Průběžná zpráva. Institucionální podpora za rok 2015

Transkript

1 Průběžná zpráva Institucionální podpora za rok 2015 Finanční prostředky poskytnuté na Rozvoj výzkumné organizace byly uděleny rozhodnutím MZ č. 1 RVO-MOU/2015. Za Masarykův onkologický ústav předkládají: doc. MUDr. Marek Svoboda, Ph.D. náměstek pro vědu, výzkum a výuku prof. MUDr. Jan Žaloudík, CSc. ředitel MOÚ V Brně, dne

2 OBSAH strana 1. Úvod 3 2. Ekonomická část 6 Předběžné rozdělení IPO Přehled publikací a dalších výsledků Přehled projektů Výzkumná část Koncepční část Závěr 263 2

3 1. ÚVOD Věda a výzkum jsou významnou součástí práce odborníků Masarykova onkologického ústavu (MOÚ). Rok 2015 byl pro náš ústav v této oblasti opět rokem úspěšným. To dokazuje jak vysoký počet řešených projektů, tak i rozsáhlá tvůrčí a publikační aktivita zaměstnanců ústavu. Tohoto stavu by jistě nebylo možné dosáhnout bez finanční a technické podpory, kterou ústav pro tyto aktivity trvale poskytuje. Napomáhají tomu i prostředky institucionální podpory (dále jen IPO) na dlouhodobý koncepční vývoj výzkumné organizace, které získáváme ze státního rozpočtu prostřednictvím našeho zřizovatele. Přestože se v případě našeho ústavu jedná o relativně malou částku, Kč v roce 2015, je racionálně využívána. Podpora výzkumu v MOÚ z prostředků IPO je od roku 2012 realizována následujícím způsobem. Ze získané částky pro daný rok, se odečtou položky určené na režijní náklady a případné investice a přibližně 50 % ze zbývající části prostředků se automaticky vrací přímo tvůrcům výsledků vědecko-výzkumných projektů (VVP), kteří sami určují, k čemu je použijí, (prostředky IPO přiznávané tvůrcům) a druhá polovina prostředků se ponechá pro financování společných a nebo jiných potřebných aktivit v oblasti rozvoje vědy, výzkumu a výuky v MOÚ (ostatní prostředky IPO). Prostředky IPO přiznané tvůrcům VVP Až 50 % finančních prostředků z IPO, kterou MOÚ v daném roce získal, se automaticky vrací přímo tvůrcům výsledků vědecko-výzkumných projektů. Při rozdělování této části IPO mezi jednotlivé vědecké týmy/pracoviště MOÚ, jejichž členy jsou příslušní tvůrci, se postupuje na základě bodové hodnoty přiznané MOÚ za jejich výsledky v monitorovaném období, dle platné Metodiky hodnocení výsledků výzkumných organizací. Z takto přidělených prostředků IPO si tvůrci sami určí, jakou část chtějí použít na financování nákupu materiálu či služeb nebo na pokrytí osobních nákladů. Ostatní prostředky IPO Zbývající část se rozděluje do čtyř oblastí, které MOÚ považuje za nutné podporovat, aby byly vytvořeny podmínky pro vznik nových vědecko-výzkumných projektů a udrženy stávající 3

4 významné projekty a aktivity. O finanční prostředky v těchto programech se mohou ucházet jednotlivé výzkumné týmy, resp. jejich členové, a to prostřednictvím interních žádostí a/nebo vypsaných soutěží. Oblast 1. Program publikační podpory /PPP/. Oblast 2. Program NRVaV pro podporu výzkum (PPV) (včetně tzv. start-up grantů) Oblast 3. Program technnické podpory /PTP/ Oblast 4. Program podpory mobility /PPM/ Pokud se pro uvedené čtyři oblasti nevyužije možných 50 % prostředků IPO, rozdělí se zbylé prostředky mezi tvůrce výsledků tak, jak bylo popsáno výše /viz Prostředky IPO přiznané tvůrcům VVP). Bohužel, institucionální podpora, kterou naše organizace získává je velmi nízká na to, aby zajistila dostatečnou podporu pro projekty onkologického výzkumu. Zejména se nám nedostává prostředků na zajištění podpory akademických klinických studií, které často, podobně jako řada dalších výzkumných projektů, jsou víceleté. Na prostředcích IPO přitom nelze stavět dlouhodobou koncepci rozvoje výzkumu, neboť na jejich poskytnutí není právní nárok a dopředu nelze přesně odhadnout, jaká bude celková přidělená částka a zda bude případně poskytovatelem krácena. Navíc se zdá, že vlastní proces žádosti o IPO se stále více komplikuje a stává se z něj v podstatě grantová aplikace, ve které jsme nuceni si dopředu svázat ruce podrobným členěním navrhovaného rozpočtu, případně přesným určením pro směřování osobních výdajů. Z výše uvedeného vyplývá, že nemá-li výzkumná organizace zaručenou institucionální podporu na další rok a už vůbec ne na delší časové období, a nedokáže-li odhadnout její výši a musí-li se předem zavazovat k rozdělení prostředků do jednotlivých položek a subkategorií, nelze následně přidělené prostředky využívat k plánování ani krátkodobých ani dlouhodobých projektů a už vůbec ne k zajištění víceletých pracovních úvazků potřebných vědeckých a výzkumných pracovníků. V minulosti se nám přitom již několikrát vyplatila určitá flexibilita použití prostředků institucionální podpory, a to jak při nedostatku 4

5 prostředků při výpadku financování výzkumu v době nefunkčnosti IGA MZ ČR, tak při nečekaném objevení se zajímavého projektu či myšlenky hodné realizace. Právě i díky prostředkům IPO jsme byli schopni se důkladně připravit na vznik nové AZV a podat dostatečné množství kvalitních projektů. Důkazem toho je, že v první výzvě AZV VES2015 uspělo 42 % grantových žádostí podaných našimi zaměstnanci, přitom financováno bylo 24,7 % projektů přihlášených do soutěže. Koncept naší průběžné zprávy je následující. Po úvodu a ekonomické části prezentujeme publikační výsledky našich zaměstnanců, jejichž projekty, nebo oni samotní, byli podporováni z prostředků IPO. Všechny uvedené publikace jsou v plné textové podobě přílohou této průběžné zprávy. Následně uvádíme přehled a podrobný popis výzkumných projektů realizovaných týmy multioborové spolupráce, které v MOÚ působí, a týmy naší výzkumné základny RECAMO. Projekty jsou zřetelně rozdělené na: PROJEKTY FINANCOVANÉ VÝHRADNĚ Z PROSTŘEDKŮ IPO a PROJEKTY SPOLUFINANCOVANÉ Z IPO (prostředky IPO pokrývají výdaje na nové a dodatečné experimenty nebo slouží k financování výzkumných pracovníků zapojených do řešení projektu). U každého projektu je dle požadavků uvedena anotace, metody, cíle a plán pro rok 2015, případně další. Po výzkumné částí zprávy následuje koncepční část a závěr. Na závěr bychom rádi konstatovali, že se nám podařilo vytvořit takové principy rozdělování finančních prostředků IPO, o kterých jsme přesvědčeni, že i za výše uvedených podmínek, vedou k podpoře vzniku nových projektů, tak k udržení těch stávajících, a navíc dávají motivaci tvůrcům výsledků k jejich další práci. 5

6 2. EKONOMICKÁ ČÁST 6

7 7

8 8

9 Sken podepsaného dokumentu 9

10 Sken podepsaného dokumentu 10

11 11

12 12

13 PŘEDBĚŽNÉ ROZDĚLENÍ FINANCI IPO NA ROK 2016 KVALIFIKOVANÝ ODHAD V % 13

14 3. PŘEHLED PUBLIKACÍ A DALŠÍCH DRUHŮ VÝSLEDKŮ 14

15 Všechny zde uvedené publikace tvoří samostatnou přílohu Publikace pracovníků Masarykova onkologického ústavu v roce 2015 s institucionální podporou ZAHRANIČNÍ PUBLIKACE Články v impaktovaném časopise Č. CITACE PUBLIKACE IF 1 Andreotti G, Birmann BM, Cozen W, De Roos AJ, Chiu BC, Costas L, de Sanjosé S, Moysich K, Camp NJ, Spinelli JJ, Pahwa P, Dosman JA, McLaughlin JR, Boffetta P, Staines A, Weisenburger D, Benhaim-Luzon V, Brennan P, Costantini AS, Miligi L, Campagna M, Nieters A, Becker N, Maynadié M, Foretová L, Zheng T, Tricot G, Milliken K, Krzystan J, Steplowski E, Baris D, Purdue MP. A pooled analysis of cigarette smoking and risk of multiple myeloma from the international multiple myeloma consortium. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev Mar, 24(3), ISSN Bartošík, M., Koubková, L., Karban, J., Červenková Šťastná, L., Hodík, T., Lamač, M., Pinkas, J. and R. Hrstka. Electrochemical analysis of a novel ferrocene derivative as a potential antitumor drug. Analyst. 2015, 140, ISSN Bencsikova, B., Bortlicek, Z., Halamkova, J., Ostrizkova, L., Kiss, I., Melichar, B., Pavlik, T., Dusek, L., Valik, D., Vyzula, R. and L. Zdrazilova-Dubska. Efficacy of bevacizumab and chemotherapy in the first-line treatment of metastatic colorectal cancer: broadening KRAS-focused clinical view. BMC Gastroenterology. 2015, 15, 37. [10 p.] ISSN X 4 Bienertova-Vasku, J., Zlamal, F., Tomandl, J., Hodicka, Z., Novak, J., Splichal, Z., Ventruba, P., Thon, V. and A. Vasku. The presence of B-cell activating factor (BAFF) in umbilicalcord blood in both healthy and pre-eclamptic pregnanciesand in human breast milk. Journal of Reproductive Immunology. 2015, 109, ISSN Bojková, M., Dítě, P., Dvořáčková, J., Novotný, I., Floreánová, K., Kianička, B., Uvírová, M., Martínek, A. Immunoglobulin G4, autoimmune pancreatitis and pancreatic cancer. Dig Dis. 2015, 33(1), ISSN Blanco, I., Foretova, L. et al. [94 autorů]. Assessing associations between the AURKAHMMR-TPX2-TUBG1 functional module and breast cancer risk in BRCA1/2 mutation carriers. PLoS One. 2015, Apr 1, 10(4), e [18 p.] ISSN Bouchal, P., Dvořáková, M., Roumeliotis, T., Bortlíček, Z., Ihnatová, I., Procházková, I., Ho, J.T., Maryáš, J., Imrichová, H., Budinská, E., Vyzula, R., Garbis, S.D., Vojtěšek, B., Nenutil, R. Combined proteomics and transcriptomics identifies carboxypeptidase B1 and nuclear Factor κb (NF-κB) associated proteins as putative biomarkers of metastasis in low grade breast cancer. Mol Cell Proteomics. 2015, Jul, 14(7), ISSN ,125 4,107 2,365 2,815 2,181 3,234 6,564 15

16 Č. CITACE PUBLIKACE IF 8 Brychtova, V., Mohtar, A., Vojtesek, B., Hupp, T. Mechanisms of anterior gradient-2 regulation and function in cancer. Semin Cancer Biol. 2015, 33, Bulik, M., Kazda, T., Slampa, P. and R. Jancalek. The Diagnostic ability of follow-up imaging biomarkers after treatment of glioblastoma in the temozolomide era: Implications from proton MR spectroscopy and apparent diffusion coefficient mapping. BioMed Research International. 2015, 2015, ISSN Cefalu, S., Lena, A.M., Vojtesek, B., Musaro, A., Melino, G., Candi, E. TAp63gamma is required for the late stages of myogenesis. Cell Cycle. 2015, 14(6), Costas, L., Infante-Rivard, C., Zock. J-P., Van Tongeren, M., Boffetta, P., Cusson, A., Robles, C., Casabonne, D., Benavente, Y., Becker, N., Brennan, P., Foretova, L., Maynadie, M., Staines, A., Nieters, A., Cocco, P. and S. de Sanjose. Occupational exposure to endocrine disruptors and lymphoma risk in a multicentric European study. Br J Cancer Mar 31, 112(7), ISSN Delahaye-Sourdeix, M., Urayama, K.Y., Gaborieau, V., Veenstra, R., Foll, M., Chabrier, A., Benavente, Y., Nieters, A., Becker, N., Foretova, L., Maynadié, M., Staines, A., Smedby, K.E., Glimelius, I., Lightfoot, T., Cocco, P., Galan, P., Vatten, L.J., Duell, E.J., Kiemeney, L., Roman, E., de Sanjosé, S., Lathrop, M., Melbye, M., Brennan, P., Diepstra, A., van den Berg, A., Hjalgrim, H., Jarrett, R.F., McKay, J.D. A Novel risk locus at 6p21.3 for Epstein-Barr Virus-Positive Hodgkin Lymphoma. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev Dec, 24(12), ISSN Elez, E., Kocáková, I., Höhler, T., Martens, U.M., Bokemeyer, C., Van Cutsem, E., Melichar, B., Smakal, M., Csőszi, T., Topuzov, E., Orlova, R., Tjulandin, S., Rivera, F., Straub, J., Bruns, R., Quaratino, S., Tabernero, J. Abituzumab combined with cetuximab plus irinotecan versus cetuximab plus irinotecan alone for patients with KRAS wild-type metastatic colorectal cancer: the randomised phase I/II POSEIDON trial. Annals of Oncology. 2015, 26(1), Fedorko, M., Stanik, M., Iliev, R., Redova-Lojova, M., Machackova, T., Svoboda, M., Pacik, D., Dolezel, J. and O. Slaby. Combination of MiR-378 and MiR-210 Serum levels enables sensitive detection of renal cell carcinoma. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16(10), ISSN Fiala, O., Pesek, M., Finek, J., Topolcan, O., Racek, J., Minarik, M., Benesova, L., Bortlicek, Z., Poprach, A., Buchler, T. High serum level of C-reactive protein is associated with worse outcome of patients with advanced-stage NSCLC treated with erlotinib. Tumour Biol Dec, 36(12), ISSN Fraser, J.A., Worrall, E.G., Lin Y., Landre, V., Pettersson, S., Blackburn, E., Walkinshaw, M., Muller, P., Vojtesek, B., Ball, K., Hupp, T.R. Phospohomimetic mutation of the N-terminal lid of MDM2 enhances the polyubiquitination of p53 through stimulation of E2-ubiquitin thioester hydrolysis. J Mol Biol. 2015, 427(8), ,330 1,579 4,565 4,836 4,125 7,040 2,862 3,611 4,333 16

17 Č. CITACE PUBLIKACE IF 17 Healy, A.R., Houston, D.R., Remnant, L., Huart, A., Brychtova, V., Maslon, M.M., Meers, O., Muller, P., Krejci, A., Blackburn, E.A., Vojtesek, B., Hernychova, L., Walkinshaw, M.D., Westwood, N.J., Hupp, T.R. Discovery 1 of a novel ligand that modulates the protein protein interactions of the AAA+ superfamily oncoprotein reptin. Chem Sci. 2015, 6, Hezova, R., Kovarikova, A., Srovnal, J., Zemanova, M., Harustiak, T., Ehrmann, J., Hajduch, M., Svoboda, M., Sachlova, M. and O. Slaby. Diagnostic and prognostic potential of mir-21, mir-29c, mir-148 and mir-203 in adenocarcinoma and squamous cell carcinoma of esofagus. Diagnostic Pathology. 2015, 10, 42. [6 p.] ISSN Hsu, J-L., van den Boomen, D.J.H., Tomasec, P., Weekes, M.P., Antrobus, R., Stanton, R.J., Ruckova, E., Sugrue, D., Wilkie, G.S., Davison, A.J., Wilkinson, G.W.G., Lehner, P.J. Plasma Membrane Profiling Defines an Expanded Class of Cell Surface Proteins Selectively Targeted for Degradation by HCMV US2 in Cooperation with UL141. PLoS Pathog 2015;11(4):e Childs EJ, Foretova, L., et al. [62 autorů]. Common variation at 2p13.3, 3q29, 7p13 and 17q25.1 associated with susceptibility to pancreatic cancer. Nat Genet Aug, 47(8), ISSN Jorda, R., Schütznerová, E., Cankař, P., Brychtová, V., Navrátilová, J., Kryštof, V. Novel arylazopyrazole inhibitors of cyclin-dependent kinases. Bioorg Med Chem. 2015, 23, Kazda, T., Hardie, J. G., Pafundi, D. H. Kaufmann, T. J., Brinkmann, D. H., Laack, N. N. Evaluation of RANO response criteria compared to clinician evaluation in WHO grade III anaplastic astrocytoma: implications for clinical trial reporting and patterns of failure. J Neurooncol (1), ISSN X 23 Kazda, T., Pospisil, P., Vrzal, M., Sevela, O., Prochazka, T., Jancalek, R., Slampa, P. and N.N. Laack. Volumetric modulated arc therapy for hippocampal-sparing radiotherapy in transformed low-grade glioma: A treatment planning case report. Cancer Radiotherapie. 2015, 19(3), ISSN Keřkovský, M., Zitterbartová, J., Pour, L, Šprláková-Puková, A., Mechl, M. Diffusion tensor imaging in radiation-induced myelopathy. J Neuroimaging Sep-Oct, 25(5), ISSN Kocakova, I., Melichar, B., Kocak, I., Bortlicek, Z., Büchler, T., Dusek, L., Petruzelka, L., Kohoutek, M., Prausová, J., Finek, J., Mohelnikova-Duchonova, B., Vyzula, R. Bevacizumab with FOLFIRI or XELIRI in the first-line therapy of metastatic colorectal carcinoma: results from Czech Observational Registry. Anticancer Res Jun;35(6): Kocakova, I., Kocak, I., Spelda, S., Krejčí, E., Bencsiková, B., Jurečková, A., Vyzula, R., Bortlíček, Z., Strenková, J., Brabec, P. Long term experience of one center with targeted therapies consisting of imatinib mesylate and sunitinib malate in patients with unresectable or metastatic KIT positive gastrointestinal stromal tumors. Bratislava Medical Journal. 2015, 116(4), ISSN ,211 2,597 8,057 29,352 2,793 3,070 1,411 1,734 1,826 0,439 17

18 Č. CITACE PUBLIKACE IF 27 Koubkova, L., Vyzula, R., Karban, J., Pinkas, J., Ondrouskova, E., Vojtesek, B. and R. Hrstka. Evaluation of cytotoxic activity of titanocene difluorides and determination of their mechanism of action in ovarian cancer cells. Invest New Drugs Oct, 33(5), ISSN Krajsová, I., Arenberger, P., Lakomý, R., Kubala, E., Březinová, I., Poprach, A., Šťastný, M., Mužík, J., Melichar, B. Long-term Survival with Ipilimumab: Experience from a National Expanded Access Program for Patients with Melanoma. Anticancer Res Nov, 35(11), Kubackova, K., Melichar, B., Bortlicek, Z., Pavlik, T., Poprach, A., Svoboda, M., Lakomy, R., Vyzula, R., Kiss, I., Dusek, L., Prausova, J., Buchler, T.; Czech Renal Cancer Cooperative Group. Comparison of Two Prognostic Models in Patients with Metastatic Renal Cancer Treated with Sunitinib: a Retrospective, Registry-Based Study. Target Oncol Dec, 10(4), ISSN Kuglik, P., Kasikova, K., Smetana, J., Vallova, V., Lastuvkova, A., Moukova, L., Cvanova, M., Brozova, L. Molecular cytogenetic analyses of hterc (3q26) and MYC (8q24) genes amplifications in correlation with oncogenic human papillomavirus infection in Czech patients with cervical intraepithelial neoplasia and cervical carcinomas. Neoplasma (1), ISSN Lupini, L., Bassi, C., Mlcochova, J., Musa, G., Russo, M., Vychytilova- Faltejskova, P., Svoboda, M., Sabbioni, S., Nemecek, R., Slaby, O., Negrini, M. Prediction of response to anti-egfr antibody-based therapies by multigene sequencing in colorectal cancer patients. BMC Cancer Oct 27, 15, 808. [11 p.] ISSN Malhotra, J., Sartori, S., Brennan, P., Zaridze, D., Szeszenia-Dabrowska, N., Świątkowska, B., Rudnai, P., Lissowska, J., Fabianova, E., Mates, D., Bencko, V., Gaborieau, V., Stücker, I., Foretova, L., Janout, V., Boffetta, P. Effect of occupational exposures on lung cancer susceptibility: a study of geneenvironment interaction analysis. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev Mar, 24(3), ISSN Merhautova, J., Hezova, R., Poprach, A., Kovarikova, A., Radova, L., Svoboda, M., Vyzula, R., Demlova, R. and O. Slaby. MiR-155 and mir-484 are associated with time to progression in metastatic renal cell carcinoma treated with sunitinib. BioMed Research International. 2015, 2015, ISSN Mezl, M., Jirik, R., Harabis, V., Kolar, R., Standara, M., Nylund, K., Gilja, O. H. and T. Taxt. Absolute ultrasound perfusion parameter quantification of a tissuemimicking phantom using bolus tracking. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 2015, 62(5), ISSN Mlcochova, J., Faltejskova-Vychytilova, P., Ferracin, M., Zagatti, B., Radova, L., Svoboda, M., Nemecek, R., John, S., Kiss, I., Vyzula, R., Negrini, M. and O. Slaby. MicroRNA expression profiling identifies mir-31-5p/3p as associated with time to progression in wild-type RAS metastatic colorectal cancer treated with cetuximab. Oncotarget Nov 17, 6(36), ISSN ,919 1,826 4,00 1,865 3,362 4,125 1,579 1,512 6,359 18

19 Č. CITACE PUBLIKACE IF 36 Muller, D.C., Johansson, M., Zaridze, D., Moukeria, A., Janout, V., Holcatova, I., Navratilova, M., Mates, D., Midttun, Ø., Ueland, P.M., Brennan, P., Scelo, G. Circulating concentrations of vitamin B6 and kidney cancer prognosis: a prospective case-cohort study. PLoS One Oct 27, 10(10), e ISSN Obacz, J., Brychtova, V., Podhorec, J., Fabian, P., Dobes, P., Vojtesek, B., Hrstka, R. Anterior gradient protein 3 is associated with less aggressive tumors and better outcome of breast cancer patients. Onco Targets Ther Jun 24, 8, ISSN Obacz, J., Takacova, M., Brychtova, V., Dobes, P., Pastorekova, S., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of AGR2 and AGR3 in cancer: similar but not identical. Eur J Cell Biol 2015;94: Obermannova, R., Dusek, L., Greplova, K. Jarkovsky J, Sterba J, Vyzula, R., Demlova, R., Zdrazilova-Dubska, L., Valik, D. Time-course pattern of blood 25- hydroxycholecalciferol is a significant predictor of survival outcome in metastatic colorectal cancer: a clinical practice-based study. Neoplasma. 2015, 62(6), ISSN Orzol, P., Holcakova, J., Nekulova, M., Nenutil, R., Vojtesek, B., Coates, P.J. The diverse oncogenic and tumour suppressor roles of p63 and p73 in cancer: a review by cancer site. Histol Histopathol May, 30(5), ISSN Paleček, E., Tkáč, J., Bartošík, M., Bertók, T., Ostatná, V. Paleček, J. Electrochemistry of non-conjugated proteins and glycoproteins. Towards sensors for biomedicine and glycomics. Chem Rev. 2015, 115(5), Pastorek, J., Pastorekova, S. Hypoxia-induced carbonic anhydrase IX as a target for cancer therapy: From biology to clinical use. Semin Cancer Biol. 2015, 31C, Pastorek, M., Simko, V., Takacova, M., Barathova, M., Bartosova, M., Hunakova, L., Sedlakova, O., Hudecova, S., Krizanova, O., Dequiedt, F., Pastorekova, S., Sedlak, J. Sulforaphane reduces molecular response to hypoxia in ovarian tumor cells independently of their resistance to chemotherapy. Int J Oncol. 2015, 47(1), Pavlová, T., Novák, J., Bienertová-Vašků, J. The role of visfatin (PBEF/Nampt) in pregnancy complications. J Reprod Immunol Nov, 112, ISSN Pernikářová, V., Sedláček, V., Potěšil, D., Procházková, I., Zdráhal, Z., Bouchal, P., Kučera, I. Proteomic responses to a methyl viologen-induced oxidative stress in the wild type and FerB mutant strains of Paracoccus denitrificans. J Proteomics. 2015, 125, Pernikářová, V., Bouchal, P. Targeted proteomics of solid cancers: From quantification of known biomarkers towards reading the digital proteome maps. Expert Rev Proteomics. 2015,12(6), ISSN ,234 2,311 3,825 1,865 2,096 46,568 9,330 3,025 2,815 3,888 2,896 19

20 Č. CITACE PUBLIKACE IF 47 Poprach, A., Bortlicek, Z., Melichar, B., Lakomy, R., Svoboda, M., Kiss, I., Zemanova, M., Fiala, O., Kubackova, K., Coufal, O., Pavlik, T., Dusek, L., Vyzula, R., Buchler, T. Efficacy of sunitinib in patients with metastatic or unresectable renal cell carcinoma and renal insufficiency. Eur J Cancer Mar, 51(4), ISSN Pospisil, P., Kazda, T., Bulik, M., Dobiaskova, M., Burkon, P., Hynkova, L., Slampa, P., Jancalek, R. Hippocampal proton MR spectroscopy as a novel approach in the assessment of radiation injury and the correlation to neurocognitive function impairment: initial experiences. Radiat Oncol Oct 17, 10(1), 211. ISSN X 49 Reichl, P., Fang, M., Starlinger, P., Staufer, K., Nenutil, R., Muller, P., Greplova, K., Valik, D., Dooley, S., Brostjan, C., Gruenberger, T., Shen, J., Man, K., Trauner, M., Yu, J., Gao, C.F. and W. Mikulits. Multicenter analysis of soluble Axl reveals diagnostic value for very early stage hepatocellular carcinoma. Int J Cancer Jul 15,137(2), ISSN Řezníčková, E., Popa, A., Gucký, T., Zatloukal, M., Havlíček, L., Bazgier, V., Berka, K., Jorda, R., Popa, I., Nasereddin, A., Jaffe, Ch.L., Kryštof, V., Strnad, M. 2,6,9-trisubstituted purines as CRK3 kinase inhibitors with antileishmanial activity in vitro. Bioorg Med Chem Lett. 2015, 25(11), Rihacek, M., Bienertova-Vasku, J., Valik, D., Sterba, J., Pilatova, K., Zdrazilova- Dubska, L. B-Cell activating factor as a cancer biomarker and its implications in cancer-related cachexia. Biomed Res Int. 2015, article ID [9 p.] ISSN Ruff, P., Ferry, D.R., Lakomý, R., Prausová, J., Van Hazel, G.A., Hoff, P.M., Cunningham, D., Arnold, D., Schmoll, H.J., Moiseyenko, V.M., McKendrick, J.J., Ten Tije, A.J., Vishwanath, R.L., Bhargava, P., Chevalier, S., Macarulla, T., Van Cutsem, E. Time course of safety and efficacy of aflibercept in combination with FOLFIRI in patients with metastatic colorectal cancer who progressed on previous oxaliplatin-based therapy. Eur J Cancer Jan, 51(1), Sethi, I., Romano, R., Gluck, C., Smalley, K., Vojtesek, B., Buck, M.J., Sinha, S. A global analysis of the complex landscape of isoforms and regulatory networks of p63 in human cells and tissues. BMC Genomics. 2015, 16, 584. Slaby, O., Srovnal, J., Radova, L., Gregar, J., Juracek, J., Luzna, P., Svoboda, M., Hajduch, M. and J. Ehrmann. Dynamic changes in microrna expression profiles reflect progression of Barrett s esophagus to esophageal adenocarcinoma. Carcinogenesis May, 36(5), ISSN Tefft, B. J., Uthamaraj, S., Harburn, J. J., Klabusay, M., Dragomir-Daescu, D., Sandhu, G. S. Cell labeling and targeting with superparamagnetic iron oxide nanoparticles. J. Vis. Exp Oct 19, (105). doi: / Thorenoor, N. and O. Slaby. Small nucleolar RNAs functioning and potential roles in cancer. Tumor Biol Jan, 36(1), ISSN ,417 2,546 5,085 2,420 1,579 5,417 3,986 5,334 1,325 3,611 20

21 Č. CITACE PUBLIKACE IF Trojan, J., Mineur, L., Tomášek, J., Rouleau, E., Fabian, P., de Maglio, G., 3,234 García-Alfonso, P., Aprile, G., Taylor, A., Kafatos, G., Downey, G., Terwey, J.H., van Krieken, J.H. Panitumumab Use in Metastatic Colorectal Cancer and Patterns of KRAS Testing: Results from a Europe-Wide Physician Survey and Medical Records Review. PLoS One Oct 22, 10(10), e ISSN Vijai, J,, Foretova, L. et al. [102 autorů] A genome-wide association study of 11,470 marginal zone lymphoma shows association to the HLA region. Nat Commun Jan 8, 6, ISSN Vychytilova-Faltejskova, P., Kiss, I., Klusova, S., Hlavsa, J., Prochazka, V., Kala, 2,597 Z., Mazanec, J., Hausnerova, J., Kren, L., Hermanova, M., Lenz, J., Karasek, P., Vyzula, R. and O. Slaby. MiR-21, mir-34a, mir-198 and mir-217 as diagnostic and prognostic biomarkers for chronic pancreatitis and pancreatic ductal adenocarcinoma. Diagnostic Pathology Apr 24, 10(1), 38 [5 p.]. ISSN CELKEM hodnota IF 291,583 ZAHRANIČNÍ PUBLIKACE Články v recenzovaném časopise Č. CITACE PUBLIKACE 1 Lakomy, R., Rogowski, W., Piko, B., Mihaylova, Zh., Pritzova, E., Kvocekova, L. Prospective noninterventional study on the use of panitumumab monotherapy in patients with recurrent or progressive colorectal cancer: the VECTIS study. Cancer Manag Res Oct 23, 7, ISSN Sedlaříková, L., Bešše, L., Novosadová, S., Kubaczková, V., Radová, L., Staník, M., Krejčí, M., Hájek, R., Ševčíková, S. MicroRNAs in urine are not biomarkers of multiple myeloma. J Negat Results Biomed Sep 23, 14, 16. DOMÁCÍ PUBLIKACE Články v impaktovaném časopise Č. CITACE PUBLIKACE IF 1 Klabusay, M., Skopalík, J., Erceg, S., Hrdlička, A. Aequorin as intracellular Ca2+ indicator incorporated in follicular lymphoma cells by hypoosmotic shock treatment. Folia Biol (Praha). 2015, 61(4), ISSN Rehak, Z., Vasina, J., Nemec, P., Fojtik, Z., Koukalova, R., Bortlicek, Z., Rehakova, D., Adam, J., Vavrusova, A., Adam, Z. Various forms of 18 F-FDG PET and PET/CT findings in patients with polymyalgia rheumatica. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub Dec,159(4), ISSN ,942 1,200 21

