Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D.

Rozměr: px
Začít zobrazení ze stránky:

Download "Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D."

Transkript

1 Fingerprint Identifikace proteinů Proteinové mapy (2D elektroforeogramy, HPLC spektra, CZE spektra) Peptidové mapy (2D elektroforeogramy, HPLC spektra, CZE spektra, MS spektra) Charakteristické a specifické polohy skvrn, píků otisky prstů pro každý např. buněčný proteom nebo pro každý protein Identifikace proteinů v proteomice Molekulovou hmotnost nativního proteinu separovaného ELFO lze potvrdit hmotovou spektroskopií MALDI TOF, ESI TOF. Sekvenční analýza se provádí způsoby: 1.Edmanovou degradací (přímé sekvencování) a 2. hmotovou spektrometrií (nepřímé sekvencování, fingerprinting, de novo sekvencování). V obou případech p pak na základě získaných sekvencí následuje hledání v databázích proteinů Pro přímé sekvencování je nutný blotting nativního proteinu nebo jeho peptidových fragmentů (připravených in-solution štěpením a následně separovaných ELFO Schäger/von Jagow) na PVDF membránu. Po obarvení membrány amidočerní 10B se vyříznou příslušné pásy (1D) nebo skvrny (2D) a fragmenty membrány se vloží do reakční cely proteinového sekvenátoru. DIGE Diferenční 2D elektroforéza Výsledné mapy proteinů se porovnávají s kontrolními vzorky (pacienti s konkrétním onemocněním a zdraví pacienti). Po vyříznutí oblasti vykazující odlišnost je provedena analýza MS.

2 Fragmentace proteinů, polypeptidových řetězců Edmanovo odbourávání Pro analýzu Edmanovou degradací jsou nutná množství vzorku pmol, nejlépe však 200 pmol, konkurenční MS nyní zvládá fmoly (nanosprej ESI Qq TOF MS), dosud však není tolik rozšířená. Podmínkou pro úspěšnou sekvenční analýzu Edmanovou cestou je volný N-konec peptidu či proteinu. Edmanovo odbourávání Po odštěpení PTC-derivátu následuje jeho analýza (zjištění retenčního času na HPLC koloně) s detekcí při 270 nm. Běžně je takto možné získat aminokyselin z N-konce, samozřejmě s narůstající chybou (reakce není 100% ní). Za ideálních podmínek maximálně 100 aminokyselin. V automatickém proteinovém sekvenátoru (dodávají např. firmy Applied Biosystems, Shimadzu) je analyzovaný protein či peptid imobilizován. Buď na disku ze skleněných vláken (kovalentní vazba nebo adsorpce) nebo na membráně PVDF (ProSorb patrony nebo po blottingu). Reagencie ke vzorku vstupují a jsou odváděny nejlépe v plynné fázi. Doba trvání jednoho cyklu analýzy činí min. Je třeba připočítat eluci standardů aminokyselin a tzv. prázdný run. Často je však N-konec chemicky blokován (acetylace, pyroglutamová kyselina). Nevýhodou i výskyt glykosylačních míst - zde nízký výtěžek v daném cyklu. Automatizace

3 Hmotnostní spektrometrie (mass spectometry, MS) Princip ESI TOF MS a MALDI TOF MS Je metoda pro separaci látek podle rozdílů hmoty (m) a náboje (z) s využitím elektrického a magnetického pole. Určovanou fyzikální veličinou je podíl hmoty a náboje (m/z), při znalosti náboje umožňuje j určit molekulovou hmotnost. Velmi citlivá metoda, stačí několik iontů k získání měřitelného signálu, poměr m/z může být stanoven s přesností Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Původně aplikována pro malé těkavé látky, či derivatizované netěkavé látky (ionizace i paprskem elektronů ů - EI, chemická ionizace i s nosným plynem). S objevem šetrnějších technik ionizace (ESI, MALDI) je možné měřit i velké molekuly (např. proteiny, lipidové komplexy, polysacharidy). y) Matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) Laserová desorpční ionizace s pomocí matrice Metoda MALDI MS (od 1988) je rozšířeným nástrojem pro separaci přírodních látek, peptidů, proteinů a dalších bio- makromolekul (oligonukleotidy, sacharidy, lipidy). Vzorek je na nerezové destičce ukotven v netěkavé matrici (kokrystalizace). Používá se např. kyselina nikotinová nebo 2,5- dihydroxybenzoová. Vzorek (1 mg/ml) se nanese v 0.5 l na nerezovou destičku a nechá se vysušit. Pak se aplikuje 0.5 l matrice a opět se nechá vysušit. Destička se vloží do přístroje, zacílí se laserový paprsek p ( fire ), transfer energie e e způsobí ionizaci. Směrovaný ě energetický impuls poskytuje vysoké výtěžky iontů intaktního analytu, dosahuje se subpikomolární sensitivity. SELDI surface enhanced laser desorption/ionisation array chip hmotová spektrometrie výhody jednoduchost rychlost selektivita nevýhody nízká citlivost nízká přesnost urč. m/z nízké rozlišení

4 MS je často propojena s jinými analytickými technikami: ať už separačními nebo bez separace. Vznikají tak systémy GC- MS, LC-MS, CE-MS ale i MS-MS. Kroměě tandemové MS (MS-MS) MS) mohou být spojeny ažž tři i více analyzátorů ( multiple MS). První vybírá studované látky ze směsi, druhý je fragmentuje, třetí analyzuje vzniklé fragmenty. Pro identifikaci látek ve složitých směsích; nikoli na základě m/z, ale podle fragmentačních obrazů ( patterns ). Ve spojení s chromato či elfo metodou slouží MS jako detektor s vysokým rozlišením. Taková on-line analýza pak dává okamžité výsledky na rozdíl od off-line detekce. Klíčové je propojení přístrojů. LC-MS v biochemii pro peptidy a proteiny, GC-MS pro těkavé LMW látky, CE-MS široký záběr od LMW po proteiny, DNA, viry etc. vyříznout proužek rozřezat omýt Příprava vzorku (redukce) (alkylace) štěpení proteasou proč redukce a alkylace? rozvolnění ě S-S S vazeb trypsin denaturace > lepší proteolýza agresivní proteasa ochrana oxidovaných reziduí Cys vysoká primární specificita, it nízká sekundární prům. m/z fragmentu ~ 1.5 kda štěpí: DTT, dithiothreitol arginyl-x, lysyl-x; ale ne X=prolyl KONTAMINACE! keratiny (kůže, vlasy, srst, vlna) detergenty (SDS, Triton atp.) ) IAA, jódoctová kys. Identifikace pomocí HPLC-ESI-MS/MS 1. Štěpení proteinu trypsinem 3. MS vybraného štěpu protein II (16 kd) 3 fragmenty (2 kd, 6 kd, 8 kd) 2. Separace peptidů chromatografií (HPLC) UV abs Time (min) 5. Určení části sekvence.. M G A D D H D K L.. 6. Srovnávání s databázemi, identifikace 2,5 kd Hledáním v databázi je pak proteinový vzorek identifikován, nebo se zjistí, že jde o protein, který dosud v databázi není. Předpodkladem pro vyhledávání jsou naměřené přesné m/z hodnoty peptidových fragmentů, použítí specifické proteasy a přesná m/z intaktního proteinu. Pro štěpení se používají endoproteasy, tedy proteolytické enzymy, které štěpíě uvnitř ř proteinové molekuly. l Důrazů se klade na specifitu použité proteasy, používají se proto vysoce specifické enzymy, jako je trypsin z hovězího či vepřového pankreatu (EC ) nebo Lys C proteasa z Bacillus licheniformis (EC ). Trypsin štěpí za bazickými zbytky y Arg a Lys, proteasa Lys C za zbytkem Lysinu. Podobně Glu C proteasa ze Staphylococcus aureus V8 (EC ) štěpí za Glu. Specificky lze štěpitě chemicky použitím í CNBr. m/z 4. MS/MS spektrum m/z další fragmentace

5 Identifikace proteinů peptide fingerprinting štěpení proteázou (trypsinem) protein I (12 kd) DNA (i EST), proteinová databáze 2 fragmenty (4 kd, 8 kd) protein II (16 kd) 3 fragmenty (2 kd, 6 kd, 8 kd) generování teoretických trypsinových štěpů ze známých či předpokládaných proteinových sekvencí Peptide Mass Fingerprinting - PMF, MALDI TOF MS masses (m/z) ELSDIAR QLLLTADDR PHSHPALTPEQK PHSHPALTPEQKK GILAADESTGSIAKR LQSIGTENTEWENRR IGENHTPSALAIMENANVLAR YTPSGQAGAAASESLFISNHAY MALDI ToF Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D protein I m/z protein II m/z Bioinformatika pro MS organismy se sekvenovaným genomem e PMF, statistická shoda predikovaných m/z tryptických peptidů (in silico digest) s experimentálními i PC programy MASCOT (firma Matrixscience), SEQUEST, ProteinProspector organismy s nesekvenovaným genomem protein a: 3, 5, 9, 12 kd protein b: 2, 7, 9 kd protein c: 4, 8 kd protein d: 3, 9, 12 kd protein e: 2, 6, 8 kd Srovnání experimentálně stanovených velikostí peptidů s teoretickými štěpy hledání na základě evoluční homologie proteinových sekvencí MS BLAST: MS driven Best Local Alignment Search Tool MultiTag (S. Sunyaev et al., Anal. Chem. 2003, in press) Charakterizace ko- a posttranslačních modifikací v proteinech s použitím MS fosforylace, sulfatace, glykosylace, N-koncové modifikace Význam: důležité pro regulaci buněčné distribuce a modulaci funkcí proteinů. Př. fosforylace - přenos signálu v buňce, glykosylace - vliv na funkční, strukturní a imunologické vlastnosti proteinů. Výhoda MALDI MS analýzy v tomto případě spočívá ve velké přesnosti určení molekulové hmotnosti, citlivosti a rozlišení. Typický protokol pro analýzu proteinové modifikace začíná štěpením vzorku, enzymobe modifikaci. Pak se analyzuje rozdíl v molekulové hmotnosti určitého peptidu spočítané na základě sekvence a odečtené z MS spektra. Pro složitost některých směsíě je výhodnější použít MALDI PSD MS/MS nebo LC MS.

6 MALDI MS pro studium vyšší struktury proteinů Studium prostorové struktury proteinů (zvl. terciární a kvarterní) má význam z důvodu těsného vztahu struktura - funkce. Poznání struktury tedy může poskytnout informace o funkci proteinu. Pro studium struktury proteinů se běžně používá řada spektro- skopických metod (Krystalografie - difrakce paprsků X, NMR spektroskopie a další). Dávají poměrně jasné výsledky, ale jejich nevýhodou může být zejména časová náročnost a nároky na vyšší množství materiálu. Poskytují rovněž značná množství dat, jejichž vyhodnocování je opět náročné. Technikou MS je možné studovat například přístupnost určitých povrchových regionů proteinů s použiím metody zvané protein mass fingerprinting (PMF).

7 Ověření účinnosti separace, čistoty a charakterizace produktů Oveření čistoty proteinů, peptidů a polysacharidů a jejich charakterizace pomocí HPLC (iontová, SEC, afinitní chromatografie, hydrofobní) Ověření čistoty proteinů, polypeptidů pomocí elektroforézy Volba separační metody (výtěžek, časová náročnost, nabohacení) srážení, vysolování na počátku, kdy je koncentrace produktu vysoká (> 1mg/ml) IEC separace látek podle náboje, změna kapalné fáze (equilibrace), zakoncentrování? (objem eluentu), optimalizace podmínek separace, kapacita kolon přiměřená, relativně levná GPC - separace látek podle Mr a tvaru, odsolení, změna kapalné fáze (equilibrace), šetrná, levná, jednoduchá, nezávislé na koncentraci produktu, typu kapalné fáze x zdlouhavá, zředění látky, malá kapacita kolon (1% Vt), často řadíme po vysolování HIC metoda silně závislá na experimentálních podmínkách, optimalizace podmínek (návaznost separačních kroků), objem vzorku pouze 1 5 % V kolony, vysoká kapacita, cena přiměřená AC (IAC) vysoce specifická metoda, vysoká kapacita, snižuje počty separačních kroků, cena různá podle typu ligandu, regenerace kolony Purifikace biopolymerů Cíl: získat co nejlepší výsledek (čistota, aktivita, množství) Vstupní podmínky: dostupnost materiálu, typ vstupního materiálu stabilita produktu nároky na čistotu Nároky na čistotu: terapeutické účely (> 99%) farmaceutický průmysl diagnostické testy (20 90%) výzkum, katalýza reakcí potravinářství kosmetický průmysl (70 90%) ultračisté té analytické standardy d (95 99%) Počet purifikačních kroků: minimalizace ace ztrát, časová á a finanční náročnost by měla odpovídat nárokům na čistotu a účelu využití, možnost automatizace Řazení separačních kroků techniky s vysokou kapacitou techniky s nízkou kapacitou za sebou metody separující látky na jiném principu (Mr, náboj, povrchové vlastnosti apod.) produkt jedné metody by měl být výchozím materiálem pro další (po vysolování nejde IEC bez GPC) (IEC a AC vyžadují definované složení kapalné fáze) předcházet tvorbě dimerů, polymerů, agregátů vliv agregátů na účinnost separace (přídavek detergentů?)

