SDS) SDS)- zachována je tak pouze jejich primární struktura (var 2 3 min.) Denaturované proteiny mají vláknitý tvar a stejný záporný náboj daný vazbou SDS migrace tedy závisí pouze na jejich molekulové l hmotnosti ti Aniontový detergent, solubilizuje uje a denaturujeuje proteiny Většina proteinů váže SDS ve stejném poměru, asi 1,4 g SDS/g proteinu

21 PAA gelová elektroforéza - PAGE Gel z polymerovaného akrylamidu Polymer vytváří síť (podle koncentrace akrylamidu určitá velikost ok sítě) Molekuly se dělí podle své velkosti (malé rychleji, velké pomaleji). Laemmliho diskontinuální systém Používá se dvou gelů tzv. zaostřovacího ( stacking ) gelu nahoře a separačního ( running ) gelu dole. Liší se hodnoty ph 6, 8 a 8, 3 elektrodový pufr se pak liší od obou gelových pufrů. Mobilita separovaných proteinů mezi a) mobilitou iontu ve stacking gelu Cl-, tzv. leading ion = vedoucí Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Co obsahuje vzorkový pufr pro SDS-PAGE? Tris pufr utváří vhodné ph SDS (dodecyl sulfát sodný) detergent poskytující proteinům negativní náboj Glycerol vzhledem ke své vyšší specifické hmotnosti zajišťuje klesnutí vzorku ke dnu jamky v gelu po nanesení Bromophenol Blue barvivo umižňující sledovat průběh elektroforézy (pohyb čela v gelu) 2-ME (DTT) b) mobilitou iontu v katodovém pufru (glycin, pk 9.6, tzv. trailing ion = zakončující). Ionty i proteiny migrují do zaostřovacího gelu (5%) koncentrují se do velmi úzké zóny Barvení proteinových gelů stříbrem Coomassie blue Fluorescenční barviva RI Specifické barvení pro fosfo-, glyko-

22 Molekulová hmotnost proteinů velikost měřena v daltonech (Da) či kilodaltonech (kda) Dalton = jednotka atomové hmotnosti ti Separace látek podle jejich Mr = přibližně se rovná hmotnosti atomu H (1,66 x g) = definován také jako 1/16 hmotnosti ti atomu O Průměrná aminokyselina = 110 Da Průměrný nukleotid leotidový ový pár = 649 Da Gel 10%, Mr marker pozice 5 Nanesení vzorku Určování molekulové hmotnosti proteinů

23 Účinnost separace směsi v gelech o různé porozitě Porozita gelu a Mr separovaných látek Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. PAGE elektroforézy - modifikace 1) Nativní (různé ph, pufry Tris, MES, MOPS, HEPES) 2) SDS-PAGE tris/tricine pro proteiny menší než 14 kda (urea) 3) SDS-PAGE tris/borát/edta elektroforéza pro gp, SDS se neváže na cukerné k é složkyl 4) Afinoforéza polymer modifikovaný látkou vykazující afinitu k jedné ze separovaných složek (např. lektinová, chelatační) 5) Imunoelektroforéza, Imunofixace PAGE elektroforéza preparativní verze

24 Izoelektrická fokuzace Preparativní IEF Provádí se v chlazených vertikálních skleněných kolonách, které jsou naplněny roztokem amfolytů - stabilizováno gradientem sacharosy (viz centrifugace), Ficol, Perkol. Na konci separace se kolona vypustí do zkumavek ve sběrači frakcí. Zařízení Rotofor (Bio-Rad) membranový systém zón brání smísení separovaných vzorků Izoelektrická fokuzace Isoelektická fokusace se provádí buď v trubičkách nebo v plochých gelech, stripech. Hotové IEF gely s amfolyty y nebo immobiliny se dodávají komerčně spolu s přístroji pro auomatizovanou IEF. Vzorky se obvykle nanášejí na katodové straně. Denaturující podmínky při IEF - 9 M močovina nebo neionogenní detergenty (Triton X-100). Využití: stanovení pi, kontrola homogenity, isoenzymy Separace izoenzymů ( pi)

