Replikace, transkripce a translace

Transkript

1 Replikace, transkripce a translace

2

3

4 Pravděpodobnost zařazení chybné báze cca 1:10 4, reálně 1:10 10 ; Proč? Výběr komplementární base je zásadní pro správnost mezigeneračního předávání genetické informace (zabránění nadbytečného vzniku mutací). DNA-polymerasa kromě funkce polymerační i funkci opravnou: -v případě, že se na rostoucí 3 -konec připojí nekomplementární base, DNA-polymerasa ji rozpozná a okamžitě hydrolyticky odstraní

5

6 Replikace

7 Transkripce

8

9

10 Posttranskripční modifikace RNA

11 U eukaryot - důvod existence intronů nejasný Animace transkripce:

12

13

14

15 Aktivace aminokyselin a vazba na trna Mechanismus působení aminoacyl-trna-ligasy

16 Iniciace, elongace a terminace Translace

17 Translace Elongační fáze translace Sumární rovnice: (AK)n-tRNA + AK-tRNA (AK)n+1-tRNA + trna + energie z GTP

18 Extrémní energetická náročnost translace - na prodloužení řetězce o zbytek 1 AK celkem ekv. 4 jebotek ATP (ekv. 2 pro aminoacyl t-rna + 2 GTP) Uvádí se, že rostoucí bakteriální buňky využívají kolem 90 % energie, získávané katabolickými procesy, právě pro translaci.

19 Translace: Posttranslační modifikace Vznikem polypeptidového řetězce syntéza funkční bílkoviny obvykle nekončí. Téměř vždy následují ještě různé úpravy chemické struktury, které nazýváme posttranslační modifikace, někdy též potranslační úpravy (viz kovalentní modifikace proteinů).

20

21 Regulace genové exprese Význam: Kompletní genom v každé buňce; mnoho kódujících určité proteiny - až několik desítek tisíc (u eukaryot). Buňka však v daný okamžik nikdy nepotřebuje produkty exprese všech genů, tedy všechny kódované proteiny. -většina buněk mnohobuněčných organismů obsahuje stejný genom, přičemž buňky jednotlivých tkání se vzájemně liší -heterotrofní mikroorganismus geneticky vybaven pro zracování různých organických živin; ovbykle zdaleka ne všechny má v danou chvíli k dispozici; proč by měl syntetizovat enzymy které nepotřebuje?

22 Operon je specifický úsek genetického kódu (molekuly DNA) prokaryotického organizmu, který obsahuje více genů, ale funguje jako jedna transkripční jednotka (geny bývají transkribovány společně). Společná je také regulace transkripce všech genů z celého operonu. Např.: Lac-operon (Nobelova cena) Lac-operon - tři strukturní geny (lac Z, lac Y a lac A) - zajišťuje využití laktosy u bakterií Escherichia coli. Laktosa je,, který musí být nejdříve transportován do buňky specifickou permeasou (produkt genu lacy) a poté rozštěpen specifickou glykosidasou (gen lacz). Souvislost mezi proteinem, kódovaným genem lac A, a zpracováním laktosy, není dosud jasná.

23 Transkripce může být zablokována vazbou represorové bílkoviny na regulační oblast O. Není-li laktosa přítomna, represorová bílkovina je na regulační oblast navázána, je-li však přítomna bílkovina ji naváže, čímž ztrácí afinitu k regulační oblasti DNA; pro RNA-polymerasu se tak otvírá cesta od promotoru (P lac) ke strukturním genům a k jejich transkripci. -pokud i glukosa, proč transport laktosy a její hydrolýza? pohodlnější žít ze spotřeby glukosy. Neníli přítomna glukosa - zvyšení koncentrace camp, který se váže na tzv. catabolite activator protein (CAP) a vyvolá u něj změnu konformace, což mu umožní navázat se na regulační oblast CAP; následně se změní i konformace DNA a transkripce genů, operonu začíná naplno.

