Úvod do molekulární biologie

Transkript

1 Úvod do molekulární biologie Struktura a vlastnosti nukleových kyselin Uchování a přenos genetické informace - replikace Transkripce Proteosynthesa a skládání proteinů - translace Regulace transkripce Základní techniky molekulární biologie, rekombinantní technologie Metodické přístupy molekulární biologie

2 Struktura a vlastnosti nukleových kyselin Deoxyribonukleová kyselina (DNA) Ribonukleová kyselina (RNA) Každá monomerní jednotka obsahuje: 1) Fosfátovou skupinu 2) Pětiuhlíkatý monosacharid Ribosa 2-deoxyribosa 3) Base Purinové a pyrimidinové stejné

3 Nukleové báze

4 Vlastnosti nukleových bází souvisí s jejich funkcí Planární Keto-enol tautomerie Slabě bazické Spektrální - UV

5 Strukturní jednotky NK Uhlíkové atomy v cukerné části číslovány s čárkou O O P O HO O H 2 C 5 O C 4 H H C 1 H C 3 C 2 H O OH H NUKLEOSID Monosacharid + base base Monomerní jednotka RNA Monomerní jednotka DNA Glykosidická vazba Mezi C 1 monosacharidu a N base NUKLEOTID C5 - fosforylovaný derivát nukleosidu, monomerní jednotka NK

6 Glykosidická vazba v nukleosidech a nukleotidech je u pyrimidinových bází tvořena mezi N 1 a C 1 (deoxy)ribosy Glykosidická vazba v nukleosidech a nukleotidech je u purinových bází tvořena mezi N 9 a C 1 (deoxy)ribosy 1 9

7 Názvosloví Báze se označují jednopísmennými symboly: A T C G U Nukleosidy: Purinové: přípona osin (adenosin, guanosin) Pyrimidinové: přípona idin (thymidin, cytidin, uridin) Deoxy- Nukleotidy: Nukleosid (x ) mono-, di-, tri- fosfát Adenosin 5 trifosfát = ATP, obecně NTP nebo dntp

8 Funkce nukleotidů stavební složky nukleových kyselin přenašeče energie (ATP, GTP, ligasy, hydrolasy) fosforylační činidla (ATP - kinasy) aktivátory meziproduktů biosyntéz: N H 3 C CH 3 N + CH 3 CH 2 H 2 C O O P O O O P O O H 2 C H H O N H H N O HO OH UDPglukosa CDPcholin

9 Funkce nukleotidů. součásti kofaktorů (NAD(P), FAD, AdoMet, CoA) regulační molekuly a neuromodulátory (camp, cgmp) Využití v terapii antivirotika (AIDS, herpes, hepatitida) NH 2 N N N N H 2 C O camp O H H H H O P O OH O Cyklický AdenosinMonoFosfát

10 Struktura DNA Primární - pořadí nukleotidů 5 3 Sekundární Terciární

11 Primární struktura Zapisujeme: TACG... (dtdadcdg...)

12 Sekundární struktura DNA dvojitá šroubovice James Watson, Francis Crick Rosalind Franklin - rentgenostrukturní analysa meziatomární vzdálenosti, helikální struktura

13 Chargaffova pravidla: Zastoupení basí v DNA (molární %) Organismus A T G C Člověk Kuře Kobylka luční Pšenice Kvasinky E. coli [A] = [T] a [G] = [C] [A] /[T] = [G] / [C] = 1 Princip párování basí

14 James D.Watson & Francis Crick Nobelova cena 1962

15 Sekundární struktura 1. Dvě vlákna, z nichž každé tvoří pravotočivý helix, vzájemně svinuté, parametry 2. Monosacharid + fosfát = páteř vně šroubovice polární povrch 3. Báze lokalizovány uvnitř šroubovice, roviny kruhů kolmo na osu, stohování basí, patrové hydrofobní interakce 4. Komplementární párování basí odpovídá Chargaffovým pravidlům, vodíkové můstky 5. Dvoušroubovice má dva žlábky: velký(mělký a široký) a malý (úzký a hluboký) 6. Polynukleotidové řetězce mají antiparalelní uspořádání: velikost se udává počtem párů bazí bp

16 Prokaryotní Terciární struktura DNA 1 molekula kruhové DNA - 1 chromosom (E.coli 2,6x10 6 kda, 1400 m!!) + Plasmid(ová DNA) - autonomně se replikující (zdvojující) mimochromosomální cirkulární DNA, odlišná od bakteriálního genomu (chromosomální DNA), která není nezbytná pro kontinuální existenci organismu za neselektivních podmínek.