25 Dvojrozměrná (2D) elektroforéza proteinů Kombinuje použití IEF a SDS-PAGE pro účely studia proteomu, vypracováno O Farrellem v 70. letech., Umožňuje rozlišení až proteinů. 2D gelová elektroforéza Rozdělí současně stovky i tisíce proteinů Proteiny jsou rozprostřeny na ploše Proteiny se nejprve rozdělí podle jejich pi v gradientu ph Proteiny se nejprve rozdělí podle jejich pi v gradientu ph. Po separaci v prvním rozměru je provedena elektroforéza v gelu. Proteiny migrují ve druhém rozměru v závislosti na své velikosti. Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Separace izoforem ( pi) Blotting proteinů a nukleových kyselin blotting (angl. blot = skvrna, kaňka, česky přenos) pásy separované látky (např. SDS-PAGE) se přenášejí elektroforézou na membránu (NC, PVDF), kde jsou uchyceny adsorpcí nebo kovalentní vazbou. DNA analýza (Southern blotting, Southern 1975) RNA analýza (Northern blotting, Alwine et al., 1977) PROT analýza (Western blotting, Towbin et al., 1979) 1. fáze: klasická SDS-PAGE (separace podle Mr) 2. fáze: blotování působením elektrického proudu dojde k přeblotování proteinů z gelu do membrány 3. fáze: vyvíjení vizualizace přenesených proteinů, nespecifické nebo specifické barvení Ponceau S, Fast Green nebo Amidočerni10 B.

26 Sestava při blotování Detekce konkrétního proteinu Western blot s imunochemickou detekcí Proteinová elektroforéza (SDS-PAGE) W. blot transfer proteinů ů z gelu na membránu = Western blot detekce proteinu protilátkou (komplexu primární a sekundární protilátky) vizualizace pomocí barevné reakce nebo chemiluminiscence Rozdělení metod blottingu podle provedení Difúzní blotting - prostá difúze v tanku s přenosovým pufrem, dlouhá doba hodin, velkou nevýhodou difuze do stran - zhoršení rozlišení vlastní elektroforetické separace. Kapilární blotting - celá jednotka je zatížena, suchý papír nasává kapilárními silami pufr, vzorek je tak tažen z gelu na membránu. Trvá zhruba 12 hodin. Vakuový blotting - místo kapilárních sil vzorek tažen vakuem. Podstatně rychlejší (30 min). Výhodou též ostřejší pásy (potlačení difuze). Elektroblotting - nejrychlejší a nejúčinnější metoda. Hnací silou je v tomto případě síla elektrického kéh pole. Podle provedení se rozlišuje tzv. tankový (tank, wet) blotting a polosuchý (semi-dry) blotting. Jediný pro vysokomolekulární biopolymery. Elektroblotting Primární protilátka membrána s navázanými proteiny Sekundární protilátky konjugované s enzymem, fluor. značkou, ale i koloidním zlatem, radioaktivně, luminiscenčně. Detekce glykoproteinů Schiffovou reakcí, alcianovou modří, vazbou lektinů.

27 SDS-PAGE široké uplatnění čistota produktu průběžné, konečné monitorování citlivost metody μg až ng! podle typu vizualizace vizualizace všech, i kontaminujících složek x imunoblott (identifikace) široké rozmezí Mr látek - zvolit vhodnou porozitu gelu, nejlépe gradientové gely detekce kontaminace NML problematická průkaz produktu ve směsi (Mr, standard) průkaz rozpadových fragmentů (Mr, Imunoblot) kvantifikace (denzitometricky) omezená možnost následné MS analýzy bandů Idealizovaná PAGE purifikace fiktivního proteinu Homogenát Frakční vysolování Iontoměničová chromatografie Molekulové síto (gelová filtrace) Afinitní chromatografie Sledování čistoty proteinů Elektroforéza dokumentuje průběh purifikačního procesu Při použití standardů o známé molekulové hmotnosti je možno zhruba stanovit molekulovou l hmotnost izolovaného proteinu (SDS elektroforézou) Prokázání identity reakcí se specifickou Ab - imunoblot uvolnit elektroelucí a následně MS analýzu Izolace IgG1 - hyperimunní sérum Afinitní chromatografie MPC-protein A 10% gel SDS-PAGE barveno Coomasie Blue ndardy Stan rek odní vzor Půvo roteiny vázané pr Nenav oteiny ované pro Eluo Mr serum E1 E2 Mr