22 DOMÁCÍ PUBLIKACE Články v recenzovaném časopise, evidovaném ve SCOPUS Č. Citace publikace 1 Adam, Z., Szturz, P., Koukalová, R., Řehák, Z. Pour, L., Krejčí, M., Šmardová, L., Eid. M., Volfová, P., Čermaková, Z., Křen, L., Sokol, F., Hanke, I., Michalková, E., Král, Z., Mayer, J. PET-CT dokumentovaná remise multicentrické formy Castlemanovy choroby po léčbě rituximabem. Popis případu a přehled literatury. Vnitř Lék. 2015, 61(3), ISSN X 2 Bílek, O., Holánek, M., Zvaríková, M., Fabian, P., Robešová, B., Procházková, M., Adámková Krákorová, D. Extraoseální Ewingův sarkom, primární postižení děložního čípku kazuistika. Klin Onkol. 2015, 28(4), ISSN X. 3 Burkoň, P., Kazda, T., Slávik, M.. Onkologie v obrazech. Efekt akcelerované radioterapie u plicního adenokarcinomu. Klin Onkol. 2015, 28(1), ISSN X 4 Cibulka, M., Selingerová, I., Fědorová, L., Zdražilová Dubská, L. Imunologické aspekty v onkologii cirkulující γδ T lymfocyty. Klin Onkol. 2015, 28(suppl. 2), 2S60-2S68. ISSN X 5 Coufal, O., Fait, V., Lžičařová, E., Chrenko, V., Žaloudík, J. Magnetická detekce sentinelových uzlin u karcinomu prsu metodou SentiMag. Rozhl Chir Jul, 94(7), ISSN Coufal, O., Zapletal, O., Vrtělova, P., Vašina, J., a Z. Řehak. Neuspěšná lymfoscintigrafie před sentinelovou biopsií u karcinomu prsu, možné příčiny a důsledky pro chirurgický výkon analýza výsledků 3014 vyšetřeni. Rozhl Chir. 2015, 94(3), ISSN Coufalová, D., Vojtěšek, B., Hernychová, L. Co může přinést studium oligomerizace proteinů v procesu onkogeneze? Klin Onkol. 2015, 28(suppl. 2), 2S6-2S10. ISSN X 8 Doleželová, H., Sovadinová, Š., Hübnerová, P., Kudláček, A., Hynková, L., Šlampa P. Onkologie v obrazech. Radioterapie pokročilých kožních nádorů. Klin Onkol. 2015, 28(5), ISSN X 9 Ditě, P., Novotný, I., Kianička, B., Rydlo, M., Nechutová, H., Martínek, A., Uvírová, M., Bojková, M. a J. Dvořáčková. Autoimunitní pankreatitida diagnostický konsenzus. Vnitř Lék. 2015, 61(2), ISSN X 10 Dvořáková, P., Nekulová, M., Holčáková, J., Vojtěšek, B., Hernychová, L. Analýza změn fosfoproteomu nádorové buněčné linie MDA- MB- 468 v odpovědi na expresi izoforem p63 pomocí hmotnostní spektrometrie. Klin Onkol. 2015, 28(suppl. 2), 2S11-2S19. ISSN X 11 Fabian, P. Onkologie v obrazech: Kolizní duplicitní nádory. Klin Onkol. 2015, 28(6), ISSN X 12 Fait, V. Onkologie v obrazech. Kongenitální naevus někdy neprávem opomíjené riziko. Klin Onkol. 2015, 28(3), 231. ISSN X 13 Fiala, L., Šefr, R., Kocáková, I., Pacal, M. Léčba gastrointestinálních stromálních tumorů komplexní pohled chirurga. Rozhl Chir. 2015, 94(5), ISSN Goněc, R., Macků, I., Selingerová, I., Kozáková, Š. Body surface area and body weight of Czech adult cancer population. Čes Slov Farm. 2015, 64(6),

23 Č. Citace publikace 15 Gottvaldová, M., Jedličková, H., Poprach, A., Vašků, V. Případ pozdně diagnostikovaného akrolentiginózního melanomu. Klin Onkol. 2015, 28(6), ISSN X 16 Hrabovský, Š., Řehák, Z., Stulík, J., Prášek, J., Mayer, J. Raritní případ mnohočetného myelomu: vícečetný solitární plazmocytom kostí bérců a předloktí. Vnitř Lék. 2015, 61(2), ISSN X 17 Kazda, T., Kuklová, A., Pospíšil, P., Burkoň, P., Slávik, M., Hynková, L., Procházka, T., Vrzal, M., Šťavík, M., Šlampa, P., Jančálek, R. Utilization of prognostic indexes for patients with brain metastases in daily radiotherapy routine is the complexity and intricacy still an issue? Klin Onkol. 2015, 28(5), ISSN X 18 Klabusay M. Úloha regulačních T buněk v protinádorové imunitní odpovědi. Klin Onkol. 2015, 28(suppl. 4), 4S23-4S27. ISSN X 19 Kleinová R., Slabý O., Šána J. Význam mikrorna u glioblastomových kmenových buněk. Klin Onkol. 2015, 28(5), ISSN X 20 Konieczna, A., Nováková, V., Medalová,, J., Erceg, S., Klabusay, M. Thiazolidinediones regulate the level of ABC transporters expression on lung cancer cells. Klin Onkol. 2015, 28(6), ISSN X 21 Krejčí, A., Müller, P., Vojtěšek, B. Bioinformatika a sekvenování nové generace. Klin Onkol. 2015, 28(suppl. 2), 2S91-2S96. ISSN X 22 Lakomý, R. Nežádoucí účinky moderní imunoterapie a jejich řešení v klinické praxi. Klin Onkol. 2015, 28(suppl. 4), 4S103-4S114. ISSN X 23 Maryáš, J., Bouchal, P. PDLIM2 a jeho role v onkogenezi tumor supresor nebo onkoprotein? Klin Onkol. 2015, 28(suppl. 2), 2S40-2S46. ISSN X 24 Melichárková, K., Neradil, J., Múdry, P., Zitterbart, K., Obermannová, R., Skotáková, J., Veselská, R., Štěrba, J. Profil aktivace receptorových tyrozinkináz a mitogenem aktivovaných proteinkináz v terapii Maffucciho syndromu. Klin Onkol. 2015, 28(suppl. 2), 2S47-2S51. ISSN X 25 Navrátil, J., Fabian, P., Palácová, M., Petráková, K., Vyzula, R., Svoboda, M. Triple negativní karcinom prsu. Klin Onkol. 2015, 28(6), ISSN X 26 Nenutil, R. Revoluce se odkládá na neurčito. WHO klasifikace nádorů prsu 2012: hlavní změny oproti 3. vydání (2003). Ces Slov Patol. 2015, 51(1), ISSN Ondroušková, E., Hrstka, R. Cirkulující nádorová DNA v krvi a její využití jako potenciálního biomarkeru nádorových onemocnění. Klin Onkol. 2015, 28(suppl. 2), 2S69-2S74. ISSN X 28 Pastorek, M., Müller, P., Vojtěšek, B. Nrf2 dve tváre regulátora antioxidačného systému. Klin Onkol. 2015, 28(suppl. 2), 2S26-2S31. ISSN X 29 Pjechová, M., Hernychová, L., Tomašec, P., Wilkinson, G. W., Vojtěšek, B. Adenovírusové vektory v génovej terapii. Klin Onkol. 2015, 28(suppl. 2), 2S75-2S80. ISSN X 30 Procházková, I., Vojtěšek, B. Polo-like kináza 1 jako cíl protinádorové terapie. Klin Onkol. 2015, 28(suppl. 2), 2S32-2S39. ISSN X 31 Růčková, E., Müller, P., Vojtěšek, B. Rekombinantní protilátky a jejich využití v protinádorové terapii. Klin Onkol. 2015, 28(suppl. 2), 2S52-2S59. ISSN X 32 Řehák, Z., Lakomý, R., Fait, V. Onkologie v obrazech: Rozmanitost 18 F-FDG PET obrazů pacientů s maligním melanomem. Klin Onkol. 2015, 28(2), ISSN X 23

24 Č. Citace publikace 33 Řiháček, M., Pilátová, K., Štěrba, J., Pilný, R., Valík, D. Nové poznatky ve farmakologii methotrexátu diagnostické možnosti a klinický význam. Klin Onkol. 2015, 28(3), ISSN X 34 Sochor, M., Sláma, O., Loučka, M. Časná integrace paliativní péče do standardní onkologické péče benefit, limitace, bariéry a druhy paliativní péče. Klin Onkol. 2015, 28(3), ISSN X 35 Sochor, M., Sláma, O. Management chronické a akutní bolesti u pacientů s nádorovými chorobami. Klin Onkol. 2015, 28(2), ISSN X 36 Staňková, M., Andrašina, T., Sedmík, J., Válek, V., Ostřížková, L., Tuček, Š. Přežívání pacientů s hepatocelulárním karcinomem léčených transarteriální chemoembolizací s drugeluting beads. Česká radiologie. 2015, 69(2), ISSN Svoboda, M., Navrátil, J., Slabý, O. Imunoterapie v prevenci a léčbě karcinomu prsu. Klin Onkol. 2015, 28(6), ISSN X 38 Šefr, R., Silák, J., Fabian, P., Ondrák, M., Fiala, L., Zapletal, O. Von Meyenburgovy komplexy mnohočetné biliární hamartomy imitující metastatický jaterní proces. Rozhl Chir Aug, 94(8), Tuček, Š., Jurečková, A., Tomášek, J., Adámková-Krákorová, D., Halámková, J., Pochop, L. Antikoagulační léčba a trombembolizmus při léčbě bevacizumabem opatrnost, či obavy? Klin Onkol. 2015, 28(4), ISSN X 40 Turjap, M., Juřica, J., Demlová, R. Možný klinický přínos terapeutického monitorování hladin imatinibu v onkologii. Klin Onkol. 2015, 28(2), ISSN X 41 Zahradníková, M., Vojtěšek, B., Hernychová, L. Cukry zasahují aneb glykomika na poli nádorových biomarkerů. Klin Onkol. 2015, 28(suppl. 2), 2S20-2S25. ISSN X 42 Bencsiková B. Systémová cílená léčba gastrointestinálních stromálních nádorů. Onkologie. 2015, 9(2), ISSN Fadrus P., Šlampa P., Lakomý R., Smrčka M. Komplexní terapie gliomů mozku. Onkologie. 2015, 9(5), ISSN Chrastina, J., Hrabovský, D., Hermanová, M., Burkoň, P., Brázdil, M., Novák, Z. Neuroonkologické aspekty u nemocných s farmakorezistentní epilepsií. Onkologie. 2015, 9(1), ISSN Jelenek, G., Náležinská, M. Chyloperitoneum zkušenost našeho pracoviště. Onkologie. 2015, 9(1), ISSN Náležinská, M., Kalábová, R., Kleinová, J., Kolářová, H., Tomíšková, M., Chovanec, J. Případ domnělé pnumotixicity topotekanu. Onkologie. 2015, 9(4), ISSN Obermannová, R., Melichárková, K., Vyzula, R. Nové léky v léčbě karcinomu žaludku. Onkologie. 2015, 9(6), ISSN Pochop, L. Léčba bolesti u onkologických pacientů se zaměřením na průlomovou bolest. Onkologie. 2015, 9(5), ISSN Šachlová, M., Májek, O. Screening kolorektálního karcinomu. Onkologie. 2015, 9(4), ISSN DOMÁCÍ PUBLIKACE Články v recenzovaném časopise 24

25 Č. Citace publikace 1 Doležalová, L. Cílená léčba v onkologii solidních nádorů. Praktické lékárenství, 2015, 11(6), Fadrus P., Šlampa P., Lakomý R., Smrčka M. Komplexní terapie gliomů mozku. Onkologie. 2015, 9(5), ISSN Fait, V., Chrenko, V., Šimůnek, R. Chirurgické postupy v léčbě maligního melanomu. Farmakoterapie. 2015, monografie Aktuální léčba maligního melanomu, s ISSN Chovanec, J. Olaparib v léčbě karcinomu vaječníků. Farmakoterapie. 2015, 11(5), ISSN Jurečková, A. Biologická léčba metastatického kolorektálního karcinomu. Farmakoterapie. 2015, 11(2), Kiss, I. Bevacizumab v lečbě metastatického kolorektalniho karcinomu učinnost a toxicita lečby napřič liniemi. Farmakoterapie. 2015, 11(5), ISSN Kiss, I., Neumann, A. Biologická léčba v kombinaci s chemoterapií prodlužuje přežití pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem. Farmakoterapie. 2015, 11(5), ISSN Krásenská, M. Studie MARIANNE - trastuzumab emtansin v první linii léčby lokálně pokročilého a metastazujícího karcinomu prsu s nadměrnou expresí HER2. Remedia. 2015, 25(5), ISSN Lakomy, R., Poprach, A. Cílená léčba pokročilého maligního melanomu. Farmakoterapie. 2015, monografie Aktuální léčba maligního melanomu, s ISSN Lakomý, R., Poprach, A., Koukalová, R. Maligní melanom současné přístupy k léčbě. Remedia. 2015, 25(3), ISSN Mechl Z., Červená R. 5. Konference ICHNO, , Nice, Francie. Farmakoterapie. 2015, 11(2), ISSN Staník, M., Doležel, J., Čapák, I., Macík, D., Jarkovský, J., Lžičářová, E., Vagundová, M., Šustr, M., Miklánek, D. Krátkodobé onkologické výsledky po radikální prostatektomii s rozšířenou pánevní lymfadenektomií a s nálezem uzlinových metastáz. Lze pomýšlet na úspěch bez systémové léčby? Ces Urol. 2015, 19(2), ISSN DOMÁCÍ PUBLIKACE Odborná kniha Č. CITACE PUBLIKACE 1 Slabý, O. (pořadatel a hlavní autor). Molekulární medicína. Praha: Galén, s. ISBN DOMÁCÍ PUBLIKACE Kapitoly v odborné knize 25

26 Č. CITACE PUBLIKACE 1 Adam, Z., Pour, L., Pourová, E., Koukalová, R., Vaníček, J., Ševčíková, S. Specifika diagnostiky a terapie mnohočetného myelomu u seniorů. In: H. Matějovská Kubešová, I. Kiss et al. Geriatrická onkologie. Praha: Mladá fronta, 2015, kap. 19, s ISBN Adámková Krákorová, D., Bencsiková, B. Sarkomy. In: J. Tomášek. Onkologie: minimum pro praxi. Praha: Axonite CZ, 2015, s ISBN Adámková Krákorová D., Janíček, P., Šimůnek, R. Sarkomy vyššího věku. In: H. Matějovská Kubešová, I. Kiss et al. Geriatrická onkologie. Praha: Mladá fronta, 2015, kap. 21, s ISBN Burkoň, P. Nádory hlavy a krku. In: J. Tomášek. Onkologie: minimum pro praxi. Praha: Axonite CZ, 2015, s ISBN Coufal, O., Palácová, M., Petráková, K., Žaloudík, J. Nádory prsu v období senia. In: H. Matějovská Kubešová, I. Kiss et al. Geriatrická onkologie. Praha: Mladá fronta, 2015, kap. 11, s ISBN Fabian, P. Morfologická klasifikace nádorů. In: J. Tomášek. Onkologie: minimum pro praxi. Praha: Axonite CZ, 2015, s ISBN Fabian, P., Rohan, Z. Zásady odběru materiálu k histologickému, cytologickému a molekulárnímu vyšetření. In: J. Tomášek. Onkologie: minimum pro praxi. Praha: Axonite CZ, 2015, s ISBN Fedorko, M., Kiss, I., Pacík, D. Uroonkologická problematika senia. In: H. Matějovská Kubešová, I. Kiss et al. Geriatrická onkologie. Praha: Mladá fronta, 2015, kap. 8.1, s ISBN Foretová, L. Dědičná nádorová onemocnění. In: J. Tomášek. Onkologie: minimum pro praxi. Praha: Axonite CZ, 2015, s ISBN Goněc, R., Kiss, I., Kozáková, Š. Chemoterapie a biologická léčba. In: H. Matějovská Kubešová, I. Kiss et al. Geriatrická onkologie. Praha: Mladá fronta, 2015, kap. 6, s ISBN Halámková, J., Krejčí, M., Tomíšková, M., Adam, Z., Kiss, I. Cílená terapie u geriatrických nemocných. In: H. Matějovská Kubešová, I. Kiss et al. Geriatrická onkologie. Praha: Mladá fronta, 2015, kap. 27, s ISBN Halámková, J., Kratochvíl, J. Jak a kde hledat zdroje informací v onkologii. In: J. Tomášek. Onkologie: minimum pro praxi. Praha: Axonite CZ, 2015, s ISBN Hynková, L., Šlampa, P. Principy radioterapie u geriatrických onkologických pacientů. In: H. Matějovská Kubešová, I. Kiss et al. Geriatrická onkologie. Praha: Mladá fronta, 2015, kap. 5, s ISBN Hynková, L., Šlampa, P. Radioterapie základní termonologie. In: J. Tomášek. Onkologie: minimum pro praxi. Praha: Axonite CZ, 2015, s ISBN Hynková, L., Šlampa, P. Radioterapie u geriatrických pacientů. In: H. Matějovská Kubešová, I. Kiss et al. Geriatrická onkologie. Praha: Mladá fronta, 2015, kap. 26, s ISBN Chovanec, J. Nejčastější gynekologické nádory. In: J. Tomášek. Onkologie: minimum pro praxi. Praha: Axonite CZ, 2015, s ISBN

27 Č. CITACE PUBLIKACE 17 Jurečková, A., Starý, K. Karcinomy štítné žlázy. In: J. Tomášek. Onkologie: minimum pro praxi. Praha: Axonite CZ, 2015, s ISBN Kiss, I., Kala, Z., Pospíšil, P., Andrašina, T., Tomášek, J. Léčba nádorů trávicího traktu u geriatrických pacientů. In: H. Matějovská Kubešová, I. Kiss et al. Geriatrická onkologie. Praha: Mladá fronta, 2015, kap. 5, s ISBN Lakomý, R., Poprach,A. Maligní melanom u starších pacientů. In: H. Matějovská Kubešová, I. Kiss et al. Geriatrická onkologie. Praha: Mladá fronta, 2015, kap. 20.2, s ISBN Lakomý, R., Kazda, T. Nádory CNS. In: J. Tomášek. Onkologie: minimum pro praxi. Praha: Axonite CZ, 2015, s ISBN Lakomý, R., Poprach, A. Nádory kůže. In: J. Tomášek. Onkologie: minimum pro praxi. Praha: Axonite CZ, 2015, s ISBN Macík, D., Kocák, I. Karcinom prostaty. In: J. Tomášek. Onkologie: minimum pro praxi. Praha: Axonite CZ, 2015, s ISBN Obermannová, R. Zásady léčby vybraných nežádoucích účinků protinádorové léčby v kostce. In: J. Tomášek. Onkologie: minimum pro praxi. Praha: Axonite CZ, 2015, s ISBN Petráková, K. Karcinom prsu. In: J. Tomášek. Onkologie: minimum pro praxi. Praha: Axonite CZ, 2015, s ISBN Poprach, A., Lakomý, R. Nádory močového měchýře. In: J. Tomášek. Onkologie: minimum pro praxi. Praha: Axonite CZ, 2015, s ISBN Romaňáková, M., Šutorová, V., Kryšková, L. Psychologická podpora sdělování diagnózy a prognózy. In: J. Tomášek. Onkologie: minimum pro praxi. Praha: Axonite CZ, 2015, s ISBN Sláma, O. Management nádorové bolesti. In: J. Tomášek. Onkologie: minimum pro praxi. Praha: Axonite CZ, 2015, s ISBN Sláma, O., Slámová, R. Management nádorové bolesti. In: H. Matějovská Kubešová, I. Kiss et al. Geriatrická onkologie. Praha: Mladá fronta, 2015, kap. 25, s ISBN Sláma, O. Principy paliativní léčby a péče. In: J. Tomášek. Onkologie: minimum pro praxi. Praha: Axonite CZ, 2015, s ISBN Svoboda, M., Halámková, J., Fabian, P. a O. Slabý. Nádory neznámé primární lokace. In: K. Kubáčková et al. Vzácné nádory v onkologii. Praha: Mladá fronta, 2015, s ISBN Šachlová, M., Skovajsová, M., Dvořák, V., Májek, O. Screeningová vyšetření. In: J. Tomášek. Onkologie: minimum pro praxi. Praha: Axonite CZ, 2015, s ISBN Špelda, S. Nádory pleury a mediastina. In: J. Tomášek. Onkologie: minimum pro praxi. Praha: Axonite CZ, 2015, s ISBN Tomášek, J. Jak informovat pacienta o vlivu paliativní protinádorové léčby na délku celkového přežití. In: J. Tomášek. Onkologie: minimum pro praxi. Praha: Axonite CZ, 2015, s ISBN Tomášek, J., Kiss, I. Nádory jater. In: J. Tomášek. Onkologie: minimum pro praxi. Praha: 27

28 Č. CITACE PUBLIKACE Axonite CZ, 2015, s ISBN Tomášek, J., Kiss, I. Nádory trávicí trubice. Anální karcinom. In: J. Tomášek. Onkologie: minimum pro praxi. Praha: Axonite CZ, 2015, s ISBN Tomíška, M., Tuček, Š. Problematika výživy onkologicky léčeného seniora. In: H. Matějovská Kubešová, I. Kiss et al. Geriatrická onkologie. Praha: Mladá fronta, 2015, kap. 24, s ISBN Tomíšková, M., Čoupková, H., Hanke. I. Nádory plic. In: H. Matějovská Kubešová, I. Kiss et al. Geriatrická onkologie. Praha: Mladá fronta, 2015, kap. 9, s ISBN Tuček, Š. Zásady nutriční péče v onkologii. In: J. Tomášek. Onkologie: minimum pro praxi. Praha: Axonite CZ, 2015, s ISBN Valík, D., Zdražilová Dubská, L. Klinické využití solubilních nádorových markerů. In: J. Tomášek. Onkologie: minimum pro praxi. Praha: Axonite CZ, 2015, s ISBN Vít, V., Pacík, D., Kocák, I., Kocáková, I., Špelda. S. Nádory prostaty. In: H. Matějovská Kubešová, I. Kiss et al. Geriatrická onkologie. Praha: Mladá fronta, 2015, kap. 8.3, s ISBN Žaloudík, J. Onkochirurgická léčba v seniu. In: H. Matějovská Kubešová, I. Kiss et al. Geriatrická onkologie. Praha: Mladá fronta, 2015, kap. 4, s ISBN DOMÁCÍ PUBLIKACE Ostatní výsledky Články ve sbornících (neobsažen ve SCOPUS) Č. Citace publikace 1 Andrášková, V., Žďárská, H. Úprava a hodnocení výživy v onkologii. Onkologická revue. speciál pro sestry. Praha: Current Media, 2015, s ISBN Coufal, O. Onkoplastická chirurgie v léčbě karcinomu prsu. In: Onkologická revue. Vybrané kapitoly ze systémové léby. Current Media, 2015, s ISBN Čoupek, P., Čoupková, I., Coufal, O., Šlampa, P., Procházka, T. Naše zkušenosti s radioterapií po časné rekonstrukci prsu. In: Onkologická revue. Vybrané kapitoly ze systémové léby. Current Media, 2015, s ISBN Halámková, J., Petráková, K., Kiss, I. PARP inhibitory v léčbě karcinomu prsu u pacientek s BRCA mutací. In: Onkologická revue. Lékařsky na mateřské. Current Media, 2015, s ISBN Jurečková, A. Karcinom štítné žlázy z pohledu onkologa. In: Onkologická revue. Vybrané kapitoly ze systémové léby. Current Media, 2015, s ISBN Jurišová, Z., Bednářová, Z. Poradiační dermatitida. Onkologická revue. Speciál pro sestry. Praha: Current Media, 2015, s ISBN Justan, I., Coufal, O. Estetické operace prsu - přehledová práce. In: Onkologická revue. Vybrané kapitoly ze systémové léby. Current Media, 2015, s ISBN

29 Č. Citace publikace 8 Kocák, I., Kocáková, I. Přehled léčby kastračně rezistentního karcinomu prostaty. In: Onkologická revue. Vybrané kapitoly ze systémové léby. Current Media, 2015, s ISBN Krásenská, M., Holánek, M. Význam biologické léčby v terapii karcinomu prsu. In: Onkologická revue. Vybrané kapitoly ze systémové léby. Current Media, 2015, s ISBN Lordick, F., Obermannová, R. Novel targets and treatment of advanced gastric cancer: what exists and what comes next. In: Onkologická revue. Vybrané kapitoly z diagnostiky a léčby karcinomu žaludku. Current Media, 2015, s ISBN Obermannová, R. Paliativní systémová léčba u karcinomu žaludku a gastroezofageální junkce. In: Onkologická revue. Vybrané kapitoly z diagnostiky a léčby karcinomu žaludku. Current Media, 2015, s ISBN Zvaríková, M. Léčba karcinomu vaječníků u BRCA mutovaných pacientek.. In: Onkologická revue. Vybrané kapitoly ze systémové léby. Current Media, 2015, s ISBN

30 4. PŘEHLED PROJEKTŮ Projekty financované výhradně z IPO 1. Identifikace a funkční charakterizace pirna deregulovaných v tkáni renálního karcinomu 2. Identifikace diagnostických a prediktivních mikrorna v moči/tkáni pacientů s karcinomem prostaty za využití metodiky NGS 3. Prediktivní a prognostické faktory karcinomu ledviny 4. "Triple-negativní" karcinom prsu z pohledu etiologie, epidemiologie, diagnostiky a léčby 5. Predikce odpovědi na cílenou protinádorovou léčbu u pacientek s HER2 pozitivním karcinomem prsu 6. Mozkové metastázy u karcinomu prsu 7. Androgenový receptor jako biomarker efektivity neoadjuvantní chemoterapie (NCT), délky bezpříznakového období (DFI), popř. celkového přežití (OS) u pacientek s triple-negativním a HER2 pozitivním/sr negativním karcinomem prsu 8. Identifikace biomarkerů umožňujících predikci rizika relapsu a individualizaci protinádorové léčby u pacientek s karcinomem prsu T1-3N0-1M0 9. Identifikace diagnostických a prognostických mikrorna v krevní plazmě pacientů s karcinomem pankreatu. 10. Identifikace diagnostických a prognostických mikrorna v nádorové tkáni a krevním séru pacientů s karcinomem žaludku. 11. Sekvenční léčba metastatického kolorektálního karcinomu EGFR inhibitory molekulárně biologické charakteristiky umožňující racionální indikaci léčby. 12. Identifikace diagnostických a prediktivních mikrorna u pacientů s karcinomem pankreatu. 13. Vytvoření a charakterizace souboru pacientů s karcinomem žaludku a pilotní analýzy potenciálních biomarkerů na bázi mikrorna. 14. Analýza mutačního stavu členů EGFR signální dráhy u pacientů s kolorektálním karcinomem léčených erbituxem metodou sekvenování nové generace. 15. Využití metod sekvenování nové generace (NGS) ke sledování nádorové heterogenity u pacentů s kolorektálním karcinomem. 16. Vývoj elektrochemického testu na elektrodových biočipech pro detekci lidských papilomavirů. 17. Detekce alterujících glykanových struktur v sérech a tkáních pacientek s nádorem vaječníků rezistentních k léčbě platinovými deriváty. 18. Diagnostický význam amplifikace genů hterc a MYCC při vzniku a vývoji cervikálních intraepiteliálních dysplázií a karcinomu děložního hrdla. 19. Pilotní studie laváže dutiny děložní za účelem diagnostiky serózních intraepiteliálních karcinomů tuby LUSTIC Study. 20. Klinické hodnocení diagnostické proveditelnosti a morfologicko-funkční korelace vyšetření PET/CT při použití 11 C-Methioninu inj. u pacientů s primárním nebo sekundárním postižením mozku nádorovým procesem. 21. Základní klinické prognostické a prediktivní faktory u glioblastoma multiforme. 22. MikroRNA a nádory oblasti hlavy a krku 23. Sentinelová biopsie u maligního melanomu (SNB) 24. Prognostické faktory konvenčního osteosarkomu dospělých pacientů 25. Výzkum etiologie hereditárních nádorových onemocnění pomocí sekvenování nové generace (NGS) s využitím panelů rizikových genů 30