17 Eukaryotní DNA je lineární Chromosomy + mimojaderná: mitochondriální, plastidová (pozor!! kruhová) Kódující úseky exony, nekódující úseky - introny Kondenzace, poměr sbalení až Základní jednotka - nukleosom

18 Vlastnosti DNA DNA poměrně málo stabilní - lze poškodit i mechanicky Přechod dvouvláknové struktury na jednovláknovou - porušení hydrofobních interakcí a vodíkových můstků: Pokles optické otáčivosti Pokles viskozity změna spektrálních vlastností Změna ph - protonace N1 v adeninu a N3 v cytosinu Pokles iontové síly - odhalení záporných nábojů fosfátové kostry

19 Teplotní denaturace DNA Hyperchromní efekt: T m = teplota tání DNA Tm se s zastoupením GC párů Denaturace může být vratná - annealing

20 RNA Ribosa x deoxyribosa U x T Jednovláknová! Messenger RNA mrna (5%) Ribosomální RNA rrna (80%) Transferová RNA trna (10 15%)

21 Ribosomální RNA, sekundární struktury: smyčky, výdutě, helikální úseky

22 Transferová RNA 3 konec

23

24 Úvod do molekulární biologie Struktura a vlastnosti nukleových kyselin Uchování a přenos genetické informace - replikace Transkripce Proteosynthesa a skládání proteinů Regulace transkripce Základní techniky molekulární biologie, rekombinantní technologie Metodický přístup molekulární biologie

25 Přenos genetické informace Centrální dogma molekulární biologie: x viry Základní pojmy: Templát - vázán nekovalentně - matrice, vzor Replikace, transkripce, translace řízené polymerace: Iniciace, elongace, terminace, postsyntetické úpravy (processing) Primer - vázán kovalentně - iniciátor růstu řetězců

26 Replikace DNA Konzervativní x Semikonzervativní? Meselson - Stahlův experiment

27 Meselsonův a Stahlův experiment nově vznikající DNA je kombinací starého a nového řetězce: E.coli v mediu s 15 N hybridizace

28 Replikace Specifické párování bází umožňuje kopírování ssdna slouží jako templát Vysoká rychlost genom E.coli 4,8 x 10 6 bp zkopírován za 40 min!!! tj. inkorporace 2000 bází/s lidský genom 6 x bp - replikace zahájena na více místech najednou

29 Rozvolnění dvojšroubovicové struktury v počátku replikace Vznik replikační bubliny replikační vidlička Espero Publishing, s.r.o.

30 Polarita DNA-řetězců v replikační vidličce Espero Publishing, s.r.o.

31 DNA polymerasa (I, II, III) - transferasa Podmínky: templát Mg 2+ Specifita: Vazba 3 5 Růst vlákna ve směru 5 3 Na začátku nutná přítomnost volné 3 OH - primer Sumárně: dntp + (DNA) n (DNA) n+1 + PPi

32 Mechanismus replikace

33 Asymetričnost replikační vidličky

34 Dokončení synthesy zpožďujícího se vlákna DNA polymerasa III DNA polymerasa I DNA ligasa

35 DNA ligasa propojení Okazakiho fragmnetů ATP AMP + PPi

36 Replikace DNA... Terminace Prokaryota kruhová DNA Eukaryota telomery, telomerasy

37 Vysoká přesnost kopírování je nezbytná!!! Pravděpodobnost inkorporace chybné base je 1 : 10 4 Ve skutečnosti pouze 1 : Opravný mechanismus?? Nukleasová aktivita DNA polymerasy

38 Stručná historie sekvenování DNA První DNA sekvence ~ alanin trna (77 basí) z kvasinky Vývoj metod pro sekvenování DNA Maxam-Gilbert a Sanger

39 DNA polymerasa (I, II, III) - transferasa Podmínky: templát Mg 2+ Primer s 3 OH Specifita: Vazba 3 5 Růst vlákna ve směru 5 3 Sumárně: dntp + (DNA) n (DNA) n+1 + PPi

40 DNA polymerasa (I, II, III) - transferasa Podmínky: templát Mg 2+ Specifita: Vazba 3 5 Růst vlákna ve směru 5 3 Na začátku nutná přítomnost volné 3 OH - primer Sumárně: dntp + (DNA) n (DNA) n+1 + PPi

41 Sangerova metoda Založena na použití dideoxynukleotidů

42 Pro sekvenování je třeba: Dostatečný počet kopií DNA Vhodný primer DNA polymerasa normalní nukleotidy v dostatečném množství Malé množství dideoxynukleotidů nějak označených (radioaktivně, fluorescenční značkou)

43 Templát 3 CCAAGGGT 5 5 primer G GG GGT GGTT GGTTC GGTTCC GGTTCCC GGTTCCCA 4 reakční směsi: - Elektroforetické dělení fragmentů podle Mh +

