Cíle: NEPRAVIDELNÉ NESPORULUJÍCÍ GRAMPOZITIVNÍ TYČINKY. bakterie anaerobní nebo aerotolerantní (rody Bifidobacterium, Actinobaculum)

Transkript

1 Praktikum č. 16: Mikrobiologická diagnostika veterinárně významných zástupců rodů Actinomyces, Arcanobacterium, Actinobaculum, Mycobacterium, Rhodococcus, Nocardia, Dermatophilus. Barvení na acidorezistenci. Cíle: 1. Seznámit se s morfologií a kultivačními vlastnostmi veterinárně významných zástupců uvedených rodů. 2. Naučit se barvicí techniku k průkazu acidorezistentních bakterií. 3. Naučit se obecné postupy bakteriologické diagnosticky tuberkulózy zvířat a paratuberkulózy přežvýkavců. NEPRAVIDELNÉ NESPORULUJÍCÍ GRAMPOZITIVNÍ TYČINKY bakterie aerobní nebo fakultativně anaerobní (rody Corynebacterium, Actinomyces, Propionibacterium) bakterie anaerobní nebo aerotolerantní (rody Bifidobacterium, Actinobaculum) Rod: Corynebacterium Corynebacterium pseudotuberculosis saprofyt sliznic gastrointestinálního ústrojí ovcí, koz, skotu a koní jako potenciální patogen vyvolává kaseózní lymfadenitídy a pneumónie ovcí a koz, dále pak ulcerativní lymfangoitídy koní a skotu Corynebacterium renale latentní kolonizace genitálií skotu původce pyelonefritíd a cystitíd skotu Corynebacterium cystitidis saprofyt prepuciálního vaku zdravých býků a genitálií krav příležitostný původce hemoragických cystitíd a pyelonefritíd skotu Corynebacterium pilosum součást běžné mikroflóry vaginy krav příležitostný původce cystitíd a pyelonefritíd skotu 100

2 Corynebacterium kutscheri saprofyt horních dýchadel myší a krys jako potenciální patogen vyvolává pseudotuberkulózní změny v plicích a dalších parenchymatózních orgánech KORYNEBAKTERIÍ (obecně) Vyšetřovaný materiál: hnis, moč, stěry sliznic, změněné tkáně Přímá mikroskopie preparátů barvených podle Grama. Korynebakteria tvoří drobné, pleomorfní grampozitivní tyčinky, někdy zakřivené. Kultivační průkaz. Vzorky kultivujeme přímo na MPKA a paralelně pomnožujeme v tekutém médiu, po 24 h subkultivujeme na MPKA. Naočkované půdy inkubujeme aerobě při 37 o C po dobu h. Získané kultury identifikujeme podle jejich biochemické aktivity k jejímu stanovení využíváme komerčně vyráběných mikrotestů např. API Coryne. Tabulka č. 25: Biochemické vlastnosti vybraných korynebakterií a příbuzných druhů Vlastnost Arcanobacterium pyogenes Corynebacterium renale Corynebacterium pseudotuberculosis Rhodococcus equi β hemolýza + - (+) - želatináza ureáza redukce nitrátů kataláza (upraveno pro výuku ) Rod: Actinomyces A. israelii, A. odontolyticus, A. naeslundii tyto druhy se izolují z člověka A. bovis původce aktinomykózy skotu A. viscosus infekce psů, koček i prasat Rod: Arcanobacterium A. pyogenes komenzál sliznic zvířat, který vyvolává hnisavé infekce (abscesy, polyartritídy, pyémie, mastitídy skotu, endometritídy krav...) 101

3 Vyšetřovaný materiál: změněné tkáně, hnis, výtěry, výtoky, mléko... Přímá mikroskopie: grampozitivní tyčinky, rovné nebo mírně zakřivené, různé délky a šířky, řadí se v párech nebo v podobě písmene Y a T, palisády, řetězce. Kultivační průkaz. Vzorky kultivujeme na MPKA připravený z mozkosrdcové infuze (BHI). Naočkované půdy inkubujeme anaerobně při 37 o C po dobu 2-5 dnů (A. pyogenes aerobní inkubace). Čisté kultury identifukujeme podle jejich biochemické aktivity. Vyšetřovaný materiál: výtoky, močový sediment. Přímá mikroskopie :!!! imunofluorescence, G+ pleomorfní tyčinky. Kultivační průkaz. Vzorky kultivujeme na MPKA, který inkubujeme za anaerobních podmínek po dobu 3-5 dnů. Rod: Actinobaculum koryneformní anaerobní bakterie, které na krevním agaru vytvářejí kolonie o průměru do 3 mm s lesklým centrem a matnými okraji. Z biochemické aktivity je významná pozitivní hydrolýza močoviny Actinobaculum suis epifyt prepuciální sliznice kanců původce cystitíd a nekrotických pyelonefritíd prasnic Rod: Propionibacterium G+ pleomorfní, nepohyblivé tyčinky vyskytují se v mléčných produktech, hlavně v tvrdých sýrech Rod: Bifidobacterium G+ anaerobní, krátké, tenké a pravidelné tyčinky součást mikroflóry střeva člověka a zvířat Čeleď: Mycobacteriaceae Rod: Mycobacterium M Y K O B A K T É R I A Mykobakteria jsou grampozitivní pleomorfní tyčinky, jejichž charakteristickým znakem je acidorezistence (barví se podle Ziehl - Neelsena). Rod zahrnuje řadu druhů od obligátně patogenních až po saprofytické. 1. Obligátně patogenní původci tuberkulózy a lepry člověka 102