28 Purifikace trypsinu na koloně o ě s p-aminobenzamidinem a e Hodnocení čistoty výchozího materiálu před enzymovou fragmentací Tris Tricine SDS-PAGE: Tricine gel 16,5% T, 3% C (MW 1 70 kda), detection with silver staining, positions: (1) non-digested native CA I, (2) non-digested unfolded CA I, (3) unfolded CA I digested 3 h by immobilized trypsin, (4) molecularlar marker ( kda) Identifikace anti-ca I protilátek izolovaných afinitní chromatografií Vizualizace fosforylovaných proteinů - specifické barvení ProQ Diamond II Čísla udávají množství proteinu v mg/band Detailní snímek gelu l barveného 180 minut a odbarvovaného přes ř noc Detekce na přístroji Molecular Imager FX (Bio Rad Laboratories): Ex/Em: 532nm/602nm

29 Tris-Tricine Tricine-SDS-PAGE-urea pro Abeta peptidy + blotting M1 APP alfa Analýzy elučních frakcí pomocí SDS-PAGE a IMUNOBLOTu SDS-PAGE 37 kda 25 kda 37 kda Myelinový bazický PAAG gely reprezentují eluční protein!! (MS analýza) 25 kda frakce z imunosorbentu Ademtech 5B2 Ab. Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D Abeta Original CSF Eluting fraction standards Lane 1, 2 and 10: synthetic Abeta Standard mix 1-37, 1-38, 1-39, 1-40, 1-42 Lane 3: CSF (#3131) which was sent to Pardubice Lane 4: Original sample (CSF UPCE) Lane 5: Eluting fraction IP 1 Lane 6: Eluting fraction IP 1 (1:4 diluted) Lane 7: Eluting fraction IP 2 Lane 8: Eluting fraction IP 2 (1:4 diluted) Lane 9: Eluting fraction IP 2 (1:8 diltuted) Western blot, University of Duisburg (Hermann) HA štěpená Hyaluronidázou v čase PAA gel, 10%, 5% zaostřovací, TBE pufr ph 8,4. Separace 20 min při 125 V a 20 ma/1 gel a potom 200 V a 40 ma/1 gel a PrP 37 kda 25 kda Eluce ph 3 Eluce ph 2,5 HPLC proteinů, peptidů, polysacharidů Gelová permeační chromatografie Iontově výměnná chromatografie Hydrofóbní interakční chromatografie Afinitní chromatografie RP-HPLC b Imunoblot Gely reprezentují eluční frakce získané z imunosorbentů Ademtech 5B2 Ab (a) a perlové celulózy 9H7 Ab (b). Průkaz PrP specificky pomocí anti-prp- HRP 3F4 (imunoblot).

30 HPLC analytické uspořádání Preparativní Částice 5 10 µm Kolona 30,0 21,2 mm x 250 mm (semiprep. 7,8 mm) Průtoky 10tky ml/min Objem vzorku ml Kapacita kolony mg Recyklace vzorku Sériové řazení kolon Předkolona Iontově výměnná chromatografie v HPLC módu První typ v HP módu (HPIEC) Silikagelové ionexové pryskyřice Nové materiály - PS-DVB, alumina, PES-PA Pelikulární hydrofilní polymery Odolnost vůči tlaku Analytické Částice 1,8 3,5 µm Kolona 2,5 4,6 mm x mm Průtoky 10ky µl/min Objem vzorku µll Kapacita kolony - µg Předkolona Monolitické kolony Kapilární kolony Nano-HPLC Preparativní uspoř. - částice až 25 µm (40% hydratace) Anal. uspoř. ř částice 5 10 µm, menší stupeň ň hydratace (10 20%) Separace x eluce ph a iontová síla mob. fáze Gelová permeační chromatografie v HPLC módu Rigidní nosič silikagel (povahou aniont, hydrofóbní) Semirigidní nosič PS Modifikované povrchy biokompatibilita (Silikagel modif. hydrofilním polymerem) Částice 5 10 µm, sférické Částice s uniformní porozitou Průtoky do 0,5 ml Teplota 4 C 37 C Kombinace SEC (IEC) + ELFA

