Cíle: G R A M P O Z I T I V N Í PLAZMAKOAGULÁZAPOZITIVNÍ STAFYLOKOKY

Transkript

1 Praktikum č. 13: Mikrobiologická diagnostika veterinárně významných zástupců rodů Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Micrococcus a Kocuria. Diagnostika infekčních mastitid skotu. Cíle: 1. Seznámit se s morfologií a kultivačními vlastnostmi veterinárně významných zástupců uvedených rodů. 2. Naučit se obecné postupy bakteriologické diagnosticky infekcí vyvolaných stafylokoky a streptokoky. G R A M P O Z I T I V N Í K O K Y Čeleď: Micrococacceae Rod: Micrococcus saprofyté kůže savců, vyskytují se též v půdě a prachu Rod: Staphylococcus Tabulka č. 21: Diferenciace rodů Staphylococcus a Micrococcus Vlastnost Micrococcus Staphylococcus fermentace glukózy - + růst v přítomnosti - + furazolidonu profil kolonií vypouklé ploché hemolýza - Variabilní (upraveno pro výuku) Staphylococcus aureus PLAZMAKOAGULÁZAPOZITIVNÍ STAFYLOKOKY Vyskytuje se u zvířat a člověka na kůži a sliznicích, jako potencionální patogen může vyvolávat akutní a chronické hnisavé záněty všech orgánových systémů. Jsou to zejména infekce ran, hnisavé záněty sliznic, abscesy, pyodermie, osteomyelitídy, mastitídy, septikémie, enterotoxinogenní kmeny bývají příčinou alimentárních intoxikací člověka. Staphylococcus hyicus Saprofyt a epifyt kůže prasat, který vyvolává nakažlivou osutinu selat (exudativní epidermitis). 84

2 Staphylococcus intermedius Saprofyt a epifyt kůže masožravců, který může vyvolat pyodermie, otitídy, hnisavé infekce psů a koček. Staphylococcus delphini Hnisavé kožní léze u delfínů PLAZMAKOAGULÁZANEGATIVNÍ STAFYLOKOKY Staphylococcus chromogenes Saprofyt a epifyt kůže prasat a drůbeže. Může být ojeďiněle původcem klinických a subklinických mastitid skotu. Staphylococcus epidermidis Saprofyt a epifyt kůže zvířat, který je méně patogenní druh než S.aureus, může vyvolat hnisavé infekce ran psů a koní. Staphylococcus saprophyticus Nepatogenní druh, který se může izolovat z různých vzorků animálního původu. Další druhy: S.arlattae, S.auricularis, S.capitis, S.caprae, S.carnosus, S.caseolyticus, S.cohni, S.equorum, S.felis, S.gallinarum, S.heaemolyticus, S.hominis, S.kloosii, S.lentus, S.lugdunensis, S.muscae, S.pasteuri, S.piscifermentans, S.pulvereri, S.saccharolyticus, S.schleiferi, S.sciuri, S.simulans, S.vitulus, S.warneri, S.xylosus. DIAGNOSTIKA Vyšetřovaný materiál. K vyšetření zasíláme změněné tkáně, hnis, stěry a výtěry, mléko a jiné potraviny. Stafylokoky přežívají zaschnutí, proto vzorky pro tato vyšetření (tampony) nemusíme chránit v transportním médiu. Přímé mikroskopické vyšetření. V barvených preparátech hledáme grampozitivní koky uskupené v hroznech a balíčcích. Kultivační vyšetření. Vzorky kultivujeme přímo na MPKA nebo vhodná selektivní média, např. manitolový slaný agar, Baird-Parkerův agar (žloutkový agar s teluričitanem draselným, glycinem a pyruátem sodným), CNA agar (s kyselinou nalidixinovou a kolistinem). Pro zvýšení záchytnosti stafylokoků vzorky pomnožujeme v živném bujonu nebo tekutých selektivních půdách (slaný bujon, manitolový slaný bujon, CNA bujon) 24 hodin při 37 o C, pak subkultivujeme na MPKA nebo selektivní pevná média. Na MPKA stafylokoky tvoří ploché pigmentované kolonie o průměru 3-4 mm často se zónou hemolýzy. Identifikace suspektních kultur je založena na hodnocení morfologie kolonií, tvorby katalázy a mikroskopii. Biochemické vlastnosti hodnotíme při použití komerčně vyráběných mikrotestů (STAFY test fy Lachema). Další doplňující testy a znaky k identifikaci stafylokoků jsou plazmakoaguláza, nukleázy, hyaluronidáza, rezistence na novobiocin, typizace hemolyzinů. 85