8 Podmínky kolonové separace typ náplně (bobtnání, stabilita, chemická inertnost), parametry kolony, (s rostoucím průměrem a klesající délkou kolony klesá rozlišení, u LPLC vliv difúze na rozmývání zón) zapojení kolon v sérii recyklace vzorku rychlost průtoku (flow rate, s rostoucí rychlostí roste rozmývání zón x čas, stabilita produktu x NK) pracovní tlak, teplota ekvilibrace náplně min. mrtvé objemy objem nanášeného vzorku (flow adaptor) regenerace kolony skladování, konzervace, sterilizace Hodnocení účinnosti purifikace a kritéria čistoty 2 parametry výtěžnost (návratnost - ztráty) a stupeň přečištění (kolik balastu se odstranilo) výhoda u biologicky aktivních látek (enzymy) vždy se hodnotí biologická aktivita, objem eluentu a obsah bílkovin kritéria čistoty homogenita preparátu, krystalizace (1 pík u HPLC neznamená vždy homogenitu) ověřit si různými metodami u biologicky aktivních látek kontaminující doprovodná biol. aktivita, přítomnost izoforem (pi), pozor na proteázy hodnocení homogenity 1. rozpustnost produktu (saturační křivka s ostrým přechodem v místě nasycení roztoku) 2. analytická ultracentrifugace (60tis./ot./min, fotometricky) 3. centrifugace v gradientu hustoty (1 frakce, - čas) 4. SDS-PAGE a další elektroforetické metody 5. Imunochemické metody Kontrola stupně purifikace prvotní průběžná (tzv. postupná eliminace) finální včetně strukturní charakterizace produktu celkové množství produktu, biologická aktivita, výtěžnost, stupeň obohacení (koncentrace) Požadavky na čistotu podle účelu použití (technické, purifikované, vysoce purifikované) Technické frakcionovaná precipitace, kompromis mezi čistotou a cenou Purifikované vyšší nároky na čistotu, cena, separace více metod za sebou Vysoce purifikované vysoká cena, výzkum strukturní studie, klinická diagnostika, kalibrátory, standardy, terapeutické účely (původ) Koncentrace produktů a jejich konečná úprava zakoncentrování přečištěného produktu odpařováním (x stabilita) mrazová sublimace (lyofilizace) hygroskopický prášek (sole, ph, organická rozpouštědla) denaturace, fragmentace precipitace a resolubilizace ultrafiltrace (rychlost sedimentace, rovnováha) krystalizace (náročné, zdlouhavé)

9 Charakterizace produktů SDS-PAGE Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. molekulová hmotnost celé molekuly, dílčích podjednotek (SDS-PAGE, SEC) tvar a Mr ultracentrifugace izoelektrický bod pi - IEF spektrální vlastnosti (UV-VIS, VIS, cirkulární dichroismus, NMR spektroskopie analýza primární struktury, sekvence monomerů peptidové mapování s MS analýzou rentgenostrukturní analýza Sledování čistoty proteinů Elektroforéza dokumentuje průběh purifikačního procesu Při použití standardů o známé molekulové hmotnosti je možno zhruba stanovit molekulovou l hmotnost izolovaného proteinu (SDS elektroforézou) Prokázání identity reakcí se specifickou Ab - imunoblot uvolnit elektroelucí a následně MS analýzu ndardy Stan rek odní vzor Půvo roteiny vázané pr Nenav oteiny ované pro Eluo metoda pro sledování čistoty produktu průběžné, konečné citlivost metody μg až ng! podle typu vizualizace vizualizace všech, i kontaminujících složek široké rozmezí Mr látek - zvolit vhodnou porozitu gelu, nejlépe gradientové gely detekce kontaminace NML problematická průkaz ů produktu ve směsi (Mr, standard) průkaz rozpadových fragmentů (Mr, Imunoblot) kvantifikace (denzitometricky) omezená možnost následné MS analýzy bandů Účinnost separace směsi v gelech o různé porozitě

10 Porozita gelu a Mr separovaných látek Idealizovaná PAGE purifikace fiktivního proteinu Homogenát Frakční vysolování Iontoměničová chromatografie Molekulové síto (gelová filtrace) Afinitní chromatografie Izolace IgG1 - hyperimunní sérum Afinitní chromatografie MPC-protein A 10% gel SDS-PAGE barveno Coomasie Blue Mr serum E1 E2 Mr Purifikace trypsinu na koloně o ě s p-aminobenzamidinem a e

11 Detekce konkrétního proteinu Western blot s imunochemickou detekcí Proteinová elektroforéza (SDS-PAGE) Identifikace anti-ca I protilátek izolovaných afinitní chromatografií transfer proteinů ů z gelu na membránu = Western blot Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. W. blot Primární protilátka membrána s navázanými proteiny detekce proteinu protilátkou (komplexu primární a sekundární protilátky) vizualizace pomocí barevné reakce nebo chemiluminiscence Sekundární protilátky konjugované s enzymem či fluorescenční č značkou Hodnocení čistoty výchozího materiálu před enzymovou fragmentací Tris Tricine SDS-PAGE: gel 16,5% T, 3% C (MW 1 70 kda), detection with silver staining, positions: (1) non-digested native CA I, (2) non-digested unfolded CA I, (3) unfolded CA I digested 3 h by immobilized trypsin, (4) molecular marker ( kda) Porovnání Laemmli versus Schäger/von Jagow - separace trypsinů - Zleva standardy 29, 45, 66, 97, 116 a 200 kda; hovězí trypsin; vepřový trypsin; cytochrom c (12 kda); standardy, hovězí trypsin; vepřový trypsin; křenová peroxidasa (40 kda). Proteiny naneseny po 7 mg.

12 Vizualizace fosforylovaných proteinů - specifické barvení ProQ Diamond II Analýzy elučních frakcí pomocí SDS-PAGE a IMUNOBLOTu Z. Bílková et al., Proteomics 5, , 2005 SDS-PAGE 37 kda 25 kda PAAG gely reprezentují eluční frakce z imunosorbentu Ademtech 5B2 Ab. Čísla udávají množství proteinu v mg/band Detailní snímek gelu l barveného 180 minut a odbarvovaného přes ř noc Detekce na přístroji Molecular Imager FX (Bio Rad Laboratories): Ex/Em: 532nm/602nm Myelinový bazický protein!! (MS analýza) Eluce ph 3 Eluce ph 2,5 37 kda 25 kda Tris-Tricine-SDS-PAGE-urea pro Abeta peptidy + blotting M HA štěpená Hyaluronidázou v čase APP alfa Abeta Original CSF Eluting fraction standards Lane 1, 2 and 10: synthetic Abeta Standard mix 1-37, 1-38, 1-39, 1-40, 1-42 Lane 3: CSF (#3131) which was sent to Pardubice Lane 4: Original sample (CSF UPCE) Lane 5: Eluting fraction IP 1 Lane 6: Eluting fraction IP 1 (1:4 diluted) Lane 7: Eluting fraction IP 2 Lane 8: Eluting fraction IP 2 (1:4 diluted) Lane 9: Eluting fraction IP 2 (1:8 diltuted) Western blot, University of Duisburg (Hermann) PAA gel, 10%, 5% zaostřovací, TBE pufr ph 8,4. Separace 20 min při 125 V a 20 ma/1 gel a potom do konce 200 V a 40 ma/1 gel PrP Imunoblot 37 kda 25 kda a b Gely reprezentují eluční frakce získané z imunosorbentů Ademtech 5B2 Ab (a) a perlové celulózy 9H7 Ab (b). Průkaz PrP specificky pomocí anti-prp- HRP 3F4 (imunoblot).

13 HPLC proteinů, peptidů, polysacharidů HPLC analytické uspořádání Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Gelová permeační chromatografie Iontově výměnná chromatografie Hydrofóbní interakční chromatografie Afinitní chromatografie Reverzní HPLC Gelová permeační chromatografie v HPLC módu Rigidní nosič silikagel (povahou aniont, hydrofóbní) Semirigidní nosič PS Modifikované povrchy biokompatibilita (Silikagel modif. hydrofilním polymerem) Částice 5 10 µm, sférické Částice s uniformní porozitou Průtoky do 0,5 ml Teplota 4 C 37 C Preparativní Částice 5 10 µm Kolona 30,0 21,2 mm x 250 mm (semiprep. 7,8 mm) Průtoky 10tky ml/min Objem vzorku ml Kapacita kolony mg Recyklace vzorku Sériové řazení kolon Předkolona Analytické Částice 1,8 3,5 µm Kolona 2,5 4,6 mm x mm Průtoky 10ky µl/min Objem vzorku µl Kapacita kolony - µg Předkolona Monolitické kolony Kapilární kolony Nano-HPLC Iontově výměnná chromatografie v HPLC módu První typ v HP módu (HPIEC) Silikagelové ionexové pryskyřice Nové materiály - PS-DVB, alumina, PES-PA Pelikulární hydrofilní polymery Odolnost vůči tlaku Preparativní uspoř. - částice až 25 µm (40% hydratace) Anal. uspoř. částice 5 10 µm, menší stupeň hydratace (10 20%) Separace x eluce ph a iontová síla mob. fáze

14 RP-HPLC Nejvhodnější pro separaci proteinů, peptidů podmínky, kdy nedochází k denaturaci Závislost retence peptidů na malé změně obsahu organického modifikátoru Silikagel modifikovaný různě dlouhými alkylovými řetězci endcapping, omezená chemická stabilita! Polymerní kolony PS-DVB ph 2 12 Zirkoniové výborná chemická a tepelná stabilita Monolitické materiály Částice 5 8 µm (lze až 40 µm) Velikost pórů 90 Å 300 Å 4000 Å Příklady RP-HPLC Detekce UV-VIS (205 nm, 215 nm, 252 nm, 280 nm) Průtoky do 1 ml/min Teplota Stacionární fáze pro silně hydrofobní C4, C5 pro hydrofilní peptidy C8, C18 Organický modifikátor acetonitril, metanol, isopropanol (gradient) Alternativní stacionární fáze monolitické kolony, kapilární kolony 150 x 0,32 mm; průměr 3,5 µm, průtok 3 µl/min

15 Shrnutí. Volba separační metody (výtěžek, časová náročnost, nabohacení) srážení, vysolování na počátku, kdy je koncentrace produktu vysoká (> 1mg/ml) IEC separace látek podle náboje, změna kapalné fáze (equilibrace), optimalizace podmínek separace, kapacita kolon přiměřená, relativně ě levná GPC - separace látek podle Mr a tvaru, odsolení, změna kapalné fáze (equilibrace), šetrná, levná, jednoduchá, nezávislé na koncentraci produktu, typu kapalné fáze x zdlouhavá, zředění látky, malá kapacita kolon (1% Vt), často řadíme po vysolování HIC metoda silně závislá na experimentálních podmínkách, optimalizace podmínek (návaznost separačních kroků), objem vzorku pouze 1 5 % V kolony, vysoká kapacita, cena přiměřená AC (IAC) vysoce specifická metoda, vysoká kapacita, snižuje počty separačních kroků, cena různá podle typu ligandu, regenerace kolony Purifikace biopolymerů Cíl: získat co nejlepší výsledek (čistota, aktivita, množství) Vstupní podmínky: dostupnost materiálu, typ vstupního materiálu stabilita produktu nároky na čistotu Nároky na čistotu: terapeutické účely (> 99%) farmaceutický průmysl diagnostické testy (20 90%) výzkum, katalýza reakcí potravinářství kosmetický průmysl (70 90%) ultračisté té analytické standardy d (95 99%) Počet purifikačních kroků: minimalizace ace ztrát, časová á a finanční náročnost by měla odpovídat nárokům na čistotu a účelu využití, možnost automatizace Řazení separačních kroků techniky s vysokou kapacitou techniky s nízkou kapacitou za sebou metody separující látky na jiném principu (Mr, náboj, povrchové vlastnosti apod.) produkt jedné metody by měl být výchozím materiálem pro další (po vysolování nejde IEC bez GPC) (IEC a AC vyžadují definované složení kapalné fáze) předcházet tvorbě dimerů, polymerů, agregátů vliv agregátů na účinnost separace (přídavek detergentů?)