31 RP-HPLC RP-HPLC Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Nejvhodnější pro separaci proteinů, peptidů podmínky, kdy nedochází k denaturaci Závislost retence peptidů na malé změně obsahu organického modifikátoru Silikagel modifikovaný různě dlouhými alkylovými řetězci endcapping, omezená chemická stabilita! Polymerní kolony PS-DVB ph 2 12 Zirkoniové výborná chemická a tepelná stabilita Monolitické materiály Částice 5 8 µm (lze až 40 µm) ) Velikost pórů 90 Å 300 Å 4000 Å Výsledek purifikace Detekce UV-VIS (205 nm, 215 nm, 252 nm, 280 nm) Průtoky do 1 ml/min Teplota Stacionární fáze pro silně hydrofobní C4, C5 pro hydrofilní peptidy C8, C18 Organický modifikátor acetonitril, metanol, isopropanol p (gradient) Alternativní stacionární fáze monolitické kolony, kapilární kolony 150 x 0,32 mm; průměr 3,5 µm, průtok 3 µl/min Identifikace proteinů Březen 2011

32 Identifikace proteinů v proteomice A) Molekulovou hmotnost a identifikace analytu ELFO (Imunoblot) + MS (MALDI TOF, ESI TOF) B) Identifikace tzv. sekvenční analýza 1. Edmanovou degradací (přímé sekvencování) 2. Hmotovou spektrometrií (nepřímé sekvencování, fingerprinting, de novo sekvencování) + Informační databáze DIGE Diferenční 2D elektroforéza Fingerprint Proteinové mapy 2D elektroforeogramy, HPLC spektra, CZE spektra Peptidové mapy 2D elektroforeogramy, HPLC spektra, CZE spektra, MS spektra Charakteristické a specifické polohy skvrn, píků otisky prstů pro každý např. buněčný proteom nebo pro každý protein Fragmentace proteinů, polypeptidových řetězců Výsledné mapy proteinů se porovnávají s kontrolními vzorky (pacienti s konkrétním onemocněním a zdraví pacienti). Po vyříznutí oblasti vykazující odlišnost je provedena analýza MS.

33 Edmanovo odbourávání množství vzorku min pmol, opt. 200 pmol konkurenční MS nyní zvládá fmoly (nanosprej ESI Qq TOF MS) Podmínkou je volný N-konec peptidu či proteinu. Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Často je však N-konec chemicky blokován (acetylace, pyroglutamová kyselina). Nevýhodou i výskyt glykosylačních míst zde nízký Nevýhodou i výskyt glykosylačních míst - zde nízký výtěžek v daném cyklu. Edmanovo odbourávání možné získat aminokyselin z N-konce, samozřejmě s narůstající chybou (reakce není 100% ní). Za ideálních podmínek maximálně 100 aminokyselin. V automatickém proteinovém sekvenátoru (dodávají např. firmy Applied Biosystems, Shimadzu) je analyzovaný protein či peptid imobilizován. Buď na disku ze skleněných vláken (kovalentní vazba nebo adsorpce) nebo na membráně PVDF (ProSorb patrony nebo po blottingu). Reagencie ke vzorku vstupují a jsou odváděny nejlépe v plynné fázi. Doba trvání jednoho cyklu analýzy činí min. Je třeba připočítat eluci standardů aminokyselin a tzv. prázdný run. Po odštěpení PTC-derivátu následuje jeho analýza (zjištění retenčního času na HPLC koloně) s detekcí při 270 nm. Hmotnostní spektrometrie (MS) Automatizace Je metoda pro separaci látek podle rozdílů hmoty (m) a náboje (z) s využitím elektrického a magnetického pole. Určovanou fyzikální veličinou je podíl hmoty a náboje (m/z), při znalosti náboje umožňuje určit molekulovou hmotnost. Velmi citlivá metoda, stačí několik iontů k získání měřitelného signálu, poměr m/z může být stanoven s přesností techniky ionizace (ESI, MALDI) - lze měřit i velké molekuly (např. proteiny, lipidové komplexy, polysacharidy).

34 Princip ESI TOF MS a MALDI TOF MS SELDI surface enhanced laser desorption/ionisationionisation array chip hmotová spektrometrie výhody jednoduchost rychlost selektivita nevýhody nízká citlivost nízká přesnost urč. m/z nízké rozlišení Matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) Laserová desorpční ionizace s pomocí matrice Metoda MALDI MS (od 1988) je rozšířeným nástrojem pro separaci přírodních látek, peptidů, proteinů a dalších bio- makromolekul (oligonukleotidy oligonukleotidy, sacharidy, lipidy). Vzorek na nerezové destičce ukotven v netěkavé matrici i (kokrystalizace). k Používá se např. ř kyselina nikotinová nebo 2,5-dihydroxybenzoová. Destička se vloží do přístroje, zacílí se laserový paprsek ( fire ), transfer energie způsobí ionizaci. MS je často propojena s jinými analytickými technikami: GC-MS, LC-MS, CE-MS ale i MS-MS (Interphase) Kromě tandemové MS (MS-MS) mohou být spojeny až tři i více analyzátorů ( multiple MS). 1) Výběr studované látky ze směsi 2) Fragmentace 3) Analýza fragmentů Kombinace s chromato či elfo metodou slouží MS jako detektor s vysokým rozlišením - on-line analýza (x off- line detekce). Klíčové je propojení přístrojů. LC-MS v biochemii pro peptidy a proteiny. Spřažení - ESI x MALDI