24 -schopnost v pravou chvíli syntetizovat potřebné proteiny souvisí se všemi zásadními adaptačními fyziologickými procesy: přizpůsobení se podmínkám (teplota); reakce na stresy; i syntéza specifických PL -zvýšení nebo snížení syntézy určitého proteinu je základním krokem hormonální regulace. V případě, kdy hormony nevstupují do buněk, mohou egulovat expresi genů prostřednictvím regulačních kaskád, začínajících membránovými receptory - mechanismus genom statický x proteom dynamický pozn. proteomika

25 Genové technologie (nahlédnutí) Manipulace s genomem (a související technologie) -PCR -sekvenování (projekt "lidský genom") -genové inženýrství (synthesa určité bílkoviny jiným organismem) - syntéza požadovaných proteinů (expresní systém) -proteinové inženýrství (cílená mutace) -klonování organismů (živočichové i rostliny, GMO) -hybridomové technologie

26 Polymerázová řetězová reakce (PCR): Chceme např. pracovat s určitým úsekem lidské DNA kódujícím jednu bílkovinu (jeden gen) Umíme připravit DNA: po homogenizaci buněk Lidská DNA však obsahuje asi genů (+ kromě toho cca 10 x tolik dalších sekvencí) Potřebujeme jen relativně krátký úsek v mnoha kopiích

27 Schéma PCR 1. Denaturace, 2. Nasedají pimery, 3. Syntéza DNA

28 PCR objevil Kary B. Mullis, když pracoval pro Cetus Corporation Od Cetusu -obdržel bonus ve výši USD x Firma technologii prodala firmě Roche za USD Mullis sám za vynález PCR obdržel v roce 1993, deset let po nápadu na cestě, Nobelovu cenu za chemii. K syntéze nového vlákna DNA - nejčastěji termostabilní DNA polymeráza z bakterie Thermus aquaticus (Taq polymeráza) PCR - v termocykleru, během několika sekund dokáže zvýšit nebo snížit teplotu o několik desítek stupňů Celsia

29 Sekvenování DNA Sangerova dideoxymetoda sekvenování krátkých úseků (asi 500 bazí) využívá vlastnosti speciálních nukleotidů - 2', 3' dideoxyribonukleotidtrifosfátů. Tyto nukleotidy (ddatp, ddctp, ddgtp a ddttp) nemají na 3' uhlíku ribosy OH skupinu, z čehož plyne, že na tento konec již nemůže být žádný další nukleotid navázán. Vyhodnocení pomocí elektroforézy

30 PROJEKT LIDSKÝ GENOM aneb Jak určit pořadí deoxynukleotidů? 1983: genová knihovna (rozčlenění genu na "použitelné fragmenty") 1990: začátek systematické mezinárodní spolupráce 1990: formulace cílů: - identifikovat všech genů (je jich méně ) - určit kompletní sekvenci ( deoxynukleotidů) - všechna data uložit a vypracovat metody jejich analysy - řešit otázky etické, legální a společenské

31 Lidský genom Publikován 2001

32 Lidský genom 3,2 mld párů bází genů Velký podíl opakujících se sekvencí (48 %) Virové sekvence 5 % Funkce více než 50 % identifikovaných genů neznámá Zveřejňován na databázích na internetu Databáze HGP (Human Genom Project) a databáze Celery

33 První přečtené genomy Moucha octomilka (Drosophila melanogaster) Huseníček rolní (Arabidopsis thaliana) Hlístice (Caenorhabditis elegans)

34 Exprese rekombinantních proteinů -proces, při kterém můžeme pomocí různých expresních systémů vytvořit protein odvozený od konkrétního genu Vložení úseků do vhodného plasmidu

35 Konstrukce genomové knihovny

36 PROTEINOVÉ INŽENÝRSTVÍ změny struktury určitých bílkovin; proč? enzymy: zvýšená stabilita, možnost imobilizace, změna ph-optima farmakologie: změny působení hormonů (snížení vedlejších účinků) věda: identifikace funkčních skupin...