31 Projekty spolufinancované z IPO (prostředky IPO pokrývají výdaje na nové a dodatečné experimenty nebo slouží k financování výzkumných pracovníků zapojených do řešení projektu) 1. Molekulární prognostické a prediktivní faktory u pacientů s metastatickým renálním karcinomem léčených tyrozinkinázovými inhibitory 2. Studium močových/tkáňových mikrorna jako potenciálních biomarkerů uroteliálního karcinomu močového měchýře 3. Studium mikrorna a genů asociovaných s procesem epiteliálně-mezenchymální tranzice jako potenciálních markerů pro predikci rizika a časný záchyt metastazování u pacientů s renálním karcinomem 4. Hodnocení onkologických a funkčních výsledků u pacientů po retropubické a roboticky asistované radikální prostatektomii. Nákladová efektivita operačních metod. 5. Cystectomy (Q)-CZ - CyRUS (Cystektomický Registr Urologické Společnosti): studium nádorů močového měchýře léčených cystektomií a další následnou léčbou. 6. Diagnostická proveditelnost a morfologicko-funkční korelace vyšetření PET při použití [18F]-Fluorocholin inj. u pacientů s karcinomem prostaty. 7. Hypofrakcionovaná akcelerovaná radioterapie u lokalizovaného karcinomu prostaty. 8. Význam cyklin-dependentní kinázy 12 (CDK12) v patogenezi a predikci u karcinomu prsu a dalších malignit. 9. Prognostické a prediktivní faktory výběru Adjuvantní terapie u pacientek s ER+ a Her2- karcinomem prsu 10. Nový panel proteinů korelujících se stavem lymfatických uzlin u low-grade nádorů prsu: Klinická verifikace a úloha v invazivitě nádorových buněk. 11. Využití proteinů p63/p73 a jejich signálních drah jako prediktivních markerů v klinické onkologii. 12. Chirurgické výkony na spádových mízních uzlinách u pacientek s karcinomem prsu. 13. Nežádoucí následky chirurgických výkonů na mízních uzlinách u pacientek s karcinomem prsu. 14. Vliv modulace vimentinu na expresi BRCA Studium signální dráhy EGFR a expresních profilů mikrorna v predikci odpovědi na cílenou anti-egfr terapii u pacientů s kolorektálním karcinomem s nemutovanou variantou onkogenu KRAS. 16. Vytvoření diagnostické sady cirkulujících mikrorna pro neinvazivní časnou diagnostiku a sledování pacientů s kolorektálním karcinomem. 17. Angiogeneze u zhoubných nádorů: stanovení prediktivních markerů u pacientů s kolorektálním karcinomem léčených antiangiogenní léčbou. 18. Prognostické faktory u karcinomu pankreatu. 19. Perioperační chemobioterapie v chirurgické léčbě jaterních metastáz kolorektálního karcinomu 20. Současné možnosti léčby refrakterního ascitu u pacientek s pokročilým gynekologickým maligním onemocněním. 21. Predikce odpovědi na léčbu u pacientek s karcinomern ovaria 22. Optimalizace 3D brachyterapie nádorů děložního hrdla a vliv hypoxie nádoru na výsledky léčby 23. Využití stereotaktické radioterapie a radiochirurgie v léčbě nádorů mozku. Provádění a zhodnocení toxicity a efektu aplikace stereotaktického ozáření na lineárním urychlovači pomocí mikrokolimátoru v léčbě primárních a sekundárních nádorů mozku. 31

32 24. Korelace obrazu MR spektroskopie v oblasti hipokampu a poškození kognitivních funkcí u pacientů po ozařování mozkovny. 25. Význam spektrální magnetické rezonance v léčbě a sledování pacientů s nádory CNS. 26. Možnosti molekulárně řízené radikální radioterapie nebo radiochemoterapie dle profilu mikrorna u pacientů se spinocelulárními karcinomy hlavy a krku 27. Hereditární nádorová onemocnění a) Mezinárodní výzkumné projekty b) Dílčí genetická vyšetření 28. Cílený screening kolorektálního karcinomu u diabetiků 2. typu a osob s vysokým kardiovaskulárním rizikem: multicentrická prospektivní studie 29. Vytvoření diagnostické sady cirkulujících mikrorna pro neinvazivní časnou diagnostiku a sledování pacientů s kolorektálním karcinomem 32

33 5. VÝZKUMNÁ ČÁST 33

34 TÝM PRO UROGENITÁLNÍ NÁDORY Vedoucí týmu: doc. MUDr. Jan Doležel, Ph.D. Vedoucí chirurgického programu týmu: doc. MUDr. Jan Doležel, Ph.D. Vedoucí onkologického programu týmu: MUDr. Ivo Kocák, Ph.D. Vedoucí radioterapeutického programu týmu: MUDr. Irena Čoupková Vedoucí výzkumného programu týmu: MUDr. Alexandr Poprach, Ph.D. Kompletní seznam členů týmu v roce 2015 je dostupný na internetových stránkách MOÚ: SEZNAM PROJEKTŮ ŘEŠENÝCH V ROCE 2015: (pouze projekty financované a spolufinancované z IPO) Jednoleté projekty: 0 Víceleté projekty : 10 Projekty financované výhradně z IPO 26. Identifikace a funkční charakterizace pirna deregulovaných v tkáni renálního karcinomu 27. Identifikace diagnostických a prediktivních mikrorna v moči/tkáni pacientů s karcinomem prostaty za využití metodiky NGS 28. Prediktivní a prognostické faktory karcinomu ledviny Projekty spolufinancované z IPO (prostředky IPO pokrývají výdaje na nové a dodatečné experimenty nebo slouží k financování výzkumných pracovníků zapojených do řešení projektu) 29. Molekulární prognostické a prediktivní faktory u pacientů s metastatickým renálním karcinomem léčených tyrozinkinázovými inhibitory 30. Studium močových/tkáňových mikrorna jako potenciálních biomarkerů uroteliálního karcinomu močového měchýře 31. Studium mikrorna a genů asociovaných s procesem epiteliálně-mezenchymální tranzice jako potenciálních markerů pro predikci rizika a časný záchyt metastazování u pacientů s renálním karcinomem 32. Hodnocení onkologických a funkčních výsledků u pacientů po retropubické a roboticky asistované radikální prostatektomii. Nákladová efektivita operačních metod. 33. Cystectomy (Q)-CZ - CyRUS (Cystektomický Registr Urologické Společnosti): studium nádorů močového měchýře léčených cystektomií a další následnou léčbou. 34. Diagnostická proveditelnost a morfologicko-funkční korelace vyšetření PET při použití [18F]-Fluorocholin inj. u pacientů s karcinomem prostaty. 35. Hypofrakcionovaná akcelerovaná radioterapie u lokalizovaného karcinomu prostaty. 34

35 1. IDENTIFIKACE A FUNKČNÍ CHARAKTERIZACE PIRNA ZAPOJENÝCH V PATOGENEZI RENÁLNÍHO KARCINOMU Řešitel: Spoluřešitelé: Anotace: Mgr. Jaroslav Juráček doc. RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D. MUDr. Michal Staník MUDr. Alexander Poprach, Ph.D. MUDr. Pavel Fabian, Ph.D. doc. MUDr. Marek Svoboda, Ph.D. Cílem projektu je pomocí sekvenování nové generace identifikovat deregulované pirna v nádorové tkáni renálního karcinomu a stanovit jejich v prognostický význam u pacientů s RCC. Zhoubné nádory ledvin představují v současnosti asi 3 % všech solidních nádorů vyskytujících se v dospělé populaci. Nejčastějším nádorem ledvin je pak renální karcinom (RCC). RCC je urologickým onemocněním s nejvyšší letalitou. V České republice mortalita u RCC mírně přesahuje 40 %. Závažným problémem je jak vysoká incidence, tak také výrazná agresivita ledvinových karcinomů. RCC je charakteristický vysokou mírou chemorezistence a radiorezistence a v současnosti je proto zatím nejúčinnější chirurgická léčba. Je také charakteristický časnou tvorbou metastáz a při stanovení diagnózy bývají u % pacientů již metastázy přítomné. Pro malou účinnost klasické chemoterapie a značnou chemorezistenci renálního karcinomu se v současné době věnuje pozornost cílené léčbě. PIWI interacting RNA (pirna) jsou krátké jednořetězcové RNA o délce nukleotidů. Podílejí se na umlčování transponovatelných elementů a předpokládá se, že se podílejí také na regulaci genů kódujících proteiny. Změněná exprese pirna byla pomocí NGS a hybridizačních čipů již popsána u nádoru prsu (pir-30924, pir-34736, pir-36249, pir-35407, pir-36318, pir-34377, pir-36743, pir-36026, pir-58106), žaludku (pir ) a močového měchýře (pir-52681, pir-48765, pir-36984, pir , pir-60152) a skvamózního karcinomu hlavy a krku, kde hladina pir korelovala s celkovým přežitím. Zvýšená exprese pir byla pozorována u mnohočetného myelomu. Cíle projektu: V našem projektu bychom pomocí NGS identifikovali deregulované pirna v nádorové tkání oproti zdravému renálnímu parenchymu a následně pak ty pirna, které by byly asociované s horší prognózou. Pro analýzu použijeme izolovanou RNA z nádorové a nenádorové tkáně od 12 pacientů s RCC, přičemž z těchto bude 6 s časným relapsem a 6 bez relapsu. RNA pak bude sekvenována a po statistickém vyhodnocení zjistíme, které pirna jsou v nádorové 35

36 tkáni signifikantně deregulované. Vybrané pirna pak budou validovány metodou qpcr na nezávislém souboru 40 párových vzorků od pacientů s RCC. Po analýze pak zjistíme, zdali by se mohli využít u pacientů s RCC jako prognostické biomarkery a odlišit tak pacienty s krátkou dobou do relapsu od pacientů s lepší prognózou. Metodika: Pro analýzu hladin RNA byly použity párové vzorky nádorové a přilehlé nenádorové tkáně. Celková RNA byla izolována kitem mirvana mirna Isolation Kit. Pro přípravu RNA knihovna byl použit kit TruSeq Small RNA Library Prep Kit od firmy Illumina. Sekvenace malých RNA probíhala na sekvenátoru miseq od firmy Illumina za použití kitu MiSeq Reagent Kit v2. Stav řešení v roce 2015: V našem projektu jsme zatím analyzovali vzorky tkání od pěti pacientů bez relapsu a jednoho pacienta s relapsem z plánovaných dvanácti. Jednalo se o párové vzorky nádorové tkáně a přilehlého nenádorového ledvinového parenchymu. Pacienti (čtyři muži a dvě ženy) s RCC byli léčeni na Masarykově onkologickém ústavu v Brně. Výsledky: U 6 párových vzorků nádorové tkáně a přilehlého nenádorového parenchymu jsme detekovali 440 pirna v počtu větším než jedena molekula u nejméně sedmi vzorků (Obr.1). Z těchto bylo 38 pirna významně deregulovanch (p <0,01) v RCC tkáni (Obr. 2A). Z těchto 38 pirna byly nejvýznamněji deregulovány (p<0,001) pir-1207, pir-2107, pir-2155, pir , pir-12488, pir-21508, pir-23230, pir-26525, pir a pir (Obr. 2B). Publikace vzešlé z projektu v roce 2015: Publikace je plánována až na rok Plán na rok 2016: Na rok 2016 je plánováno dokončení sekvenace pirna u zbývajících šesti párových vzorků. Následovat bude analýza hladin detekovaných pirna a jejich asociace s časem do relapsu a celkovým přežitím. Poté bude pět potenciálních prognostických pirna validováno metodou qpcr na nezávislém souboru 40 párových vzorků od pacientů s RCC a analyzován jejich vztah s klinicko-patologickými daty. Po vyhodnocení validační fáze bude připravena publikace do časopisu s IF. 36

37 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-2107 pir-hsa pir-hsa pir-hsa-1207 pir-hsa-5938 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-3178 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-820 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-7193 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-1742 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-1242 pir-hsa-1243 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-6145 pir-hsa-6147 pir-hsa pir-hsa pir-hsa-325 pir-hsa pir-hsa pir-hsa-9491 pir-hsa pir-hsa-2155 pir-hsa-1849 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-1338 pir-hsa pir-hsa-1823 pir-hsa-1282 pir-hsa pir-hsa pir-hsa-5937 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-1580 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-2138 pir-hsa pir-hsa pir-hsa-3200 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-3405 pir-hsa-1177 pir-hsa pir-hsa-993 pir-hsa pir-hsa pir-hsa-1834 pir-hsa pir-hsa-952 pir-hsa pir-hsa-1944 pir-hsa-515 pir-hsa-317 pir-hsa-456 pir-hsa-1556 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-6746 pir-hsa pir-hsa pir-hsa-1248 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-1043 pir-hsa-7549 pir-hsa pir-hsa-4112 pir-hsa pir-hsa-7116 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-3586 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-624 pir-hsa pir-hsa pir-hsa-6148 pir-hsa pir-hsa pir-hsa-1245 pir-hsa-2129 pir-hsa-1100 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-1280 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-4048 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-324 pir-hsa pir-hsa-1710 pir-hsa-1711 pir-hsa-4047 pir-hsa-9059 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-3616 pir-hsa pir-hsa pir-hsa-7201 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-1873 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-6105 pir-hsa-8226 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-2084 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-7327 pir-hsa pir-hsa-8030 pir-hsa pir-hsa-8031 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-1219 pir-hsa-1344 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-7637 pir-hsa-6647 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-7244 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-1077 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-1872 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-7102 pir-hsa pir-hsa-3391 pir-hsa pir-hsa pir-hsa-5370 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-7435 pir-hsa pir-hsa pir-hsa-6840 pir-hsa pir-hsa pir-hsa-2166 pir-hsa pir-hsa pir-hsa-7930 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-2750 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-1731 pir-hsa-2790 pir-hsa pir-hsa pir-hsa-1748 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-1848 pir-hsa pir-hsa-7164 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-1336 pir-hsa pir-hsa pir-hsa-2645 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-2106 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-2117 pir-hsa-9010 pir-hsa pir-hsa pir-hsa-182 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-1361 pir-hsa pir-hsa-793 pir-hsa-963 pir-hsa pir-hsa pir-hsa-619 pir-hsa-1191 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-1847 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-2154 pir-hsa pir-hsa pir-hsa-5939 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-426 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-3645 pir-hsa pir-hsa pir-hsa-5067 pir-hsa pir-hsa-7239 pir-hsa pir-hsa-1079 pir-hsa-1281 pir-hsa pir-hsa pir-hsa-6144 pir-hsa-6146 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-5770 pir-hsa pir-hsa-1359 pir-hsa-6463 pir-hsa-5936 pir-hsa pir-hsa pir-hsa pir-hsa-1254 Obr. 1: 440 pirna detekovaných v nejméně sedmi vzorcích nádorové a nenádorové tkáně Obr. 2A: 38 pirna významně deregulovaných v párových vzorcích (p<0,01), 2B: Deset nejvýznamněji deregulovaných pirna.

38 2. IDENTIFIKACE DIAGNOSTICKÝCH A PREDIKTIVNÍCH MIKRORNA V MOČI/TKÁNI PACIENTŮ S KARCINOMEM PROSTATY ZA VYUŽITÍ METODIKY NGS. Hlavní řešitel: Spoluřešitelé v MOÚ: doc. MUDr. Jan Doležel, Ph.D. doc. RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D. MUDr. Michal Staník doc. MUDr. Marek Svoboda, Ph.D. Anotace: Hlavním cílem projektu je za pomocí technologie NGS identifikovat neinvazivní močové biomarkery na bázi mikrorna umožňující navýšení specificity PSA a následně citlivější selekci pacientů k biopsii prostaty a k rebiopsii prostaty při negativní první biopsii a stoupajícím PSA. Dalším cílem je zavést močové/tkáňové biomarkery umožňující odlišení indolentní formy karcinomu prostaty (very low/low risk) od agresivního karcinomu prostaty (high risk, Gleason score 8-10), čímž by byla zajištěna bezpečná identifikace pacientů profitujících z radikální protinádorové terapie. Cíle projektu: 1) Identifikovat mirna s diagnostickým potenciálem v moči pacientů s karcinomem prostaty v souvislosti s pozitivitou/negativitou biopsie prostaty a hladin PSA pomocí technologie NGS 2) Pomocí metodiky qrt-pcr provést validaci identifikovaných mirna na nezávislém souboru pacientů za účelem prokázání jejich schopnosti navýšit specificitu PSA pro indikaci k bioptickému vyšetření prostaty 3) Identifikovat mirna v moči/nádorové tkáni pacientů s karcinomem prostaty umožňující odlišení indolentní formy karcinomu prostaty (very low/low risk) od agresivního karcinomu prostaty (high risk, Gleason score 8-10) Metodika: V rámci projektu bylo plánováno vyšetřit 120 vzorků moče pacientů s karcinomem prostaty či benigní hyperplazie prostaty stratifikovaných podle pozitivity/negativity biopsie, hladiny PSA a rizika nádoru kvantifikovaného pomocí Gleason score. Součástí kohorty bude také 20 vzorků moči od pacientů se zánětem močových cest a 50 vzorků moči od nenádorových kontrol. Ze získaného materiálu bude vyizolována celková RNA obohacená o frakci mirna a u vybraných 15 vzorků pacientů s karcinomem prostaty a 5 vzorků zdravých kontrol bude provedena vysokokapacitní analýza pomocí sekvenace nové generace krátkých RNA na přístroji Illumina MiSeq. Identifikované mirna schopné odlišit vyšetřované skupiny vzorků (přibližně 10 mirna) budou dále validovány na novém nezávislém souboru pacientů pomocí 38

39 metody Real-Time PCR a statisticky vyhodnoceny se zaměřením na schopnost navýšit specificitu PSA. U nejvíce významných mirna je plánováno provést také funkční charakterizace in vitro na stabilních buněčných liniích odvozených od karcinomu prostaty (testy na viabilitu, migraci, proliferaci, invazivitu, klonogenicitu, buněčný cyklus a apoptózu). Celý projekt bude veden v souladu se směrnicemi REMARK a STARD pro biomarkerové studie. Stav řešení/výsledky projektu v roce 2015: V souladu s plánovanými cíli byl nasbíraný popsaný počet vzorků moči/tkání od pacientů s karcinomem prostaty, zdravých kontrol a pacientů s infekcí močových cest. U všech vzorků byla úspěšně vyizolovaná celková RNA obohacená o frakce krátkých RNA (mirvana TM mirna Isolation Kit, Ambion, USA; Urine microrna Purification Kit, Norgen, Kanada), byla změřena koncentrace a čistota získané RNA (NanoDrop ND-1000) a rovněž její kvalita (Agilent Bioanalyzer 2100). Pro další analýzy bylo využito pouze vzorků, u kterých byl poměr A260/A280 > 2, poměr A260/A230 > 1,8 a RIN 8. Dále byl zoptimalizován sekvenační postup a technika na přístroji Illumina MiSeq. Následně byla u 20 vybraných vzorků provedena komplexní analýza mirna. Na základě biostatistického hodnocení sekvenačních dat byl získán soubor mirna s diagnostickým potenciálem, který umožňoval rozlišit pacienty s negativní či pozitivní biopsií prostaty (31 mirna, P < 0,0001) a zároveň vykazoval souvislost s hladinou PSA v krvi těchto pacientů. Z tohoto souboru bylo k následné validaci na nově nasbírané kohortě pacientů vybráno 5 mirna (mir-205, P < 0,0001; mir-214, P < 0,001; mir-221, P < 0,001; mir-99b, P < 0,01; mir-23b, P < 0,01), u nichž bylo potvrzeno navýšení specificity PSA. K in vitro charakterizaci byla vybrána mir-205, jejíž expresní hladina byla u stabilní linie karcinomu prostaty PC-3 zvýšena pomocí transientní transfekce. Analzován byl vliv mir-205 na viablitu, migraci, apoptózu a buněčný cyklus. Po experimentálním zvýšení hladiny mir- 205 byla pozorována inhibici migrace buněk (P = < 0,001) a také snížená viabilita buněk (P < 0,01). Vliv mir-205 na regulaci buněčného cyklu a apoptických dějů nebyl prokázán. Na základě výsledků bychom v roce 2016 rádi pokračovali v projektu a validovali identifikované mirna na větším souboru pacientů. Zároveň bychom rádi potvrdili výsledky in vitro experimentů na dalších stabilních buněčných liniích odvozených od karcinomu prostaty. Publikace vzešlé z projektu v roce 2015: Publikace je plánována až na rok Plán na rok 2016: 1. Příprava publikace z pilotních dat projektu. 2. Validace identifikovaných mirna na větším nezávislém souboru pacientů. 3. Validace výsledků in vitro charakterizace na dalších stabilních buněčných liniích karcinomu prostaty. 39

40 3. PREDIKTIVNÍ A PROGNOSTICKÉ FAKTORY KARCINOMU LEDVINY Hlavní řešitel projektu: MUDr. Alexandr Poprach, Ph.D. Spoluřešitelé: MUDr. Radek Lakomý, Ph.D., doc. MUDr. Marek Svoboda, Ph.D. Anotace projektu Projekt je zaměřen na identifikaci prediktivních a prognostických faktorů u karcinomu ledviny. Práce je rozdělena na dvě části: klinickou a laboratorní. Klinická část navazuje na předchozí sestavení konsekutivního souboru pacientů s renálním karcinomem diagnostikovaným a/nebo léčeným v MOU v letech , na který navazuje průběžně probíhající aktualizace klinicko-patologických parametrů. Laboratorní část je založena na analýze exprese vybraných mikrorna (mirna) ve vzorcích nádorů a zdravé renální tkáně. V závěru jsou provedeny klinicko-patologické korelace s cílem identifikovat prediktivní a prognostické faktory pro toto onemocnění. Cíle projektu Identifikace nových a validace již používaných prediktivních a prognostických faktorů u karcinomu ledviny. Identifikovat prediktory cílené léčby. Metodika Retrospektivní a prospektivní sběr klinických a histopatologických dat, vyšetření exprese mirna v nádoru a zdravé tkáni, ověření vztahu mezi expresí mirna a prognózou pacientů, in vitro testování vlivu vybraných mikrorna na buněčné funkce, statistické zpracování dat a interpretace výsledků. Stav řešení v roce 2015 Průběžně aktualizujeme data souboru 544 pacientů diagnostikovaných a/nebo léčených v MOÚ v období K této kohortě pacientů je k dispozici biologický materiál v podobě tkáně fixované formalínem a archivované v parafinových blocích a od většiny vzorků je uskladněna i tkáň v tkáňové bance. Kohortu používáme pro naše laboratorní analýzy, zejména pro měření mikrorna. Publikace v roce 2015: Kohorta pacientů byla součástí publikací: 1: Buchler T, Bortlicek Z, Poprach A, Pavlik T, Veskrnova V, Honzirkova M, Zemanova M, Fiala O, Kubackova K, Slaby O, Svoboda M, Vyzula R, Dusek L, Melichar B; Czech Renal Cancer Cooperative Group. Outcomes for Patients with Metastatic Renal Cell Carcinoma Achieving a Complete Response on Targeted Therapy: A Registry-based Analysis. Eur Urol Dec 30. pii: S (15) : Kubackova K, Melichar B, Bortlicek Z, Pavlik T, Poprach A, Svoboda M, Lakomy R, Vyzula R, Kiss I, Dusek L, Prausova J, Buchler T; Czech Renal Cancer Cooperative Group. Comparison of Two Prognostic Models in Patients with Metastatic Renal Cancer Treated with Sunitinib: a Retrospective, Registry-Based Study. Target Oncol Dec;10(4):

41 3: Poprach A, Bortlicek Z, Melichar B, Lakomy R, Svoboda M, Kiss I, Zemanova M, Fiala O, Kubackova K, Coufal O, Pavlik T, Dusek L, Vyzula R, Buchler T. Efficacy of sunitinib in patients with metastatic or unresectable renal cell carcinoma and renal insufficiency. Eur J Cancer Mar;51(4): : Merhautova J, Hezova R, Poprach A, Kovarikova A, Radova L, Svoboda M, Vyzula R, Demlova R, Slaby O. mir-155 and mir-484 Are Associated with Time to Progression in Metastatic Renal Cell Carcinoma Treated with Sunitinib. Biomed Res Int. 2015;2015: Plán pro rok 2016 Pokračovat v aktualizaci klinických dat a vytvářet informační podporu pro laboratorní experimenty.. 4. MOLEKULÁRNÍ PROGNOSTICKÉ A PREDIKTIVNÍ FAKTORY U PACIENTŮ S METASTATICKÝM RENÁLNÍM KARCINOMEM LÉČENÝCH TYROZINKINÁZOVÝMI INHIBITORY Hlavní řešitel v MOÚ: Spolupracovníci v MOÚ: Spolupráce: MUDr. Alexandr Poprach, Ph.D. doc. MUDr. Marek Svoboda, Ph.D. doc. MUDr. Ondřej Slabý, Ph.D., CEITEC, a doc. MUDr. Tomáš Büchler, Ph.D., FTN Praha Anotace: Renální karcinom (RCC) je nejčastější typ maligních nádorů ledvin, který představuje přibližně 2,5 % z celkového počtu diagnostikovaných nádorových onemocnění. V porovnání s jinými zeměmi dosahuje incidence renálního karcinomu v České republice velmi vysokých hodnot (28 případů/ osob/rok). Renální karcinomy jsou charakteristické značnou chemorezistencí a radiorezistencí, vysoká mortalita je však spojena především s častým rozvojem metastatického onemocnění (mrcc), které nastává až u 40 % pacientů s primárním tumorem. Léčebný postup RCC zahrnuje částečnou nebo úplnou nefrektomii, u některých pacientů s mrcc lze provést rovněž chirurgické odstranění metastáz. Většina pacientů s metastatickým renálním karcinomem je však léčena systémovými farmakoterapeutiky. V první linii cílené terapie jsou použity inhibitory tyrosinkináz (TKI) jako např. sunitinib, sorafenib nebo pazopanib. Tyto nízkomolekulární léčiva inhibují receptory tyrosin kináz potřebné k aktivaci velkého množství intracelulárních signálních drah kontrolujících buněčnou proliferaci, přežití, diferenciaci a angiogenezi. Důležitým nedostatkem této cílené terapie je sekundární rezistence, která se časem vyvine u všech pacientů. Navíc existuje podskupina pacientů, u nichž je pozorována již rezistence primárního tumoru. Prognóza pacientů je běžně určována kombinací různých faktorů (TNM klasifikace, laboratorní testy), 41

42 neexistuje však prediktivní biomarker, který by dokázal odlišit pacienty odpovídající a neodpovídající na léčbu zmíněnými nízkomolekulárními inhibitory TK. Skupinou biomolekul, které by mohly splňovat požadavky pro takový predikční marker, jsou mikrorna (mirna), které představují důležité regulátory genové exprese. Cíle projektu: 1. Zahájit kolekci vzorků séra a klinických dat od pacientů s metastatickým RCC před indikací a během systémové léčby sunitinibem nebo pazopanibem. 2. Analyzovat expresní profily tkáňových mirna asociovaných s odpovědí na TKI léčbu u retrospektivní kohorty pacientů s mrcc. Definovat panel tkáňových mirna schopných predikovat odpověď na léčbu sunitinibem a pazopanibem (explorativní fáze). 3. Verifikovat prognostický a prediktivní potenciál získaného mirna panelu na nezávislém souboru pacientů s mrcc. Pokud možno snížit počet kandidátních molekul vybraných do panelu (tréninková fáze). 4. Validovat a analyticky charakterizovat (AUC, senzitivita, specificita) panel tkáňových mirna a ověřit schopnost predikce odpovědi na léčbu TKI na prospektivně sbíraných vzorcích mrcc viz bod 1 (validační fáze). 5. Analyzovat globální expresní profily cirkulujících mirna v krevním séru pacientů s mrcc viz bod Stanovit plazmatické koncentrace sunitinibu a pazopanibu v krevním séru u vzorků sbíraných během průběhu léčby viz bod 1. Metodika: V rámci explorativní fáze budou analyzovány expresní profily mirna u 30 mrcc pacientů odpovídajících na léčbu sunitinibem, 30 mrcc pacientů neodpovídající na léčbu sunitinibem, 15 mrcc pacientů odpovídajících na léčbu pazopanibem a 15 mrcc pacientů neodpovídajících na léčbu pazopanibem. U této kohorty bude z FFPE vzorků vyizolována celková RNA obohacená o frakci krátkých RNA (mirvana, Ambion), stanovena čistota a kvalita získané RNA a změřena exprese 752 mirna za použití microrna Ready-to-Use PCR, Human panel I+II, V3.R, (explorativní fáze studie). Expresní data budou normalizována k vhodnému referenčnímu genu/mirna a vyhodnocena standardními multidimensionálními biostatistickými metodami za účelem identifikace mirna rozdílně exprimovaných u pacientů odpovídajících a neodpovídajících na léčbu TKI. Následně bude v rámci tréninkové fáze ověřen prognostický (čas do progrese) a prediktivní potenciál (odpověď na léčbu na základě RECIST kritérií) definovaného panelu mirna čítajícího mirna na nezávislé kohortě pacientů s mrcc léčených TKI (50 odpovídajících a 50 neodpovídajících na léčbu sunitinibem; 30 odpovídajících a 30 neodpovídajících na léčbu pazopanibem). V rámci validační fáze bude panel mirna za použití standartní ROC analýzy (AUC, specificita, senzitivita) analyticky charakterizován na novém nezávislém souboru vzorků prospektivně sbíraných během prvních dvou let projektu 42

43 (50 odpovídajících a 50 neodpovídajících na léčbu sunitinibem; 30 odpovídajících a 30 neodpovídajících na léčbu pazopanibem). Provedena bude také globální analýza expresních profilů cirkulujících mirna v krevním séru pacientů s mrcc (20 odpovídajících a 20 neodpovídajících na léčbu sunitinibem). Plazmatické koncentrace sunitinibu a pazopanibu v krevním séru sbíraném během léčby TKI budou stanoveny za použití HPLC-MS. Získané hodnoty AUC budou korelovány s vybranými klinicko-patologickými parametry a expresními hladinami mirna. Studie bude zakončena publikací výsledků v zahraničním časopise s impakt faktorem. Celý projekt bude veden v souladu se směrnicemi REMARK a STARD pro biomarkerové studie. Stav řešení/výsledky projektu: V současné době probíhá sběr klinických dat o pacientech léčených tyrozinkinázovými inhibitory (TKI) a vyšetření histologických preparátů s profilací panelů mirna. Provedli jsme retrospektivní analýzu 240 pacientů, zároveň probíhá prospektivní nábor pacientů do výše uvedeného projektu. V rámci retrospektivní části projektu máme k dispozici 63 histologických vzorků pacientů s mrcc (metastatický renální karcinom) léčených TKI v MOU (Masarykův onkologický ústav) a 25 vzorků pacientů léčených v Thomayeorově nemocnici, u těchto probíhá nyní genetické profilování (explorativní fáze projektu). Cílem této fáze projektu je nalezení mirna, které jsou statisticky významně asociovány s odpověďmi na TKI podanými v první linii paliativní léčby mrcc. V listopadu 2015 jsme též zažádali mimocentrová patologická pracoviště o dodání dalších 155 histologických vzorků pacientů, kteří jsou taktéž léčení v MOU pomocí TKI, ale operace primárního nádoru a jeho histopatologie je mimo ústav - očekáváme dodání do konce 01/2016. U těchto pacientů provedeme taktéž genetické profilování primárního nádoru. V roce 2016 zahájíme prospektivní část projektu, v ní budeme analyzovat nové pacienty s mrcc, včetně odběrů jejich periferní krve (cirkulující mirna) a vyšetření primárního nádoru. Plán pro rok 2016: Dokončit analýzu globálního profilování exprese mirna u retrospektivně sbírané kohorty pacientů. Zahájení tréninkové fáze studie zaměřené na validaci identifikovaných mirna u nezávislého souboru pacientů s mrcc. Verifikace schopnosti tkáňových mirna predikovat u pacientů s metastatickým renálním karcinomem odpověď na léčbu TKI. Pokračování v prospektivním sběru klinických dat a krevních sér pacientů s mrcc. 43