16 Praktické příklady Srážení síranem amonným (vysoká koncentrace soli ve vzorku) chromatografie s hydrofóbní interakcí Ionexová chromatografie (eluce vysokou iontovou silou) chromatografie s hydrofóbní interakcí Gelová chromatografie se používá na konci celé purifikační sekvence (odstranění fragmentů a komplexů) NEVHODNÉ Srážení síranem amonným a ionexová chromatografie (nutno zařadit odsolovací krok dialýza, ultrafiltrace) Ověření účinnosti separace, čistoty a charakterizace produktů Sledování průběhu separace Metoda Celková bílkovina Celková aktivita Kontrola stupně purifikace Specifická aktivita Přečištění Výtěžek extrakt % HIC % IEX % prvotní průběžná (tzv. postupná eliminace) finální včetně strukturní charakterizace produktu celkové množství produktu, biologická aktivita, výtěžnost, stupeň obohacení (koncentrace) Oveření čistoty proteinů, peptidů a polysacharidů a jejich charakterizace pomocí HPLC (iontová, SEC, afinitní chromatografie, hydrofobní) Ověření čistoty proteinů, polypeptidů pomocí elektroforézy Požadavky na čistotu podle účelu použití (technické, purifikované, vysoce purifikované) Technické frakcionovaná precipitace, kompromis mezi čistotou a cenou Purifikované vyšší nároky na čistotu, cena, separace více metod za sebou Vysoce purifikované vysoká cena, výzkum strukturní studie, klinická diagnostika, kalibrátory, standardy, terapeutické účely (původ)

17 Hodnocení účinnosti purifikace a kritéria čistoty Zakoncentrování produktů a jejich konečná úprava Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. 2 parametry výtěžnost (návratnost - ztráty) a stupeň přečištění (kolik balastu se odstranilo) výhoda u biologicky aktivních látek (enzymy) vždy se hodnotí biologická aktivita, objem eluentu a obsah bílkovin kritéria čistoty homogenita preparátu, krystalizace (1 pík u HPLC neznamená vždy homogenitu) ověřit si různými metodami u biologicky aktivních látek kontaminující doprovodná biol. aktivita, přítomnost izoforem (pi), pozor na proteázy hodnocení homogenity 1. rozpustnost produktu (saturační křivka s ostrým přechodem v místě nasycení roztoku) 2. analytická ultracentrifugace (60tis./ot./min, fotometricky) 3. centrifugace v gradientu hustoty (1 frakce, - čas) 4. SDS-PAGE a další elektroforetické metody 5. Imunochemické metody Charakterizace produktů molekulová hmotnost celé molekuly, dílčích podjednotek (SDS-PAGE, SEC) tvar a Mr ultracentrifugace izoelektrický bod pi - IEF spektrální vlastnosti (UV-VIS, VIS, cirkulární dichroismus, NMR spektroskopie analýza primární struktury, sekvence monomerů peptidové mapování s MS analýzou rentgenostrukturní analýza zakoncentrování přečištěného produktu odpařováním (x stabilita) mrazová sublimace (lyofilizace) hygroskopický prášek (sole, ph, organická rozpouštědla) denaturace, fragmentace precipitace a resolubilizace ultrafiltrace (rychlost sedimentace, rovnováha) krystalizace (náročné, zdlouhavé) Elektromigrační metody

18 Princip elektroforézy Separační metoda využívající různé pohyblivosti různých iontů (složek směsi) ) ve stejnosměrném (homogenním) elektrickém poli. Pohyblivost separovaných iontů závisí také na: použitém elektrolytu (kapalné fázi) chemické vlastnosti a porozita nosiče Většinu biologicky zajímavých látek lze ve vodném prostředí převést ř na elektricky k nabité částice. Metodika: disociace, změna ph, adsorpce iontů jiného druhu, chemickou vazbou - tvorbou tzv. ionogenních komplexů. Jevy doprovázející elektroforézu Produkce Jouleova tepla S rostoucím napětím (Ohm Ohmův zákon) roste elektrický proud: I = U/R. Pokud el. proud nekoná mechanickou nebo chemickou práci, energie se bez užitku přeměňuje na teplo: Jouleovo teplo Chlazení gelů u vysokonapěťové elektroforézy voda, termostat, led Elektroendoosmóza Uplatňuje u kapilární elektroforézy. Stěny kapilár jsou vyrobeny z kremičitého skla a vlivem disociacei silanolových l skupin mají záporný náboj. K záporným nábojům se váží pozitivně nabité ionty ( counterions counterions ), vytváří stacionární vrstvu (Sternova Sternova). V následující vrstvě jsou však tyto ionty již mobilní (Guy-Chapmanova vrstva). Elektroendoosmóza na vnitřním povrchu kapiláry v místě styku s vodivým roztokem vzniká elektrická dvojvrstva pevná část (stěna kapiláry) je nabitá nepohyblivým plošným záporným elektrickým nábojem z kapalné části se kladné ionty připojí ke stěně kapiláry (dvojvrtva), ionty se pohybují k anodě pohyblivá vrstvička se žene kapilárou a strhne sebou celý průřez kapaliny v kapiláře roztok putuje kapilárou celý najednou (u elektroforézy putují jen ionty).

19 Typy elektroseparačních metod Zónová elektroforéza - Elektroforéza na nosiči Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Volná elektroforéza Zónová elektroforéza Isoelektrická fokusace Kapilární elektroforéza Vertikální x Horizontální Vertikální x Horizontální 1D nebo 2D rozměrná Nativní x Denaturační podmínky Analytická x Preparativní Gelová elektroforéza vertikální horizontální provádí se na hydrofilních porézních nosičích, nerozpustných ve vodě, s minimální i adsorpční č schopností, zabraňuje ň zpětnému mísení í rozdělených složek Nosiče Papírová elektroforéza nosičem elektrolytu l t je chromatografický papír analýza bílkovin; dělení nízkomolekulárních látek, aminokyselin Elektroforéza na tenké vrstvě nosičem elektrolytu (H2O + pufr) je vrstva silikagelu nebo škrobu na skleněné podložce. Gelová elektroforéza agar, agaróza, PAAG, porozita gelu gradient porozity gradient ph Provedení: plošné, v trubičkách, vertikální, horizontální Aparatury pro trubičkové gely

20 Kombinovaná elektroforéza dělení je využito (kromě.el.náboje) ještě dalších odlišností např. velikosti a molární hmotnosti iontů. Nosičem elektrolytu je obvykle gel (porozita gelu) př. SDS-PAGE elektroforéza dělení látek podle Mr (zvýšení účinnosti separace, citlivosti detekce) 2D elektroforéza kombinace izoleektrické fokuzace s gelovou chromatografií Elektrochromatografie dvourozměrná jeden směr chromatografie, druhý směr elektroforéza, Elektrodialýza, Elektroultrafiltrace, Elektrodesorpce eluce složek afinitní chromatografie elektrickým polem. Blotting (Western blotting, Immunoblotting) Dva hlavní typy PAAG elektroforézy Nativní gelová (nedenaturační) elektroforéza Probíhá bez denaturačních činidel. Proteiny migrují gelem podle svého celkového náboje velikosti a tvaru a podle velikosti pórů v gelu. SDS gelová elektroforéza Proteiny jsou denaturovány dodecylsíranem sodným (SDS) a β- merkaptoetanolem (zruší disulfidické vazby). Pohyblivost závisí na molekulové l hmotnosti polypeptidových řetězců (Mr) Vhodná pro analýzu makromolekulárních komplexů. Akrylamidový gel: pevná a inertní matrix ideální pro separaci proteinů Menší velikost pórů než u agarosy Použití 1. pro účely analytické i preparativní (méně) 2. k separaci velkých molekul (proteiny nebo NK) 3. k separaci menších molekul (cukry, peptidy nukleotidy) Faktory ovlivňující pohyblivost látky 1. Celkový povrchový náboj separované látky 2. Velikost a tvar molekuly 3. Porosita gelu 4. ph a složení elektrolytu Proteiny jsou tepelně denaturovány ve vzorkovém pufru obsahujícím dodecyl sulfát sodný (SDS) SDS)- zachována je tak pouze jejich primární struktura (var 2 3 min.) Denaturované proteiny mají vláknitý tvar a stejný záporný náboj daný vazbou SDS migrace tedy závisí pouze na jejich molekulové l hmotnosti ti Aniontový detergent, solubilizuje uje a denaturujeuje proteiny Většina proteinů váže SDS ve stejném poměru, asi 1,4 g SDS/g proteinu

21 PAA gelová elektroforéza - PAGE Gel z polymerovaného akrylamidu Polymer vytváří síť (podle koncentrace akrylamidu určitá velikost ok sítě) Molekuly se dělí podle své velkosti (malé rychleji, velké pomaleji). Laemmliho diskontinuální systém Používá se dvou gelů tzv. zaostřovacího ( stacking ) gelu nahoře a separačního ( running ) gelu dole. Liší se hodnoty ph 6, 8 a 8, 3 elektrodový pufr se pak liší od obou gelových pufrů. Mobilita separovaných proteinů mezi a) mobilitou iontu ve stacking gelu Cl-, tzv. leading ion = vedoucí Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Co obsahuje vzorkový pufr pro SDS-PAGE? Tris pufr utváří vhodné ph SDS (dodecyl sulfát sodný) detergent poskytující proteinům negativní náboj Glycerol vzhledem ke své vyšší specifické hmotnosti zajišťuje klesnutí vzorku ke dnu jamky v gelu po nanesení Bromophenol Blue barvivo umižňující sledovat průběh elektroforézy (pohyb čela v gelu) 2-ME (DTT) b) mobilitou iontu v katodovém pufru (glycin, pk 9.6, tzv. trailing ion = zakončující). Ionty i proteiny migrují do zaostřovacího gelu (5%) koncentrují se do velmi úzké zóny Barvení proteinových gelů stříbrem Coomassie blue Fluorescenční barviva RI Specifické barvení pro fosfo-, glyko-

22 Molekulová hmotnost proteinů velikost měřena v daltonech (Da) či kilodaltonech (kda) Dalton = jednotka atomové hmotnosti ti Separace látek podle jejich Mr = přibližně se rovná hmotnosti atomu H (1,66 x g) = definován také jako 1/16 hmotnosti ti atomu O Průměrná aminokyselina = 110 Da Průměrný nukleotid leotidový ový pár = 649 Da Gel 10%, Mr marker pozice 5 Nanesení vzorku Určování molekulové hmotnosti proteinů

23 Účinnost separace směsi v gelech o různé porozitě Porozita gelu a Mr separovaných látek Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. PAGE elektroforézy - modifikace 1) Nativní (různé ph, pufry Tris, MES, MOPS, HEPES) 2) SDS-PAGE tris/tricine pro proteiny menší než 14 kda (urea) 3) SDS-PAGE tris/borát/edta elektroforéza pro gp, SDS se neváže na cukerné k é složkyl 4) Afinoforéza polymer modifikovaný látkou vykazující afinitu k jedné ze separovaných složek (např. lektinová, chelatační) 5) Imunoelektroforéza, Imunofixace PAGE elektroforéza preparativní verze

24 Izoelektrická fokuzace Preparativní IEF Provádí se v chlazených vertikálních skleněných kolonách, které jsou naplněny roztokem amfolytů - stabilizováno gradientem sacharosy (viz centrifugace), Ficol, Perkol. Na konci separace se kolona vypustí do zkumavek ve sběrači frakcí. Zařízení Rotofor (Bio-Rad) membranový systém zón brání smísení separovaných vzorků Izoelektrická fokuzace Isoelektická fokusace se provádí buď v trubičkách nebo v plochých gelech, stripech. Hotové IEF gely s amfolyty y nebo immobiliny se dodávají komerčně spolu s přístroji pro auomatizovanou IEF. Vzorky se obvykle nanášejí na katodové straně. Denaturující podmínky při IEF - 9 M močovina nebo neionogenní detergenty (Triton X-100). Využití: stanovení pi, kontrola homogenity, isoenzymy Separace izoenzymů ( pi)

25 Dvojrozměrná (2D) elektroforéza proteinů Kombinuje použití IEF a SDS-PAGE pro účely studia proteomu, vypracováno O Farrellem v 70. letech., Umožňuje rozlišení až proteinů. 2D gelová elektroforéza Rozdělí současně stovky i tisíce proteinů Proteiny jsou rozprostřeny na ploše Proteiny se nejprve rozdělí podle jejich pi v gradientu ph Proteiny se nejprve rozdělí podle jejich pi v gradientu ph. Po separaci v prvním rozměru je provedena elektroforéza v gelu. Proteiny migrují ve druhém rozměru v závislosti na své velikosti. Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Separace izoforem ( pi) Blotting proteinů a nukleových kyselin blotting (angl. blot = skvrna, kaňka, česky přenos) pásy separované látky (např. SDS-PAGE) se přenášejí elektroforézou na membránu (NC, PVDF), kde jsou uchyceny adsorpcí nebo kovalentní vazbou. DNA analýza (Southern blotting, Southern 1975) RNA analýza (Northern blotting, Alwine et al., 1977) PROT analýza (Western blotting, Towbin et al., 1979) 1. fáze: klasická SDS-PAGE (separace podle Mr) 2. fáze: blotování působením elektrického proudu dojde k přeblotování proteinů z gelu do membrány 3. fáze: vyvíjení vizualizace přenesených proteinů, nespecifické nebo specifické barvení Ponceau S, Fast Green nebo Amidočerni10 B.