35 Identifikace pomocí HPLC-ESI-MS/MS 1. Štěpení proteinu trypsinem 3. MS vybraného štěpu Identifikace proteinů peptide fingerprinting štěpení proteázou (trypsinem) MALDI ToF protein I (12 kd) 2 fragmenty (4 kd, 8 kd) protein II (16 kd) 3 fragmenty (2 kd, 6 kd, 8 kd) protein I m/z protein II m/z protein II (16 kd) 3 fragmenty (2 kd, 6 kd, 8 kd) 2. Separace peptidů chromatografií (HPLC) UV abs Time (min) 5. Určení části sekvence.. M G A D D H D K L.. 6. Srovnávání s databázemi, identifikace 2,5 kd m/z 4. MS/MS spektrum m/z DNA (i EST), proteinová databáze generování teoretických trypsinových štěpů ze známých či předpokládaných proteinových sekvencí protein a: 3, 5, 9, 12 kd protein b: 2, 7, 9 kd protein c: 4, 8 kd protein d: 3, 9, 12 kd protein e: 2, 6, 8 kd další fragmentace Srovnání experimentálně stanovených velikostí peptidů s teoretickými štěpy vyříznout proužek rozřezat omýt Příprava vzorku (redukce) (alkylace) štěpení proteasou proč redukce a alkylace? rozvolnění ě S-S S vazeb trypsin denaturace > lepší proteolýza agresivní proteasa ochrana oxidovaných reziduí Cys vysoká primární specificita, it nízká sekundární prům. m/z fragmentu ~ 1.5 kda štěpí: DTT, dithiothreitol arginyl-x, lysyl-x; ale ne X=prolyl KONTAMINACE! keratiny (kůže, vlasy, srst, vlna) detergenty (SDS, Triton atp.) ) IAA, jódoctová kys. Peptide Mass Fingerprinting - PMF, MALDI TOF MS masses (m/z) ELSDIAR QLLLTADDR PHSHPALTPEQK PHSHPALTPEQKK GILAADESTGSIAKR LQSIGTENTEWENRR IGENHTPSALAIMENANVLAR YTPSGQAGAAASESLFISNHAY

36 Bioinformatika pro MS organismy se sekvenovaným e genomem e PMF, statistická shoda predikovaných m/z tryptických peptidů (in silico digest) s experimentálními i PC programy MASCOT (firma Matrixscience), SEQUEST, ProteinProspector organismy s nesekvenovaným genomem hledání na základě evoluční homologie proteinových sekvencí Charakterizace ko- a posttranslačních modifikací v proteinech s použitím MS SEC + Q TOF MASS Charakterizace ko- a posttranslačních modifikací v proteinech s použitím MS fosforylace, sulfatace, glykosylace, N-koncové modifikace Význam: důležité pro regulaci buněčné distribuce ib a modulaci funkcí proteinů. Př. fosforylace - přenos signálu v buňce, glykosylace - vliv na funkční, strukturní a imunologické vlastnosti proteinů. Výhoda MALDI MS (FT ICR MS) analýzy v tomto případě spočívá ve velké přesnosti určení molekulové hmotnosti, citlivosti ti a rozlišení. Protokol pro analýzu proteinové modifikace 1) štěpením vzorku 2) enzymové modifikaci. Pak se analyzuje rozdíl v Mr určitého peptidu spočítané na základě sekvence a odečtené z MS spektra.