44 Sangerova metoda

45 Automatické sekvenování s využitím fluorescenčně značených dideoxynukleotidů Copyright Bios Publishers Ltd

46 Realita..

47 Amplifikace DNA Metoda PCR - polymerase chain reaction Polymerasová řetězová reakce

48 Amplifikace DNA - PCR (polymerase chain reaction) Reakční směs: - Taq polymerasa - Primery: levý pravý - Nukleotidy dntp

49 Využití PCR: Materiál pro sekvenování Sekvenace genomů (HUGO) Diagnostika infekčních onemocnění Identifikace poruch na úrovni DNA Identifikace osob Studium evoluce (zpracování fosilií) Základ genových technologií - GMO

50 Úvod do molekulární biologie Struktura a vlastnosti nukleových kyselin Uchování a přenos genetické informace - replikace Transkripce Proteosynthesa Regulace transkripce Základní techniky molekulární biologie, rekombinantní technologie Metodické přístupy molekulární biologie

51 Exprese genu DNA RNA RNA protein Transkripce Translace

52 Transkripce DNA RNA RNA polymerasa katalyzuje většinu kroků v procesu: - rozpoznává iniciační místa promotory - vytváří rozvinuté úseky (transkripční bubliny) - katalyzuje připojování správných basí, tj. tvorbu fosfoesterových vazeb - rozpoznává terminační místo - nemá nukleasovou aktivitu neopravuje chyby! Mechanismus syntézy je stejný pro všechny typy RNA

53 Transkripce Iniciace - promotor rozpoznán sigma (σ) podjednotkou RNA polymerasy prokaryota: σ podjednotka: 1. snižuje afinitu RNA polymerasy k nepřepisovaným oblastem 2. Rozpoznává oblast promotoru

54 DNA je transkribována enzymem RNA-polymerázou ( DNA dependentní) vytváří rozvinuté úseky (transkripční bubliny) - katalyzuje připojování správných basí, tj. tvorbu fosfoesterových vazeb - rozpoznává terminační místo RNA n + NTP RNA n PPi 3 5

55 Transkripce dvou genů na snímku z elektronového mikroskopu Transkripce mnoha RNA najednou Není třeba opravovat RNA polymerasa nemá nukleasovou aktivitu Espero Publishing, s.r.o.

56 Posttranskripční úpravy RNA Prokaryota - bez úprav Eukaryota - replikace a transkripce jsou časoprostorově oddělené procesy 5' čepička (cap) 3 ' konec - poly A ocas (tail) + Sestřih (splicing)

57 Sestřih RNA Genom: 5 Intergenic Gen Intergenic 3 Transkripce pre-mrna 5 Exon Intron Exon Intron Exon GT AG GT AG 3 Sestřih mrna Transkriptom: 5 Exon Exon Exon 3

58 Translace - proteosynthesa Probíhá na ribosomech Mechanismus u všech organismů prakticky stejný Směr N-konec C-konec Překlad z jazyka basí do jazyka aminokyselin: Genetický kód úkol: Ze 4 písmen je třeba vytvořit 20 slov : 4 2 = = 64 Dešifrován pomocí syntetických polynukleotidů: poly U polyphe

59 Tripletový Nepřekrývá se Degenerovaný, pouze trp a met jeden kodon, ostatní více (synonyma) Většina synonym se liší basí na třetí pozici Degenerace minimalizuje vliv mutací záměna basí neznamená vždy záměnu AK (Ile, Leu) Počet kodonů koreluje s četností výskytu AK v proteinech Pouze tři nemají smysl - stop! Iniciace start kodon Met Téměř univerzální, výjimky u protozoí a mitochondrií (vlastní sada trna) Vlastnosti genetického kódu

60 Proteosynthesa probíhá na ribosomech: rrna - 80% buněčných RNA Ribozymy 25% sušiny E.coli S = Svedbergův koeficient míra rychlosti sedimentace při centrifugaci

61

62 Base aminokyselina

63 Vazba AK na trna - aminoacyl trna synthetasa (ligasa) sumárně: AK + trna + ATP aminoacyl trna + AMP + PPi Opravný mechanismus hydrolasová aktivita některých aminoacyl trna synthetas (thr x val)

64 Iniciace

65 Elongace růst peptidového řetězce Energetická bilance aktivace AK ekv. 2 ATP elongace 2 GTP Terminace stop kodon, Rf faktor

66 Proteosynthesa -shrnutí

67 Exprese genu u prokaryot a eukaryot - shrnutí

68 Postranslační modifikace proteinů fosforylace glykosylace myristoylace N-glykosidická vazba - Asn O-glykosidická vazba - Ser a Thr