26 Sestava při blotování Detekce konkrétního proteinu Western blot s imunochemickou detekcí Proteinová elektroforéza (SDS-PAGE) W. blot transfer proteinů ů z gelu na membránu = Western blot detekce proteinu protilátkou (komplexu primární a sekundární protilátky) vizualizace pomocí barevné reakce nebo chemiluminiscence Rozdělení metod blottingu podle provedení Difúzní blotting - prostá difúze v tanku s přenosovým pufrem, dlouhá doba hodin, velkou nevýhodou difuze do stran - zhoršení rozlišení vlastní elektroforetické separace. Kapilární blotting - celá jednotka je zatížena, suchý papír nasává kapilárními silami pufr, vzorek je tak tažen z gelu na membránu. Trvá zhruba 12 hodin. Vakuový blotting - místo kapilárních sil vzorek tažen vakuem. Podstatně rychlejší (30 min). Výhodou též ostřejší pásy (potlačení difuze). Elektroblotting - nejrychlejší a nejúčinnější metoda. Hnací silou je v tomto případě síla elektrického kéh pole. Podle provedení se rozlišuje tzv. tankový (tank, wet) blotting a polosuchý (semi-dry) blotting. Jediný pro vysokomolekulární biopolymery. Elektroblotting Primární protilátka membrána s navázanými proteiny Sekundární protilátky konjugované s enzymem, fluor. značkou, ale i koloidním zlatem, radioaktivně, luminiscenčně. Detekce glykoproteinů Schiffovou reakcí, alcianovou modří, vazbou lektinů.

27 SDS-PAGE široké uplatnění čistota produktu průběžné, konečné monitorování citlivost metody μg až ng! podle typu vizualizace vizualizace všech, i kontaminujících složek x imunoblott (identifikace) široké rozmezí Mr látek - zvolit vhodnou porozitu gelu, nejlépe gradientové gely detekce kontaminace NML problematická průkaz produktu ve směsi (Mr, standard) průkaz rozpadových fragmentů (Mr, Imunoblot) kvantifikace (denzitometricky) omezená možnost následné MS analýzy bandů Idealizovaná PAGE purifikace fiktivního proteinu Homogenát Frakční vysolování Iontoměničová chromatografie Molekulové síto (gelová filtrace) Afinitní chromatografie Sledování čistoty proteinů Elektroforéza dokumentuje průběh purifikačního procesu Při použití standardů o známé molekulové hmotnosti je možno zhruba stanovit molekulovou l hmotnost izolovaného proteinu (SDS elektroforézou) Prokázání identity reakcí se specifickou Ab - imunoblot uvolnit elektroelucí a následně MS analýzu Izolace IgG1 - hyperimunní sérum Afinitní chromatografie MPC-protein A 10% gel SDS-PAGE barveno Coomasie Blue ndardy Stan rek odní vzor Půvo roteiny vázané pr Nenav oteiny ované pro Eluo Mr serum E1 E2 Mr

28 Purifikace trypsinu na koloně o ě s p-aminobenzamidinem a e Hodnocení čistoty výchozího materiálu před enzymovou fragmentací Tris Tricine SDS-PAGE: Tricine gel 16,5% T, 3% C (MW 1 70 kda), detection with silver staining, positions: (1) non-digested native CA I, (2) non-digested unfolded CA I, (3) unfolded CA I digested 3 h by immobilized trypsin, (4) molecularlar marker ( kda) Identifikace anti-ca I protilátek izolovaných afinitní chromatografií Vizualizace fosforylovaných proteinů - specifické barvení ProQ Diamond II Čísla udávají množství proteinu v mg/band Detailní snímek gelu l barveného 180 minut a odbarvovaného přes ř noc Detekce na přístroji Molecular Imager FX (Bio Rad Laboratories): Ex/Em: 532nm/602nm

29 Tris-Tricine Tricine-SDS-PAGE-urea pro Abeta peptidy + blotting M1 APP alfa Analýzy elučních frakcí pomocí SDS-PAGE a IMUNOBLOTu SDS-PAGE 37 kda 25 kda 37 kda Myelinový bazický PAAG gely reprezentují eluční protein!! (MS analýza) 25 kda frakce z imunosorbentu Ademtech 5B2 Ab. Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D Abeta Original CSF Eluting fraction standards Lane 1, 2 and 10: synthetic Abeta Standard mix 1-37, 1-38, 1-39, 1-40, 1-42 Lane 3: CSF (#3131) which was sent to Pardubice Lane 4: Original sample (CSF UPCE) Lane 5: Eluting fraction IP 1 Lane 6: Eluting fraction IP 1 (1:4 diluted) Lane 7: Eluting fraction IP 2 Lane 8: Eluting fraction IP 2 (1:4 diluted) Lane 9: Eluting fraction IP 2 (1:8 diltuted) Western blot, University of Duisburg (Hermann) HA štěpená Hyaluronidázou v čase PAA gel, 10%, 5% zaostřovací, TBE pufr ph 8,4. Separace 20 min při 125 V a 20 ma/1 gel a potom 200 V a 40 ma/1 gel a PrP 37 kda 25 kda Eluce ph 3 Eluce ph 2,5 HPLC proteinů, peptidů, polysacharidů Gelová permeační chromatografie Iontově výměnná chromatografie Hydrofóbní interakční chromatografie Afinitní chromatografie RP-HPLC b Imunoblot Gely reprezentují eluční frakce získané z imunosorbentů Ademtech 5B2 Ab (a) a perlové celulózy 9H7 Ab (b). Průkaz PrP specificky pomocí anti-prp- HRP 3F4 (imunoblot).

30 HPLC analytické uspořádání Preparativní Částice 5 10 µm Kolona 30,0 21,2 mm x 250 mm (semiprep. 7,8 mm) Průtoky 10tky ml/min Objem vzorku ml Kapacita kolony mg Recyklace vzorku Sériové řazení kolon Předkolona Iontově výměnná chromatografie v HPLC módu První typ v HP módu (HPIEC) Silikagelové ionexové pryskyřice Nové materiály - PS-DVB, alumina, PES-PA Pelikulární hydrofilní polymery Odolnost vůči tlaku Analytické Částice 1,8 3,5 µm Kolona 2,5 4,6 mm x mm Průtoky 10ky µl/min Objem vzorku µll Kapacita kolony - µg Předkolona Monolitické kolony Kapilární kolony Nano-HPLC Preparativní uspoř. - částice až 25 µm (40% hydratace) Anal. uspoř. ř částice 5 10 µm, menší stupeň ň hydratace (10 20%) Separace x eluce ph a iontová síla mob. fáze Gelová permeační chromatografie v HPLC módu Rigidní nosič silikagel (povahou aniont, hydrofóbní) Semirigidní nosič PS Modifikované povrchy biokompatibilita (Silikagel modif. hydrofilním polymerem) Částice 5 10 µm, sférické Částice s uniformní porozitou Průtoky do 0,5 ml Teplota 4 C 37 C Kombinace SEC (IEC) + ELFA

31 RP-HPLC RP-HPLC Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Nejvhodnější pro separaci proteinů, peptidů podmínky, kdy nedochází k denaturaci Závislost retence peptidů na malé změně obsahu organického modifikátoru Silikagel modifikovaný různě dlouhými alkylovými řetězci endcapping, omezená chemická stabilita! Polymerní kolony PS-DVB ph 2 12 Zirkoniové výborná chemická a tepelná stabilita Monolitické materiály Částice 5 8 µm (lze až 40 µm) ) Velikost pórů 90 Å 300 Å 4000 Å Výsledek purifikace Detekce UV-VIS (205 nm, 215 nm, 252 nm, 280 nm) Průtoky do 1 ml/min Teplota Stacionární fáze pro silně hydrofobní C4, C5 pro hydrofilní peptidy C8, C18 Organický modifikátor acetonitril, metanol, isopropanol p (gradient) Alternativní stacionární fáze monolitické kolony, kapilární kolony 150 x 0,32 mm; průměr 3,5 µm, průtok 3 µl/min Identifikace proteinů Březen 2011

32 Identifikace proteinů v proteomice A) Molekulovou hmotnost a identifikace analytu ELFO (Imunoblot) + MS (MALDI TOF, ESI TOF) B) Identifikace tzv. sekvenční analýza 1. Edmanovou degradací (přímé sekvencování) 2. Hmotovou spektrometrií (nepřímé sekvencování, fingerprinting, de novo sekvencování) + Informační databáze DIGE Diferenční 2D elektroforéza Fingerprint Proteinové mapy 2D elektroforeogramy, HPLC spektra, CZE spektra Peptidové mapy 2D elektroforeogramy, HPLC spektra, CZE spektra, MS spektra Charakteristické a specifické polohy skvrn, píků otisky prstů pro každý např. buněčný proteom nebo pro každý protein Fragmentace proteinů, polypeptidových řetězců Výsledné mapy proteinů se porovnávají s kontrolními vzorky (pacienti s konkrétním onemocněním a zdraví pacienti). Po vyříznutí oblasti vykazující odlišnost je provedena analýza MS.

33 Edmanovo odbourávání množství vzorku min pmol, opt. 200 pmol konkurenční MS nyní zvládá fmoly (nanosprej ESI Qq TOF MS) Podmínkou je volný N-konec peptidu či proteinu. Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Často je však N-konec chemicky blokován (acetylace, pyroglutamová kyselina). Nevýhodou i výskyt glykosylačních míst zde nízký Nevýhodou i výskyt glykosylačních míst - zde nízký výtěžek v daném cyklu. Edmanovo odbourávání možné získat aminokyselin z N-konce, samozřejmě s narůstající chybou (reakce není 100% ní). Za ideálních podmínek maximálně 100 aminokyselin. V automatickém proteinovém sekvenátoru (dodávají např. firmy Applied Biosystems, Shimadzu) je analyzovaný protein či peptid imobilizován. Buď na disku ze skleněných vláken (kovalentní vazba nebo adsorpce) nebo na membráně PVDF (ProSorb patrony nebo po blottingu). Reagencie ke vzorku vstupují a jsou odváděny nejlépe v plynné fázi. Doba trvání jednoho cyklu analýzy činí min. Je třeba připočítat eluci standardů aminokyselin a tzv. prázdný run. Po odštěpení PTC-derivátu následuje jeho analýza (zjištění retenčního času na HPLC koloně) s detekcí při 270 nm. Hmotnostní spektrometrie (MS) Automatizace Je metoda pro separaci látek podle rozdílů hmoty (m) a náboje (z) s využitím elektrického a magnetického pole. Určovanou fyzikální veličinou je podíl hmoty a náboje (m/z), při znalosti náboje umožňuje určit molekulovou hmotnost. Velmi citlivá metoda, stačí několik iontů k získání měřitelného signálu, poměr m/z může být stanoven s přesností techniky ionizace (ESI, MALDI) - lze měřit i velké molekuly (např. proteiny, lipidové komplexy, polysacharidy).