37 Děkuji za pozornost cz Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D.

38 Metody izolace a purifikace produktů Zdroje proteinů, polysacharidů a jiných. mikroorganismy (bakterie, kvasinky, plísně, řasy) živočišné tkáně (myši, krysy, králíci, jateční zvířata orgány, krev, člověk tělní tekutiny (krev plasmin, thrombin, specifické protilátky...; moč urokinasa...) rostlinná pletiva tělní tekutiny savců obrazová příloha Škola molekulárních biotechnologií Profession, Olomouc, březen 2011 Bílková Zuzana Cíl izolace Získání biopolymeru (proteiny, polysacharidy, glykoproteiny.) definované čistoty Zachování biologické aktivity Získat produkt o patřičné čistotě s vynaložením přiměřeného (optimálního) úsilí a přiměřeného množství peněz Výchozí materiál - úskalí Komplexnost biologické matrice ( (velké množství doprovodných odných bílkovin a jiných látek) Malá množství cílového produktu Labilita biologické aktivity produktu Strukturní labilita

39 Rozbíjení buněk, tkání, homogenizace Zásady pro práci s biologickým materiálem Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Separační metody A. Separace založené na velikosti molekul (dialýza a ultrafiltrace, centrifugace v hustotním gradientu, gelová filtrační chromatografie) B. Separace založené na rozdílech rozpustnosti proteinů (izoelektrická precipitace, vysolování neutrálními solemi, frakcionace organickými rozpouštědly) C. Separace založené na základě povrchového náboje (elektroforetické metody, iontově výměnná chromatografie, afinitní chromatografie) 1. Pokud možno zpracovat co nejdříve 2. V případě potřeby zmrazit ( 20;C, 80 o C) 3. Rozmražování co nejrychleji j x postupně p zvyšovat teplotu? 4. Nízká teplota při izolaci 5. Vhodné ph + iontová síla 6. Vhodná koncentrace bílkoviny 7. Zabránit pěnění 8. Omezení proteolytické aktivity (směs inhibitorů) 9. Přídavek specifických látek (např. ř ME, EDTA...) Separační metody Centrifugace a ultracentrifugace Membránové separace (ultrafiltrace, dialýza) Selektivní precipitace Iontově výměnná chromatografie (IEC) Chromatografie na molekulových sítech (SEC) Hydrofóbní chromatografie (HIC) Afinitní chromatografie (AC, IAC, HPIAC) Preparativní elektromigrační techniky

40 Frakcionovaná precipitace - vysolování Hydrofilní aminokyseliny interagují s molekulami vody a vytvářejí s ní vodíkové můstky (čím více hydrofilních skupin, tím více je protein rozpustný) Přidání soli do roztoku odebírá proteinu vodní plášť Interakce protein/protein je silnější než protein/roztok Molekuly l proteinu koagulují (agregují) díky hydrofóbním interakcím Selektivní precipitace Separace založené na rozdílné rozpustnosti proteinů Rozpustnost proteinu prudce stoupá, je-li v roztoku o ph nižším nebo v ph vyšším než pi proteinu (molekuly mají stejné náboje a odpuzují se). nost rozpustn vsolování I vysolování Při vysoké iontové síle se protein kompletně vysráží (mezi 39 a 75 %). Precipitace Selektivní precipitace 1) rozpustnost globulárních proteinů ovlivňuje ph 2) při ph = pi je rozpustnost nejnižší, molekuly mají tendenci se shlukovat mají 0 náboj 3) protein má celkový povrchový náboj buď kladný nebo záporný (NH + 3 nebo COO - postranních řetězců aminokyselin v proteinu) 4) princip izoelektrické precipitace - každý protein má jiné pi a vysráží se ze směsi proteinů v roztoku, který má ph = jeho pi. ph roztoku je nižší náboj proteinu pi Bílkoviny aktivní v nativním stavu, srážením ke změnám konformace molekuly (porušení fyz.-chem.vlastností chem.vlastností), musí biol. aktivita zajištěna návratem do fyziol. Podmínek Nezaměňovat s denaturací - Ireverzibilní precipitace sole těžkých kovů, koncentrované minerální kyseliny, y, orga- nické kyseliny, teplo Látky používané pro separaci bílkovin EtOH, NaCl, (NH 4 4) 2 SO 4 - rozpustnost se málo mění s teplotou, saturovaný roztok 4 M - hustota 1,235g/cm 3 umožňuje centrifugaci agregovaných bílkovin (hustota 1,29 g/cm 3 ), levný, čistý Filtrace nahrazena centrifugací ph roztoku je vyšší náboj proteinu + -