44 5. STUDIUM MOČOVÝCH/TKÁŇOVÝCH MIKRORNA JAKO POTENCIÁLNÍCH BIOMARKERŮ UROTELIÁLNÍHO KARCINOMU MOČOVÉHO MĚCHÝŘE Hlavní řešitel: Spoluřešitelé: Anotace: doc. MUDr. Jan Doležel, Ph.D. doc. RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D., MUDr. Michal Staník, Ph.D., MUDr. Igor Kiss, Ph.D., doc. MUDr. Marek Svoboda, Ph.D. Uroteliální karcinom močového měchýře (UKMM) se řadí mezi nejčastější maligní onemocnění urinárního systému. Běžně je dělen na sval invadující (muscle-invasive) a povrchový sval neinvadující (superficiální) karcinom, který zaujímá přibližně 80 % všech případů. Přes relativně vysoký výskyt superficiálních tumorů je uroteliálním karcinom močového měchýře asociován s častou progresí v invazivní formu, ke které dochází u více jak 20 % případů. Přesto že cystoskopie zůstává hlavní technikou v detekci a sledování pacientů s karcinomem močového měchýře, v případě karcinomu in situ nebo příliš malé nádorové léze může být malignita lehce přehlédnuta. Navzdory k vývoji nových technologií a urinárních testů není však v současnosti k dispozici dostatečně senzitivní biomarker, který by odrážel biologické vlastnosti karcinomu a případně umožnil časnou detekci relapsu, který nastává až u 70 % povrchového karcinomu. Požadavkům na takové biomarkery by mohly vyhovovat močové mikrorna (mirna), které vykazují velmi vysokou stabilitu a dobré analytické vlastnosti. Cíle projektu: 1. Identifikovat expresní profily mirna v nádorové a přilehlé nenádorové tkáni a v moči pacientů s uroteliálním karcinomem močového měchýře. 2. Korelovat získané profily mirna s klinicko-patologickými údaji (zejména prognózou onemocnění, odpovědí na terapii, histologickým typem a gradem) za účelem sestavení panelu močových mirna, který by umožnil neinvazivně diagnostikovat onemocnění a panelu tkáňových mirna umožňující určit individuální riziko progrese do invazivní formy onemocnění. 3. Validovat získaný mirna panel na nezávislém souboru pacientů se zaměřením na schopnost diagnostikovat pacienty s UCUB a stratifikaci pacientů podle histopatologického typu a prognózy. Určit specificitu panelu močových mirna na rozšířeném souboru zahrnujícím zdravé kontroly, pacienty s infekcí močového traktu a pacienty s renálním karcinomem. 4. Validovat a analyticky charakterizovat panel tkáňových mirna a ověřit schopnost časné detekce relapsu onemocnění a predikce progrese superficiální formy do sval invadující formy UCUB. 44

45 5. Připravit prospektivní studii, která by evaluovala a analyticky charakterizovala identifikovaný panel močových mirna ve smyslu diagnózy onemocnění a časné detekce rekurence. Metodika: V první fázi studii bude analyzována tkáň a moč od pacientů s UCUB diagnostikovaných a léčených v Masarykové onkologickém ústavu (20 sval-invadujících, 30 superficiálních, 20 zdravých). U této kohorty bude v rámci explorativní fáze projektu vyizolována celková RNA obohacená o frakci krátkých RNA (mirvana, Ambion; Urine microrna Purification Kit, Norgen), stanovena čistota a kvalita získané RNA a změřena exprese 752 mirna za použití microrna Ready-to-Use PCR, Human panel I+II, V3.R, (explorativní fáze studie). Exprese mirna bude normalizována k vhodnému referenčnímu genu/mirna identifikovaném na základě algoritmů genorm a NormFinder. První verze panelů močových mirna (schopný odlišit zdravé a nemocné jedince; předpokládáno mirna) a tkáňových mirna (časná detekce relapsu a predikce progrese onemocnění; předpokládáno mirna) bude následně validována na nezávislém souboru pacientů s uroteliálním karcinomem močového měchýře (n = 70) za použití TaqMan mirna real-time PCR assays. Specificita panelu močových mirna bude ověřena rozšířením o pacienty s infekcí močových cest a pacienty s renálním karcinomem (tréninková fáze studie). V rámci validační fáze studie budou močové mirna s potvrzeným diagnostickým potenciálem (AUC > 8) a vysokou specificitou k danému onemocnění analyzovány u nové nezávislé kohorty zahrnující 100 močí od pacientů s UCUB se zaměřením na časnou detekci relapsu onemocnění. Zároveň budou analytické vlastnosti panelu močových mirna porovnány a kombinovány s běžně používanou cytologickou diagnostikou. Na prospektivně sbíraných vzorcích tkáně od pacientů s UCUB rozdělených do dvou samostatných kohort podle podle progrese onemocnění bude validován a analyticky charakterizován panel tkáňových mirna. Studie bude zakončena publikací výsledků v zahraničním časopise s impakt faktorem. Celý projekt bude veden v souladu se směrnicemi REMARK a STARD pro biomarkerové studie. Stav řešení/výsledky projektu: V rámci projektu jsme nejprve optimalizovali proces odběru, skladování a zpracování vzorků moče pro analýzu mirna tak, aby nedocházelo ke ztrátám a degradaci analytu (např. optimální čas odběru moče, prezervace moče, selekce optimální frakce moče). V souladu se zadáním projektu byla poté u 50 vzorků moče (20 UCUB, 10 RCC, 20 zdravá kontrola) vyizolována celková RNA obohacená o mirna (Urine microrna Purification Kit, Norgen, Kanada) a následně byly pomocí microrna Ready-to-Use PCR, Human panel I+II, V3.R (Exiqon) analyzovány profily 752 mirna. Data byla analyzována pomocí statistického nástroje R s využitím balíčku Bioconductor LIMMA zaměřeným na profilování mirna. Pomocí softwaru GeNorm a NormFinder byla ze získaných expresních profilů identifikována 45

46 optimální endogenní kontrola s nejnižší mírou variability a vysokou mírou exprese, která bude použita v navazujících validačních fázích studie. Statistická analýza odhalila 76 mirna (mezi nimi např. mir-31, mir-99b, mir-125a), které jsou signifikantně zvýšeně exprimované v moči pacientů s UCUB oproti moči zdravých kontrol a které dokáží tyto dvě skupiny vzorků vzájemně odlišit (P < 0,01) (obr. 1). Obr. 1: Hierarchický klastrogram rozdělující vzorky moče od pacientů s uroteliálním karcinomem močového měchýře a zdravých kontrol na základě exprese 76 rozdílně exprimovaných mirna (modrá barva značí zdravé kontroly, žlutá barva značí pacienty s UCUB, P < 0, 01). V rámci skupiny pacientů s uroteliálním karcinomem močového měchýře byly vzájemně porovnávány také exprese mirna u pacientů s invazivním a neinvazivním typem UCUB a také high-grade neinvazivní vs. low-grade neinvazivní UCUB (tabulky 1 a 2). V obou případech bylo identifikováno 23 respektive 17 mirna, které s významností P < 0,01 dokázaly rozlišit zmíněné skupiny. 46

47 Tabulka 1: mirna signifikantně rozdílně exprimované mezi skupinami pacientů s invazivním a neinvazivním typem UCUB (P < 0,01). mirna logfc P value hsa-mir-16-2-star_st 0, , hsa-mir p_st 0, , hsa-mir-32_st 0, , hsa-mir-548c-3p_st 0, , hsa-mir-338-5p_st 0, , hsa-mir-3150a-3p_st -0, , hsa-mir-202-star_st 0, , hsa-mir-627_st 0, , hsa-mir-548aj_st 0, , hsa-mir-451_st 1, , hsa-mir-520e_st -0,3663 0, hsa-mir-486-5p_st 1, , hsa-mir-548x_st 0, , hsa-mir-629_st 1, , hsa-mir-519b-3p_st -0, , hsa-mir-339-3p_st 0, , hsa-mir-1290_st 0, , hsa-mir-324-5p_st 1, , hsa-mir-4427_st -0, , hsa-mir-487a_st -0, , hsa-mir-93-star_st 0, , hsa-mir-1263_st 0, , hsa-mir-548u_st 0, , Stejným způsobem, tedy za použití microrna Ready-to-Use PCR, Human panel I+II, V3.R (Exiqon), byly získány profily exprese mirna i u tkání karcinomu močového měchýře a přilehlé nenádorové tkáně. V současné době jsou expresní data analyzována a po biostatistickém vyhodnocení budou vybrány mirna vhodné pro validační fáze studie. V rámci přípravy tréninkové a validační fáze byla zahájena také kolekce nových vzorků. Tabulka 2: mirna významně rozdílně exprimované mezi skupinou high-grade neinvazivních vs. low-grade neinvazivních UCUB (P < 0,01). mirna logfc P value hsa-mir-3119_st -0,4205 0, hsa-mir-548y_st -0, , hsa-mir p_st 0, , hsa-mir-29b-1-star_st -0, , hsa-mir-374b-star_st -0, ,

48 hsa-mir-1243_st -0, , hsa-mir-33b-star_st 0, , hsa-mir-4464_st -0, , hsa-mir-2113_st 0, , hsa-mir p_st 0, , hsa-mir-491-5p_st -0, , hsa-mir-371-5p_st 0, , hsa-mir-182_st 1, , hsa-mir-1282_st -0, , hsa-mir-4489_st 0, , hsa-mir-3202_st -0, , hsa-mir-634_st 0, , Plán pro rok 2016: Zahájení tréninkové fáze studie zaměřené na validaci identifikovaných mirna u nezávislého souboru pacientů. Vyhodnocení schopnosti močových a tkáňových mirna diagnostikovat u pacientů uroteliální karcinom močového měchýře, popř. odlišit histopatologické typy tohoto onemocnění respektive detekovat relaps onemocnění a predikovat progresi onemocnění. Ověření specificity získaného diagnostického panelu rozšířením analýzy o kohorty pacientů s renálním karcinomem a infekcemi močového traktu. Publikace vzešlé z projektu v roce 2015: JURÁČEK, Jaroslav, Hana MLČOCHOVÁ, Michal STANÍK, Barbora PELTANOVÁ, Robert ILIEV, Táňa MACHÁČKOVÁ, Jitka MLČOCHOVÁ, Renata HÉŽOVÁ, Jan DOLEŽEL a Ondřej SLABÝ. Urinary cell-free micrornas as potential biomarkers of urothelial carcinoma of the urinary bladder. In 106th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research 2015, Philadelphia JURÁČEK, Jaroslav, Hana MLČOCHOVÁ, Barbora PELTANOVÁ a Ondřej SLABÝ. Močové mirna jako potenciální biomarkery uroteliálního karcinomu močového měchýře. In XXXIX. brněnské onkologické dny a XXIX. konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky, Brno

49 6. STUDIUM MIKRORNA A GENŮ ASOCIOVANÝCH S PROCESEM EPITELIÁLNĚ-MEZENCHYMÁLNÍ TRANZICE JAKO POTENCIÁLNÍCH MARKERŮ PRO PREDIKCI RIZIKA A ČASNÝ ZÁCHYT METASTAZOVÁNÍ U PACIENTŮ S RENÁLNÍM KARCINOMEM Hlavní řešitel projektu za MOÚ: MUDr. Pavel Fabian, Ph.D., doc. RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D., Mgr. Martina Rédová-Lojová, Ph.D. Anotace: Renální karcinom (RCC) je třetí nejčastější příčinou úmrtí na urologické malignity a představuje cca 3 % všech solidních nádorů v dospělém věku. Nejčastějším histologickým podtypem RCC je jeho světlobuněčná forma (ccrcc), která představuje přibližně % všech nádorů ledvin. Jedním ze stěžejních momentů v patogenezi různých nádorových onemocnění, včetně RCC, je proces epiteliálně-mezenchymální tranzice (EMT), který je charakterizován redukcí buněčných adhezí a změnou polarizace epiteliálních buněk, které podléhají přeměně na více motilní a invazivní mezenchymální buňky. EMT je jedním z klíčových kroků v procesech progrese, invazivity a získání metastatického potenciálu nádorově transformovaných buněk. Jedním z nejmodernějších přístupů k molekulární charakterizaci solidních nádorů, včetně RCC, je analýza mikrorna (mirna). V předkládaném projektu přinášíme analýzu profilů exprese mirna a specifických genů asociovaných s EMT v primárních tumorech pacientů s RCC. Tyto analýzy byly dále obohaceny o studium zjištěných mirna v krevním séru. Takto identifikované mirna, případně jejich cílové molekuly na proteinové úrovni, by mohly doplnit skupinu markerů vhodných pro predikci rizika a časný záchyt metastazování u pacientů s RCC a stát se tak dalším krokem směrem k individualizaci terapie a dosažení lepších léčebných výsledků u pacientů s RCC. Idetifikované mirna mohou rovněž sloužit jako potenciální terapueutické cíle. Cíle projektu: Zde prezentovaná studie byla provedena jako 4-krokový experiment s následující pracovní hypotézou: Pomocí vysokokapacitních metod identifikovat EMT asociované mirna a geny a následně validovat jejich význam jako potencionálních diagnostických, prognostických a prediktivních biomarkerů v nádorové biologii. BOD 1. Imunofluorescenční studium EMT statusu v FFPE tkáni ccrcc. BOD 2. Provedení vysokokapacitních analýz na úrovni mirna (TaqMan Low Density Array) a genů (Human Gene 1.0 ST Array, Affymetrix). BOD 3. Validace nově identifikovaných mirna a genů pomocí RT-qPCR. BOD 4. Závěrečná sumarizace výsledků a jejich korelace s klinicko-patologickými daty. BOD 5. Funkční analýzy 49

50 Metodika: Klinický materiál. Ve studii bylo použito 182 vzorků nádorové tkáně při studiu mirna a 201 vzorků při studiu genů ccrcc pacienů diagnostikovaných v letech na Masarykově onkologickém ústavu (Brno, Česká republika) s diagnózou ccrcc. Imunofluorescenční analýza parafinových bloků. Sekce parafinových bloků byly inkubovány s primárními protilátkami (E-kadherin, CK-18, CK-19, vimentin, S100A4...). EMT status byl hodnocen podle intenzity barvení (0-3) a procentuálního zastoupení obarvených buněk: 0 (0-5%), 1 (6-25%), 2 (26-75%), 3 (76-100). TaqMan Low Density Arrays. Pomocí qrt-pcr TaqMan Low Density Array (TLDA) byly analyzovány globální expresní profily mirna u 27 ccrcc pacientů, které byly rozděleny do dvou podskupin, 8 EMT (+) a 21 EMT (-). Všechny analýzy a vyhodnocení TLDA byly provedeny na přístroji ABI 7900HT Instrument (Applied Biosystems) podle výrobcem doporučeného protokolu. Affymetrix GeneChip Human Exon 1.0 ST Arrays. 14 ccrcc pacientů, 6 vzorků EMT(+) a 8 vzorků EMT (-) byly použity k analýze podle protokolu GeneChip WT PLUS Reagent Kit za použití Affymetrix GeneChip Human Exon 1.0 ST Arrays (Affymetrix, Santa Clara, USA). Arrays byly promývány a naskenovány pomocí GeneChip FS400 promývací stanice a GeneArray skeneru. Izolace celkové RNA. Izolace RNA probíhala pomocí 3 komerčně dostupných izolačních sad v závislosti na vstupním biologickém materiálu; nativní tkáň (mirvana mirna Isolation Kit), buněčné kultury (ZYMORESEARCH Isolation Kit) a krevní sérum ( MiRNeasy mini kit). RT-qPCR- exprese mirna a genů. Izolovaná RNA byla u analýzy mirna naředěna na koncentraci 2 ng/ul a přepsána reverzní transkripcí do komplementární DNA (cdna) pomocí TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit. U analýzy genů byla RNA naředěna na koncentraci 75 ng/ul a reverzní transkripcí přepsána do komplementární cdna pomocí High Capacity cdna Reverse Transcription Kit dle doporučení výrobce. Přepis RNA do komplementární DNA byl proveden na přístroji Biorad. Následná real-time PCR byla provedena za použití přístroje Real-time QuantStudio podle doporučení výrobce. Reakce byly inkubovány v 386-jamkové optické desce MicroAmp EnduraPlate Optical 384-Well Reaction Plates při teplotě 50 C po dobu 2 minut, 95 C 10 minut, následováno 40 cykly při 95 C 15 s a 60 C po dobu 1 minuty. Všechny reakce byly provedeny v duplikátu. Analýza expresních dat RT-qPCR. Ct hodnoty byly získány pomocí nastavení mezní hodnoty (treshold = 0,2) za použití softwaru QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA). Relativní hladiny exprese byly získány pomocí vzorce 2 CT, přičemž CT bylo získáno podle vzorce: CT = CTmiR CT RNU48/ CT = CTgenu CT PPIA. Statistické vyhodnocení. Ke statistickému vyhodnocení dat byl použit Mann-Whitney U test, Kruskal-Wallis test, log-rank test a Kaplan-Meier metoda za použití softwaru GraphPad Prism version 6.00 for Windows (GraphPad Software, USA). In vitro analýzy. In vitro studie byly prováděny na renálních nádorových liniích Caki-2 (ATCC HTB-47 ) a (ATCC CRL-1932 ). Navozování EMT in vitro probíhalo za pomoci TGF-β o koncentraci 10 ng/ml. Cytokin byl přidáván pouze jednou po dobu 4 dnů. Následně byly také měřeny změny v expresi genů za použití RT-qPCR. 50

51 Výsledky řešení projektu v roce 2015: Stanovené cíle, předkládané v popisu projektu IPO byly splněny v plném rozsahu, viz níže: CÍL 1. Determinovat přítomnost/rozsah EMT ve vzorcích primárních nádorů pacientů s RCC (stádium I až IV dle TNM klasifikace) pomocí imunohistochemické detekce specifických markerů EMT (E-kadherin, zona occludens, N-kadherin, vimentin, alfa-aktin hladkého svalu, Zeb-1, Zeb-2). U retrospektivního souboru 73 pacientů poskytnutých Masarykovým onkologickým ústavem byla pomocí imunofluorescenční analýzy determinována přítomnost EMT (Tabul). Pomocí analýzy souboru epiteliálních markerů (E-kadherin, CK-18, CK-19) a mezenchymálních markerů (vimentin, S100A4) byly vytvořeny 2 podskupiny pacientů, EMT (+) a EMT (-) připravené k následným vysokokapacitním analýzám na úrovni mirna a genů (N=29). CÍL 2. U testovacího souboru pacientů s RCC identifikovat expresní profil mirna specifický pro proces EMT (viz cíl 1) a stanovit expresní profil sady genů dříve asociovaných s procesem EMT. EMT (+) a EMT (-) podskupiny byly testovány pomocí vysokokapacitních analýz na úrovni mirna. Nad rámec zde vytyčených cílů byly také identifikovány a nově popsány geny zapojené do procesu EMT u renálního karcinomu. Tento soubor genů byl doplněn již dříve popsanými geny diskutovanými v souvislosti s procesem EMT (E-kadherin, N-kadherin, vimentin, ZEB1, ZEB2) a dále validován. CÍL 3. A) Biostatistickými nástroji integrovat data o expresi mirna a analyzovaných genů asociovaných s EMT s klinicko-patologickými parametry pacientů s RCC (TNM, OS, DFS, Fuhrmann grade, stadium ad.). 25 mirna (N=75) a 22 genů (N=47) byly validovány v 1.fázi validace a korelovány s klinicko-patologickými daty. B) Identifikované mirna a geny validovat v nádorové tkáni u širšího souboru pacientů s RCC pomocí kvantitativní Real-Time PCR v kontextu klinicko-patologických parametrů identifikovaných v cíli 3. Do 2 fáze validace postoupilo 8 mirna a 10 genů. Soubor pacientů byl rozšířen na 126 vzorků u mirna a 184 vzorků u genů. CÍL 4. Ověřit možné využití sady mirna (viz cíl 2) pro stanovení přítomnosti/míry EMT a pro diagnostiku metastatického onemocnění z krevního séra pacientů s RCC. Současně s validací sady mirna a genů identifikovaných v předchozích fázích studie asociovaných s procesem EMT v nativní tkáni, probíhala i validace využitelnosti zde zmíněných mirnas v krevním séru na souboru pacientů s ccrcc (N=60, ccrcc, 20 metastatických vs. 40 nemetastatických pacientů) a zdravých kontrol (N=60) (Graf 1, 2). 51

52 Graf 1. Validace mirna-30a-5p v krevním séru Graf 2. Validace mirna-30e v krevním séru CÍL 4. Vyhodnotit možné klinické využití identifikovaných mirna s prognostickým a prediktivním potenciálem, a to především ve vztahu diagnostice metastatického onemocnění u pacientů s RCC, a navrhnout prospektivní studii na jejich nezávislou validaci. Záverem zde předkládaného projektu je souhrn mirna a genů potencionálně zapojených v procesu EMT a patogenezi RCC (Tabulka 1). 52

53 CÍL 5. In vitro funkčně analyzovat identifikované mirna v kontextu EMT a jejich možné využití jako potenciálních terapeutických cílů. Pomocí cytokinu TGF- β (10 ng/ml) bylo indukováno EMT u nádorových renálních linií Caki-2 a Byly pozorovány změněné expresní profily vybraných genů (např. výrazný pokles exprese E-cadherinu) (Graf 3) doprovázeny výrazně pozměněnou morfologií buněk (protáhlý vřetenovitý tvar) (Obr. 1). Graf 3. Významný pokles E-kadherinu u

54 Obr. 1: TGF-β vyvolává morfologické změny u Caki-2 v podmínkách in vitro Publikace v roce 2015: Kapitoly v knihách: MLČOCHOVÁ, Hana, Renata HÉŽOVÁ, Albano MELI a Ondřej SLABÝ. Urinary MicroRNAs as a New Class of Noninvasive Biomarkers in Oncology, Nephrology, and Cardiology. In Methods in Molecular Biology. USA: Springer New York, 2015;1218: doi: / _26. Výsledková publikace: FEDORKO, M., Stanik, M., Iliev, R., Redova-Lojova, M., Machackova, T., Svoboda, M., Pacik, D., Dolezel, J., Slaby, O. Combination of MiR-378 and MiR-210 Serum Levels Enables Sensitive Detection of Renal Cell Carcinoma. Int J Mol Sci Sep 29;16(10): doi: /ijms Plán pro rok 2016: Na leden roku 2016 je plánováno zpracování zde prezentovaných dat a jejich publikace v odborném časopise. 54

55 Tabulka 1. Souhrn 2. fáze validace mirna Exprese mirna_2.fáze validace mir-200a mir-200b mir-200c mir-429 DFS [pvalue] mir-30a- 5p mir-30a- 3p mir-30e mir-30e- 3p PARENCHYM NÁDOROVÁ TKÁŇ METASTÁZY FC (tu/par) p-value FC (meta/tu) p-value N = 40 N = 126 N = 7 median (25%- 75% percentil) median (25%- 75% percentil) median (25%- 75% percentil) FC (tu/par) p-value FC (meta/tu) p-value Grading [pvalue] Kruskal-Wallis test Grading [pvalue] Stage [p-value] Kruskal-Wallis test Stage [p-value] DFS [pvalue] OS [p-value] OS [p-value] 0,8975 0,2478 0,1695 0, < 0,0001 **** 0, ,3585-0,0003 *** 0,0012 ** N/A 0,0188 * (0,727-1,077) (0,1432-0,4141) (0,0272-0,4107) 0,5088 0,1077 0,1212 0, < 0,0001 **** 1, ,8929-0,0295 * 0,0041 ** N/A 0,0079 ** (0,3834-0,6385) (0, ,1790) (0,0228-0,3019) 0,2912 0,0065 0,0049 0, < 0,0001 **** 0, ,4152-0,3558-0, N/A 0, (0, (0, ,4111) 0,009225) (0,003-0,0098) 0,1309 0, ,0139 0, < 0,0001 **** 0, ,3684-0,0011 ** 0,0009 *** N/A 0, (0, (0, ,1748) 0,04115) (0,0024-0,0347) 6,727 2,782 1,039 0, < 0,0001 **** 0, ,0248 * < 0,0001 **** 0,0018 ** N/A 0,0027 ** (5,164-8,743) (1,72-3,580) (0,8479-2,289) 1,191 0,3477 0,1172 0, < 0,0001 **** 0, ,0068 ** < 0,0001 **** 0,0002 *** N/A 0,0056 ** (0,9306-1,557) (0,215-0,5058) (0,0379-0,3774) 6,226 2,832 1,383 0, < 0,0001 **** 0, ,0239 * < 0,0001 **** 0,0005 *** N/A 0,003 ** (4,885-7,733) (1,82-3,672) (0,9234-2,339) 0,3513 0,1349 0,068 0, < 0,0001 **** 0, ,03 * < 0,0001 **** 0,011 * N/A 0,0123 * (0,1888-0,4569) (0, ,1856) (0,0494-0,1284) 55

56 7. HODNOCENÍ ONKOLOGICKÝCH A FUNKČNÍCH VÝSLEDKŮ U PACIENTŮ PO RETROPUBICKÉ A ROBOTICKY ASISTOVANÉ RADIKÁLNÍ PROSTATEKTOMII. NÁKLADOVÁ EFEKTIVITA OPERAČNÍCH METOD. Hlavní řešitel projektu: doc. MUDr. Jan Doležel, Ph.D. Projekt probíhá ve spolupráci s Nemocnicí sv. Zdislavy, a.s.; VAMED- Mediterra AeskuLab, k.s., CEDELAB; IBA MU Brno. Anotace projektu Karcinom prostaty patří mezi nejčastěji diagnostikované solidní nádory u mužů v rozvinutých krajinách. Zlatým standardem v léčbě časných stádií onemocnění je radikální retropubická prostatektomie (RRP), nebo nověji i roboticky asistovaná radikální prostatektomie (RALP). Úspěch operační léčby se již nehodnotí jenom onkologickým výsledkem, ale i udržením kvality života, která je v dlouhodobém měřítku nejvíce ovlivněna inkontinencí moče a erektilní dysfunkcí. Hodnocení dosažených výsledků u pacientů je nezbytné jako zpětná vazba pro operační tým, ke srovnání s publikovanými údaji a ke zlepšení péče. Cíle projektu Zhodnotit onkologické a funkční výsledky u pacientů, kteří podstoupili RRP nebo RALP pro karcinom prostaty, posoudit komplikace operace a jejich spokojenost s léčbou. Vyhodnotit nákladovou efektivitu léčby. Metodika V letech bylo provedených 1000 RALP v nemocnici sv. Zdislavy v Mostištích a 350 RRP v Masarykově onkologickém ústavu. Demografické a onkologické údaje pacientů jsme prospektivně sbírali do databáze. Pooperační komplikace jsou hodnoceny podle Clavienovy klasifikace. Medián doby sledování je 32 měsíců. Histopatologická vyšetřování všech operovaných pacientů provádí, resp. druhotně vyhodnocuje, dle kriterií ISUP (z r. 2011) jeden dedikovaný uropatolog laboratoře Cedelab. V plánu studie je osobní pohovor s pacienty zaměstnanci oddělení klinických studií, vyplnění dotazníku, který se zaměřuje na 4 základní okruhy: 1. onkologické výsledky, 2. funkční výsledky, 3. komplikace operace, 4. celková spokojenost s léčbou. V dotazníku jsou použity standardizované formuláře k hodnocení erektilní funkce (IIEF-5 dotazník International Index of Erectile Function), mikčních potíží a inkontinence (modifikovaný EPIC dotazník Extended Prostate Inventory Composite) a kvality života (část EORTC dotazníku QLQ-C30). Stav řešení v roce 2015 v současnosti jsou standardizovaně vyhodnoceny perioperační komplikace u 1000 roboticky a 500 otevřeně operovaných pacientů. Byl rozeslán standardizovaný dotazník 1500 pacientům a opakovaně těm, kteří dosud neodpověděli. Soubor celkově čítá 1500 pacientů (500 operováno otevřenou cestou). Probíhá vyhodnocování histopatologických nálezů dle kritérií ISUP. Výsledky vyplněných dotazníků jsou průběžně zanášeny do databáze. Publikační a přednášková aktivita

57 Projekt dosud nebyl prezentován, dále viz níže. Plán pro rok 2016 V plánu je finalizace sběru dat a pooperačních komplikací po RRP a histolopatologických nálezů.. Následovat bude statistické vyhodnocení, stejně jako vyhodnocení nákladové efektivity metod, což provede IBA MU ve spolupráci s Oddělením klinického hodnocení MOÚ. Výsledky plánujeme prezentovat na konferencích ČUS a BOD a připravuje se i publikace in extesno. 8. Cystectomy (Q)-CZ - CyRUS (CYSTEKTOMICKÝ REGISTR UROLOGICKÉ SPOLEČNOSTI) STUDIUM NÁDORŮ MOČOVÉHO MĚCHÝŘE LÉČENÝCH CYSTEKTOMIÍ A DALŠÍ NÁSLEDNOU LÉČBOU Hlavní řešitel projektu za MOÚ: doc. MUDr. Jan Doležel, Ph.D. Nositelem projektu je IBA MU. Zapojena do projektu budou zejména velká ( high volume ) urologická centra, cca 20 pracovišť z ČR. Anotace Projekt představuje ve své podstatě registr nádorů močového měchýře léčených cystektomií a další následnou léčbu. Cílem je získat informace o počtu operovaných pacientů a výsledcích v ČR. Tyto údaje pak využít k podpoře významu operační léčby u urologických nádorů. Metodika Design studie Observační, prospektivní - longitudinální, kohortová studie. Pacienti budou zařazováni postupně dle jejich příchodu na klinická centra a indikace k cystektomii. Dlouhodobé následné sledování směřuje k hodnocení účinnosti a bezpečnosti léčby a obecných indikátorů její kvality. Podmínky pro zařazení pacienta: Každý pacient, u kterého je provedena radikální cystektomie pro nádor močového měchýře. Podepsání informovaného souhlasu k průběhu projektu a ke sběru dat. Okamžikem založení záznamu v registru je čas provedení cystektomie. Od té chvíle je pacient veden v registru a je pravidelně sledován. Počet zapojených pracovišť Zapojena budou zejména velká ( high volume ) urologická centra, cca 20 pracovišť z ČR. Optimálním cílem je zapojení všech pracovišť, která v ČR provádějí cystektomie. Jedná se o plošný celostátní registr s ambicí získat robustní a reprezentativní datovou základnu pro hodnocení dané oblasti péče. Podle plánu projektu budou centra sledovat i následnou péči při propuštění pacienta do ambulantní sféry, bude tudíž nutné zavázat příslušného ambulantního lékaře k zadávání dalších záznamů. Následná péče se bude sledovat podrobně, s ohledem na klinické standardy. Doba trvání projektu Projekt je primárně plánován na celkové období 36 měsíců, nicméně není striktně časově omezen, neboť jeho cílem je plně reprezentativní náběr vhodných pacientů ze spádových 57