34 Princip ESI TOF MS a MALDI TOF MS SELDI surface enhanced laser desorption/ionisationionisation array chip hmotová spektrometrie výhody jednoduchost rychlost selektivita nevýhody nízká citlivost nízká přesnost urč. m/z nízké rozlišení Matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) Laserová desorpční ionizace s pomocí matrice Metoda MALDI MS (od 1988) je rozšířeným nástrojem pro separaci přírodních látek, peptidů, proteinů a dalších bio- makromolekul (oligonukleotidy oligonukleotidy, sacharidy, lipidy). Vzorek na nerezové destičce ukotven v netěkavé matrici i (kokrystalizace). k Používá se např. ř kyselina nikotinová nebo 2,5-dihydroxybenzoová. Destička se vloží do přístroje, zacílí se laserový paprsek ( fire ), transfer energie způsobí ionizaci. MS je často propojena s jinými analytickými technikami: GC-MS, LC-MS, CE-MS ale i MS-MS (Interphase) Kromě tandemové MS (MS-MS) mohou být spojeny až tři i více analyzátorů ( multiple MS). 1) Výběr studované látky ze směsi 2) Fragmentace 3) Analýza fragmentů Kombinace s chromato či elfo metodou slouží MS jako detektor s vysokým rozlišením - on-line analýza (x off- line detekce). Klíčové je propojení přístrojů. LC-MS v biochemii pro peptidy a proteiny. Spřažení - ESI x MALDI

35 Identifikace pomocí HPLC-ESI-MS/MS 1. Štěpení proteinu trypsinem 3. MS vybraného štěpu Identifikace proteinů peptide fingerprinting štěpení proteázou (trypsinem) MALDI ToF protein I (12 kd) 2 fragmenty (4 kd, 8 kd) protein II (16 kd) 3 fragmenty (2 kd, 6 kd, 8 kd) protein I m/z protein II m/z protein II (16 kd) 3 fragmenty (2 kd, 6 kd, 8 kd) 2. Separace peptidů chromatografií (HPLC) UV abs Time (min) 5. Určení části sekvence.. M G A D D H D K L.. 6. Srovnávání s databázemi, identifikace 2,5 kd m/z 4. MS/MS spektrum m/z DNA (i EST), proteinová databáze generování teoretických trypsinových štěpů ze známých či předpokládaných proteinových sekvencí protein a: 3, 5, 9, 12 kd protein b: 2, 7, 9 kd protein c: 4, 8 kd protein d: 3, 9, 12 kd protein e: 2, 6, 8 kd další fragmentace Srovnání experimentálně stanovených velikostí peptidů s teoretickými štěpy vyříznout proužek rozřezat omýt Příprava vzorku (redukce) (alkylace) štěpení proteasou proč redukce a alkylace? rozvolnění ě S-S S vazeb trypsin denaturace > lepší proteolýza agresivní proteasa ochrana oxidovaných reziduí Cys vysoká primární specificita, it nízká sekundární prům. m/z fragmentu ~ 1.5 kda štěpí: DTT, dithiothreitol arginyl-x, lysyl-x; ale ne X=prolyl KONTAMINACE! keratiny (kůže, vlasy, srst, vlna) detergenty (SDS, Triton atp.) ) IAA, jódoctová kys. Peptide Mass Fingerprinting - PMF, MALDI TOF MS masses (m/z) ELSDIAR QLLLTADDR PHSHPALTPEQK PHSHPALTPEQKK GILAADESTGSIAKR LQSIGTENTEWENRR IGENHTPSALAIMENANVLAR YTPSGQAGAAASESLFISNHAY

36 Bioinformatika pro MS organismy se sekvenovaným e genomem e PMF, statistická shoda predikovaných m/z tryptických peptidů (in silico digest) s experimentálními i PC programy MASCOT (firma Matrixscience), SEQUEST, ProteinProspector organismy s nesekvenovaným genomem hledání na základě evoluční homologie proteinových sekvencí Charakterizace ko- a posttranslačních modifikací v proteinech s použitím MS SEC + Q TOF MASS Charakterizace ko- a posttranslačních modifikací v proteinech s použitím MS fosforylace, sulfatace, glykosylace, N-koncové modifikace Význam: důležité pro regulaci buněčné distribuce ib a modulaci funkcí proteinů. Př. fosforylace - přenos signálu v buňce, glykosylace - vliv na funkční, strukturní a imunologické vlastnosti proteinů. Výhoda MALDI MS (FT ICR MS) analýzy v tomto případě spočívá ve velké přesnosti určení molekulové hmotnosti, citlivosti ti a rozlišení. Protokol pro analýzu proteinové modifikace 1) štěpením vzorku 2) enzymové modifikaci. Pak se analyzuje rozdíl v Mr určitého peptidu spočítané na základě sekvence a odečtené z MS spektra.

37 Děkuji za pozornost cz Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D.

38 Metody izolace a purifikace produktů Zdroje proteinů, polysacharidů a jiných. mikroorganismy (bakterie, kvasinky, plísně, řasy) živočišné tkáně (myši, krysy, králíci, jateční zvířata orgány, krev, člověk tělní tekutiny (krev plasmin, thrombin, specifické protilátky...; moč urokinasa...) rostlinná pletiva tělní tekutiny savců obrazová příloha Škola molekulárních biotechnologií Profession, Olomouc, březen 2011 Bílková Zuzana Cíl izolace Získání biopolymeru (proteiny, polysacharidy, glykoproteiny.) definované čistoty Zachování biologické aktivity Získat produkt o patřičné čistotě s vynaložením přiměřeného (optimálního) úsilí a přiměřeného množství peněz Výchozí materiál - úskalí Komplexnost biologické matrice ( (velké množství doprovodných odných bílkovin a jiných látek) Malá množství cílového produktu Labilita biologické aktivity produktu Strukturní labilita

39 Rozbíjení buněk, tkání, homogenizace Zásady pro práci s biologickým materiálem Autor prezentace: Doc. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D. Separační metody A. Separace založené na velikosti molekul (dialýza a ultrafiltrace, centrifugace v hustotním gradientu, gelová filtrační chromatografie) B. Separace založené na rozdílech rozpustnosti proteinů (izoelektrická precipitace, vysolování neutrálními solemi, frakcionace organickými rozpouštědly) C. Separace založené na základě povrchového náboje (elektroforetické metody, iontově výměnná chromatografie, afinitní chromatografie) 1. Pokud možno zpracovat co nejdříve 2. V případě potřeby zmrazit ( 20;C, 80 o C) 3. Rozmražování co nejrychleji j x postupně p zvyšovat teplotu? 4. Nízká teplota při izolaci 5. Vhodné ph + iontová síla 6. Vhodná koncentrace bílkoviny 7. Zabránit pěnění 8. Omezení proteolytické aktivity (směs inhibitorů) 9. Přídavek specifických látek (např. ř ME, EDTA...) Separační metody Centrifugace a ultracentrifugace Membránové separace (ultrafiltrace, dialýza) Selektivní precipitace Iontově výměnná chromatografie (IEC) Chromatografie na molekulových sítech (SEC) Hydrofóbní chromatografie (HIC) Afinitní chromatografie (AC, IAC, HPIAC) Preparativní elektromigrační techniky

40 Frakcionovaná precipitace - vysolování Hydrofilní aminokyseliny interagují s molekulami vody a vytvářejí s ní vodíkové můstky (čím více hydrofilních skupin, tím více je protein rozpustný) Přidání soli do roztoku odebírá proteinu vodní plášť Interakce protein/protein je silnější než protein/roztok Molekuly l proteinu koagulují (agregují) díky hydrofóbním interakcím Selektivní precipitace Separace založené na rozdílné rozpustnosti proteinů Rozpustnost proteinu prudce stoupá, je-li v roztoku o ph nižším nebo v ph vyšším než pi proteinu (molekuly mají stejné náboje a odpuzují se). nost rozpustn vsolování I vysolování Při vysoké iontové síle se protein kompletně vysráží (mezi 39 a 75 %). Precipitace Selektivní precipitace 1) rozpustnost globulárních proteinů ovlivňuje ph 2) při ph = pi je rozpustnost nejnižší, molekuly mají tendenci se shlukovat mají 0 náboj 3) protein má celkový povrchový náboj buď kladný nebo záporný (NH + 3 nebo COO - postranních řetězců aminokyselin v proteinu) 4) princip izoelektrické precipitace - každý protein má jiné pi a vysráží se ze směsi proteinů v roztoku, který má ph = jeho pi. ph roztoku je nižší náboj proteinu pi Bílkoviny aktivní v nativním stavu, srážením ke změnám konformace molekuly (porušení fyz.-chem.vlastností chem.vlastností), musí biol. aktivita zajištěna návratem do fyziol. Podmínek Nezaměňovat s denaturací - Ireverzibilní precipitace sole těžkých kovů, koncentrované minerální kyseliny, y, orga- nické kyseliny, teplo Látky používané pro separaci bílkovin EtOH, NaCl, (NH 4 4) 2 SO 4 - rozpustnost se málo mění s teplotou, saturovaný roztok 4 M - hustota 1,235g/cm 3 umožňuje centrifugaci agregovaných bílkovin (hustota 1,29 g/cm 3 ), levný, čistý Filtrace nahrazena centrifugací ph roztoku je vyšší náboj proteinu + -

Elektromigrační metody

Elektromigrační metody Elektromigrační metody Princip: molekuly nesoucí náboj se pohybují ve stejnosměrném elektrickém Arne Tiselius rozdělil proteiny krevního séra na základě jejich rozdílných rychlostí pohybu v elektrickém

Více

Metody práce s proteinovými komplexy

Metody práce s proteinovými komplexy Metody práce s proteinovými komplexy Zora Nováková, Zdeněk Hodný Proteinové komplexy tvořeny dvěma a více proteiny spojenými nekovalentními vazbami Van der Waalsovy síly vodíkové můstky hydrofobní interakce

Více

Vizualizace DNA ETHIDIUM BROMID. fluorescenční barva interkalační činidlo. do gelu do pufru barvení po elfu SYBR GREEN

Vizualizace DNA ETHIDIUM BROMID. fluorescenční barva interkalační činidlo. do gelu do pufru barvení po elfu SYBR GREEN ETHIDIUM BROMID fluorescenční barva interkalační činidlo do gelu do pufru barvení po elfu Vizualizace DNA SYBR GREEN Barvení proteinů Coommassie Brilliant Blue Coomassie Blue x barvení stříbrem Porovnání

Více

laktoferin BSA α S2 -CN α S1 -CN Popis: BSA bovinní sérový albumin, CN kasein, LG- laktoglobulin, LA- laktalbumin

laktoferin BSA α S2 -CN α S1 -CN Popis: BSA bovinní sérový albumin, CN kasein, LG- laktoglobulin, LA- laktalbumin Aktivita KA 2340/4-8up Stanovení bílkovin v mléce pomocí SDS PAGE (elektroforéza na polyakrylamidovém gelu s přídavkem dodecyl sulfátu sodného) vypracovala: MVDr. Michaela Králová, Ph.D. Princip: Metoda

Více

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti CHROMATOGRAFIE

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti CHROMATOGRAFIE Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti CHROMATOGRAFIE Chromatografie co je to? : široká škála fyzikálních metod pro analýzu nebo separaci komplexních směsí proč je to super?

Více

CHROMATOGRAFIE ÚVOD Společný rys působením nemísících fází: jedna fáze je nepohyblivá (stacionární), druhá pohyblivá (mobilní).

CHROMATOGRAFIE ÚVOD Společný rys působením nemísících fází: jedna fáze je nepohyblivá (stacionární), druhá pohyblivá (mobilní). CHROMATOGRAFIE ÚOD Existují různé chromatografické metody, viz rozdělení metod níže. Společný rys chromatografických dělení: vzorek jako směs látek - složek se dělí na jednotlivé složky působením dvou

Více

Western blotting. 10% APS 20,28 µl 40,56 µl 81,12 µl 20,28 µl 40,56 µl 81,12 µl

Western blotting. 10% APS 20,28 µl 40,56 µl 81,12 µl 20,28 µl 40,56 µl 81,12 µl Western blotting 1. Příprava gelu složení aparatury hustotu gelu volit podle velikosti proteinů příprava rozdělovacího gelu: 10% 12% počet gelů 1 2 4 1 2 4 objem 6 ml 12 ml 24 ml 6 ml 12 ml 24 ml 40% akrylamid

Více

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE - kvalitativní i kvantitativní detekce v GC a LC - pyrolýzní hmotnostní spektrometrie - analýza polutantů v životním

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE - kvalitativní i kvantitativní detekce v GC a LC - pyrolýzní hmotnostní spektrometrie - analýza polutantů v životním HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE - kvalitativní i kvantitativní detekce v GC a LC - pyrolýzní hmotnostní spektrometrie - analýza polutantů v životním prostředí - farmakokinetické studie - kvantifikace proteinů

Více

Spojení hmotové spektrometrie se separačními metodami

Spojení hmotové spektrometrie se separačními metodami Spojení hmotové spektrometrie se separačními metodami RNDr. Radomír Čabala, Dr. Katedra analytické chemie Přírodovědecká fakulta Univerzita Karlova Praha Spojení hmotové spektrometrie se separačními metodami

Více

MENÍ A INTERPRETACE SPEKTER BIOMOLEKUL. Miloslav Šanda

MENÍ A INTERPRETACE SPEKTER BIOMOLEKUL. Miloslav Šanda MENÍ A INTERPRETACE SPEKTER BIOMOLEKUL Miloslav Šanda Ionizaní techniky využívané k analýze biomolekul (biopolymer) MALDI : proteiny, peptidy, oligonukleotidy, sacharidy ESI : proteiny, peptidy, oligonukleotidy,

Více

Příprava vzorků pro proteomickou analýzu

Příprava vzorků pro proteomickou analýzu Příprava vzorků pro proteomickou analýzu 1) Úvod Proteomické analýzy mohou být naprosto odlišné cíle... Detekce změn v mozkové kůře při Alzheimerově chorobě Identifikace plazmatických markerů karcinomu

Více

Inovace studia molekulární a buněčné biologie

Inovace studia molekulární a buněčné biologie Inovace studia molekulární a buněčné biologie Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky. MBIO1/Molekulární biologie 1 Tento projekt je spolufinancován

Více

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Vysokoúčinná kapalinová chromatografie HPLC High Performance Liquid Chromatography Vysokoúčinná...X... Vysoceúčinná kapalinová chromatografie RRLC Rapid Resolution Liquid Chromatography Rychle rozlišovací