4 M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. leprae 2. Atypická mykobakteria (mohou být fakultativně patogenní) Dnes má klasifikace těchto mykobakterií podle RUNYONa (rychlost růstu a pigmentace kolonií) spíše historický význam: a) fotochromogenní - pomalý růst, ve tmě tvoří nepigmentované kolonie, které na světle při další inkubaci zřetelně zežloutnou. M. marinum - tuberkulóza ryb a chladnokrevných živočichů M. kansasii - saprofyt b) skotochromogenní - pomalý růst, i ve tmě tvoří výrazně pigmentované kolonie M. scrofulaceum - saprofyt c) nonchromogenní - pomalu rostoucí a nepigmentované kolonie M. avium subsp. avium - původce tuberkulózy ptáků M. intracellulare - saprofyt půdy a vody, izoluje se z tuberkulózních změn v mezenteriálních mízníchuzlinách prasat M. terrae, M. triviale - saprofyté půdy a vody d) rychle rostoucí - vyrůstají do 5 dnů při teplotě o C M. fortuitum, M.phlei, M. smegmatis - saprofyté, kteří mohou příležitostně vyvolat i některé infekce (mastitídy, dermatitídy) 3. Původce tuberkulózy ptáků M. avium komplex - původce tuberkulózy ptáků (kromě papoušků), ojediněle prasat, skotu 4. Ostatní oblikátně patogenní mykobakteria M. avium subsp. paratuberculosis - obligátní patogen, který vyvolává paratuberkulózu přežvýkavců, zejména skotu M. lepraemurium - původce lepry hlodavců a koček MYKOBAKTERIÍ (obecně) Vyšetřovaný materiál: změněné tkáně, spůtum, mléko... Přímé mikroskopické vyšetření otiskových preparátů obarvených podle Ziehl-Neelsena (viz. barvicí metody), preparát prohlížíme minimálně 5 až 10 minut. Barvení acidorezistentních mikroorganismů Mykobakteria a některé druhy aktinomycet (podobně i spóry) přijímají lépe zahřátá barviva, která si podržují i při odbarvování kyselinami, alkoholem či jinými prostředky. Podle této schopnosti se tato skupina bakterií označuje někdy jako acidorezistentní nebo acidoalkoholostabilní. Podstata této vlastnosti nebyla zatím zcela objasněna, ale důležitou 103

5 úlohu zde bude hrát přítomnost mykolových kyselin v buněčné stěně těchto bakterií. Nejpoužívanější metodou na stanovení acidorezistence je barvící postup podle ZIEHL- NEELSONA. Postup: Preparát fixujeme plamenem, přelijeme konc. karbolfuchsinem a 3x během 5 minut zahříváme nad plamenem do výstupu par (barvivo se nesmí vařit a nesmí vyschnout!) Slijeme barvivo a preparát odbarvíme kyselým alkoholem (musí odtékat čistý alkohol!). Preparát opláchneme vodou a dobarvíme 1% vodným roztokem metylénové modři nebo malachitové zeleně (15-20 s.). Pak opláchneme vodou a osušíme. Karbolfuchsin zbarví acidorezistentní bakterie červeně na modrém nebo zeleném pozadí. Kultivační postup: Preparace vyšetřovaného materiálu. Asi 25g tkáně/výkalů po přidání 50 ml fyz. roztoku homogenizujeme ve třecí misce. Tekuté vzorky odstředíme při ot., minut. Dekontaminace. Homogenizovaný materiál nebo sediment smísíme s 4-6násobným množstvím kyseliny (3-6% H 2 SO 4 nebo HCl) a necháme stát min.. Neutralizace vzorku 4 % NaOH, pak odstředění min.. Sediment se kultivuje. Kultivace na vaječné půdy podle Petragnaniho nebo Löwenstein-Jensena Inkubace: aerobně při 37 o C 8 až 12 týdnů Identifikace kultur: 1. naočkované půdy se odečítají jedenkrát za týden a suspektní kultury se barví podle Z-N 2. pokud kutury vyrůstají do 5 dnů jedná se o rychle rostoucí mykobakteria 3. pomale rostoucí mykobakteria (>5 dnů) se diferencují podle morfologie kolonií a bichemické aktivity (akumulace niacinu, redukce nitrátů, produkce pirazinamidázy...) Tabulka č. 26: Biologický pokus - pozorovací doba 6-8 týdnů pokusné zvíře (způsob aplikace) M.tuberculosis M.bovis M.avium morče (s.c. 0,01mg) /- králík (i.v.0,01 mg) kur (i.v. 0,1 mg) Vysvětlivky: ++ generalizovaná infekce, + lokalizovaná infekce, - beze Alergenodiagnostika tuberkulinace. Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis původce paratuberkulózy (chronická enteritída) skotu, ovcí, koz a ostatních přežvýkavců inkubační doba onemocnění je několik let (2-6 let) Vyšetřovaný materiál: výkaly, stěry změněných sliznic, mezenteriální MU. 104