58 oblastí center a zajistit jejich dlouhodobé sledování. Předpokládaný začátek projektu: Předpokládané ukončení: Očekávatelný počet záznamů ročně: Cíle projektu Primární cíl projektu: hodnocení výsledků léčebné péče, počínaje cystektomií z důvodu zhoubného nádoru močového měchýře doba do relapsu, doba do progrese, nemocniční a krátkodobá mortalita, celkové přežití. Sekundární cíle studie: upřesnění a zobecnění odhadů incidence a prevalence cystektomie z důvodu ZN močového měchýře pro spádové oblasti urologických center ČR; hodnocení bezpečnosti léčby, komplikace léčby; hodnocení podpůrné terapie; vliv a řešení komorbidit. Další výstupy studie: databázové zázemí a pilotní verze informačního systému pro sledování zátěže, výsledků a kvality péče v klinické praxi urologických center ČR; datová základna pro hodnocení nákladovosti a struktury nákladů dané oblasti léčebné péče. Implementace registru Cystectomy(Q)-CZ a sběr dat na centrech Pro celostátní sběr dat bude vyvinut centrální repozitář, registr, ukládající anonymizovaná data dílčích databází a zajišťující centrální validaci dat, jejich management i analytické zpracování a reporting; v rámci tohoto řešení bude probíhat i anonymizované hlášení záznamů z jednotlivých center (= standardizovaný centrální registr). Stav řešení v roce 2015 Probíhá nábor pacientů dle stanoveného plánu. Plán pro rok 2016 Nábor pacientů. 58

59 9. HYPOFRAKCIONOVANÁ AKCELEROVANÁ RADIOTERAPIE U LOKALIZOVANÉHO KARCINOMU PROSTATY Hlavní řešitel projektu: MUDr. Pavel Krupa, prof. MUDr. Pavel Šlampa, CSc. Anotace projektu V současnosti existují přesvědčivé důkazy o tom, že pravděpodobnost biochemické kontroly karcinomu prostaty lze zlepšit eskalací dávky záření především u pacientů se středním rizikem onemocnění. Aby nedocházelo k neúnosnému poškození zdravých tkání, je třeba snížit radiační zátěž kritických orgánů. Na tomto poli byl v posledních letech učiněn výrazný pokrok díky rutinnímu využívání konformní radioterapie (3D-CRT) a stále vyšší dostupnosti technik IMRT a IGRT. Zátěž kritických orgánů lze snížit jak redukcí fyzikální dávky, tak omezením biologického účinku záření volbou vhodného frakcionačního režimu ve smyslu akcelerované hypofrakcionace. Klasická frakcionační schémata využívající velikost frakce 1,8-2,0 Gy jsou postavena na předpokladu, že nádorová tkáň, podobně jako časně reagující tkáně, je méně citlivá na velikost jednotlivé frakce ve srovnání s pozdně reagujícímu tkáněmi. Naopak pozdně reagující tkáně jsou citlivé spíše na velikost jednotlivé frakce, méně potom na jejich počet. Současné výzkumy ukazují, že karcinom prostaty vykazuje vysokou citlivost k velikosti frakce. Hodnota poměru α/β, který vyjadřuje citlivost k velikosti frakce, se u karcinomu prostaty pohybuje v oblasti velmi nízkých hodnot (1,5 Gy), narozdíl od většiny ostatních tumorů, které mají hodnotu α/β vysokou (>8 Gy). Jedná se dokonce o nižší hodnotu, než je běžně popisována pro pozdně reagující tkáně močového měchýře a rekta (5 Gy), tedy obligátních kritických orgánů při radioterapii karcinomu prostaty. Hypofrakcionovaná akcelerace se tak jeví jako vhodný frakcionační režim Cíle projektu Prokázat bezpečnost a účinnost zkrácených frakcionačních režimů u radioterapie karcinomu prostaty. Běžně je aplikováno x 2,0 Gy, v rámci projektu je aplikováno x 3,0 Gy, za každodenní kontroly polohy ozařovaného objemu pomocí cone beam CT Metodika Využivá se různé radiosenzitivity kritických orgánů a karcinomu prostaty. Hypofrakcionované akcelerované režimy zvyšují terapeutický poměr ve prospěch nižších nežádoucích účinků a současně vyšší účinnosti. Pro každého pacienta se využívá matematické modelování těchto efektů pomocí programu BioGray a na základě modelu je stanoveno ideální frakcionační schéma Stav řešení v roce 2015: V roce 2015 byla vyhodnocena předběžná data dalších pacientů. Hodnotit lze nyní pouze akutní toxicitu, která se jeví stejná nebo lepší, než u pacientů ozařovaných klasickým režimem. Pravděpodobnost lokální kontroly (účinnost léčby) a pozdní nežádoucí účinky jsou vzhledem k dosud krátké době sledování prakticky nehodnotitelné. Plán pro rok 2016 (případně další roky): Pokračuje náběr nových pacientů a současně se průběžně hodnotí data o výskytu akutní toxicity a pozdní toxicity. Tyto výsledky budou prezentovány na domácích a zahraničních kongresech. 59

60 10. DIAGNOSTICKÁ PROVEDITELNOST A MORFOLOGICKO- FUNKČNÍ KORELACE VYŠETŘENÍ PET PŘI POUŽITÍ [18F]- FLUOROCHOLIN INJ. U PACIENTŮ S KARCINOMEM PROSTATY. KLINICKÁ STUDIE II/III. FÁZE. NÁZEV ZKOUMANÉHO PŘÍPRAVKU: [18F]-Fluorocholin inj. IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO PROTOKOLU: RD-FCH-2014 EUDRACT NUMBER: VERZE PROTOKOLU: 1.3 DATUM VERZE PROTOKOLU: JMÉNO A ADRESA ZADAVATELE: Masarykův onkologický ústav, Žlutý kopec 7, Brno JMÉNO ZKOUŠEJÍCÍHO: doc. MUDr. Jan Doležel, Ph.D. TRVÁNÍ KLINICKÉHO HODNOCENÍ: Zahájení: 1/2015 Ukončení je plánováno na 12/2016 POČET SUBJEKTŮ KLINICKÉHO HODNOCENÍ: CÍLE A ZDŮVODNĚNÍ KLINICKÉHO HODNOCENÍ Hlavním cílem tohoto klinického hodnocení je prokázat akumulaci radiofarmaka [ 18 F]- Fluorocholin inj. v nádorové tkáni karcinomu prostaty buď lokálně v prostatě, v lymfatických uzlinách nebo ve vzdálených metastázách. Účelem je zjistit, zda zvýšenou akumulací hodnoceného přípravku aplikovaného i.v. v nádorové tkáni karcinomu prostaty a případných metastázách je možné zajistit včasnou diagnostiku a včasné zahájení protinádorové léčby. Dále bude vyhodnocen a stanoven optimální odstup snímání od aplikace radiofarmaka [ 18 F]- Fluorocholin inj. na základě sledování obrazového kontrastu v nádorové tkáni vzhledem k pozadí a případně zdravým strukturám v časném a pozdním snímání. Bude sledován a vyhodnocen vztah hladiny PSA (nebo dynamiky vzestupu PSA) při biochemickém relapsu onemocnění k pravděpodobnosti pozitivního nálezu patologie ve snímaných obrazech k možnému stanovení správného časování vyšetření v průběhu léčby. V případě identifikace patologické (nádorové) tkáně bude hodnocen poměr (ratio R T/B ) akumulace FCH v tomto ložisku (SUVmax T ) vzhledem k pozadí v srdečním septu (SUVmax B ) R T/B = SUVmax T / SUVmax B, a to ve shodných lokalitách jak na časných tak na pozdních snímcích. Při identifikaci patologického ložiska ve skeletu bude krom poměru R T/B pro toto ložisko vypočítán také poměr R T/S = SUVmax T / SUVmax S se SUVmax S v normálním skeletu páteře. Při identifikaci patologického ložiska v prostatě a přítomnosti nepatologické tkáně prostaty (není postižená celá prostata) krom poměru R T/B také poměr R T/P = SUVmax T / SUVmax P se SUVmax P pro nepatologickou tkáň prostaty. 60

61 Ložiska s nejistým vztahem ke karcinomu prostaty (například zjištění přítomnosti jiného nádorového onemocnění) budou z dalšího statistického zpracování vyloučena. Pokud bude u hodnoceného skeletu identifikováno více patologických ložisek, k dalšímu zpracování budou vybrána reprezantativní ložiska následovně (vždy jen pokud ložisko v dané oblasti existuje): pro skelet: alespoň jedno ložisko v páteři, v dlouhých kostech, v kalvě, v pánvi a alespoň jedno v žebrech, sternu nebo ramenním pletenci pro LU: alespoň jedno pro pánevní LU, tříselné LU, LU retroperitonea, LU mesenteria, LU mediastina, LU hilů plicních ostatní systémy (játra, plíce, mozek): alespoň jedno ložisko z každého systému Zhodnocená patologická ložiska budou pro další statistické zpracování rozdělena následujících skupin: ložiska v prostatě ložiska v lymfatický uzlinách ložiska ve skeletu ostatní patologická ložiska K dalšímu statistickému zpracování lze použít na úrovní lézí ( per-lesion analysis ) následující parametry nebo hodnoty: poměr R T/B v časném a pozdním snímku k nalezení nejvhodnějšího časového odstupu snímání od aplikace RF pro patologická ložiska ve skeletu SUVmax T a poměr R T/S případně R T/B k nalezení případné cut-off hodnoty pro patologická ložiska v prostatě SUVmax T a poměr R T/P případně R T/B k nalezení případné cut-off hodnoty Na úrovni hodnocených subjektů ( per-patient analysis ) lze statisticky zpracovávat následující hodnoty: počet a poměr subjektů s pozitivním (patologickým) nálezem ve vztahu k hladině PSA (%pozitivních nálezů při PSA > 1,5 ng / ml, PSA > 2 ng / ml, PSA > 3 ng / ml, PSA > 5 ng / ml, PSA > 10 ng / ml) počet a poměr subjektů s pozitivním nálezem ve vztahu k PSA doubling time (%pozitivních nálezů při PSAdt > 12 měsíců, PSAdt < 12 měsíců, PSAdt <6 měsíců, PSAdt < 3 měsíce) Obě hodnoty slouží ke stanovení vhodného časování FCH PET/CT vyšetření vzhledem ke klinickému průběhu onemocnění. Dále lze do uvedeného hodnocení pravděpodobnosti vnést i vztah ke Gleason skore při histologickém ověření karcinomu prostaty. 61

62 KRITÉRIA PRO ÚČAST: Vstupní kritéria: Vstupní kritéria: Klinicky lokalizovaný / lokálně pokročilý karcinom prostaty zařazen do skupiny s vysokým rizikem (klinické stádium ct2c a vyšší NEBO PSA více než 20ng/ml NEBO Gleason skóre 8-10), před zvažovanou kurativní léčbou, k vyloučení metastatického postižení vyšetření u diseminovaného karcinomu prostaty k posouzení rozsahu postižení biochemická recidiva po radikální léčbě karcinomu prostaty k lokalizaci recidivy a případnému plánování cílené lokální léčby CT vyšetření břicha a pánve provedené max. 28 dnů před studiovým PET vyšetřením odběr hodnoty PSA max. 14 dnů před studiovým PET vyšetřením, v případě relapsu onemocnění PSA doubling time Věk 18 let Podepsaný Informovaný souhlas ECOG PS 0-1 Laboratorní hodnoty: o bilirubin < 1,5x horní hranice normálu o kreatinin < 1,5x horní hranice normálu o Urea < 1,5x horní hranice normálu o trombocyty > 50 x 10 9 /L minimálně 3 týdny od případné poslední aplikace protinádorové léčby a 6 týdnů od případné poslední radioterapie (první 4 subjekty hodnocení by optimálně neměly být předléčeny chemoterapií ani radioterapií, aby byl omezen možný vliv této léčby na kvalitu vyšetření) Schopnost subjektu hodnocení spolupracovat dle požadavků protokolu Vylučující kritéria: Hypersenzitivita na jakoukoli součást hodnoceného přípravku Porucha funkce ledvin o Urea > 1,5x horní hranice normálu o Kreatinin > 1,5x horní hranice normálu o Diuréza > 1,5x horní hranice normálu Přítomnost jakýchkoli duševních, rodinných, sociálních či geografických skutečností, které by mohly být překážkou postupu v souladu s protokolem. Tyto skutečnosti musejí být se subjektem hodnocení před jeho zařazením do klinického hodnocení prodiskutovány Hmotnost subjektu hodnocení nad 204 kg nebo deformita trupu bránící prostupu přes otvor v gantry o průměru 70 cm Klaustrofobie nebo neschopnost ležet 20 min bez pohnutí 62

63 HODNOCENÝ PŘÍPRAVEK, PŘÍPRAVA DÁVKY A APLIKACE Během tohoto klinického hodnocení bude použito radiofarmakum [ 18 F]-Fluorocholin inj., vyrobené v MOÚ. Léčivá látka obsahuje ve své molekule radioaktivní izotop 18 F, který má poločas přeměny 109,8 min a emituje pozitrony o maximální energii 0,633 MeV s následným anihilačním zářením gama o energii 0,511 MeV, četnost 1,935 fotonu na 1 radioaktivní přeměnu. Příprava injekcí [ 18 F]-Fluorocholin inj. probíhá podle standardního operačního postupu v laboratoři k tomuto účelu určené. Příprava se provádí v prostředí třídy čistoty A, za dodržení podmínek pro přípravu injekcí a manipulace s radioaktivními látkami. Náběr jednotlivých injekcí je prováděn na základě požadavku oddělení nukleární medicíny pro konkrétního pacienta. Ke snížení expozice připravujících pracovníků je využíván k náběru injekcí automatický dávkovací systém microdds-a. Okamžitě po náběru injekce je tato dopravena k subjektům hodnocení, kterému je ve stanovený čas (čas, ke kterému je aktivita v injekci kalibrována) odborným lékařem podána intravenózně. Po aplikaci bude zahájeno snímání přístrojem dle parametrů protokolu. Aktivita 4 MBq / kg tělesné hmotnosti byla vybrány na základě dostupné literatury. POPIS TYPU KLINICKÉHO HODNOCENÍ Jedná se o otevřené nerandomizované, jednoramenné, nekomparativní klinické hodnocení II./III. fáze, statistická analýza bude tedy spíše popisná, příp. grafická. Výsledky akumulace radiofarmaka v jednotlivých časových intervalech a vypočtené hodnoty T/B ratio budou zaznamenány v tabulkách. Monocentrické klinické hodnocení bude probíhat pouze v České republice. STATISTICKÉ METODY Pro analýzu dat budou použity metody deskriptivní statistiky. Akumulace hodnoceného radiofarmaka v nádorové tkáni bude stanovena jako podíl subjektů, u kterých je poměr akumulace v nádorové a zdravé tkáni (T/B ratio) > 1, tento podíl subjektů bude doplněn výpočtem 95% intervalu spolehlivosti. Analýza nežádoucích účinků bude provedena deskriptivně formou výpočtu frekvence výskytu jednotlivých typů a intenzit nežádoucích účinků doplněných o příslušné 95% intervaly spolehlivosti. PLÁN STUDIE Do klinického hodnocení je v plánu zařadit subjektů hodnocení v jednom centru klinického hodnocení MOÚ Brno. Očekávaná doba náboru je 1 rok od zahájení klinického hodnocení., tj. do 12/

64 TÝM PRO NÁDORY PRSU Vedoucí týmu: prof. MUDr. Rostislav Vyzula, CSc. Vedoucí chirurgického programu týmu: doc. MUDr. Vuk Fait, CSc. Vedoucí onkologického programu týmu: MUDr. Katarína Petráková, Ph.D. Vedoucí radioterapeutického programu týmu: MUDr. Petr Čoupek Vedoucí diagnostického programu týmu: MUDr. Monika Schneiderová Vedoucí histopatologického programu týmu: MUDr. Rudolf Nenutil, CSc. Vedoucí výzkumného programu týmu: doc. MUDr. Marek Svoboda, Ph.D. Kompletní seznam členů týmu v roce 2015 je dostupný na internetových stránkách MOÚ: SEZNAM PROJEKTŮ ŘEŠENÝCH V ROCE 2015: Jednoleté projekty: 0 Víceleté projekty : 9 Projekty financované výhradně z IPO 1. "Triple-negativní" karcinom prsu z pohledu etiologie, epidemiologie, diagnostiky a léčby 2. Predikce odpovědi na cílenou protinádorovou léčbu u pacientek s HER2 pozitivním karcinomem prsu 3. Mozkové metastázy u karcinomu prsu 4. Androgenový receptor jako biomarker efektivity neoadjuvantní chemoterapie (NCT), délky bezpříznakového období (DFI), popř. celkového přežití (OS) u pacientek s triple-negativním a HER2 pozitivním/sr negativním karcinomem prsu 5. Identifikace biomarkerů umožňujících predikci rizika relapsu a individualizaci protinádorové léčby u pacientek s karcinomem prsu T1-3N0-1M0 Projekty spolufinancované z IPO (prostředky IPO pokrývají výdaje na nové a dodatečné experimenty nebo slouží k financování výzkumných pracovníků zapojených do řešení projektu) 6. Význam cyklin-dependentní kinázy 12 (CDK12) v patogenezi a predikci u karcinomu prsu a dalších malignit. 7. Prognostické a prediktivní faktory výběru Adjuvantní terapie u pacientek s ER+ a Her2- karcinomem prsu 8. Nový panel proteinů korelujících se stavem lymfatických uzlin u low-grade nádorů prsu: Klinická verifikace a úloha v invazivitě nádorových buněk. 9. Využití proteinů p63/p73 a jejich signálních drah jako prediktivních markerů v klinické onkologii. 10. Chirurgické výkony na spádových mízních uzlinách u pacientek s karcinomem prsu. 11. Nežádoucí následky chirurgických výkonů na mízních uzlinách u pacientek s karcinomem prsu. 12. Vliv modulace vimentinu na expresi BRCA1. 64

65 1. "TRIPLE-NEGATIVNÍ" KARCINOM PRSU Z POHLEDU ETIOLOGIE, EPIDEMIOLOGIE, DIAGNOSTIKY A LÉČBY Hlavní řešitelé projektu: doc. MUDr. Marek Svoboda, Ph.D., MUDr. Jiří Navrátil, RNDr. Eva Macháčková, MUDr. Marie Navrátilová, Ph.D., Mgr. Jaroslav Juráček, doc. RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D., Mgr. Roman Hrstka, Ph.D. Anotace projektu Triple-negativní (trojitě negativní) typ karcinomu prsu charakterizuje chybění exprese estrogenových, progesteronových a Her-2 receptorů. Jejich podíl představuje přibližně 15 % karcinomů prsu, vyskytují se spíše v mladším věku. Histologicky se jedná zejména o nízce diferencované karcinomy, většina patří do basal-like podskupiny. Klinicky se vyznačují vysokou agresivitou a častějším vznikem vzdálených metastáz. Tento typ nádoru prsu se rovněž častěji vyskytuje u žen s hereditární patogenní mutací v BRCA1 genu. V jejich léčbě má mnohem významnější postavení chemoterapie, než u jiných molekulárních podtypů karcinomu prsu. Obecně jsou sice tyto nádory k chemoterapii vnímavější, nicméně přibližně u 30 % pacientek nenastává žádná výraznější odpověď na neoadjuvantní chemoterapii, což značí primární nebo získanou chemorezistenci, vůči které stále neexistují silné prediktory. Cílená léčba, která by pacientkám přinesla jednoznačný benefit dosud nebyla nalezena. Cíle projektu 1) Stanovit prevalenci triple-negativních karcinomů v české populaci pacientek s karcinomem prsu. 2) Provést bližší molekulární charakterizaci triple-negativních karcinomů prsu, s cílem identifikovat podskupinu tzv. basal-like karcinomů a expresi klíčových molekul použitelných jako diagnostické, prediktivní a prognostické biomarkery. 3) Zjistit zastoupení sporadické a hereditární formy triple-negativního karcinomu prsu v populaci českých pacientek. 4) Ve skupině sporadických triple-negativních karcinomů identifikovat karcinomy s poruchou v mechanismech regulujících expresi BRCA1 genu. Metodika viz publikace v samostatné příloze. Stav řešení v roce 2015 Ad 1) Stanovena prevalenci triple-negativních karcinomů v české populaci pacientek s karcinomem prsu. Na konsekutivní sestavě 515 pacientek s karcinomem prsu diagnostikovaným v MOÚ jsme zjistili, že prevalence triple-negativního karcinomu ve studované populaci českých žen činí 12,62 %. Toto číslo, stejně tak i výskyt dalších podtypů karcinomu prsu (viz tabulka 1), odpovídá literárním údajům, kde předmětem studia byla evropská populace žen. Tabulka č. 1. Prevalence jednotlivých molekulárně definovaných subtypů karcinomu prsu v populaci českých žen. 65

66 FENOTYP KARCINOMU PRSU Zastoupení Zastoupení N (počet) mezi karcinomy uvnitř skupiny CELKEM % TRIPLE NEGATIVNÍ 65 12,62% ER+ a/nebo PR+ a HER ,82% ER+/PR ,61% 81,9% ER+/PR ,41% 17,1% ER-/PR+ 4 0,8% 1,0% Luminal A (ER+ a/nebo PR+ a Ki-67<= 25%) % Luminal B (ER+ a/nebo PR+ a Ki-67 > 25%) % HER ,56% HER-2+/ER+ a/nebo PR+ (Luminal B) 39 7,57% 52,0% HER-2+/ER- a PR- 36 6,99% 48,0% Nelze stanovit 0 0% Ad 2) Provedena bližší molekulární charakterizace triple-negativních karcinomů prsu, s cílem identifikovat podskupinu tzv. basal-like karcinomů a expresi klíčových molekul použitelných jako diagnostické, prediktivní a prognostické biomarkery. Na konsekutivní sestavě 335 pacientek s triple-negativním karcinomem prsu (její charakteristika viz tabulka č. 3) jsme zjistili, že basal-like karcinomy tvoří naprostou většinu triple-negativních karcinomů i v naší populaci. Jejich zastoupení se pohybuje mezi 66,1 % až 76,6 %, a to dle kriterií, která se k definici této podskupiny použijí (viz tabulka č. 2.). Tabulka č.2. Molekulární klasifikace TNBC. Molekulární klasifikace TNBC na základě histologického a imunohistochemického vyšetření Definice Počet TNBC Basal-like TNBC Non-Basal-like TNBC Basal-like TNBC dle exprese CK5/6+ a/nebo CK14+ Basal-like TNBC dle exprese CK5/6+ a/nebo CK14+ a/nebo EGFR Basal-like TNBC dle exprese CK5/6+ a/nebo EGFR (66,1 %) 61 (33,9 %) (76,6 %) 44 (24,4 %) (65,7 %) 61 (34,3 %) 66

67 Tabulka č. 3. Charakteristika souboru pacientek s triple-negativním karcinomem prsu. Charakteristika souboru pacientek s triple-negativním karcinomem prsu Klinické stádium (335 pacientek) Histologie I 90 26,9 % Invazivní duktální karcinom ,0 % IIA 98 29,3 % Medulární karcinom 23 6,9 % IIB 49 14,6 % Medulární karcinom atypický 11 3,3 % Nediferencovaný karcinom 12 3,6 % IIIA 34 10,1 % Metaplastický karcinom 12 3,6 % IIIB 29 8,7 % Invazivní lobulární karcinom 6 1,8 % IIIC 24 7,2 % Apokrinní 2 0,5 % IV 10 2,9 % Ostatní 11 3,3 % Neurčeno 1 0,3 % Primární tumor patologická klasifikace Primární tumor klinická klasifikace pt0 14 4,3 % ct ,9 % pt ,7 % ct ,6 % pt ,3 % ct3 17 5,1 % pt3 11 3,4 % ct ,6 % pt4 16 4,9 % ctx 6 1,8 % ptx 1 0,3 % Regionální uzliny klinická klasifikace Regionální uzliny patologická klasifikace cn ,6 % pn ,0 % cn ,9 % pn ,9 % cn2 25 7,5 % pn ,2 % cn3 9 2,7 % pn3 18 5,9 % cnx 8 2,4 % pnx 0 0,0 % Chirurgický výkon Grading nádoru Neproveden primum 11 3,3 % Grade % Neproveden - regionální uzliny 30 9,0 % Grade ,6 % Parciální mastektomie ,4 % Grade ,4 % Radikální mastektomie ,6 % Nádorová exprese sledovaných znaků (IHC) Exstirpace sentinelové uzliny ,7 % ER-α a/nebo PR 0-1 % ,2 % Disekce axilly ,4 % ER-α a/nebo PR 2-10 % 6 1,8 % Systémová léčba HER ,4 % Nepodána 44 13,1 % HER ,7 % Neoadjuvantní chemoterapie 61 18,2 % HER2 2+ / FISH negat 29 8,7 % Adjuvantní chemoterapie ,7 % HER2 3+ / FISH negat 1 0,3 % Na bázi antracyklinů ,2 % Ki-67 < nebo = 50 % ,8 % Na bázi antracyklinů a taxanů ,9 % Ki-67 > 50 % ,2 % Na bázi taxanů 12 4,1 % ER-β negativní (0-10 %) ,9 % Ostatní 11 3,8 % ER-β pozitivní (> 10 %) 48 26,1 % Radioterapie AR negativní (0-1 %) ,8 % Adjuvantní radioterapie ,9 % AR pozitivní (> 1 %) 32 17,2 % Vícečetný výskyt malignit (72 pacientek) Cytokeratin 5/6 - negativní (0-2 %) 81 45,3 % Synchronní výskyt /tumory/ 26 16,8 % Cytokeratin 5/6 - pozitivní (> 2 %) 98 54,7 % Metachronní výskyt /tumory/ ,2 % Cytokeratin 14 - negativní (0-2 %) ,9 % Nádorové duplicity /pacienti/ 61 84,7 % Cytokeratin 14 - pozitivní (> 2 %) 83 45,1 % Nádorové triplicity /pacienti/ 11 15,3 % EGFR negativní (0 a 1+) 68 37,2 % Věk v době diagnózy EGFR pozitivní (2+ a 3+) ,8 % Medián (počet let) 56 Vimentin - negativní (0-2 %) 74 40,4 % Rozpětí Vimentin - pozitivní (> 2 %) ,6 % 67

68 Potvrdili jsme, ze se jedná o molekulární podtyp karcinomu prsu vyznačující se horší prognózou ve srovnání s ostatními podtypy. Výjimkou jsou karcinomy detekované v I. klin. stádiu, avšak za cenu podání adjuvantní chemoterapie (tab č. 4 a 5 ). Tab. 4: Tabulka přežívání pacientek s triple negativním karcinomem prsu v závislosti na klinickém stádiu nemoci. OS (ds) Procento přežívajících pacientek s TNBC Klinické stádium 2 roky 3 roky 5 let 9 let I IIA IIB IIIA IIIB IIIC IV Tab. 5: Věková struktura populace pacientek s karcinomem prsu (% případů dle věkových kategorií). Věk (roky) NOR 1* 0,5 % 1,8 % 17,5 % 22,5 % 26,0 % 32,2 % 20,5 % TNBC 2* 3,4 % 9,8 % 22,8 % 26,7 % 25,5 % 15,2 % 10,0 % BL-TNBC 3 3,7 % 7,4 % 30,1 % 28,2 % 23,3 % 11,0 % 3,1 % Vysvětlivky: Analyzované počty pacientek: , 2 408, 3 163; * - konsekutivní soubor; NOR Národní onkologický registr ČR, BL-TNBC basal-like triple negativní karcinom prsu. Srovnání rozdílů ve věkové struktuře mezi karcinomy prsu v NOR a TNBC v MOÚ, p=0,013. Statisticky signifikantní prognostický faktor ve vztahu k celkovému přežití byl již zmiňovaný věk. Nejvyšší riziko úmrtí v důsledku nemoci měly pacientky v nejmladší a nejstarší věkové skupině. V prvním případě je důvodem agresivita onemocnění v mladším věku, ve druhém případě pak nepodání chemoterapie (38,7 % pacientek nad 70let nedostalo systémovou léčbu, ve věkové skupině nad 80 let dokonce 88,2 %). Obecně tedy můžeme říci, že starší pacientky zřídka podstoupily náročnou systémovou léčbu. Nejčastějším důvodem jejího nepodání byl komorbidity a vysoké riziko komplikací vzhledem k pokročilému věku a očekávanému přežití i bez léčby. Nepodání chemoterapie, nebo její nepodání v plánovaném rozsahu, bylo vysoce signifikantně spojeno s horším přežitím (p<0,0001). Pacientky ve věkové skupině 41 až 70 let měly celkové přežití nejlepší. Věk nad 75 let byl spojen s horším OS(ds) (p=0,035) i DFS (p=0,007). Graficky znázorněno na obr. č.1. a 2. Výsledky jsme publikovali na zahraničních kongresech formou posterů. 68