Více

Hmotnostní detekce biologicky významných sloučenin pro biotechnologie část 3 - Provedení štěpení proteinů a následné analýzy,

Hmotnostní detekce biologicky významných sloučenin pro biotechnologie část 3 - Provedení štěpení proteinů a následné analýzy, Laboratoř Metalomiky a Nanotechnologií Hmotnostní detekce biologicky významných sloučenin pro biotechnologie část 3 - Provedení štěpení proteinů a následné analýzy, vyhodnocení výsledků, diskuse Anotace

Více

ELEKTROFORETICKÁ SEPARACE NUKLEOVÝCH KYSELIN

ELEKTROFORETICKÁ SEPARACE NUKLEOVÝCH KYSELIN ELEKTROFORETICKÁ SEPARACE NUKLEOVÝCH KYSELIN Fragmenty nukleových kyselin lze dle jejich velikosti rozdělit elektroforézou. Elektroforéza využívá rozdílné pohyblivosti jednotlivých fragmentů, danou právě

Více

1. Metodika. Protokol č. F1-4 Metodika: Srovnávací analýza efektivity přípravy rekombinantního proteinu ve fermentoru

1. Metodika. Protokol č. F1-4 Metodika: Srovnávací analýza efektivity přípravy rekombinantního proteinu ve fermentoru Protokol č.: F1-4 Datum: 20.12.2010 Metodika: analýza efektivity přípravy výběr z výsledků ze zkušebních provozů výroby antigenů. Vypracoval: Ing. Václav Filištein, Mgr. Tereza Chrudimská, Spolupracující

Více

SPE je metoda vhodná pro rychlou přípravu vzorků, která užívá

SPE je metoda vhodná pro rychlou přípravu vzorků, která užívá Extrakce na pevné fázi (SPE) Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Extrakce na pevné fázi (SPE) (Solid Phase Extraction) SPE je metoda vhodná pro rychlou přípravu vzorků,

Více

Název: Vypracovala: Datum: 7. 2. 2014. Zuzana Lacková

Název: Vypracovala: Datum: 7. 2. 2014. Zuzana Lacková Název: Vypracovala: Zuzana Lacková Datum: 7. 2. 2014 Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.4.00/31.0023 Název projektu: Partnerská síť centra excelentního bionanotechnologického výzkumu MĚLI BYCHOM ZNÁT: informace,

Více

PROTOKOL WESTERN BLOT

PROTOKOL WESTERN BLOT WESTERN BLOT 1. PŘÍPRAVA ELEKTROFORETICKÉ APARATURY Saponátem a vodou se důkladně umyjí skla, plastové vložky a hřebínek, poté se důkladně opláchnou deionizovanou/destilovanou vodou a etanolem a nechají

Více

Diagnostické metody v analýze potravin. Matej Pospiech, FVHE Brno

Diagnostické metody v analýze potravin. Matej Pospiech, FVHE Brno Diagnostické metody v analýze potravin Matej Pospiech, FVHE Brno Důvody diagnostiky potravin Dodržování legislativních požadavků Vlastní kontrola v provozu Národní legislativa Evropská a mezinárodní legislativa

Více

ÚSTAV CHEMIE A ANALÝZY POTRAVIN

ÚSTAV CHEMIE A ANALÝZY POTRAVIN VYSOKÁ ŠKOLA CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ V PRAZE ÚSTAV CHEMIE A ANALÝZY POTRAVIN Technická 5, 166 28 Praha 6 tel./fax.: + 420 220 443 185; jana.hajslova@vscht.cz LABORATOŘ Z ANALÝZY POTRAVIN A PŘÍRODNÍCH PRODUKTŮ

Více

Stanovení koncentrace (kvantifikace) proteinů

Stanovení koncentrace (kvantifikace) proteinů Stanovení koncentrace (kvantifikace) proteinů Bioanalytické metody Prof. RNDr. Pavel Peč, CSc. Úvod Kritéria výběru metod stanovení koncentrace proteinů jsou založena na možnostech pro vlastní analýzu,

Více

Antiparalelní beta list

Antiparalelní beta list Antiparalelní beta list Paralelní beta list Schematický model beta listu (stužkový) Proteiny obsahují zpětné kličky (beta kličky nebo vlásenkové ohyby). Obvykle je CO skupina i-té aminokyseliny vázána

Více

ELEKTROFORETICKÉ METODY

ELEKTROFORETICKÉ METODY ELEKTROFORETICKÉ METODY ELEKTROFORETICKÁ SEPARACE AMINOKYSELIN NA PAPÍROVÉM NOSIČI Aminokyseliny lze rozdělit elektroforézou na papíře. Protože molekulová hmotnost jednotlivých aminokyselin není příliš

Více

BÍLKOVINY HLÍZ BRAMBOR

BÍLKOVINY HLÍZ BRAMBOR Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích ZEMĚDĚLSKÁ FAKULTA BÍLKOVINY HLÍZ BRAMBOR jejich izolace a možnosti uplatnění Jan Bárta a kol. 19. května 2015, České Budějovice Kancelář transferu technologií

Více

Látky obsahují aminoskupinu

Látky obsahují aminoskupinu Látky obsahují aminoskupinu pro aminy a aminokyseliny se běžně používají derivatizace (viz kapitola o derivatizaci), peptidy lze detekovat přímo při krátkých UV vlnových délkách (amidická vazba 200 nm),

Více

Trendy v moderní HPLC

Trendy v moderní HPLC Trendy v moderní HPLC Josef Cvačka, 5.1.2011 CHROMATOGRAFIE NA ČIPECH Miniaturizace separačních systémů Mikrofluidní čipy Mikrofabrikace Chromatografické mikrofluidní čipy s MS detekcí Praktické využití

Více

METODY STUDIA PROTEINŮ

METODY STUDIA PROTEINŮ METODY STUDIA PROTEINŮ Mgr. Vlasta Němcová vlasta.furstova@tiscali.cz OBSAH PŘEDNÁŠKY 1) Stanovení koncentrace proteinu 2) Stanovení AMK sekvence proteinu Hmotnostní spektrometrie Edmanovo odbourávání

Více

V organismu se bílkoviny nedají nahradit žádnými jinými sloučeninami, jen jako zdroj energie je mohou nahradit sacharidy a lipidy.

V organismu se bílkoviny nedají nahradit žádnými jinými sloučeninami, jen jako zdroj energie je mohou nahradit sacharidy a lipidy. BÍLKOVINY Bílkoviny jsou biomakromolekulární látky, které se skládají z velkého počtu aminokyselinových zbytků. Vytvářejí látkový základ života všech organismů. V tkáních vyšších organismů a člověka je

Více

Suchá chemie. Miroslava Beňovská (vychází z přednášky doc. Šterna)

Suchá chemie. Miroslava Beňovská (vychází z přednášky doc. Šterna) Suchá chemie Miroslava Beňovská (vychází z přednášky doc. Šterna) Využití Močová analýza diagnostické proužky POCT imunoanalytické kazety, diagnostické proužky Automatické analyzátory řada analyzátorů

Více

WESTERN BLOT. Velikost signálu je vyhodnocována srovnáním s naneseným proteinovým markerem, což je komerčně dostupná směs proteinů o známé velikosti.

WESTERN BLOT. Velikost signálu je vyhodnocována srovnáním s naneseným proteinovým markerem, což je komerčně dostupná směs proteinů o známé velikosti. WESTERN BLOT Western blot je metoda používaná pro kvalitativní nebo semikvantitativní detekci určitého proteinu ve vzorku. Metoda je tvořena třemi základními kroky: 1. elektroforetickou separací proteinů,

Více

Hydrofobní chromatografie

Hydrofobní chromatografie Hydrofobní chromatografie Hydrofobicita proteinu insulin malwmrllpl lallalwgpd paaafvnqhl cgshlvealy lvcgergffy tpktrreaed lqvgqvelgg gpgagslqpl alegslqkrg iveqcctsic slyqlenycn vliv soli na protein Stacionární

Více

7. Biofyzikální a biochemická analýza rekombinantních proteinů

7. Biofyzikální a biochemická analýza rekombinantních proteinů 7. Biofyzikální a biochemická analýza rekombinantních proteinů Rekombinantní proteiny, které se mají použít jako proteiny terapeutické, je nutné dobře charakterizovat z hlediska jejich biofyzikálních a

Více

Obsah Protein Gel Electrophoresis Kitu a jeho skladování

Obsah Protein Gel Electrophoresis Kitu a jeho skladování Obsah Protein Gel Electrophoresis Kitu a jeho skladování Protein Gel Electrophoresis Kit obsahuje veškerý potřebný materiál provádění vertikální polyakrilamidové gelové elektroforézy. Experiment provádějí

Více

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MELAMINU A KYSELINY KYANUROVÉ METODOU LC-MS

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MELAMINU A KYSELINY KYANUROVÉ METODOU LC-MS Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU MELAMINU A KYSELINY KYANUROVÉ METODOU LC-MS 1 Rozsah a účel Postup je určen pro stanovení obsahu melaminu a kyseliny kyanurové v krmivech. 2 Princip

Více

Hmotnostní spektrometrie

Hmotnostní spektrometrie Hmotnostní spektrometrie Podstatou hmotnostní spektrometrie je studium iontů v plynném stavu. Tato metoda v sobě zahrnuje tři hlavní části:! generování iontů sledovaných atomů nebo molekul! separace iontů

Více

Extrakce. Dělení podle způsobů provedení -Jednostupňová extrakce - mnohastupňuvá extrakce - kontinuální extrakce

Extrakce. Dělení podle způsobů provedení -Jednostupňová extrakce - mnohastupňuvá extrakce - kontinuální extrakce Extrakce Slouží k izolaci, oddělení analytu nebo skupin látek s podobnými vlastnostmi od matrice a ostatních látek, které nejsou předmětem analýzy (balasty). Extrakce je založena na ustavení rovnováhy

Více

CRH/NPU I - Systém pro ultraúčinnou kapalinovou chromatografii (UHPLC) ve spojení s tandemovým hmotnostním spektrometrem (MS/MS)

CRH/NPU I - Systém pro ultraúčinnou kapalinovou chromatografii (UHPLC) ve spojení s tandemovým hmotnostním spektrometrem (MS/MS) ODŮVODNĚNÍ VEŘEJNÉ ZAKÁZKY v souladu s 156 zákona č. 137/2006, Sb., o veřejných zakázkách, ve znění pozdějších předpisů Nadlimitní veřejná zakázka na dodávky zadávaná v otevřeném řízení v souladu s ust.

Více

Detekce a detektory část 2

Detekce a detektory část 2 Detekce a detektory část 2 Ivan Mikšík Fyziologický ústav AV ČR, v.v.i. Praha Spojení (spřažení) hmotnostní spektrometrie a separačních technik Analýza složitých směsí (nejdříve separace, poté analýza)

Více

Základy hmotnostní spektrometrie

Základy hmotnostní spektrometrie Základy hmotnostní spektrometrie Lenka Hernychová e-mail: hernychova@pmfhk.cz Ústav molekulární patologie, Fakulta vojenského zdravotnictví, Universita obrany Hradec Králové Historie Koichi Tanaka vyvinul

Více

Chromatografie. Petr Breinek. Chromatografie_2011 1

Chromatografie. Petr Breinek. Chromatografie_2011 1 Chromatografie Petr Breinek Chromatografie_2011 1 Společným znakem všech chromatografických metod je kontinuální rozdělování složek analyzované směsi vzorku mezi dvěma fázemi. Nepohyblivá fáze (stacionární

Více

BÍLKOVINY. V organismu se nedají nahradit jinými sloučeninami, jen jako zdroj energie je mohou nahradit sacharidy a lipidy.

BÍLKOVINY. V organismu se nedají nahradit jinými sloučeninami, jen jako zdroj energie je mohou nahradit sacharidy a lipidy. BÍLKOVINY o makromolekulární látky, z velkého počtu AMK zbytků o základ všech organismů o rostliny je vytvářejí z anorganických sloučenin (dusičnanů) o živočichové je musejí přijímat v potravě, v trávicím

Více

volba separace pro následnou MS kvantifikaci proteinů Jan Havliš Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta, Brno Ústav experimentální biologie : Oddělení funkční genomiky a proteomiky :: Centrální laboratoř

Více

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU LC-MS - FUMONISIN B 1 A B 2

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU LC-MS - FUMONISIN B 1 A B 2 Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU LC-MS - FUMONISIN B 1 A B 2 1 Rozsah a účel Metoda je vhodná pro stanovení fumonisinů B 1 a B 2 v krmivech. 2 Princip Fumonisiny

Více

DNA TECHNIKY IDENTIFIKACE ŽIVOČIŠNÝCH DRUHŮ V KRMIVU A POTRAVINÁCH. Michaela Nesvadbová

DNA TECHNIKY IDENTIFIKACE ŽIVOČIŠNÝCH DRUHŮ V KRMIVU A POTRAVINÁCH. Michaela Nesvadbová DNA TECHNIKY IDENTIFIKACE ŽIVOČIŠNÝCH DRUHŮ V KRMIVU A POTRAVINÁCH Michaela Nesvadbová Význam identifikace živočišných druhů v krmivu a potravinách povinností každého výrobce je řádně a pravdivě označit

Více

DYNEX nabízí komplexní řešení v oblasti zpracování a analýzy biologických materiálů pomocí molekulárně biologických metod.