37 G.Köhler a C.Milstein (1975) HYBRIDOMOVÉ TECHNOLOGIE buňky produkující určitou bílkovinu + buňky (myelomu) hybridní buňky (myelom, hybridom) polyethylenglykol Produkce monoklonálních protilátek hybridomovou technologií

38 HYBRIDOMOVÉ TECHNOLOGIE využití: příprava monoklonálních protilátek použití monoklonálních protilátek: imunoafinitní chromatografie imunodiagnostika cílený transport léčiv výzkum (mapování povrchů bílkovin)

39

40 Etické problémy genových technologií USA a Británie - pojišťovny nesmějí vyžadovat genetické vyšetření předem. UNESCO: nikdo nesmí být diskriminován kvůli svému genotypu (1997)

41 PROTEOMIKA Jak se geny realizují (exprimují) v dané fysiologické a pathologické situaci? dvojrozměrná elektroforesa, hmotnostní spektrometrie MALDI TOF, LC-Q-TOF

42 GENOVÉ INŽENÝRSTVÍ příklad: Jak vyrobit lidský protein v bakterii? 1. Získat cdna (komplementární DNA) našeho proteinu - získat mrna reversní transkripce cdna - synthesa in vitro automatické synthesátory synthesa na pevné fázi zejména synthesa primerů (na objednávku) zablokování reaktivních skupin, aktivace fosfátové skupiny

43 GENOVÉ INŽENÝRSTVÍ 2. vložit do vhodného expresního vektoru (plasmid, virus) výkonný promotor, selekční marker (rezistence proti antibiotikům, fluoreskující protein...) 3. vnesení do bakterie (recipient) 4. exprese (vhodné podmínky - podle promotoru, nadprodukce) (problém posttranslačních modifikací) 5. detekce (ELISA, enzymová aktivita...) 6. isolace produktu (všemi prostředky, inklusní tělíska)

44 Využití plasmidů 1. vložit úseky do vhodného plasmidu (genová (genomová) knihovna (banka)) (universální plasmid - "sekvenační") 2. vnesení rekombinantní DNA do vhodného akceptoru (E. coli) (elektroporace nebo tepelný šok) 3. selekce, vytřídění jednotlivých klonů 4. namnožení (kultivace) 5. isolace plasmidové rekombinantní DNA 6. sekvenace 7. kompletace celého genomu (překrývající se úseky) 8. analysa (nalézt jednotlivé geny, otevřené čtecí rámce - ORF, introny

45 Namnožení materiálu pro další biotechnologické metody, jako je: Sekvenování DNA Analýza genů Vnášení mutací do vzorků Diagnostika infekčních nemocí Zjišťování genetických nemocí Identifikace osob - kriminalistika

46 KLONOVÁNÍ ORGANISMŮ -klonování organismů - pěstování orgánů (kmenové buňky) - geneticky modifikované organismy (GMO) - odolnost proti škůdcům (méně pesticidů) - lepší využití živin (méně hnojiv) - zvýšení trvanlivosti (více než 1/2 ovoce a zeleniny se zkazí)

47 Selekce, vytřídění jednotlivých klonů

48 Rozdělení genomu na přijatelně dlouhé úseky - náhodně (ultrazvuk) - cíleně (restrikční endonukleasy) (ochrana mikroorganismů před cizími geny, palindromní sekvence) Označení enzymu Eco RI Hind III Hpa II Pvu II Sma I Bakteriální zdroj Escherichia coli Haemophilus influenzae Hemophilus influenzae Proteus vulgaris Serratia marcescans Rozpoznávaná sekvence a místo štěpení 5'-G AATTC- -C TTAA G-5' 5'-A AGCT T- -T TCGA A-5' 5'-C CG G- -G GC C-5' 5'-CAG CTG- -GTC GAC-5' 5'-CCC GGG- -GGG CCC-5'