6 Přímé mikroskopické vyšetření otiskových preparátů barvených podle Ziehl-Neelsena. Při této metodě je uváděna pouze 30 % úspěšnost průkazu infikovaných zvířat. Kultivační průkaz: vyšetřovaný materiál se preparuje 5% kyselinou šťavelovou po dobu 30 minut při 37 o C a následně neutralizuje sodou. Preparovaný vzorek se kultivuje na média, která se obohacují extraktem z Mycobacterium phlei (mykobaktin). Naočkované půdy se aerobně při 37 o C až 8-12 týdnů. Nepřímý průkaz: RVK (90% spolehlivost u klinických infekcí, 30% spolehlivost u latentních) ELISA alergický intradermální test (johnin) NOKARDIOFORMNÍ BAKTÉRIE Bakterie této skupiny tvoří mycelium, které se rozpadá na tyčinkovité nebo kokovité formy. Rod: Nocardia saprofyté půdy, vody a symbionti některých členovců Patogenní druhy: Nocardia asteroides (celosvětové rozšíření) vyvolává nokardiózu, která probíhá u skotu ve formě akutních až chronických mastitíd, často vznikajících jako důsledek nesprávné léčby primárních mastitíd (iatrogenní vlivy) méně časté jsou aborty a celkové infekce skotu u psů a koček může tento mikroorganismus vyvolat séropurulentní pleuritídy v tropech se u skotu, psů a člověka může rozvinout kožní forma nokardiózy (granulomatózně-purulentní zánět podkoží a regionálních mízních uzlin) Vyšetřovaný materiál: hnis, změněné tkáně, mléko. Přímá mikroskopie: hledáme grampozitivní vlákna, tyčinky a koky, které se částečně barví jako mykobakteria acidorezistentně. Kultivační průkaz: Vzorky kultivujeme na krevní agar připravený z BHI nebo Sabouraudův agar. Půdy inkubujeme aerobně při o C po dobu 3-4 dnů. Nokardie vytvářejí bílé až oranžové kolonie voskovitého vzhledu, 1-2 mm v průměru, pevně ulpívající k médiu. Rod: Rhodococcus pleomorfní mikroorganismy tvaru koků, tyčinek i větveného mycelia mají společné antigeny s rody Corynebacterium, Mycobacterium a Nocardia 105

7 Rhodococcus equi saprofyt v půdě, komenzál střeva koní, skotu,ovcí a prasat je původcem bronchopneumonií hříbat, izoluje se rovněž z infekcí cervikálních a submandibulárních MU prasat Vyšetřované vzorky: výtěry, změněné MU, krevní sérum. Kultivační průkaz: R. equi vyrůstá na MPKA po h inkubace v koloniích pro které je charakteristická M-fáze růstu a narůžovělé zabarvení. Tvoří EQUI faktor, jehož účinek na ovčí erytrocyty je potencován do úplné hemolýzy exolátkami L. monocytogenes. Toho se využívá při identifikaci listerií. Z biochemických vlastností je typická tvorba ureázy a redukce nitrátů. K nepřímé diagnostice lze využít průkazu titru neutralizačních protilátek proti EQUI- faktoru v krevních sérech hříbat a v mlezivu klisen. Rod: Dermatophilus Dermatophilus congolensis Jsou to grampozitivní kokoidní bakterie, které vyvolávají u člověka a zvířat dermatitídy. Původce se množí v epidermis hostitele, pod vlivem oslabujících vlivů. Onemocnění se projevuje tvorbou vrstevnatých strupů a masivní exudací. Vyšetřovaný materiál: kožní seškraby. Přímá mikroskopie: hledáme vláknité formy, spóry. Kultivace: vzorky kultivujeme na MPKA. Půdy inkubujeme za mikroaerofilních až anaerobních podmínek po dobu 1-2 dny. Kolonie D.congolensis jsou šedožluté barvy, suché konzistence se zónou úplné hemolýzy. Mikroskopicky ověříme přítomnost vláknitých forem se spórami. Poznámky: 106