69 Posttranslační úpravy proteinů - štěpení Doprava na místo určení (targeting) signální sekvence pre- Vznik biologicky aktivní formy z pro formy Příklad - insulin

70

71 Regulace genové exprese Konstitutivní geny - kontinuální transkripce síla promotoru Indukovatelné a reprimovatelné geny Transkripce a postranskripční procesy Degradace RNA Translace Degradace proteinů Regulace převážně na úrovni iniciace translace Příklad: lac operon

72 Regulace genové exprese Operonová teorie: + regulátor

73 lac operon E.coli Kultivace v mediu s glc Při nedostatku glc náhrada laktosou

74 Genové technologie (inženýrství) Manipulace s genomem a s tím související technologie PRO nejoptimističtější scénář: Zvýšení nutriční hodnoty potravin Boj s chorobami Výživa třetího světa Snížení spotřeby pesticidů PROTI nejpesimističtější scénář: Zvýšení úmrtnosti díky alergickým reakcím Nevratné zamoření životního prostředí

75 Genové technologie (inženýrství) Oblasti využití: Sekvenování celých genomů - tvorba DNA knihoven Transkriptomika - Proteomika - jak se geny realizují v dané fyziologické resp. pathologické situaci Synthesa určité bílkoviny jiným organismem (insulin, chymosin) Proteinové inženýrství (synthesa upravených bílkovin, cílené mutace) Klonování organismů - produkce geneticky identických populací organismů, ale také tvorba kopií DNA Genetická modifikace organismů - vpravování cizích genů do organismu, potlačení exprese vlastních genů

76 Technologie rekombinantní DNA Amplifikace DNA pomocí plasmidů Základ genových manipulací: Plasmid vektor Restrikční endonukleasy

77 Restrikční endonukleasy

78 Příprava plasmidu (vektor) rekombinantní DNA

79 Selekce plasmidů nesoucích vloženou DNA 1. Vhodný plasmid (resistence k amp a tet 2. Štěpení restrikčními endonukleasami 3. ligace insertu 4. Transfekce buněk 5. Selekce buněk nesoucích plasmid s insertem

80 DNA knihovny, YAC, BAC fragmenty DNA Chromosom mrna cdna Reversní Transkriptasa 1) Reversní transkriptasa: RNA Dependentní DNA Polymerasa 2) Každý gen je nejméně jednou zastoupen v DNA knihovně

81 Genové technologie (inženýrství) Oblasti využití: Sekvenování celých genomů - tvorba knihoven Proteomika - jak se geny realizují v dané fyziologické resp. pathologické situaci Synthesa určité bílkoviny jiným organismem (insulin, chymosin) Proteinové inženýrství (synthesa upravených bílkovin, cílené mutace) Klonování organismů Genetická modifikace organismů - vpravování cizích genů do organismu, potlačení exprese vlastních genů

82 Instead of putting the foreign DNA into a bacterium, put it into a farm animal that can be milked so that the factor will be in he milk. Genetically modified organisms

83 Genové technologie (inženýrství) Oblasti využití: Sekvenování celých genomů - tvorba knihoven Proteomika - jak se geny realizují v dané fyziologické resp. pathologické situaci Synthesa určité bílkoviny jiným organismem (insulin, chymosin) Proteinové inženýrství (synthesa upravených bílkovin, cílené mutace) Klonování organismů Genetická modifikace organismů - vpravování cizích genů do organismu, potlačení exprese vlastních genů

84 Konvenční křížení versus genové technologie škůdce Vložit do jiné rostliny Pomalý přirozený výběr resistentních rostlin škůdce škůdce Může trvat mnoho generací rychle nepřirozeně vedlejší účinky? Isolace genu resistence

85 Genetické úpravy rostlin Buněčná kultura Buňka nesoucí příslušný gen DNA A single gene Rostlinná buňka Rekonstrukce rostliny transformace Transgenní rostlina Dělení buněk

86 Studium funkce genů SIGnAL- SALK Institute Genomic Analysis Laboratory T-DNA SALK lines resource for systematic genome-wide functional screens, a "phenomeready" genome, Up today lines, representing individual genes are available Agrobacterium tumefaciens

87 Transkriptom Příprava cdna

88 DNA mikročipy - analýza exprese genů Microarrays detect gene interactions: 4 colors: Green: high control Red: High sample Yellow: Equal Black: None Problem is to quantify image signals

89 Proteomika

90 A toto je realita

91 Proteom:

92 Studium procesů probíhajících v živých organismech DNA Genom Transkripce Translace Transkriptom DNA array Vnější prostředí Proteiny Biochemické procesy Proteom 2D MS Vnější projevy Metabolom, Fyziom HPLC

93 Reversní genetika studium funkce genů Příprava cdna