69 Obr. 1: 3D graf znázorňující riziko úmrtí (osa y) pacientek s triple negativním karcinomem prsu ve vztahu k věku v době diagnózy (osa x) a k době trvání nemoci (osa z, zkráceno na prvních 50 měsíců). Nejvyšší riziko úmrtí z důvodu progrese nemoci mají pacientky mladší 35 let a starší 70 let. Výskyt relapsů se také lišil v i jednotlivých věkových skupinách, jak ukazuje následující obrázek. Nejvyšší riziko relapsu měly pacientky nad 75 let (p<0,05). Obr. 2: Výskyt relapsů ve vztahu k věku pacientek s TNBC v době diagnózy. Ad 3) Zjistit zastoupení sporadické a hereditární formy triple-negativního karcinomu prsu v populaci českých pacientek. Z konsekutivní kohorty 348 pacientek s TNBC bylo 161 pacientek testováno na přítomnost zárodečné mutace BRCA1 genu a 134 pacientek na mutaci v BRCA2 genu (viz tabulka č. 6). Výsledky sekvenací byly korelovány s molekulárními podtypy triple-negativních karcinomů Statistickým zpracováním získaných dat byly zjištěny: 1. relativní incidence 69

70 BRCA1 a BRCA2 mutace u TNBC v závislosti na věku pacientek v době zjištění prvního nádorového onemocnění, 2. molekulární fenotyp tumoru nesoucí alteraci v BRCA1 genu. Obě analýzy mají zásadní dopad pro klinickou praxi. V prvním případě z výsledků vyplývá, že v naší populaci nemá smysl indikovat genetické vyšetření mutačního stavu BRCA1 a BRCA2 genů u pacientek s triple-negativním karcinomem prsu, u kterých bylo onemocnění diagnostikováno ve věku 51 a více let, není-li k tomu další indikace, např. výskyt malignit charakteristický pro rodiny s mutací v BRCA genech. U žen v dané věkové kategorii, kterým jsme nabídli genetické testování mutačního stavu BRCA genů, se patogenní mutace v těchto genech nevyskytovaly. Ve druhém případě výsledky v současnosti patentujeme, neboť mohou sloužit jako rychlá screeningová metoda pro vyhledávání karcinomů nesoucích BRCA1 mutaci a vhodných pro cílenou léčbu PARP inhibitory nebo léčbu cytostatiky, která vedou ke tvorbě dvojitých zlomů DNA (např. deriváty platiny). Tabulka č. 6. Výskyt mutace v BRCA1/2 genu v závislosti na věku pacientek s triplenegativním karcinomem prsu. Ad 4) Ve skupině sporadických triple-negativních karcinomů identifikovat karcinomy s poruchou v mechanismech regulujících expresi BRCA1 genu. Metylace promotoru pro BRCA1 gen Metylací promotoru určitého genu lze dosáhnout stejného biologického efektu jako v případě jeho mutace, která způsobí produkci nefunkčního proteinu, nebo produkci zamezí úplně. Za účelem stanovení stavu metylace promotoru genu BRCA1 jsme testovali 2 typy primerů na souboru 63 TNBC. Vyšetření se v případě primerů 2 podařilo provést u všech karcinomů, u primerů 1 u 60 karcinomů (viz tabulka 7). Tabulka č. 7. Metylace promotoru BRCA1 genu u triple-negativních karcinomů Procento karcinomů s dosaženou hladinou metylace promotoru genu BRCA1 Hladina metylace 2% 10% 20% 40% 60% 90% promotoru BRCA1 Primery 1 48,3% 30% 21,7% 16,7% 11,7% 5% P=0,66 P=0,63 P=0,31 P=0,56 P=1,0 P=1,0 Primery 2 23,8% 17,5% 14,3% 11,1% 9,5% 3,3% P=0,3 P=0,57 P=0,6 P=0,57 P=1,0 P=1,0 70

71 Ani v jednom případě, jak ukazují výsledky Fisherova testu, nebyla prokázána spojitost mezi hypermetylací promotoru a mutačním stavem genu BRCA1, a tedy ani mezi sporadickým a hereditárním TNBC. Spojitost mezi jednotlivými, molekulárně charakterizovanými podtypy triple-negativního karcinomu prsu ukazuje obrázek č. 1 Obr. 1: Spojitost mezi jednotlivými podtypy karcinomu prsu Publikace a přednášky v roce 2015: Navrátil J, Fabian P, Palácová M., Petráková K., Vyzula R., Svoboda M. Triple negativní karcinom prsu. Klin Onkol 2015; 28(6): Svoboda M, Navrátil J, Slabý O. Imunoterapie v prevenci a léčbě karcinomu prsu. Klin Onkol 2015; 28(6): Svoboda M, Navrátil J, Palácová M, Fabian P, Bareková L, Kabut T, Coufal O, Fait V, Jurácek J, Selingerová I. Triple-negative breast cancer: A single-centre retrospective cohort study of 408 TNBC cases with a focus on elderly patients. Proceedings of the 105th Annual 71

72 Meeting of the American Association for Cancer Research; 2015 Dec 8-12; San Antonio, Texas: AACR; Cancer Res 2015; Suppl: Abstract P Navratil J, Palacova M, Svoboda M. et al. Triple-negative breast cancer: a single-centre retrospective cohort study of 408 patients ( ). Global Breast Cancer Conference & 4th International Breast Cancer Symposium April Abstract No. AF0292, Soul, South Korea. Navrátil J., Svoboda M., Palácová M, Fabian P., Folberová J., Baldíková L., Princ D., Kudláček A., Bílek O., Kazda T., Grell P., Juráček J., I. Selingerova I., Vyzula R. Triple negativní karcinom prsu: analyza souboru pacientek diagnostikovanych a/nebo lečenych v Masarykově onkologickem ustavu v letech Edukační sborník XXXIX. Brněnských onkologických dnů a XXIX. Konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky, Brno, Brno (CZ): Masarykův onkologický ústav; Plán pro rok 2016 Projekt bude pokračovat i v následujících letech. Plánujeme publikovat data v časopisu s IF a dále se připravuje klinická studie pro pacientky s TNBC podstupující neoadjuvantní léčbu s využitím molekulárního prediktoru Bcl-2. 72

73 2. PREDIKCE ODPOVĚDI NA CÍLENOU PROTINÁDOROVOU LÉČBU U PACIENTEK S HER2 POZITIVNÍM KARCINOMEM PRSU Hlavní řešitel projektu: doc. MUDr. Marek Svoboda, Ph.D. a MUDr. Peter Grell, Ph.D. Anotace projektu Zhoubné novotvary prsu představují druhou nejčastější malignitu u žen. U cca 15 až 20 % z nich je detekována vysoká exprese HER2 receptoru a/nebo amplifikace Her-2/neu genu (tzv. HER2 pozitivní karcinomy), vedoucí k horší prognóze choroby. U těchto pacientek je pro klinickou praxi k dispozici cílená anti-her2 protinádorová léčba (např. monoklonální protilátka proti HER2 receptoru trastuzumab), jejímž použitím dochází k signifikantnímu zlepšení léčebných výsledků. I přesto, že je trastuzumab podáván pacientkám s HER2 pozitivním karcinomem, nastává léčebná odpověď pouze v cca 40 % případů. Zejména vzhledem k nákladům na tuto cílenou terapii, vyvstává potřeba identifikovat molekulární markery vhodné k predikci primární a sekundární rezistence u HER2 pozitivního karcinomu prsu a jejich pomocí individualizovat v budoucnosti léčbu a předcházet aplikování neúčinných, potenciálně kardiotoxických, vysoce nákladných léčiv. Dosud publikované práce a naše předběžné výsledky ukazují, že navrhovanou analýzou Akt signální dráhy a sérové hladiny HER-2 receptoru, lze dosáhnout požadovaných prediktivních ukazatelů. Cíle projektu Zhodnotit efektivitu léčby trastuzumabem na vlastním souboru pacientek a identifikovat potenciální prediktivní faktory, a to zejména s ohledem na předpokládané mechanismy rezistence k trastuzumabu. Metodika Zpracovaný je soubor 103 pacientek s HER2 pozitivním metastatickým karcinomem prsu, které byly léčené cílenou anti-her2 terapií na bázi trastuzumabu. Jedná se o referenční soubor pro další molekulární analýzy. Stav řešení v roce 2015 V roce 2015 probíhala aktualizace dat v rámci období sledování pacientek, tzv. follow-up V předchozích letech jsme dokončili analýzu exprese a aktivity Akt kinázy ve vztahu ke klinickým a morfologickým parametrům. Naše studie je první, která poukazuje na význam kompartmentalizace Akt kinázy v predikci cílené anti-her2 terapie a na negativní prediktivní význam aktivované formy S6K a GSK3-beta kinázy. Naše výsledky lze interpretovat tak, že anti-her2 cílená léčba je efektivní zejména v těch případech, kde není porušena signální transdukce HER2 signální dráhy. Její narušení, např. kumulací Akt kinázy v cytoplasmě, kde vykonává svoji antiapoptotickou úlohu, pak může vést k rezistenci na cílenou léčbu. V případě S6K kinázy je možný klinický dopad našeho pozorování v tom, že pacientky s nádorovou expresí aktivované formy S6K kinázy jsou kandidátky na kombinovanou blokádu PI3K/AKT/mTOR signální dráhy (viz obrázek č. 2). Publikace s výsledky projektu v roce 2015 V roce 2015 nebyly v tomto projektu publikovány žádné výsledky Obrázek č. 1. Závislost času do progrese karcinomu prsu léčeného anti-her-2 cílenou terapií na aktivitě S6K kinázy 73

74 Obrázek č. 2. Možnosti využití AKT a S6K kinázy jako prediktivních biomarkerů u Her-2 pozitivního karcinomu prsu. Plán pro rok 2016 V roce 2016 plánujeme vytvořit novou kohortu pacientek s HER2+ karcinomem prsu. Důvodem je spotřebování dosavadního materiálu archivovaného v parafinových blocích z původní kohorty, zejména však potřeba vytvořit i kohortu pacientek s nemetastatickým onemocněním léčeným anti-her2 cílenou terapií. Předpokládáme zařazení cca 200 pacientek. 3. MOZKOVÉ METASTÁZY U KARCINOMU PRSU Hlavní řešitel projektu: MUDr. Markéta Palácová, doc. MUDr. Marek Svoboda, Ph.D., MUDr. Jana Folberová. 74

75 Anotace projektu Metastatické postižení v CNS významně a negativně ovlivňuje nejenom další léčbu karcinomu prsu, ale především celkový vývoj onemocnění a osud postižených pacientek. V případě karcinomu prsu nastává tato komplikace u přibližně 10 % pacientek, některé fenotypy jsou však zatíženy mnohem vyšší incidencí těchto metastáz. Tato skutečnost se projevila zejména v současné době, kdy jsme schopni pomocí cílené léčby dosáhnout úspěšné kontroly extrakraniální části nádorového onemocnění, zatímco hematoencefalická bariéra omezuje průnik některých těchto léčiv do CNS (např. monoklonálních protilátek). Cíle projektu Sestavit konsekutivní soubor pacientek s karcinomem prsu, u kterých bylo diagnostikováno metastatické postižení CNS a na tomto souboru stanovit základní klinicko-patologické charakteristiky a případně určit prediktory vzniku CNS metastáz. Metodika Bude zkoumán konsekutivní soubor pacientek s karcinomem prsu z mozkovými metastázami, analyzovány budou klinické a histopatologické údaje, nálezy zobrazovacích metod. Realizována budou imunohistochemicka vyšetření ER, PR, HER-2 receptorů, cadherinů, integrinů, p53 v primárním tumoru, FISH analýza Her-2/neu genu v primárním tumoru. Biostatistické zpracování dat. Stav řešení v roce 2015 Je sestaven soubor o 187 pacientkách s karcinomem prsu, jejichž onemocnění metastazovalo do CNS. V uvedené sérii byla incidence HER-2+ karcinomu nejvyšší, a to 42% ze 162 karcinomů, u kterých bylo možné stanovit statut HER-2 receptoru a/nebo genu, respektive 37% z celého souboru 187 karcinomů. V souboru 112 pacientek léčených paliativní protinádorovou léčbou s trastuzumabem jsme v průběhu léčby zaznamenali u 31 pacientek relaps v CNS, tj. 27,7%. Naše pozorování tak potvrzují, že metastatické postižení CNS je důsledkem agresivity HER-2+ karcinomu prsu, které v současnosti vyniká zejména na pozadí schopnosti trastuzumabu účinně kontrolovat nádorové onemocnění pouze extrakraniálně. Dalším fenotypem s vysokým rizikem vzniku mozkových metastáz je triple-negativní karcinom, který od vzniku disseminace choroby metastazuje do CNS ze všech molekulárních podtypů nejdříve. Publikace s výsledky projektu v roce 2015 Projekt nebyl v roce 2015 prezentován. Plán pro rok 2016 Rozšíření souboru o pacientky, u kterých byly aplikovány moderní techniky radioterapie na oblast metastatického postižení CNS. Aktualizace klinických dat, statistické zpracování. 4. ANDROGENOVÝ RECEPTOR JAKO BIOMARKER EFEKTIVITY NEOADJUVANTNÍ CHEMOTERAPIE (NCT), DÉLKY BEZPŘÍZNAKOVÉHO OBDOBÍ (DFI), POPŘ. CELKOVÉHO PŘEŽITÍ (OS) U PACIENTEK S TRIPLE-NEGATIVNÍM A HER2 POZITIVNÍM/SR NEGATIVNÍM KARCINOMEM PRSU Hlavní řešitel: MUDr. Markéta Palácová, MUDr. Pavel Fabian, Ph.D. 75

76 Anotace projektu Androgenový receptor (AR) patří do rodiny jaderných steroidních receptorů a vykazuje vysokou strukturální, funkční a topografickou podobnost s estrogenovým a progesteronovým receptorem. Doposud však není zřejmé, jakou roli hraje jako prognostický a prediktivní faktor. AR je exprimován v 70-90% invazivních karcinomů prsu, častěji jak ER (60-80 %) a PR (50-70%). Androgenový receptor byl prokázán jako nezávislý prognostický faktor ( signifikantní marker v parametru TTP a DSS (disease specific survival) prokazující lepší výsledky u pacientek s expresí SR. Skupina nádorů prsu ER negativních se jeví jako heterogenní s rozdílnými molekulárními subtypy. Hladina AR rozděluje SR negativní nádory na dvě velké skupiny ER-/AR- (basal) a ER-/AR+ (apokrinní ) subtypy. Ve skupině apokrinní nádorů byla nalezena poměrně vysoká HER 2 pozitivita (50-72%). Vysoká exprese HER 2 u molekulárního apokrinního subtypu naznačuje možnou koexpresi HER 2 a genů pro steroidní receptory u tohoto typu nádoru. Exprese AR u triple negativních nádorů prsu je podstatně menší - popisována je pouze u 25-35% nádorů. Zatímco je prokázána korelace mezi expresí ER,AR a lepší prognózou, u TNBC a HER 2 pozitivních nádorů jsou data rozporuplná. Někteří autoři prokazují, že exprese AR u TNBC je signifikantně spojena s delším DFS (disease free survival) a delším přežitím, a dokonce rozdělují skupinu TNBC na AR pozitivní s příznivější prognózou a AR negativní s horší prognózou. Cíle projektu Zjistit, zda existuje spojitost mezi expresí AR a efektivitou neoadjuvantní chemoterapie, hodnoceno v parametru pcr, DFS a popř. celkovým přežitím u pacientek s triple-negativním a HER 2 pozitivním/er a PR negativním karcinomem prsu. Metodika Retrospektivní analýza dat soubor pacientek s karcinomem prsu, selektivně pouze nádory s negativními steroidními receptory, které byly léčeny neoadjuvantní chemoterapií, popř. neoadjuvantní biologickou léčbou v MOÚ v letech Vyšetření ER, PR a AR bude provedeno imunohistochemicky, vyšetření HER 2 imunohistochemicky a v případě IHC 2 a 3+ i metodou FISH. Histopatologické nálezy budou doplněny o klinická data z lékařské dokumentace (GREYFOX). Zařazeny a analyzovány budou pouze pacientky léčené v MOÚ. Předpokládaná velikost souboru: 200 žen. Stav řešení v roce 2015 Sběr klinických dat a jejich statistické zpracování. Plán pro rok 2016 Aktualizace klinických dat a jejich publikování. Publikace v roce 2015: Svoboda M, Navrátil J, Palácová M, Fabian P, Bareková L, Kabut T, Coufal O, Fait V, Jurácek J, Selingerová I. Triple-negative breast cancer: A single-centre retrospective cohort study of 408 TNBC cases with a focus on elderly patients. Proceedings of the 105th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research; 2015 Dec 8-12; San Antonio, Texas: AACR; Cancer Res 2015; Suppl: Abstract P Časopis s IF v 2014: 9,329. Navratil J, Palacova M, Svoboda M. et al. Triple-negative breast cancer: a single-centre retrospective cohort study of 408 patients ( ). Global Breast Cancer Conference & 76

77 4th International Breast Cancer Symposium April Abstract No. AF0292, Soul, South Korea. 5. IDENTIFIKACE BIOMARKERŮ UMOŽŇUJÍCÍCH PREDIKCI RIZIKA RELAPSU A INDIVIDUALIZACI PROTINÁDOROVÉ LÉČBY U PACIENTEK S KARCINOMEM PRSU T1-3N0-1M0 Hlavní řešitelé projektu: doc. MUDr. Marek Svoboda, Ph.D., Mgr. Jaroslav Juráček, MUDr. Pavel Fabian, Ph.D., doc. RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D. Anotace projektu V ČR v současné době neexistuje účinné molekulárně-biologické vyšetření umožňující rozdělit pacientky v časných stádiích mamárního karcinomu do skupin podle rizika jejich nádorového onemocnění, kvantifikovat jaký prospěch chemoterapie dané pacientce přinese, a individualizovat tak jejich léčebný plán. Možnost takového vyšetření by společně s dalšími klinickými ukazately umožnila klinickému onkologovi a pacientce samotné racionálně zhodnotit rizika a rozhodnout o podání systémové chemoterapie. V USA a některých státech EU jsou již s tímto typem vyšetření zkušenosti, přičemž v USA je k dispozici OncoTypeDX společnosti GenomicHealth Inc. ( v EU potom MammaPrint společnosti Agendia. Jsou tak k dispozici nejen data ukazující citlivost tohoto typu vyšetření a přínos pro kvalitu života cílové skupiny pacientek, ale také ekonomické ukazatele demonstrující zásadní úspory pro zdravotní systém spojené se zavedením tohoto vyšetření. Oba produkty vyhodnocují míru rizika rozvoje vzdálených metastáz v dlouhodobém časovém horizontu na základě genové exprese vybraných, řádově desítek, genů souvisejících s nádorovou biologií a metastazováním. Design tohoto vyšetření lze nejlépe demonstrovat na produktu OncoTypeDX. Toto vyšetření zahrnuje analýzu genové exprese sady 21 genů, které jsou členěny do skupin na základě biologické funkce na geny spojené s buněčnou proliferací, invazivitou, HER2 signalizací, přítomností estrogenových receptorů a referenční geny. Analýzy je prováděna metodou Real-Time PCR, a celkové riziko vyhodnocuje matematický algoritmus, který přidělí danému pacientovi míru pravděpodobnosti (recurrence score) progrese onemocnění v následujících 10 letech. MammaPrint je založen na principu DNA čipů (nesoucích sondy pro 70 genů, které jsou publikovány), a vyžaduje pro analýzy nativní materiál karcinomu prsu, což významně značně limituje jeho použitelnost ve srovnání s produktem OncoTypeDX, který pracuje s biologickým materiálem uloženým v parafinových blocích (FFPE). Sady genů, na kterých jsou OncoTypeDX a MammaPrint založeny, lze v současné době definovat vhodněji (rozšířit je) za účelem dosažení lepších analytických parametrů. Cíle projektu V předkládaném projektu bychom nejprve (i) provedli metaanalýzu dostupných studií (z let ) zaměřených na identifikaci genů umožňujících predikovat vývoj onemocnění u pacientek v časných stádiích mamárního karcinomu, (ii) navrhli bychom prediktivní sady genů (přibližně 20-30), které bychom dále (iii) validovali v retrospektivní klinické studii ve spolupráci s MOU, přičemž předpokládáme zařazení přibližně pacientek. Metodou 77

78 použitou v těchto analýzách by byla Real-Time PCR a vstupním biologickým materiálem nádorová tkáň fixovaná ve formalínu a uložená v parafinovém bloku. Metodika V prvním fázi řešení projektu vytvoříme retrospektivní soubor pacientek s karcinomem prsu v časném stádiu onemocnění. Na základě detailně zpracovaných klinicko-patologických parametrů bude rozdělen do skupin dle času do progrese. Bude provedena izolace mirna (mirvana mirna Isolation Kit, Ambion) z tkáně uložené v parafinových bločcích (FFPE) primárních tumorů pacientek s karcinomem prsu, jejichž biologický materiál je deponován na Oddělení onkologické patologie Masarykova onkologického ústavu (MOÚ). A dále provedeme analýzu exprese vybraných genů souvisejících s nádorovou biologií a metastazováním a provedeme také expresi vybraných mikrorna, které hrají rovněž úlohu v nádorové biologii (mir- 9, mir-34a, mir-210a mir-128a). Výsledky expresní analýzy budeme korelovat s mírou rizika rozvoje vzdálených metastáz v dlouhodobém časovém horizontu. Stav řešení v roce 2015 V roce 2015 jsem aktualizovali klinická data souboru pacientek. Očekáváme, že s narůstajícím mediánem sledování budou přibývat i relapsy onemocnění, což umožní validovat dosavadní výsledky, kdy na retrospektivním souboru 74 FFPE tkání karcinomu prsu ve stadiu I a II (66 bez relapsu, 6 s relapsem) jsem analyzovali prognostické vlastnosti vybraných tkáňových mirna (mir-34a, mir-210, mir-9 a mir-128a) ve vztahu k riziku relapsu onemocnění. Nalezli jsme signifikantní rozdíly hladin exprese tří mirna (mir-34a, mir-210 a mir-128a) mezi skupinami pacientek s relapsem a bez relapsu do 5 let od diagnózy. Naše výsledky jsme validovali na větším souboru pacientek (113 bez relapsu, 13 s relapsem). Byla provedena normalizace expresních dat a nalezeny signifikantní rozdíly hladin exprese u 2 mirna (mir-210, p=0,0175; mir-128a, p=0,0069) mezi skupinami pacientek s relapsem a bez relapsu do 5 let od diagnózy. normalized gene expression mir-34a bez relapsu relaps normalized gene expression mir bez relapsu ** p=0,0069 relaps normalized gene expression mir bez relapsu * p=0,0175 relaps normalized gene expression mir bez relapsu relaps 78

79 Plán na rok 2016: Pokračování ve sběru dat a funkčních analýzách mikrorna. Současně máme v plánu rozšíření výzkumu na sérové mikrorna. 79

80 6. VÝZNAM CYKLIN-DEPENDENTNÍ KINÁZY 12 (CDK12) V PATOGENEZI A PREDIKCI U KARCINOMU PRSU A DALŠÍCH MALIGNIT. Hlavní řešitelé projektu: doc. MUDr. Marek Svoboda, Ph.D., Mgr. Jaroslav Juráček, MUDr. Pavel Fabian, Ph.D., MUDr. Marie Navrátilová, Ph.D. Anotace projektu Mechanismus opravy poškozené DNA představuje kritický obranný systém v lidském těle, jehož cílem je zachování integrity a stability genomu. Na straně druhé, schopnost nádorových buněk opravovat poškozenou DNA je jednou ze základních příčin selhání protinádorové léčby. Tyto skutečnosti byly dosud nejlépe demonstrovány na modelu karcinomu prsu. Gen BRCA1, který hraje zásadní roli v procesu opravy/reperace DNA a při vývoji mléčné žlázy, se uplatňuje i v průběhu kancerogeneze a při odpovědi nádoru na systémovou léčbu. Nosičky mutovaného BRCA1 genu mají významně zvýšené riziko vzniku karcinomu prsu a vaječníků, současně jsou však tyto nádory vnímavější k protinádorové léčbě způsobující poškození DNA. Stejný dopad jako patogenní mutace může mít na funkci BRCA1 genu, kromě jiného, i řízení její transkripce aktivitou cyklin-dependentní kinásy 12 (CDK12). Tuto biologickou funkci CDK12 poprvé prokázal právě tým spoluřešitele. Projekt je zaměřen na studium epidemiologických, genetických a klinicko-patologických aspektů CDK12 pozitivních a/nebo mutovaných karcinomů v populaci žen se zhoubným novotvarem prsu a vaječníků, s možností rozšíření na další malignity. Na primárních tumorech a na preklinických modelech chceme identifikovat CDK12-dependentní geny a popsat molekulární funkci CDK12 v procesu karcinogeneze. Předpokládáme, že získané poznatky budou použitelné ke zpřesnění diagnostiky studovaných onemocnění a k predikci efektivity protinádorové léčby, jejíž účinek je založený na poškození DNA. Cíle projektu 1) Stanovit prevalenci karcinomů se zvýšenou expresí CDK12 v populaci pacientek se sporadickou a hereditární formou ZN prsu a vaječníků. 2) Stanovit prevalenci karcinomů s mutovanou formou CDK12 v populaci pacientek se sporadickou a hereditární formou ZN prsu a vaječníků. 3) Zjistit, zda existuje vztah mezi expresí CDK12 a některou z epidemiologických, klinických, histologických či molekulárních charakteristik pacientek a jejich nádorů. 4) Provést bližší molekulární charakterizaci CDK12 pozitivních karcinomů, s cílem identifikovat expresi klíčových molekul potenciálně využitelných ke zpřesnění diagnostiky a k predikci efektivity protinádorové léčby těchto karcinomů. Stav řešení v roce 2015 K určení prevalence nádorů se zvýšenou expresí CDK12 byla použita konsekutivní kohorta čítající 220 karcinomů prsu. Vyšetření bylo realizovatelné u 196 karcinomů (89 %), přičemž 87 % z nich vykazovalo homogenní silnou pozitivitu barvení ( % všech nádorových buněk), značícího vysokou expresi CDK12. Naopak zcela negativních bylo 3,5 % karcinomů. Z toho vyplývá, že přítomnost jakéhokoliv množství proteinu CDK12 byla prokázána u více než 96 % karcinomů prsu (viz tab. č.1, obrazek č.1). Screening na funkci CDK12, provedený na souboru 200 pacientek s ovariálním karcinomem, neprokázal žádný výpadek funkce CDK12, tj. všechny ovariální karcinomy měly funkční CDK12 řízenou opravu poškozené DNA. I když jsme vynaložili velké úsilí nalézt mutaci v genu pro CDK12 ve studovaných subtypech karcinomu prsu, v konečném důsledku se nám nepodařilo identifikovat de novo 80

81 mutaci CDK12 v nádorových vzorcích. Současně jsme nenalezli ani hereditární mutaci v genu pro CDK12 asociovanou se syndromem karcinomem prsu/ovárií. Tab. č. 1: Základní klinická, morfologická a histopatologická charakteristika souboru 217 pacientek / 220 nádorů karcinomu prsu Parametr n % Parametr n % Věk (roky) Grading Medián 60 G % Rozptyl G % Sledování (měsíce) 126 G % Relaps % Histologie Úmrtí v důsledku C % Invazivní duktální (NST) % pt Invazivní lobulární % % Smíšený inv.dukt. a lob % % Tubulolobulární 7 3 % % Tubulární 7 3 % % Mucinózní 11 5 % pn Papilární 3 1 % % Medulární (a/typický) 2 (1/1) 1 % % Ostatní 5 2 % % Imunohistochemie % ER pozitivní % Klinické stádium PR pozitivní % I % HER2 pozitivní 4 2 % IIA % Ki % % IIB % Fenotyp IIIA 7 3 % Luminalní A % IIIB 5 2 % Luminální B % IIIC 2 1 % HER2 pozitivní 4 2 % IV 0 0 % Triple negativní 6 3 % Vysvětlivka: C50 karcinom prsu Klinickou část výzkumu jsme soustředili na model karcinomu prsu, kde jsme podrobně analyzovali vztah mezi expresí CDK12 a epidemiologickými, klinickými, histologickými a molekulárními charakteristikami pacientek a jejich nádorů. Prokázali jsme, že vysoká exprese CDK12 je spojená obecně s agresivnějším fenotypem onemocnění (HER2 pozitivní, triple negativní a luminální B, p=0,0053; ve stejném pořadí klesá míra exprese) a jeho zvýšenou proliferací (vysoký počet mitóz a narůstající hodnota markeru Ki-67, p=0,0064 a 0,0017), s častějším nálezem metastatického postižení regionálních lymfatických uzlin (p=0,0029) a vyšším klinickým stádiem onemocnění (p=0,0268). Naopak, nezjistili jsme žádné významné rozdíly v expresi CDK12 mezi skupinami pacientek odlišujícími se věkem v době diagnózy a mutačním stavem BRCA genu. V souladu s těmito výsledky jsme u nádorů s vysokou expresí CDK12 zaznamenali i zvýšený výskyt relapsů (p=0,0097) a úmrtí pacientek v důsledku nádorového onemocnění (p=0,0087), což se odrazilo i v parametrech přežití. Zjistili jsme, že vysoká nádorová exprese ( 70 % buněk pozitivních) je spojena s horšími výsledky přežití, respektive v této skupině pacientek došlo ke všem relapsům i k úmrtím v důsledku rakoviny 81