3 Tabulka č. 22: Rozlišení veterinárně významných stafylokoků Vlastnost S.aureus S.hyicus S.intermedius S.epidermidis Hemolýza + v + - Manitol (aerobně) Anaerobně Plazmakoaguláza + v + - Hyaluronidáza Rezistence na novobiocin (upraveno pro výuku) S.aureus se může dále rozlišovat na biotypy, což má význam zejména pro potřeby epidemiologie. Při podezření na alimentární intoxikace člověka izolujeme stafylokoky z potravin a detekujeme tvorbu enterotoxinů. Výskyt enterotoxínů předpokládáme, je-li koncentrace stafylokoků mezi 10 5 a 10 6 CFU. g -1. Enterotoxíny jsou stabilnější než stafylokoky, proto nízká koncenterace nebo negativní nález stafylokoků nevylučuje přítomnost enterotoxínů v potravině. Rod: Streptococcus S. agalactiae původce katarálních chronických masitíd krav často kolonizuje sliznice faryngu a střeva skotu je zjišťován rovněž v tkáních tonzil prasat, nutrií je izolován i z urogenitálního traktu člověka (u novorozenců může vyvolat celkové infekce a meningitídy) DIAGNOSTIKA Vyšetřovaný materiál. K vyšetření zasíláme vzorky mléka, tkáně, stěry sliznic. Přímé mikroskopické vyšetření. V barvených preparátech hledáme řetízky grampozitivních koků. Kultivační vyšetření. Vzorky kultivujeme přímo na MPKA nebo Edwardsův agar, případně k izolaci použijeme médium s pranými ovčími erytrocyty, stafylokokovým betatoxinem a antibiotickým suplementem. Pomnožení vzorku se provádí v Todd-Hewitově bujonu nebo SBM bujonu. Naočkované půdy inkubujeme aerobně při 37 o C po dobu h. Získané kultury předběžně identifikujeme CAMP testem. Z biochemických testů jsou pro diferenciaci významné hydrolýza hippurátu sodného (pozitivní) a hydrolýza eskulínu (negativní). Sérologickým vyšetřením se rozlišují polysacharidový antigen skupiny B a typové antigeny, k tomu se využívá koaglutinace a precipitace v gelu nebo v kapiláře. 86

4 Streptococcus dysgalactiae ( sérolog. sk. C) původce mastitíd skotu Streptococcus uberis původce mastitíd skotu, rovněž je izolován z kůže mléčné žlázy a sliznic skotu U koní se vyskytují následující druhy streptokoků: Streptococcus equi subsp. equi původce akutního onemocnění mladých koní tzv. hříběcí Streptococcus equi subsp. equisimilis Streptococcus equi subsp. zooepidemicus hnisavé infekce reprodukčních orgánů (sterilita klisen), pneumónie, mastitídy, septikémie paralýzy starších hříbat latentní infekce sliznic U prasat se vyskytují následující druhy streptokoků: Streptococcus suis (sérol. sk. D, R, S) původce septikémií a meningoencefalitíd selat, ojediněle jsou zjišťovány artritídy, pneumónie a endokarditídy, sérotyp 2 může vyvolávat i meningitídy lidí (ošetřovatelé prasat, řezníci) Streptococcus porcinus ( sérol. Sk. E, P, U, V) mastitídy, septikémie, lymfadenitídy prasat U psů se vyskytuje: Streptococcus canis ( sérol. sk. G) tonzilitídy, metritídy, mastitídy, otitídy, septikémie štěňat Další druhy streptokoků: S.acidominimus, S.adjacens, S.alactolyticus, S.anginosus, S.bovis, S.constellatus, S.cricetus, S.crista, S.defectivus, S.downei, S.equinus, S.ferus, S.gordonii, S.iniae, S.intermedius, S.intestinalis, S.macacae, S.mitis, S.mutans, S.oralis, S.parasanguis, S.parauberis, S.phocae, S.pleomorphus, S.pneumoniae, S.pyogenes, S.rattus, S.salivarius, S.sanguis, S.shiloi, S.sobrinus, S.vestibularis. Rod: Enterococcus Zástupci rodu se vyskytují v gastrointestinálním aparátu člověka, zvířat a v prostředí znečištěném fekáliemi. Jsou považovány za indikátory fekálního znečištění prostředí, vody a potravin. Přehled druhů: E.avium, E.casseliflavus, E.cecorum, E.dispar, E.durans, E. faecalis, E. faecium, E.gallinarum, E.hirae, E.malodoratus, E.mundtii, E.pseudo-avium, E.raffinosus, E.sacharolyticus, E.seriolicida, E.solitarius. 87

5 DIAGNOSTIKA STREPTOKOKŮ (obecně) Vyšetřovaný materiál: mléko, stěry sliznic, výtoky, hnis, změněné tkáně, potraviny. Přímé mikroskopické vyšetření otiskových preparátů a roztěrů barvených podle Grama, nebo metylenovou modří. V preparátech nacházíme grampozitivní koky nebo kokobacily. Kultivační vyšetření je založeno na přímé kultivaci na MPKA, MPKA s antibiotickým suplementem (kys.nalidixinová, polymyxin B, neomycin), Edwardsův agar. Vzorky pomnožujeme v Todd-Hewitově bujonu nebo selektivních bujonech (SBM bujon). Naočkované půdy inkubujeme h při 37 o C. Identifikace se provede podle následujících znaků: hodnocení morfologie kolonií (typ hemolýzy) CAMP test při identifikaci S.agalactiae identifikace čisté kultury sérologické určení skupinového antigenu (koaglutinace) a zařazení do sérologické skupiny biochemická aktivita (STREPTO test fy Lachema) Diferenciace enterokoků: růst při 45 o C růst v MPB s 6 % NaCl růst na žlučovém agaru Rod: Melissococcus M. pluton původce evropské hniloby včelího plodu Rod: Peptostreptococcus P. indolicus potencionální původce mastitid skotu Úkol: Zakreslete výsledky CAMP testu. Poznámky: 88