DYNEX nabízí komplexní řešení v oblasti zpracování a analýzy biologických materiálů pomocí molekulárně biologických metod. DYNEX nabízí komplexní řešení v oblasti zpracování a analýzy biologických materiálů pomocí molekulárně biologických metod. Od 1.1.2014 DYNEX jediným OFICIÁLNÍM (autorizovaným) distributorem společnosti

Více

ZÁKLADNÍ MODELY TOKU PORÉZNÍ MEMBRÁNOU

ZÁKLADNÍ MODELY TOKU PORÉZNÍ MEMBRÁNOU ZÁKLADNÍ MODELY TOKU PORÉZNÍ MEMBRÁNOU Znázornění odporů způsobujících snižování průtoku permeátu nástřik porézní membrána Druhy odporů R p blokování pórů R p R a R m R a R m R g R cp adsorbce membrána

Více

Sbohem, paní Bradfordová

Sbohem, paní Bradfordová Sbohem, paní Bradfordová aneb IČ spektroskopie ve službách kvantifikace proteinů Mgr. Stanislav Kukla Merck spol. s r. o. Agenda 1 Zhodnocení současných možností kvantifikace proteinů Bradfordové metoda

Více

Separační metody SEPARAČNÍ (DĚLÍCÍ) METODY CHROMATOGRAFIE ROZDĚLENÍ SEPARAČNÍCH METOD. www.natur.cuni.cz/~suchan. Jana Sobotníková

Separační metody SEPARAČNÍ (DĚLÍCÍ) METODY CHROMATOGRAFIE ROZDĚLENÍ SEPARAČNÍCH METOD. www.natur.cuni.cz/~suchan. Jana Sobotníková Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Katedra analytické chemie Separační metody Jana Sobotníková tel.: 221951230 e-mail: jana.sobotnikova@natur.cuni.cz www.natur.cuni.cz/~suchan *přednášky

Více

Ultrastopová laboratoř České geologické služby

Ultrastopová laboratoř České geologické služby Ultrastopová laboratoř České geologické služby Jitka Míková Česká geologická služba Praha - Barrandov Laboratorní koloběh Zadavatel TIMS Analýza vzorku Vojtěch Erban Jakub Trubač Lukáš Ackerman Jitka Míková

Více

Vícefázové reaktory. Probublávaný reaktor plyn kapalina katalyzátor. Zuzana Tomešová

Vícefázové reaktory. Probublávaný reaktor plyn kapalina katalyzátor. Zuzana Tomešová Vícefázové reaktory Probublávaný reaktor plyn kapalina katalyzátor Zuzana Tomešová 2008 Probublávaný reaktor plyn - kapalina - katalyzátor Hydrogenace méně těkavých látek za vyššího tlaku Kolony naplněné

Více

SLEDOVÁNÍ VZTAHU MEZI OBSAHEM ENZYMU RUBISCO A KONCENTRACÍ CO 2 V CHLOROPLASTU

SLEDOVÁNÍ VZTAHU MEZI OBSAHEM ENZYMU RUBISCO A KONCENTRACÍ CO 2 V CHLOROPLASTU SLEDOVÁNÍ VZTAHU MEZI OBSAHEM ENZYMU RUBISCO A KONCENTRACÍ CO 2 V CHLOROPLASTU Nikola Burianová Experimentální biologie 2.ročník navazujícího studia Katedra Fyziky Ostravská univerzita v Ostravě OBSAH

Více

HPLC/MS tělních tekutin nový rozměr v medicinální diagnostice

HPLC/MS tělních tekutin nový rozměr v medicinální diagnostice HPLC/MS tělních tekutin nový rozměr v medicinální diagnostice Lukáš Chytil Ústav organické technologie VŠCHT Praha Medicinální diagnostika a hmotnostní spektrometrie Medicinální diagnostika: - Klasické

Více

ÚPRAVA VODY V ENERGETICE. Ing. Jiří Tomčala

ÚPRAVA VODY V ENERGETICE. Ing. Jiří Tomčala ÚPRAVA VODY V ENERGETICE Ing. Jiří Tomčala Úvod Voda je v elektrárnách po palivu nejdůležitější surovinou Její množství v provozních systémech elektráren je mnohonásobně větší než množství spotřebovaného

Více

Chromatografie Královna analýz

Chromatografie Královna analýz Chromatografie Královna analýz Monika Klusáčková monika.klusackova@jh-inst.cas.cz Ústav fyzikální chemie J.Heyrovského, AVČR, v.v.i. Analytická chemie Jaké látky se nachází ve vzorku? kvalitativní složení

Více

Diagnostika bronchiálního. ho astmatu HPLC/MS analýzou. Kamila Syslová Ústav organické technologie

Diagnostika bronchiálního. ho astmatu HPLC/MS analýzou. Kamila Syslová Ústav organické technologie Diagnostika bronchiálního ho astmatu HPLC/MS analýzou Kamila Syslová Ústav organické technologie Bronchiální astma Civilizační onemocnění rostoucí počet případů snižující se věková hranice prvních projevů

Více

Praktický kurz Monitorování hladiny metalothioneinu po působení iontů těžkých kovů Vyhodnocení měření

Praktický kurz Monitorování hladiny metalothioneinu po působení iontů těžkých kovů Vyhodnocení měření Laboratoř Metalomiky a Nanotechnologií Praktický kurz Monitorování hladiny metalothioneinu po působení iontů těžkých kovů Vyhodnocení měření Vyučující: Ing. et Ing. David Hynek, Ph.D., Prof. Ing. René

Více

Kosmetika a kosmetologie Přednáška 8 Funkční látky péče o kůži II

Kosmetika a kosmetologie Přednáška 8 Funkční látky péče o kůži II Kosmetika a kosmetologie Přednáška 8 Funkční látky péče o kůži II Přednáška byla připravena v rámci projektu Evropského sociálního fondu, operačního programu Vzdělávání pro konkurenceschopnost s názvem

Více

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Kapalinová chromatografie (LC) 1.1. Teorie kapalinové

Více

Vlastnosti peptidů a proteinů a jejich implikace pro vývoj HPLC metod... 23 Parametry mobilní a stacionární fáze... 23 Detekce peptidů a proteinů

Vlastnosti peptidů a proteinů a jejich implikace pro vývoj HPLC metod... 23 Parametry mobilní a stacionární fáze... 23 Detekce peptidů a proteinů Obsah METODY PURIFIKACE PRODUKTŮ... 5 Selektivní precipitace... 5 Chromatografické metody... 6 Afinitní purifikace... 8 Iontově výměnná chromatografie... 9 Gelová filtrace... 10 Hydrofobní chromatografie...

Více

Izolace genomové DNA ze savčích buněk, stanovení koncentrace DNA pomocí absorpční spektrofotometrie

Izolace genomové DNA ze savčích buněk, stanovení koncentrace DNA pomocí absorpční spektrofotometrie Izolace genomové DNA ze savčích buněk, stanovení koncentrace DNA pomocí absorpční spektrofotometrie IZOLACE GENOMOVÉ DNA Deoxyribonukleová kyselina (DNA) představuje základní genetický materiál většiny

Více

Laboratoř ze speciální analýzy potravin II. Úloha 3 - Plynová chromatografie (GC-MS)

Laboratoř ze speciální analýzy potravin II. Úloha 3 - Plynová chromatografie (GC-MS) 1 Úvod... 1 2 Cíle úlohy... 2 3 Předpokládané znalosti... 2 4 Autotest základních znalostí... 2 5 Základy práce se systémem GC-MS (EI)... 3 5.1 Parametry plynového chromatografu... 3 5.2 Základní charakteristiky

Více

VYUŽITÍ BEZKONTAKTNÍ VODIVOSTNÍ DETEKCE PRO HPLC SEPARACI POLYKARBOXYLÁTOVÝCH DERIVÁTŮ CYKLENU. Anna Hamplová

VYUŽITÍ BEZKONTAKTNÍ VODIVOSTNÍ DETEKCE PRO HPLC SEPARACI POLYKARBOXYLÁTOVÝCH DERIVÁTŮ CYKLENU. Anna Hamplová VYUŽITÍ BEZKOTAKTÍ VODIVOSTÍ DETEKCE PRO HPLC SEPARACI POLYKARBOXYLÁTOVÝCH DERIVÁTŮ CYKLEU Anna Hamplová Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta, Katedra analytické chemie Albertov 6, 128 43

Více

DĚLÍCÍ METODY. Autor: Mgr. Stanislava Bubíková. Datum (období) tvorby: 28. 5. 2012. Ročník: osmý. Vzdělávací oblast: Člověk a příroda / Chemie / Směsi

DĚLÍCÍ METODY. Autor: Mgr. Stanislava Bubíková. Datum (období) tvorby: 28. 5. 2012. Ročník: osmý. Vzdělávací oblast: Člověk a příroda / Chemie / Směsi Autor: Mgr. Stanislava Bubíková DĚLÍCÍ METODY Datum (období) tvorby: 28. 5. 2012 Ročník: osmý Vzdělávací oblast: Člověk a příroda / Chemie / Směsi 1 Anotace: Žáci se seznámí s nejčastěji používanými separačními

Více

PROTEOMIKA 6-8. 12. 2006

PROTEOMIKA 6-8. 12. 2006 PROTEOMIKA 6-8. 12. 2006 Středa: Čtvrtek: Pátek: Co je proteomika? Nástroje 2D elektroforéza IEF SDS PAGE Barvení Digesce Čištění peptidů Omezení 2D Zpracování Obrazu, Analýza 2D gelů (Dr. J. Pánek, AVČR)

Více

Odůvodnění veřejné zakázky

Odůvodnění veřejné zakázky Odůvodnění veřejné zakázky ZADAVATEL: Česká zemědělská univerzita v Praze Sídlem: Kamýcká 129, 165 21 Praha - Suchdol Zastoupený: Ing. Jana Vohralíková, kvestorka IČO: 60460709 Profil zadavatele: https://zakazky.czu.cz

Více

Výukové texty pro předmět Měřící technika (KKS/MT) na téma Podklady k principu měření hodnoty ph a vodivosti kapalin

Výukové texty pro předmět Měřící technika (KKS/MT) na téma Podklady k principu měření hodnoty ph a vodivosti kapalin Výukové texty pro předmět Měřící technika (KKS/MT) na téma Podklady k principu měření hodnoty ph a vodivosti kapalin Autor: Doc. Ing. Josef Formánek, Ph.D. Podklady k principu měření hodnoty ph a vodivosti

Více

Chromatografie polymerů III.: IC+LC CC+LC LC. FFF-Field flow fractionation (Frakcionace tokem v silovém poli)

Chromatografie polymerů III.: IC+LC CC+LC LC. FFF-Field flow fractionation (Frakcionace tokem v silovém poli) Přednáška 3 Chromatografie polymerů III.: IC+LC CC+LC LC FFF-Field flow fractionation (Frakcionace tokem v silovém poli) Studijní opora pro studenty registrované v akademickém roce 2013/2014 na předmět:

Více

Ing. Milan Vodehnal, AITEC s.r.o., Ledeč nad Sázavou

Ing. Milan Vodehnal, AITEC s.r.o., Ledeč nad Sázavou Technologie zneškodňování odpadních vod z galvanického vylučování povlaků ZnNi Ing. Milan Vodehnal, AITEC s.r.o., Ledeč nad Sázavou Používání galvanických lázní pro vylučování slitinových povlaků vzhledem

Více

I N V E S T I C E D O R O Z V O J E V Z D Ě L Á V Á N Í

I N V E S T I C E D O R O Z V O J E V Z D Ě L Á V Á N Í I V E S T I E D Z V J E V Z D Ě L Á V Á Í AMIKYSELIY PEPTIDY AMIKYSELIY = substituční/funkční deriváty karboxylových kyselin = základní jednotky proteinů (α-aminokyseliny) becný vzorec 2-aminokyselin (α-aminokyselin):

Více

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU Úvod IntellMed, s.r.o., Václavské náměstí 820/41, 110 00 Praha 1 DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU Jednou z nejvhodnějších metod pro detekci minimální

Více

Repetitorium chemie IV (2014)

Repetitorium chemie IV (2014) Repetitorium chemie IV (2014) Chromatografie Podstatou je rozdělování složek směsi dávkovaného vzorku mezi dvěma fázemi Stacionární fáze je nepohyblivá (silikagel, celulóza, polymerní částice) Mobilní