82 prsu. Rozdíl v DFS mezi oběma skupinami pacientek (% nádorových buněk exprimujících CDK12 < 70 vs 70 %) byl jednoznačně statisticky signifikantní (p=0,0373, obr. č.2 ), v případě OS pak hraničně (p=0,0579, obr. č. 3). Multivariační analýza však prokázala, že jak pro predikci DFS, tak i OS, je nádorová exprese CDK12 zcela nezávislým faktorem (DFS: p=0,0301; OS: p=0,0402). Hodnotili jsme vliv i dalších faktorů na parametry přežití pacientek v našem souboru, ve kterém dosáhl medián sledování 126 měsíců, tj. 10,5 roku. Jejich přehled je uveden v tabulkách ve výsledkové části. Obr. č.1 histogram rozložení hodnot nádorové exprese CDK12 Údaje o prevalenci nádorové exprese CDK12 byly pro nás značným překvapením, neboť jsme původně očekávali existenci zřetelné skupiny pacientek s poruchou exprese / funkce CDK12, ve které bychom identifikovali i mutace CDK12. Pravdou je, že v době přípravy tohoto grantového projektu, tj. v roce 2012, se naše hypotézy mohly opřít pouze o 4 publikace věnující se funkci CDK12 v patogenezi nádorů, z toho jednou z nich byla práce dr. Kohoutka a dr. Blazka publikovaná v Genes and Development (IF 12.64, 1. místo mezi časopisy v kategorii Developmental Biology Research Journals ). V posledních dvou letech se však výzkum v oblasti CDK12 stal prioritou řady laboratoří, neboť se prokázala její potenciální role v kombinované cílené léčbě nádorů prsu a ovárií PARP inhibitory (Bajrami I et al, Cancer Res 2014;74(1): ). Naše výsledky jsme konzultovali s předním odborníkem v této oblasti, profesorem Geoffrye Shapirem, který práci dr. Kohoutka citoval i ve své vyzvané přednášce na San Antonio Breast Cancer Symposium Profesor Shapiro potvrdil, že všechna naše pozorování jsou ve shodě s jejich. Správnost našich výsledků navíc potvrzuje i zcela recentní publikace z ledna 2016, ve které byla somatická mutace v CDK12 prokázána pouze u jednoho karcinomu prsu z 1000 analyzovaných a necelých 4 % serózních ovariálních karcinomů (Popova et al. Cancer Res 2016 Epub ahead of print). Dále se prokázalo, že v experimentech na myších má ztráta funkce CDK12 za následek embryonální letalitu. Z toho se dá usuzovat, že zárodečné mutace nelze ani u lidí předpokládat. 82

83 Obrázek 1: Srovnání proteinové hladiny CDK12 v různých subtypech zhoubného novotvaru prsu. Proteinové lyzáty byly připraveny ze vzorků pacientek se subtypem zhoubného novotvaru prsu luminální A, luminální B, HER2 pozitivní a triple negativní (Lu-A, Lu-B, HER2, TN). Vlastní číslo představuje daného pacienta a označení 1c nádorovou tkáň. Metoda western blotu byla využita k detekci proteinových hladin CDK12 (CDK12) a cytokeratinu 19 (CK19, kontrola inputu) specifickými protilátkami. Kromě práce zaměřené na poznání klinicko-patologických korelací nádorové exprese CDK12, probíhaly paralelně i laboratorní experimenty sloužící k podrobnější funkční charakterizaci CDK12, s cílem využít případných poznatků k predikci efektivity protinádorové léčby způsobující poškození DNA nebo opravných mechanismů tohoto poškození. V souladu se zadáním projektu byly použity nádorové linie odvozené nejenom od karcinomu prsu, ale i od ovariálního a kolorektálního karcinomu. Abychom identifikovali CDK12 dependentní geny museli jsme v uvedených buněčných liniích cíleně manipulovat nejenom s genovou expresí vlastní CDK12, ale i dalších genů, regulovaných touto cyklin dependentní kinázou (např. BRCA1). Pomocí expresních DNA čipových analýz a multiplexových qrt-pcr vyšetření, jsme našli geny a nekódující mikrorna, jejichž exprese je významně snížena v nepřítomnosti funkčního genu pro CDK12 (obr. č. 4). Podle předpokladu byly ve skupině genů se sníženou expresí geny zapojené do opravných mechanismů DNA (BRCA1, BRCA2, FANCD2, ATM, RAD50, MSH2, RFC4 a další). 83

84 Obr. č. 2: Kaplan-Meierovy křivky: DFS - přežití bez známek choroby u pacientek s karcinomem prsu v závislosti na expresi CDK12 (v měsících). Obr. č. 3: Kaplan-Meierovy křivky: OS - celkové přežití u pacientek s karcinomem prsu v závislosti na expresi CDK 12 (cut-off 70 %). 84

85 Obrázek 4: Hladiny mirna stanovených RT-qPCR metodikou. Z nalezených mirna v tabulce R, jsme vybrali 5 mirna k ověření jejich hladiny v situaci s nefunkční CDK12 (oranžový sloupec) a sníženou hladinou CDK13 (šedý sloupec) ve srovnání s kontrolními buňkami (modrý sloupec). Kromě nich byla významná část identifikovaných genů (více než 30) zapojena do metabolismu lipidů, především sfingomyelinu a ceramidu (např. FABP3, SMPD2, G6PD) (obr. č. 5), a nukleových kyselin. Protože metabolismus lipidů hraje důležitou úlohu jak ve fyziologii prsu, tak i patogenezi nádorových onemocnění a v procesu apoptózy, věnovali jsme se této problematice podrobněji a za využití HPLC-MS metodiky jsme hledali rozdíly vybraných mastných kyselin a lipidů v nádorových buňkách lišících se expresí CDK12. V provedené analýzách jsme pozorovali statisticky významné snížení ceramid-fosfátu v nepřítomnosti CDK12. A) B) C) Obrázek 5: Hladiny mrna genů zapojených v metabolismu lipidů. Z buněk se sníženou hladinou cyklinu K (CCNK), CDK12 (CDK12) a CDK13 (CDK13) byla izolována celková RNA. Metoda RT-qPCR byla použita k určení hladin mrna. Experiment představuje výsledek ze tří nezávislých opakování. Za naše nejvýznamnější experimentální pozorování lze považovat jev, kdy snížená exprese CDK12 senzitizuje nádorové buňky, nejen karcinomu prsu, k antiproliferačnímu účinku 85

86 nízkomolekulárního inhibitoru checkpoint kinázy 1 (CHK1), která patří mezi kritické regulátory buněčného cyklu. Detailním studiem daného fenotypu jsme zjistili, že snížená hladina CDK12 indukuje expresi inhibitoru CDK kináz proteinu p21, přičemž exprese p21 je nezávislá na funkčnosti p53 proteinu a zvýšená hladina p21 vede k zástavě buněčného cyklu v G1/S a G2/M přechodech po aplikaci CHK1 inhibitoru (obr. 6). Toto pozorování jsme učinili jako vůbec první. Obrázek 6: (A, B) Grafy reprezentují výsledky proliferačních esejí v HCT116 p53+/+ a v HCT116 p53-/- buňkách. Po transfekci jednotlivými sirna byly provedeny expozice 0, 0,3 nebo 1 um CHK1 inhibitorem LY (C) Snížení proteinových hladin CDK12, CDK13 a BRCA1 bylo potvrzeno i na western blotu 72 hodin po transfekci jednotlivými sirna. Stejně tak hladina p53 byla stanovena v příslušných p53 +/+ a p53 -/- liniích. Proteinová hladina cyklinu T1 slouží jako kontrola vložení stejné koncentrace proteinu. (D) Buňky HCT116 p53+/+ byly transfekovány pomocí jednotlivých sirna a exponovány 0, 0,3 nebo 1 um CHK1 inhibitoru SCH podobu 96 hodin. Pomocí western blotu byly určeny hladiny vyznačených proteinů. Hladina cyklinu T1 slouží jako kontrola stejné koncentrace naneseného proteinu. Hladina γh2ax jako markeru poškození DNA a hladina štěpeného PARP jako markeru apoptosy. Ke stejnému efektu, jako v případě CDK12, došlo po snížení exprese BRCA1 a přidání CHK1 inhibitoru. Naše pozorování vede ke konceptu použití inhibitorů CHK1 u CDK12 nebo 86

87 BRCA1 deficientních nádorů, případně v kombinaci s inhibitory CDK12 u nádorů s normální nebo zvýšenou expresí CDK12. Publikační aktivita v roce 2015 Jiří Kohoutek, Function of cyclin-dependent kinase 12 in cancer development, Abstrakt, přednáška. 6TH RECAMO JOINT MEETING - THROUGH CANCER RESEARCH TOWARDS APPLIED MOLECULAR ONCOLOGY, Recamo, Brno, Hana Paculova, Marta Dzimkova, David Vrabel, Šárka Šimečková, Karel Souček, Juraj Kramara, Jiří Bártek, Marek Svoboda, Jiri Kohoutek, Targeting chemoresistant ovarian malignancies to cytostatic drugs and PARP inhibitors by inhibition of CDK12 kinase activity, Abstrakt, přednáška XI. Diagnostic, Predictive and Experimental Oncology Days, Olomouc, Hana Paculová, Karel Souček, Juraj Kramara, Kamil Paruch, Šárka Šimečková, Jiří Bartek, Marek Svoboda and Jiří Kohoutek, Sensitization of tumor cells to CHK1 inhibitors by knockdown of BRCA1 or CDK12, v přípravě Marek Svoboda, Jiří Navrátil, Miloš Holánek, Pavel Fabian, Ondřej Slabý, Peter Grell, Markéta Palácová, Alexander Poprach, Jiří Kohoutek. Expression of CDK12 in the cohort of primary breast cancer and its clinical correlations and impal on survival. V přípravě. Plán prací v roce 2016 V roce 2016 plánujeme zaměřit experiment na HER2 pozitivní nádory prsu. Cílem je identifikovat skupinu HER2+ nádorů s koamplifikací CDK12 a současně budeme pokračovat v testování inhibitorů CHEK1 specificky u této skupiny karcinomů prsu. 87

88 7. PROGNOSTICKÉ A PREDIKTIVNÍ FAKTORY VÝBĚRU ADJUVANTNÍ TERAPIE U PACIENTEK S ER+/HER2- KARCINOMEM PRSU Hlavní řešitelé: MUDr. Miloš Holánek, MUDr. Katarína Petráková, Ph.D. Anotace projektu: V rámci adjuvantní léčby pacientek s karcinomem prsu jsou používány následující modality - léčba cytostatická, radioterapie a léčba hormonální. Volba optimálního adjuvantního schématu je prováděna na základě posouzení standardních prediktivních a prognostických faktorů pt, pn, klinického stádia onemocnění, přítomnosti hormonálních receptorů v nádorové tkáni, nádorovém gradu, expresi onkogenu Her2 a věku pacientky. Volba optimálního adjuvantního schématu je obtížná u pacientek s časným, ER+ a Her2- karcinomem prsu (luminal A, luminal B - Her2 negat.), mezi kterými existuje skupina pacientek nemající profit z přidání adjuvantní chemoterapie, a která je tedy zbytečně zatížena rizikem spojeným s cytostatickou léčbou. Identifikace této podskupiny pacientek je v současnosti možná na základě využití molekulárních čipů typu Oncotype DX, MammaPrint, PAM50 aj. Rutinnímu využití v klinické praxi však brání jak dostupnost těchto metod, tak i její finanční náročnost. Alternativou je použití Nottinghamského prognostického skóre, na základě kterého je možné odhadnout riziko recidivy onemocnění a možný benefit z přidání adjuvantní chemoterapie. Metody: Budou retrospektivně zhodnoceny pacientky s karcinomem prsu výše popsaného fenotypu, které byly léčeny v MOÚ Brno od roku 2004, minimální doba sledování pacientek bude 5 let. Do tohoto souboru budou zařazeny jak pacientky, které byly léčeny kombinací adjuvantní chemoterapie a hormonoterapie, tak i pacientky léčené pouze hormonoterapií. Krom standardních, výše uvedených faktorů, zhodnotíme prognostickou a ev. prediktivní roli exprese/amplifikace genu pro cyklin D1 a přítomnosti mutací v genu TP53 pro výběr adjuvantní léčby u pacientek s časným, ER+/Her2- karcinomem prsu a ve vztahu k četnosti recidiv. Cíl práce: Cílem práce je zhodnotit prognostickou a prediktivní roli amplifikace genu pro cyklin D1 a přítomnosti mutací v genu TP53 v korelaci s biologickým chováním onemocnění (četnost recidiv) a pokusit se na základě těchto parametrů identifikovat podskupiny pacientek, které by profitovaly ze samostatné hormonální léčby a podskupiny pacientek, u kterých je nutná kombinace léčby hormonální s adjuvantní chemoterapií. Stav řešení v roce 2015: V roce 2015 jsme pokračovali na zpracovávání a rozšiřování souboru pacientek. Hodnoceny byly pacientky s karcinomem prsu léčené v MOÚ v letech Z těchto pacientek vybíráme pacientky s relapsem onemocnění v průbehu nebo po ukončení adjuvantní hormonální terapie. Takto získaná data jsou průběžně zpracovávána. Plán pro rok 2016: Pokračovat v hodnocení souboru pacientek ve spolupráci s patology MOÚ. Publikace. 88

89 8. NOVÝ PANEL PROTEINŮ KORELUJÍCÍCH SE STAVEM LYMFATICKÝCH UZLIN U LOW-GRADE NÁDORŮ PRSU: KLINICKÁ VERIFIKACE A ÚLOHA V INVAZIVITĚ NÁDOROVÝCH BUNĚK. Hlavní řešitelé: Mgr. Pavel Bouchal, Ph.D., Mgr. Monika Dvořáková Anotace projektu Zasažení lymfatických uzlin je prvním krokem metastatické kaskády, která vede k hlavním příčinám úmrtí pacientek s nádory prsu. V našem dosavadním výzkumu jsme pomocí proteomických, transkriptomických a imunohistochemických technik identifikovali panel proteinů korelujících se stavem lymfatických uzlin u low-grade karcinomů prsu. Cíle projektu Prvním cílem předkládaného projektu je verifikovat změny hladin těchto proteinů na nezávislém širším souboru nádorů prsu a definovat možnosti jejich diagnostického využití jako tkáňových markerů. Druhým cílem je pak popsat jejich úlohu v procesu buněčné migrace a invazivity jako klíčového mechanismu pro zasažení lymfatických uzlin. Metodika Bude provedena in vitro charakterizace vztahu mezi hladinami proteinů a migrací, resp. invazivitou na buněčné úrovni. Pomocí proteomických metod budou identifikovány a dalšími přístupy studovány funkční a protein-proteinové interakce na molekulární úrovni. Očekáváme, že kombinace klinických a systémově biologických dat přinese nové poznatky o proinvazivních mechanismech u identifikovaného panelu proteinů. Stav řešení / výsledky řešení v roce 2015 Výsledky výzkumu získané za rok 2015 byly publikovány v impaktovaných časopisech a prezentovány na mezinárodních a domácích sympoziích. Publikační aktivita za rok 2015 Články 1. Pavliska, L., Knizek, J., Prochazka, V., Bouchal, P., Vojtesek, B., Nenutil, R., Beranek. L. Gnostical t-tests Promising Evaluation Method of Some Medicine and Biological Data. Int J Ecol Econ Stat 2016;37(1): (accepted) (bez IF) 2. Dvořáková, M., Jeřábková, J., Procházková, I., Lenčo, J., Nenutil, R., Bouchal, P. Transgelin is upregulated in stromal cell sof lymf node positive breast cancer. J Proteomics 2015 (accepted) (IF2014: 3,888) 3. Knizek, J., Sindelar, J., Bouchal, P., Vojtesek, B., Nenutil, R., Beranek, L., Kuba, M. Tests of Hypotheses in a Set of Spectral Courses Alias Marker Statistics. Int J Stat Econ 2015 (accepted) (bez IF) 4. Pernikářová, V., Bouchal, P. Targeted proteomics of solid cancers: From quantification of known biomarkers towards reading the digital proteome maps. Expert Rev Proteomics 2015 (accepted) (IF2014: 2,896) 5. Maryáš, J., Bouchal, P PDLIM2 a jeho role v onkogenezi tumor supresor nebo onkoprotein? Klin Onkol 2015;28(Suppl 2):2S40 2S46. (bez IF) 6. Knizek, J., Bouchal, P., Vojtesek, B., Nenutil, R., Beranek, L. Gnostical p-value and Gnostical Power of Test Promising Evaluation Method of Some Medicine and Biological Data. Int J Ecol Econ Stat 2015;36(3): (bez IF) 89

90 7. Pernikářová, V., Sedláček, V., Potěšil, D., Procházková, I., Zdráhal, Z., Bouchal, P., Kučera, I. Proteome-wide dataset generated by itraq-3dlcms/ms technique for studying the role of FerB protein in oxidative stress in Paracoccus denitrificans. Data in Brief 2015: (bez IF) 8. Pernikářová, V., Sedláček, V., Potěšil, D., Procházková, I., Zdráhal, Z., Bouchal, P., Kučera, I. Proteomic responses to a methyl viologen-induced oxidative stress in the wild type and FerB mutant strains of Paracoccus denitrificans. J Proteomics 2015;125: (IF2014: 3,888) 9. Bouchal, P., Dvořáková, M., Roumeliotis, T., Bortlíček, Z., Ihnatová, I., Procházková, I., Ho, J.T.C., Maryáš, J., Imrichová, H., Budinská, E., Vyzula, R., Garbis, S.D., Vojtěšek, B., Nenutil, R. Combined Proteomics and Transcriptomics Identifies Carboxypeptidase B1 and Nuclear Factor κb (NF-κB) Associated Proteins as Putative Biomarkers of Metastasis in Low Grade Breast Cancer. Mol Cell Proteomics 2015;14(7): (IF2014: 6,564) Přednášky, postery 1. Maryáš, J., Dvořáková, M., Struhárová, I., Nenutil, R., Vojtěšek, B., Bouchal, P. Funkční charakterizace potenciálně pro-metastatických proteinů u nádorů prsu. In: Klin Onkol 2015;28(Suppl1):S146: Sborník abstrakt: XXXIX. brněnské onkologické dny a XXIX. konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky , Brno, Česká republika. ISSN X. 2. Faktor, J., Suchá, R., Struhárová, I., Nenutil, R., Bouchal, P. Advantages and drawbacks of SRM, pseudo-srm and SWATH targeted proteomics modes in cancer research. In: Sborník abstrakt: 6th RECAMO joint meeting Through cancer research towards applied molecular oncology , Brno, Česká republika. Brno: Masarykův onkologický ústav ISBN Str Maryáš, J., Dvořáková, M., Struhárová, I., Nenutil, R., Bouchal, P. Investigation of the role of PDLIM2 in breast cancer metastasis. In: Sborník abstrakt: 6th RECAMO joint meeting Through cancer research towards applied molecular oncology , Brno, Česká republika. Brno: Masarykův onkologický ústav ISBN Str Maryas, J., Dvorakova. M., Struharova, I., Nenutil, R., Bouchal, P. Investigation of pro-metastatic role of PDLIM2 protein in breast cancer using functional proteomics. In: Abstract book: 9th European Summer School Advanced proteomics , Brixen, Italy. Str Plán pro rok 2016 Proteomická analýza klinických vzorků nádorů prsu bioinformatická analýza získaných dat pro identifikaci a kvantifikaci proteinů jako potenciálních biomarkerů. Korelace ve vztaku ke klinickopatologickýcm parametrům. Studium mechanismu invazivity nádorových buněk in vitro. 90

91 9. VYUŽITÍ PROTEINŮ P63/P73 A JEJICH SIGNÁLNÍCH DRAH JAKO PREDIKTIVNÍCH MARKERŮ V KLINICKÉ ONKOLOGII. Hlavní řešitel: Mgr. Jitka Holčáková, Ph.D., MUDr. Pavel Fabian, Ph.D., Mgr. Roman Hrstka, Ph.D., MUDr. Rudolf Nenutil, CSc., Mgr. Marta Nekulová, doc. MUDr. Marek Svoboda, Ph.D., RNDr. Bořivoj Vojtěšek, DrSc. Anotace projektu Zhoubné novotvary mléčné žlázy představují druhou nejčastější malignitu u žen ve vyspělých zemích světa. Podskupina tzv. triple-negativních karcinomů mléčné žlázy, vyznačujících se negativní expresí estrogenového (ER), progesteronového (PR) a Her-2 receptoru, patří ke karcinomům s nejhorší prognózou, u nichž dosud neexistuje cílená léčba. Vzhledem k velké molekulární heterogenitě triple-negativních karcinomů existuje reálný předpoklad, že v případě zavedení individuálního přístupu a cílené léčby může nastat významný pokrok v terapii tohoto onemocnění. Byly publikovány studie o citlivosti buněčných linií odvozených od triple-negativních karcinomů mléčné žlázy k cisplatině, případně kombinaci cisplatiny s dalšími látkami a to v souvislosti s produkcí proteinů p63 a p73. S využitím unikátních buněčných linií odvozených od karcinomu mléčné žlázy inducibilně produkujících p63 a protilátek proti jednotlivým izoformám proteinů p63 a p73 provedeme analýzu úlohy těchto proteinů v citlivosti nádorových buněk k cisplatině, případně k cisplatině v kombinaci s dalšími protinádorovými látkami. Cílem projektu je nalézt expresní spektra genů a specifické proteiny, které budou sloužit k predikci citlivosti u triple-negativních karcinomů mléčné žlázy k cisplatině či dalším protinádorovým látkám. Cíle projektu 1. Charakterizace úlohy izoforem p63 ve vztahu k fenotypu kmenových buněk se zaměřením na povrchové markery, adhezi, proliferaci, invazivitu a odolnost vůči genotoxickému stresu na buněčné linii odvozené od karcinomu mléčné žlázy. 2. Příprava reportérových systémů s promotorem p63 pro analýzu regulačních proteinů. 3. Hledání cílových genů izoforem p63 po působení chemoterapeutických látek pomocí qrt-pcr, případně s využitím PCR čipů mapujících genovou expresi. 4. Hledání vazebných partnerů izoforem p63 po působení chemoterapeutických látek s využitím metody imunoprecipitate se specifickými protilátkami a identifikace pomocí hmotnostní spektrometrie. 5. Analýza vlivu DNA poškozujících látek na hladinu p63 izoforem a identifikace mechanismů zodpovědných za snižování hladiny proteinu p Hledání proteinových markerů a expresních spekter charakteristických pro buňky citlivé k DNA poškozujícím látkám. 7. Stanovení hladin izoforem p63 a p73 a proteinů spojených se signálními drahami p63/p73 identifikovaných jako potenciální markery citlivosti ke genotoxickým látkám na úrovni mrna a proteinu v souboru vybraných triple-negativních karcinomů mléčné žlázy. Tyto expresní profily budou analyzovány vzhledem k významným klinicko-patologickým ukazatelům nádorů včetně objektivní odpovědi na léčbu a přežití pacientek. Metodika Základní část projektu bude provedena na upravené buněčné linií MDA-MB-468 odvozené od triple negativního karcinomu mléčné žlázy. Tato buněčná linie inducibilně exprimuje protein p63 a umožní nám pomocí genomických a proteomických přístupů charakterizovat úlohu p63 a jeho izoforem v nádorové buňce a v její odpovědi na genotoxický stres. V 91

92 bioptickém nádorovém materiálu bude exprese p63 a p73 analyzována na úrovni mrna pomocí PCR v reálném čase (qrt-pcr) a na úrovni proteinů pomocí imunohistochemického barvení (IHC) a imunochemických metod. Intenzita exprese bude statisticky hodnocena ve vztahu k rutinně stanoveným klinicko-patologickým znakům nádorů, bezpříznakovému i celkovému přežití pacientek. Současně bude analyzována i exprese proteinů, předem vytipovaných na základě studie na buněčných liniích, jako potenciálních markerů citlivosti k cisplatině, případně dalším látkám. Cílem projektu je identifikace nových prediktivních a prognostických ukazatelů využitelných k zefektivnění samotné terapie. Stav řešení / výsledky řešení v roce 2015 Výsledky výzkumu získané za rok 2015 byly publikovány v impaktovaných časopisech a prezentovány na mezinárodních a domácích sympoziích. Publikační aktivita za rok 2015 Články 1. Dvořáková, P., Nekulová, M., Holčáková, J., Vojtěšek, B., Hernychová, L. Analýza změn fosfoproteomu nádorové buněčné linie MDA- MB- 468 v odpovědi na expresi izoforem p63 pomocí hmotnostní spektrometrie. Klin Onkol 2015;28(Suppl 2):2S11 2S19. (bez IF) 2. Orzol, P., Holcakova, J., Nekulova, M., Nenutil, R., Vojtesek, B., Coates, P.J. The diverse oncogenic and tumour suppressor roles of p63 and p73 in cancer: a review by cancer site. Histol Histopathol 2015;30: (IF2014: 2,096) Přednášky a postery 1. Orzol, P., Nekulová, M., Vojtěšek, B., Holčáková, J. DNp63 multifunctionality in triple-negative breast cancer role in cell adhesion and potential interacting partners. In: Klin Onkol 2015;28(Suppl1):S146: Sborník abstrakt: XXXIX. brněnské onkologické dny a XXIX. konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky , Brno 2. Sommerová, L., Nenutil, R., Selingerová, I., Vojtěšek, B., Hrstka, R. Stanovení exprese AGR2 u estrogen receptor negativních karcinomů mléčné žlázy. In: Klin Onkol 2015;28(Suppl1):S147: Sborník abstrakt: XXXIX. brněnské onkologické dny a XXIX. konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky , Brno. 3. Holcakova, J., Nekulova, M. Orzol, P., Vojtesek, B. Np63 regulates membrane proteins trafficking in breast cancer cells. In: Abstract book: 2nd International p53 conference. p53 isoforms in: cancer, aging development, degenerative diseases, infections , Aix-en-Provence, France. Str Orzol, P., Holcakova, J., Nekulova, M., Muller, P., Vojtesek, B., Coates, P. Np63 is a key regulator of cell adhesion and proliferation in triple-negative breast cancer. In: Abstract book: 2nd International p53 conference. p53 isoforms in: cancer, aging development, degenerative diseases, infections , France. Str. 50. Plán pro rok 2016 Projekt ukončen k

93 10. CHIRURGICKÉ VÝKONY NA SPÁDOVÝCH MÍZNÍCH UZLINÁCH U PACIENTEK S KARCINOMEM PRSU Řešitelé: MUDr. Petr Krsička, doc. MUDr. Oldřich Coufal, Ph.D. Anotace: Chirurgické výkony na regionálních mízních uzlinách jsou nedílnou součástí diagnostiky a léčby karcinomu prsu. Rozeznáváme zde dva základní typy operací: biopsii sentinelové uzliny a disekci axily. Podle dosud zažitých standardů je biopsie sentinelové uzliny určena pro pacientky s invazivním karcinomem bez předoperačně zjištěných známek axilárních metastáz. Méně jasno je v otázce indikací sentinelové biopsie u preinvazivních karcinomů. Histopatologicky zjištěná metastáza v sentinelové uzlině pak představuje indikaci k disekci axily. Tato operace je však zatížena poměrně vysokou morbiditou a některé novější nálezy ukazují, že nepřináší onkologický prospěch všem pacientkám. Proto se v některých případech uvažuje o jejím vynechání. Literární údaje však nejsou jednotné. Otázka indikací operačních výkonů v axile tak zůstává v současné době otevřená. Kolektiv autorů Masarykova onkologického ústavu se zmíněnému tématu již řadu let věnuje. Vytvořil a publikoval např. nástroj pro odhad rizika metastáz v nesentinelových uzlinách, v literatuře známý jako Nomogram MOÚ. Cílem mojí práce bude čerpat nové literární poznatky v oblasti operačních výkonů na spádových uzlinách u karcinomů prsu a především sbírat a vyhodnocovat údaje zjištěné na populaci pacientek léčených na našem pracovišti. Předpokládám, že dosažené výsledky budou nejen publikovány v odborných textech, ale přispějí i k indikační rozvaze v klinické praxi. Cíle a metodika: Práce si dává za cíl ve své teoretické části formulovat aktuální dostupné poznatky o významu a indikacích chirurgických výkonů na spádových uzlinách, ve své praktické části pak analyzovat dílčí výsledky dosahované na našem pracovišti. Stav řešení v roce 2015: prezentace příspěvků na odborné konferenci (spoluautor). Plán pro rok 2016: sběr klinických dat a příprava publikací 93

94 11. NEŽÁDOUCÍ NÁSLEDKY CHIRURGICKÝCH VÝKONŮ NA MÍZNÍCH UZLINÁCH U PACIENTEK S KARCINOMEM PRSU Řešitelé: MUDr. Pavlína Vrtělová, doc. MUDr. Oldřich Coufal, Ph.D. Anotace projektu: Karcinom prsu je solidním epitelovým nádorem s tendencí k lymfatickému metastazování a operace spádových mízních uzlin jsou u tohoto onemocnění vedle vlastních výkonů na prsu tradiční součástí diagnosticko-terapeutických postupů. V současnosti je kurativní význam regionálních lymfadenektomií u mamárního karcinomu předpokládán pouze u výrazného metastatického postižení axily, převažuje diagnostický nebo-li stagingový význam zákroků. Jde zde zejména o upřesnění stadia a prognózy nemoci a indikaci adjuvantní léčby. Kompletní odstranění axilárních uzlin (axilární disekce) je zatíženo nemalým rizikem dočasných i trvalých nežádoucích následků (morbiditou). Mezi konsekvence specifické pro tuto operativu patří lymfedém ispilaterální horní končetiny či hrudní stěny a jejich následné komplikace, poruchy senzitivní inervace v oblasti axily a dorzomediální plochy paže, omezení hybnosti v ramenním kloubu, aseptická lymfangoitida, serom, scapula alata a iatrogenní léze dalších nervově-cévních struktur probíhajících axilou. K protrahovanému hojení rány, delší rekonvalescenci a oddálení adjuvantní léčby pak vedou rovněž obecné ranné komplikace, jako jsou hematom, infekce nebo nekróza kožních laloků. Ve snaze o snížení pooperační morbidity paušálních axilárních disekcí u pacientek bez klinicky detekovatelného uzlinového postižení byla zavedena technika biopsie sentinelové uzliny (sentinel lymph node biopsy, SLNB), při níž je pomocí mapování lymfatik barvivem, radiokoloidem či kombinací obou metod cíleně detekována a následně exstirpována první spádová (strážná, angl. sentinel) uzlina drénující oblast primárního tumoru. Výsledek jejího podrobného histopatologického vyšetření odráží s vysokou pravděpodobností stav dalších regionálních uzlin. U pacientek s negativní SLNB či pouze minimálním uzlinovým postižením není v současnosti dle odborných doporučení direkce indikována. Z dosavadních studií zaměřených na morbiditu nicméně vyplývá, že určitý podíl pacientek může mít i po SLNB dlouhodobé problémy (zejména parestezie, lymfedém či serom), v této souvislosti je diskutována nutnost sentinelové biopsie u primárních operací preinvazivních karcinomů, dalšími tématy jsou vynechávání disekce v případě nálezu makrometastáz sentinelové uzliny a indikace SLNB po neoadjuvanci. Cíle projektu: Srovnání frekvence objektivních a subjektivních ukazatelů pooperační morbidity mezi skupinami pacientek se SNB a disekcí axily operovaných v MOÚ pro časné stadium karcinomu prsu Metodika: Studie je rozdělena do dvou částí: 1) prospektivní (207 pacientek) založena na klinických měřeních rozdílu obvodů paže a předloktí mezi operovanou a kontralaterální končetinou, stupněm omezení abdukce v ramenním kloubu, svalovou silou (stanovenou jako maximální úhel abdukce paže se zátěží 1kg), změnách taktilního čití a nocicepce v oblastech inervace interkostobrachiálního nervu (zadní axilární čára, střed mediální plochy paže a mediální epikondyl humeru) při vstupním předoperačním vyšetření a následně ½ a 1 rok po operaci. Objektivní měření jsou současně doplněna informacemi o subjektivním hodnocení (intenzita bolestí v axile a na paži, otoky, omezení hybnosti v ramenním kloubu, snížení svalové síly a obratnosti paže, snížení citlivosti) získanými z dotazníků 1 rok po operaci a stanovením frekvence časných raných 94