Více

EXTRAKČNÍ METODY. Studijní materiál. 1. Obecná charakteristika extrakce. 2. Extrakce kapalina/kapalina LLE. 3. Alkalická hydrolýza

EXTRAKČNÍ METODY. Studijní materiál. 1. Obecná charakteristika extrakce. 2. Extrakce kapalina/kapalina LLE. 3. Alkalická hydrolýza Studijní materiál EXTRAKČNÍ METODY 1. Obecná charakteristika extrakce 2. Extrakce kapalina/kapalina LLE 3. Alkalická hydrolýza 4. Soxhletova extrakce 5. Extrakce za zvýšené teploty a tlaku PLE, ASE, PSE

Více

STANOVENÍ AMINOKYSELINOVÉHO SLOŽENÍ BÍLKOVIN. Postup stanovení aminokyselinového složení

STANOVENÍ AMINOKYSELINOVÉHO SLOŽENÍ BÍLKOVIN. Postup stanovení aminokyselinového složení STANVENÍ AMINKYSELINVÉH SLŽENÍ BÍLKVIN Důvody pro stanovení AK složení určení nutriční hodnoty potraviny, suroviny (esenciální vs. neesenciální AK) charakterizace určité bílkovinné frakce nebo konkrétní

Více

ZŠ ÚnO, Bratří Čapků 1332

ZŠ ÚnO, Bratří Čapků 1332 Animovaná chemie Top-Hit Analytická chemie Analýza anorganických látek Důkaz aniontů Důkaz kationtů Důkaz kyslíku Důkaz vody Gravimetrická analýza Hmotnostní spektroskopie Chemická analýza Nukleární magnetická

Více

Zdroje iont používané v hmotnostní spektrometrii. Miloslav Šanda

Zdroje iont používané v hmotnostní spektrometrii. Miloslav Šanda Zdroje iont používané v hmotnostní spektrometrii Miloslav Šanda Ionizace v MS Hmotnostní spektrometrie je fyzikáln chemická metoda, pi které se provádí separace iont podle jejich hmotnosti a náboje m/z

Více

BÍLKOVINY STANOVENÍ HRUBÝCH BÍLKOVIN 1. NEPŘÍMÉ METODY

BÍLKOVINY STANOVENÍ HRUBÝCH BÍLKOVIN 1. NEPŘÍMÉ METODY BÍLKVINY Kvantitativní stanovení bílkovin - hrubá bílkovina - čistá bílkovina - travitelná bílkovina Stanovení aminokyselinového složen ení bílkovin - esenciální aminokyseliny - reaktivní kyseliny - limitující

Více

Kapalinová chromatografie - LC

Kapalinová chromatografie - LC Kapalinová chromatografie - LC Fyzikálně-chemická metoda dělení kapalin (roztoků) využívající rozdělování složky mezi dvě nestejnorodé fáze, nepohyblivou (stacionární) a pohyblivou (mobilní), přičemž pohyblivou

Více

Chemie - 3. ročník. přesahy, vazby, mezipředmětové vztahy průřezová témata. očekávané výstupy RVP. témata / učivo. očekávané výstupy ŠVP.

Chemie - 3. ročník. přesahy, vazby, mezipředmětové vztahy průřezová témata. očekávané výstupy RVP. témata / učivo. očekávané výstupy ŠVP. očekávané výstupy RVP témata / učivo Chemie - 3. ročník Žák: očekávané výstupy ŠVP přesahy, vazby, mezipředmětové vztahy průřezová témata 1.1., 1.2., 1.3., 1.4., 2.1. 1. Látky přírodní nebo syntetické

Více

Výzkumné centrum genomiky a proteomiky. Ústav experimentální medicíny AV ČR, v.v.i.

Výzkumné centrum genomiky a proteomiky. Ústav experimentální medicíny AV ČR, v.v.i. Výzkumné centrum genomiky a proteomiky Ústav experimentální medicíny AV ČR, v.v.i. Systém pro sekvenování Systém pro čipovou analýzu Systém pro proteinovou analýzu Automatický sběrač buněk Systém pro sekvenování

Více

VÝZNAM NĚKTERÝCH FAKTORŮ PREANALYTICKÉ FÁZE V MOLEKULÁRNÍ BIOLOGII

VÝZNAM NĚKTERÝCH FAKTORŮ PREANALYTICKÉ FÁZE V MOLEKULÁRNÍ BIOLOGII VÝZNAM NĚKTERÝCH FAKTORŮ PREANALYTICKÉ FÁZE V MOLEKULÁRNÍ BIOLOGII Plíšková L., Hrochová K., Kutová R. Ústav klinické biochemie a diagnostiky FN Hradec Králové PREANALYTICKÁ FÁZE V MOLEKULÁRNÍ BIOLOGII

Více

Repetitorium chemie IX (2016) (teorie a praxe chromatografie)

Repetitorium chemie IX (2016) (teorie a praxe chromatografie) Repetitorium chemie IX (2016) (teorie a praxe chromatografie) Chromatografie Podstatou je rozdělování složek směsi dávkovaného vzorku mezi dvěma fázemi Stacionární fáze je nepohyblivá (silikagel, celulóza,

Více

VÝZNAM FUNKCE PROTEINŮ V MEDICÍNĚ

VÝZNAM FUNKCE PROTEINŮ V MEDICÍNĚ FUNKCE PROTEINŮ 1 VÝZNAM FUNKCE PROTEINŮ V MEDICÍNĚ Příklad: protein: dystrofin onemocnění: Duchenneova svalová dystrofie 2 3 4 FUNKCE PROTEINŮ: 1. Vztah struktury a funkce proteinů 2. Rodiny proteinů

Více

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KARCINOMU PANKREATU

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KARCINOMU PANKREATU Úvod IntellMed, s.r.o., Václavské náměstí 820/41, 110 00 Praha 1 DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KARCINOMU PANKREATU Jednou z nejvhodnějších metod pro detekci minimální reziduální

Více

Sraz studentů v 8:00 před laboratoří A5/108, s sebou plášť a přezutí PRINCIP. Polyakrylamidová gelová elektroforéza v přítomnosti SDS (SDS-PAGE)

Sraz studentů v 8:00 před laboratoří A5/108, s sebou plášť a přezutí PRINCIP. Polyakrylamidová gelová elektroforéza v přítomnosti SDS (SDS-PAGE) PRINCIP Sraz studentů v 8:00 před laboratoří A5/108, s sebou plášť a přezutí Polyakrylamidová gelová elektroforéza v přítomnosti SDS (SDS-PAGE) SDS-PAGE slouží k separaci proteinů na základě jejich molekulové

Více

1. Proteiny. relativní. proteinu. Tento. České republiky.

1. Proteiny. relativní. proteinu. Tento. České republiky. Určení koncentrace celkových proteinů v krevním séru za využití různých metod Teoretická část: krátký úvod k metodám pro stanovení, analýzu a separaci proteinů. Praktická část: testt tří různých technik

Více

Analýza kofeinu v kávě pomocí kapalinové chromatografie

Analýza kofeinu v kávě pomocí kapalinové chromatografie Analýza kofeinu v kávě pomocí kapalinové chromatografie Kofein (obr.1) se jako přírodní alkaloid vyskytuje v mnoha rostlinách (např. fazolích, kakaových bobech, černém čaji apod.) avšak nejvíce je spojován

Více

Tabulace učebního plánu. Obecná chemie. Vzdělávací obsah pro vyučovací předmět : Ročník: 1.ročník a kvinta

Tabulace učebního plánu. Obecná chemie. Vzdělávací obsah pro vyučovací předmět : Ročník: 1.ročník a kvinta Tabulace učebního plánu Vzdělávací obsah pro vyučovací předmět : CHEMIE Ročník: 1.ročník a kvinta Obecná Bezpečnost práce Názvosloví anorganických sloučenin Zná pravidla bezpečnosti práce a dodržuje je.

Více

Využití enzymů pro analytické a výzkumné účely

Využití enzymů pro analytické a výzkumné účely Využití enzymů pro analytické a výzkumné účely Enzymy jako analytická činidla Stanovení enzymových aktivit Diagnostika (klinická biochemie) Indikátory technologických a jakostních změn v potravinářství

Více

Inovace bakalářského studijního oboru Aplikovaná chemie CZ.1.07/2.2.00/15.0247

Inovace bakalářského studijního oboru Aplikovaná chemie CZ.1.07/2.2.00/15.0247 Papírová a tenkovrstvá chromatografie Jednou z nejrozšířenějších analytických metod je bezesporu chromatografie, umožňující účinnou separaci látek nutnou pro spolehlivou identifikaci a kvantifikaci složek

Více

RNA Blue REAGENS PRO RYCHLOU PŘÍPRAVU ČISTÉ A NEDEGRADOVANÉ RNA (katalogové číslo R011, R012, R013)

RNA Blue REAGENS PRO RYCHLOU PŘÍPRAVU ČISTÉ A NEDEGRADOVANÉ RNA (katalogové číslo R011, R012, R013) RNA Blue REAGENS PRO RYCHLOU PŘÍPRAVU ČISTÉ A NEDEGRADOVANÉ RNA (katalogové číslo R011, R012, R013) Upozornění: RNA Blue obsahuje fenol a další toxické komponenty. Při kontaktu s kůží je nutné omytí velkým

Více

VYSOKOÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE (HPLC) HPLC = high performance liquid chromatography high pressure liquid chromatography

VYSOKOÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE (HPLC) HPLC = high performance liquid chromatography high pressure liquid chromatography VYSOKOÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE (HPLC) HPLC = high performance liquid chromatography high pressure liquid chromatography Separační principy kapalinové chromatografie adsorpce: anorg. sorbenty Al

Více

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ RIGORÓZNÍ PRÁCE

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ RIGORÓZNÍ PRÁCE UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA FARMACEUTICKÉ CHEMIE A KONTROLY LÉČIV RIGORÓZNÍ PRÁCE HPLC stanovení obsahu amlodipinu a perindoprilu v kombinovaném léčivém přípravku

Více

IONOSEP v analýze vody. Využití analyzátorů IONOSEP pro analýzu vod. Doc. Ing. František KVASNIČKA, CSc.

IONOSEP v analýze vody. Využití analyzátorů IONOSEP pro analýzu vod. Doc. Ing. František KVASNIČKA, CSc. Využití analyzátorů IONOSEP pro analýzu vod Doc. Ing. František KVASNIČKA, CSc. IONOSEP v analýze vody Kapilární isotachoforesa nebo její kombinace se zónovou elektroforesou je svými vlastnostmi velmi

Více

Princip ionexové chromatografie a analýza aminokyselin

Princip ionexové chromatografie a analýza aminokyselin Princip ionexové chromatografie a analýza aminokyselin Teoretická část: vysvětlení principu ionexové (iontové) chromatografie, příprava vzorku pro analýzu aminokyselin (kyselá a alkalická hydrolýza), derivatizace

Více

CZ.1.07/2.4.00/31.0133

CZ.1.07/2.4.00/31.0133 BiochemNet - Vytvoření sítě pro podporu spolupráce biomedicínských pracovišť a zvýšení uplatnitelnosti absolventů biochemických oborů v praxi CZ.1.07/2.4.00/31.0133 Univerzita Palackého Přírodovědecká

Více

Hmotnostní spektrometrie ve spojení se separačními metodami

Hmotnostní spektrometrie ve spojení se separačními metodami Pražské analytické centrum inovací Projekt CZ.04.3.07/4.2.01.1/0002 spolufinancovaný ESF a Státním rozpočtem ČR Hmotnostní spektrometrie ve spojení se separačními metodami Ivan Jelínek PřF UK Praha Definice:

Více

Metabolismus bílkovin. Václav Pelouch

Metabolismus bílkovin. Václav Pelouch ZÁKLADY OBECNÉ A KLINICKÉ BIOCHEMIE 2004 Metabolismus bílkovin Václav Pelouch kapitola ve skriptech - 3.2 Výživa Vyvážená strava člověka musí obsahovat: cukry (50 55 %) tuky (30 %) bílkoviny (15 20 %)

Více

Radiobiologický účinek záření. Helena Uhrová

Radiobiologický účinek záření. Helena Uhrová Radiobiologický účinek záření Helena Uhrová Fáze účinku fyzikální fyzikálně chemická chemická biologická Fyzikální fáze Přenos energie na e Excitace molekul, ionizace Doba trvání 10-16 - 10-13 s Fyzikálně-chemická

Více

Identifikace mikroorganismů pomocí sekvence jejich genu pro 16S rrna

Identifikace mikroorganismů pomocí sekvence jejich genu pro 16S rrna Praktická úloha Identifikace mikroorganismů pomocí sekvence jejich genu pro 16S rrna Pro spolehlivou identifikaci mikroorganismů pomocí genetických metod se velmi často využívá stanovení nukleotidové sekvence

Více