95 komplikací. U každého z těchto parametrů je pomocí statistického testování posuzován vzájemný signifikantní rozdíl jak mezi oběma skupinami pacientek v daném časovém období, tak vývoj každé skupiny v časové ose. Dále je posuzován možný vliv adjuvantní radioterapie svodných lymfatických uzlin (dle současných guidelines s vynecháním RT na oblast I. a II. etáže axily), chemoterapie, věku, BMI a frekvence pooperačních komplikací v axile na jednotlivé výsledky. 2) retrospektivní (172 pacientek) subjektivní hodnocení formou dotazníku (viz. výše) 5 let po operaci Stav řešení v roce 2015: Ukončen nábor pacientek do studie, zrealizována všechna klinická měření a sběr dotazníků v zadaných časových obdobích, dokončeno statistické testování rozdílů v definovaných parametrech mezi oběma skupinami pacientek, dokončován článek shrnujícího závěry studie v anglickém jazyce pro publikaci v zahraničním odborném periodiku s IF Publikace vzešlé z projektu v roce 2015: Coufal O., Zapletal O., Vrtělová P., Vašina J., Řehák Z. Neúspěšná lymfoscintigrafie před sentinelovou biopsií u karcinomu prsu, možné příčiny a důsledky pro chirurgický výkon analýza výsledků 3014 vyšetření. Rozhl Chir. 2015, roč. 94, č. 3, s VLIV MODULACE VIMENTINU NA EXPRESI BRCA1 Hlavní řešitel projektu: doc. MUDr. Marek Svoboda, Ph.D. a Mgr. Roman Hrstka, Ph.D. Anotace projektu Naše dosavadní výsledky získané v rámci řešení grantového projektu IGA MZ ČR ( ) ukazují, že existuje statisticky signifikantní vztah mezi expresí vimentinu v nádorové tkáni karcinomu prsu a funkčním stavem BRCA1. Jedná se o zjištění se zásadním dopadem pro klinickou praxi, kde by mohlo být základem pro rychlou screeningovou diagnostiku BRCA1 mutace. Námi objevený vztah byl zjištěn na klinickém souboru čítajícím 119 pacientek s triple-negativním karcinomem prsu, u kterých byla prokázána přítomnost mutovaného a/nebo nemutovaného genu BRCA1. Naše výsledky jsou již v součanosti publikovatelné, nicméně protože vztah mezi vimentinem a BRCA1 dosud nebyl popsán, pomohlo by, kdyby se nám podařilo tento vztah potvrdit i v podmínkách in vitro experimentu a případně i zjistit jeho přesný mechanismus. Cíle projektu 1. na buněčných liniích karcinomu prsu, které exprimují vimentin a nesou nemutovaný gen BRCA1 navodit sníženou genovou/proteinovou expresi vimentinu pomocí sirna a následně analyzovat expresi BRCA1 genu/proteinu. 2. na buněčných liniích karcinomu prsu, které exprimují vimentin a nesou nemutovaný gen BRCA1 navodit nulovou genovou/proteinovou expresi vimentinu pomocí knock-out plasmidové genové manipulace a následně analyzovat expresi BRCA1 genu/proteinu. Metodika Kultivace buněčných kultur nádorových linií karcinomu prsu, RT PCR a QRT PCR reakce ke stanovení genové exprese vimentinu a BRCA1 (případně i dalších genů, dle vývoje 95

96 experimentu), plasmidová transfekce, western-bloting (exprese proteinů vimentinu, BRCA1, případně dalších). Zablokování exprese vimentinu a BRCA1 pomocí sirna proti RNA genů kódujících vimentin a BRCA1. Stav řešení v roce 2015 Po laboratorní stránce byl projekt ukončen k V současnosti probíhá příprava pro patentovou žádost. Plán pro rok 2016 Projekt dosud nebyl prezentován. V současnosti se připravuje patentová ochrana výsledků projektu. 96

97 TÝM PRO GASTROINTESTINÁLNÍ NÁDORY Vedoucí týmu: MUDr. Igor Kiss, Ph.D. Vedoucí chirurgického programu týmu: doc. MUDr. Roman Šefr, Ph.D. Vedoucí onkologického programu týmu: MUDr. Igor Kiss, Ph.D. Vedoucí onkologického programu týmu pro GIST: MUDr. Ilona Kocáková, Ph.D. Vedoucí radioterapeutického programu týmu: MUDr. Petr Pospíšil Vedoucí endoskopického programu: MUDr. Ivo Novotný, CSc. Vedoucí výzkumného programu týmu: doc. RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D. Kompletní seznam členů týmu v roce 2015 je dostupný na internetových stránkách MOÚ: Projekty financované výhradně z IPO 1. Identifikace diagnostických a prognostických mikrorna v krevní plazmě pacientů s karcinomem pankreatu. 2. Identifikace diagnostických a prognostických mikrorna v nádorové tkáni a krevním séru pacientů s karcinomem žaludku. 3. Sekvenční léčba metastatického kolorektálního karcinomu EGFR inhibitory molekulárně biologické charakteristiky umožňující racionální indikaci léčby. 4. Identifikace diagnostických a prediktivních mikrorna u pacientů s karcinomem pankreatu. 5. Vytvoření a charakterizace souboru pacientů s karcinomem žaludku a pilotní analýzy potenciálních biomarkerů na bázi mikrorna. 6. Analýza mutačního stavu členů EGFR signální dráhy u pacientů s kolorektálním karcinomem léčených erbituxem metodou sekvenování nové generace. 7. Využití metod sekvenování nové generace (NGS) ke sledování nádorové heterogenity u pacentů s kolorektálním karcinomem. Projekty spolufinancované z IPO (prostředky IPO pokrývají výdaje na nové a dodatečné experimenty nebo slouží k financování výzkumných pracovníků zapojených do řešení projektu) 8. Studium signální dráhy EGFR a expresních profilů mikrorna v predikci odpovědi na cílenou anti-egfr terapii u pacientů s kolorektálním karcinomem s nemutovanou variantou onkogenu KRAS. 9. Vytvoření diagnostické sady cirkulujících mikrorna pro neinvazivní časnou diagnostiku a sledování pacientů s kolorektálním karcinomem. 10. Angiogeneze u zhoubných nádorů: stanovení prediktivních markerů u pacientů s kolorektálním karcinomem léčených antiangiogenní léčbou. 11. Prognostické faktory u karcinomu pankreatu. 12. Perioperační chemobioterapie v chirurgické léčbě jaterních metastáz kolorektálního karcinomu 97

98 1. IDENTIFIKACE DIAGNOSTICKÝCH A PROGNOSTICKÝCH MIKRORNA V KREVNÍ PLAZMĚ PACIENTŮ S KARCINOMEM PANKREATU Hlavní řešitel: Spoluřešitelé: MUDr. Igor Kiss, Ph.D. doc. RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D. (MOU) Mgr. Petra Vychytilová (MOU) Doc. MUDr. Marek Svoboda, Ph.D. (MOU) MUDr. Petr Karásek (MOU) Prof. MUDr. Zdeněk Kala, CSc. (FN Brno) Doc. MUDr. Leoš Křen, Ph.D. (FN Brno) Anotace: Duktální adenokarcinom pankreatu (PDAC) patří mezi nejagresivnější nádory dospělého věku. Většina pacientů je diagnostikována v pozdních stádiích se vzdálenými metastázemi, a nemohou proto podstoupit chirurgický výkon. Onemocnění je rovněž velmi rezistentní na radioterapii a chemoterapii a pouze 6 % pacientů přežívá 5 let po operaci. Radikální chirurgická resekce je proto jedinou šancí na dlouhodobé přežívání, avšak pouze % pacientů může podstoupit tento zákrok, přičemž u 90 % z nich dochází k relapsu do dvou let od operace. Z těchto důvodů je nezbytné hledat nové diagnostické, prediktivní a prognostické biomarkery, které by umožnily časnou diagnostiku onemocnění, lepší stratifikaci pacientů na základě jejich prognózy a individualizovanou terapii. MikroRNA (mirna) jsou krátké (22 nukleotidů) endogenní nekódující RNA, které ovlivňují stabilitu a translaci mrna. Jsou schopny post-transkripčně regulovat genovou expresi a podle bioinformatických modelů mohou regulovat až jednu třetinu lidských genů, přičemž některé z těchto genů jsou významnými onkogeny či nádorovými supresory. Změny v expresních profilech mirna již byly pozorovány u většiny solidních nádorů. Mechanistické studie v nádorové buňce zase prokázaly schopnost jednotlivých mirna vykazovat jak funkci nádorového supresoru, tak onkogenu. Tato pozorování zásadním způsobem rozšířila koncept molekulární patogeneze nádorových onemocnění a naznačila potenciál mirna nejen jako diagnostických markerů, ale také jako potenciálních terapeutických cílů. Současné studie ukazují, že k deregulaci mirna dochází i u nádorů slinivky břišní. Zároveň bylo prokázáno, že mirna přítomné v plazmě pacientů s PDAC mohou být slibnými biomarkery pro časnou diagnostiku tohoto onemocnění a určení prognózy pacientů. Zdá se tedy, že mirna budou velice dobře použitelné jako nová třída biomarkerů u karcinomu pankreatu. Rozdíly v hladinách mirna mezi nádorovou tkání a normální tkání pankreatu naznačují jejich možné využití jako terapeutických cílů. Předkládaný projekt je zaměřený na analýzu mirna, které by mohly sloužit jako nové diagnostické a prognostické biomarkery u pacientů s nádory slinivky břišní. Předpokládáme, že stanovení exprese vybraných mirna v krevní plazmě by mohlo přispět k přesnějšímu 98

99 určení prognózy pacientů s tímto nádorovým onemocněním a dále k identifikaci pacientů nejvíce profitujících z chirurgické léčby. Cíle projektu: 1) Validovat prognostický potenciál mirna identifikovaných během expresního profilování na souboru 80 pacientů s PDAC pomocí qrt-pcr. 2) Sestavit panel cirkulujících mirna umožňující identifikovat pacienty, kteří budou nejvíce profitovat z chirurgické léčby. 3) Validovat sestavený panel cirkulujících mirna na nezávislé kohortě pacientů podle požadavků REMARK a STARD pomocí qrt-pcr. Metodika: V předkládaném projektu bude validován prognostický potenciál vybraných mirna, které byly identifikovány v minulém roce řešení projektu, na 80 tkáních od pacientů s PDAC a 20 tkáních zdravé slinivky. Následně bude provedeno expresní profilování mirna z krevní plazmy s cílem identifikovat pacienty nejvíce profitující z chirurgické léčby (8 vzorků od pacientů s dobrou prognózou, OS > 11 měsíců; 8 vzorků od pacientů se špatnou prognózou, OS <11 měsíců). Ze všech vzorků plazmy bude izolována celková RNA obohacená o frakci krátkých RNA (mirneasy Serum/Plasma Kit, Qiagen) a koncentrace a čistota budou stanoveny spektrofotometricky pomocí přístroje NanoDrop-1000 (A260/280 > 2,0; A260/230 >1,8). Expresní profilování bude provedeno s využitím microrna Ready-to-Use PCR, Human panel I+II, V3.R (Exiqon, Vedbaek, Dánsko), které umožňují analýzu 752 mirna a kandidátních endogenních kontrol. Výsledky budou validovány na nezávislém souboru pacientů a zdravých kontrol pomocí kvantitativní PCR v reálném čase (5-10 mirna, TaqMan mirna Assays, Applied Biosystems). Následně bude provedena statistická analýza dat (GraphPad Prism). Stav řešení v roce 2015: V roce 2015 bylo navázáno na projekt IPO2012, IPO2013 a IPO2014, v rámci kterých jsme vytvořili detailně klinicky charakterizovanou kohortu 80 pacientů s karcinomem pankreatu, 20 vzorků chronické pankreatitidy a 10 vzorků zdravé sliznice (doc. MUDr. Leoš Křen, PhD, FN Brno) a provedli jsme pilotní studii zabývající se analýzou exprese mirna u těchto pacientů. V současné době rovněž probíhá nábor nových pacientů do studie, kdy od každého pacienta je odebírána nádorová tkáň, zdravá sliznice, předoperační a pooperační krev a z nádorové tkáně jsou zakládány primární buněčné linie (sběr vzorků zajišťují prof. MUDr. Zdeněk Kala, CSc, doc. MUDr. Leoš Křen, PhD, FN Brno). K dnešnímu datu máme k dispozici 80 vzorků nádorové tkáně, 80 vzorků zdravé sliznice, 120 vzorků krevní plazmy od pacientů před operací, 43 párových vzorků před- a pooperační krve týden po operaci, 11 párových vzorků před- a pooperační krve 1-3 měsíce po operaci a 50 úspěšně založených primárních linií. Ze vzorků nádorové tkáně, zdravé sliznice a krevní plazmy byla úspěšně izolována celková RNA obohacená o frakce krátkých RNA (mirvana TM mirna Isolation Kit, Ambion, USA; respektive Qiagen mirneasy Serum/Plasma kit, Qiagen, GmbH, Německo), byla změřena koncentrace a čistota získané RNA (NanoDrop ND-1000) a rovněž její kvalita 99

100 (Agilent Bioanalyzer 2100). Pro další analýzy bylo využito pouze vzorků, u kterých byl poměr A260/A280 > 2, poměr A260/A230 > 1,8 a RIN 8. V potřebných případech byla izolace opakována, dokud nebylo dosaženo stanovených kritérií pro kvalitu vzorku. Získaná RNA byla využita pro stanovení exprese 4 prognostických mirna (mir-939, mir-4486, mir p a mir-296-3p) identifikovaných pomocí expresního profilování v minulém roce řešení projektu a následně byla provedena ROC analýza a Kaplan-Meierova analýza přežívání. Validační fáze potvrdila významnou korelaci jak mezi expresí mir-939, mir-296-3p a mir-4486 a celkovým bezpříznakovým přežíváním (obr. 1-3), tak rovněž mezi expresí těchto mirna a celkovým přežíváním pacientů s PDAC (obr. 4-6). Vzhledem k příznivému vývoji na trhu s molekulárně biologickým materiálem a zavedení nových metod na našem pracovišti byly microrna Ready-to-Use PCR, Human panel I+II, V3.R Exiqon Arrays v případě vzorků krevní plazmy pacientů a zdravých kontrol nahrazeny hlubokým sekvenováním (Illumina). Tyto analýzy v současné době stále probíhají (obr. 7-10). V roce 2015 byl nakoupen veškerý materiál potřebný pro hluboké sekvenování. Po osekvenování všech vzorků krevní plazmy budou získaná data vyhodnocena pomocí standardních i vícedimenzionálních biostatistických metod s cílem identifikovat mirna s rozdílnou expresí v plazmě pacientů a zdravých kontrol. Takto identifikované mirna budou srovnány s výsledky profilování nádorových tkání PDAC a paralelních sliznic. Následně bude vybráno 5-10 mirna pro další validaci na rozsáhlejším nezávislém souboru pacientů pomocí qrt- PCR podle požadavků REMARK a STARD. V současné době byla rovněž provedena pilotní studie, jejímž cílem bylo analyzovat expresi 2 mirna (mir-21 a mir-198), kterými jsme se zabývali již v předchozích letech, v plazmě 20 pacientů před operací a týden po operaci. Hladiny jednotlivých mirna byly normalizovány pomocí let-7a, která byla již dříve identifikována jako vhodná endogenní kontrola v případě vzorků krevního séra/plazmy. Naše pilotní studie prokázala zvýšenou hladinu mir-21 (P = 0,0312; obr. 11A) a mir-198 (P = 0,0261; obr. 11B) v plazmě pacientů týden po operaci, což je v rozporu s naším očekáváním. Předpokládáme však, že tato skutečnost je způsobena odběrem pooperačního vzorku v krátkém čase od chirurgického výkonu. V současné době proto probíhá sběr pooperační krve 3 měsíce po operaci (sběr vzorků zajišťují prof. MUDr. Zdeněk Kala, CSc, doc. MUDr. Leoš Křen, PhD, FN Brno) a exprese cílových mirna bude znovu stanovena na tomto souboru vzorků. V roce 2015 byly rovněž rozšířeny in vitro analýzy na stabilních buněčných liniích PANC-1 a BxPC3, jejichž účelem bylo detailně analyzovat zapojení mir- 217 a mir-21 do patogeneze nádorů slinivky břišní. Bylo prokázáno, že utlumení hladiny mir-21 vede ke snížení metabolické aktivity buněk PANC-1 po 96 hodinách od transfekce (P = 0,0464; obr. 12) a navýšení mir-217 vyvolalo pokles rychlosti proliferace buněk PANC-1 také 96 hodin po transfekci (P = 0,0218; obr. 12). Výsledky analýz neprokázaly žádny vliv mir-21 a mir-217 na migraci buněk. Co se týče regulace buněčného cyklu, navýšení hladiny mir-217 způsobilo zástavu v G1 fázi u buněk PANC-1 (P = 0,0341; obr. 13). Studium apoptózy neprokázalo žádný významný vliv transfekce pre-mir-217 na zastoupení buněk v jednotlivých fázích apoptózy. V roce 2015 byla též odeslána výsledková publikace, která byla přijata do mezinárodního časopisu s IF (Diagnostic Pathology), a dále byla opětovně podána grantová žádost do AZV MZ ČR (Identifikace cirkulujících mikrorna umožňujících prognostickou stratifikaci a selekci pacientů nejvíce profitujících z chirurgické léčby). 100

101 100 mir-939 P = Percent survival DFS (days) lower than 1.85 higher than 1.85 Obr. 1: Kaplan-Meierova analýza hladiny mir-939 korelují s celkovým bezpříznakovým přežíváním pacientů s PDAC (P = 0,0007). 100 mir-296-3p P = Percent survival DFS (days) lower than higher than Obr. 2: Kaplan-Meierova analýza hladiny mir-296-3p korelují s celkovým bezpříznakovým přežíváním pacientů s PDAC (P = 0,0087). 101

102 100 mir-4486 P = Percent survival DFS (days) lower than higher than Obr. 3: Kaplan-Meierova analýza hladiny mir-4486 korelují s celkovým bezpříznakovým přežíváním pacientů s PDAC (P = 0,0009). 100 mir-939 P = Percent survival OS (days) lower than 1.85 higher than 1.85 Obr. 4: Kaplan-Meierova analýza hladiny mir-939 korelují s celkovým přežíváním pacientů s PDAC (P = 0,0008). 102

103 100 mir-296-3p P = Percent survival OS (days) lower than higher than Obr. 5: Kaplan-Meierova analýza hladiny mir-296-3p korelují s celkovým přežíváním pacientů s PDAC (P = 0,0269). 100 mir-4486 P = Percent survival OS (days) lower than higher than Obr. 6: Kaplan-Meierova analýza hladiny mir-4486 korelují s celkovým přežíváním pacientů s PDAC (P = 0,0003). 103

104 Obr. 7: Koláčové grafy vyjadřující průměrné zastoupení jednotlivých sekvencí ve vzorcích nádorové tkáně a zdravé sliznice. Obr. 8: Koláčový graf vyjadřující průměrné zastoupení jednotlivých sekvencí v krevní plazmě zdravých dárců. Obr. 9: Zastoupení délek jednotlivých fragmentů po odstranění adaptorů ve vzorcích nádorové/zdravé tkáně. 104

105 Obr. 10: Zastoupení délek jednotlivých fragmentů po odstranění adaptorů ve vzorcích krevní plazmy. normalized log expression pre-operative plasma mir-21 P = post-operative plasma normalized log expression pre-operative plasma mir-198 P = post-operative plasma Obr. 11: Porovnání exprese mir-21 a mir-198 v plazmě pacientů před operací a týden po operaci. 105

106 Obr. 12: Vliv transfekce inhibitorů anti-mir-21 a prekurzorů pre-mir-217 na metabolickou aktivitu buněk PANC1.*P < 0,05. Obr. 13: Vliv transfekce prekurzorů pre-mir-217 na regulaci buněčného cyklu buněk PANC-1. * P < 0,

107 Výstupy a publikace za rok 2015: VYCHYTILOVÁ, Petra, Igor KISS, Soňa KLUSOVÁ, Jan HLAVSA, Vladimír PROCHÁZKA, Zdeněk KALA, Jan MAZANEC, Jitka HAUSNEROVÁ, Leoš KŘEN, Markéta HERMANOVÁ, Jiří LENZ, Petr KARÁSEK, Rostislav VYZULA a Ondřej SLABÝ. MiR-21, mir-34a, mir-198 and mir-217 as diagnostic and prognostic biomarkers for chronic pancreatitis and pancreatic ductal adenocarcinoma. Diagnostic Pathology, LONDON: BIOMED CENTRAL LTD, 2015, roč. 10, April, s ISSN doi: /s Grantová žádost do AZV MZ ČR Identifikace cirkulujících mikrorna umožňujících prognostickou stratifikaci a selekci pacientů nejvíce profitujících z chirurgické léčby. Plán pro rok 2016: 1) Sestavit soubor párových vzorků krevní plazmy od pacientů s PDAC před chirurgickým zákrokem a 1-3 měsíce po chirurgickém zákroku. 2) S využitím technologie NGS (Illumina) identifikovat mirna s deregulovanou expresí v krevní plazmě pacientů s PDAC. 3) Validovat sestavený panel cirkulujících mirna na nezávislé kohortě pacientů podle požadavků REMARK a STARD pomocí qrt-pcr. 4) Změřit expresi identifikovaných mirna ve vzorcích krevní plazmy odebíraných před a po chirurgickém zákroku. 107

108 2. IDENTIFIKACE DIAGNOSTICKÝCH A PROGNOSTICKÝCH MIKRORNA V NÁDOROVÉ TKÁNI A KREVNÍM SÉRU PACIENTŮ S KARCINOMEM ŽALUDKU Řešitel: MUDr. Radka Obermannová Spoluřešitelé: MUDr. Milana Šachlová, CSc. et. Ph.D. Doc. RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D. Mgr. Petra Vychytilová Anotace: Nádory žaludku patří mezi nejčastější příčiny úmrtí na nádorová onemocnění na světě. Ačkoliv se zaváděním novým léčebných strategií se léčebné výsledky zlepšují, celková prognóza pacientů s pokročilým onemocněním zůstává stále velice špatná. Je proto nezbytné nalézt nové biomarkery umožňující stratifikaci pacientů do skupin jak podle rizika onemocnění, tak podle očekávané léčebné odpovědi, což by umožnilo více individualizovány přístup k těmto pacientů. CEA, CA 19-9 a CA 72-4 představují běžně užívané biomarkery karcinomu žaludku, nicméně jejich nízká senzitivita a specificita jak v primární diagnostice, tak v prognóze onemocnění jejich přínos významně limituje. V posledních letech jsou v souvislosti s karcinomem žaludku velice často studovány mikrorna (mirna), a to jak na úrovni vlastní kancerogeneze, tak jako potenciální biomarkery umožňující nejen přesnou diagnostiku, ale i citlivé stanovení prognózy onemocnění, případně predikci léčebné odpovědi. Tato problematika již byla zpracována řadou přehledných sdělení. Cílem předkládaného projektu je vytvořit a důkladně klinicky charakterizovat soubor pacientů s karcinomem žaludku, u kterého bude následně provedeno expresní profilování mirna za účelem identifikace nových diagnostických, prognostických a prediktivních biomarkerů. Cíle projektu: 1) Rozšířit soubor pacientů s nádory žaludku (cca 100 pacientů). 2) Analyzovat prognostický potenciál 6 vybraných mirna (mir-93, mir-145, mir-21, mir-143, mir-107, mir-10b) u pacientů s nádory žaludku (korelace exprese mirna a DFS/OS). 3) Provést expresní profilování mirna v séru pacientů s nádory žaludku s cílem identifikovat nové prognostické biomarkery. 4) Validovat vybrané prognostické mirna (cca 5 mirna) na nezávislém souboru pacientů pomocí qrt-pcr. Metodika: V předkládaném projektu bude sestaven důkladně klinicky charakterizovaný soubor 100 pacientů s nádorem žaludku (MOU), který bude následně využit pro retrospektivní analýzu mirna s cílem identifikovat nové biomarkery. Ze všech vzorků tkání a krevního séra bude izolována celková RNA obohacená o frakci krátkých RNA (mirvana mirna Isolation Kit, Ambion; mirneasy Serum/Plasma Kit, Qiagen) a koncentrace a čistota budou stanoveny 108

109 spektrofotometricky pomocí přístroje NanoDrop-1000 (A260/280 > 2,0; A260/230 >1,8). V první fázi studie bude ověřen prognostický potenciál 6 mirna (mir-93, mir-145, mir-21, mir-143, mir-107, mir-10b), jejichž hladiny jsou deregulovány u nádorů žaludku, přičemž exprese těchto mirna bude korelována s bezpříznakovým přežíváním pacientů (DFS) a celkovým přežíváním pacientů (OS) s využitím Kaplan-Meierovy analýzy. Následně bude provedeno expresní profilování mirna s využitím microrna Ready-to-Use PCR, Human panel I+II, V3.R (Exiqon, Vedbaek, Dánsko; analýza 752 mirna) s cílem identifikovat nové prognostické mirna v krevním séru pacientů (8 pacientů s dobrou prognózou vs. 8 pacientů se špatnou prognózou). Výsledky budou validovány na nezávislém souboru pacientů (cca 100 pacientů) pomocí kvantitativní PCR v reálném čase (5-10 mirna, TaqMan mirna Assays, Applied Biosystems). Následně bude provedena statistická analýza dat (GraphPad Prism). Stav řešení: V roce 2015 bylo navázáno na projekt IPO2014, v rámci kterého jsme vytvořili detailně klinicky charakterizovanou kohortu 60 pacientů s karcinomem žaludku (MOU, MUDr. Obermannová, MUDr. Šachlová) a provedli jsme pilotní studii zabývající se analýzou exprese mirna u těchto pacientů. V roce 2015 byl soubor pacientů rozšířen a v současné době máme k dispozici nádorovou tkáň a paralelní zdravou sliznici od 109 pacientů s histopatologicky ověřeným nádorem žaludku. Ze vzorků nádorové tkáně, zdravé sliznice a krevního séra byla úspěšně izolována celková RNA obohacená o frakce krátkých RNA (mirvana TM mirna Isolation Kit, Ambion, USA; respektive Qiagen mirneasy Serum/Plasma kit, Qiagen, GmbH, Německo), byla změřena koncentrace a čistota získané RNA (NanoDrop ND-1000) a rovněž její kvalita (Agilent Bioanalyzer 2100). Pro další analýzy bylo využito pouze vzorků, u kterých byl poměr A260/A280 > 2, poměr A260/A230 > 1,8 a RIN 8. V potřebných případech byla izolace opakována, dokud nebylo dosaženo stanovených kritérií pro kvalitu vzorku. Získaná RNA byla využita pro stanovení exprese 6 mirna (mir-10b, mir-21, mir-93, mir-107, mir-143 a mir-145) jejichž deregulovaná exprese u pacientů s nádory žaludku byla již dříve popsána. Analýzy zabývající se expresí těchto mirna v tkáni potvrdily signifikantně zvýšenou hladinu mir-21 (P < 0,0001), mir-10b (P = 0,0002), mir-93 (P < 0,0001) a mir-107 (P = ) v nádorové tkáni, což je v souladu s předchozími studiemi (obr. 1). Hladiny mir-143 a mir-145 nebyly významně změněny. Zvýšená exprese mir-10b korelovala s klinickým stádiem onemocnění (P = 0,0197) a gradem (P = 0,0589), zvýšené hladiny této mirna byly zaznamenány u pacientů s difúzním histologickým typem (P = 0,0516; obr. 2). Rovněž mir-143 (P = 0,0164) a mir-145 (P = 0,0077) byly ve zvýšené míře exprimovány v nádorové tkáni pacientů s difúzním histologickým typem (obr. 3). Exprese mir-107 korelovala s přítomností vzdálených metastáz (P = 0,0040; obr. 4). Následně byla provedena ROC analýza a Kaplan-Meierova analýza přežívání pacientů. Bylo zjištěno, že zvýšené hladiny mir-10b, mir-21, mir-143 a mir-145 signifikantně korelují s bezpříznakový přežíváním pacientů (DFS, obr. 5-8) a celkovým přežíváním (OS, obr. 9-11). Kombinovaná analýza těchto mirna prokázala signifikantně kratší dobu DFS (P = 0,0091; obr. 12) a OS (P = 0,0056; obr. 13) u pacientů s nádory žaludku u nichž byla exprese mir- 10b, mir-21, mir-143 a mir-145 zvýšená. V roce 2015 byla rovněž provedena pilotní analýza cirkulujících mirna v krevním séru u pacientů s nádory žaludku. Hladiny 109

110 jednotlivých mirna byly normalizovány pomocí mir-93, která byla identifikována jako vhodná endogenní kontrola v případě vzorků krevního séra/plazmy pomocí algoritmů Genorm a NormFinder. Naše pilotní studie prokázala sníženou hladinu mir-21 (P = 0,0081), mir-27a (P < 0,0001), mir-376c (P = 0,0073) a zvýšenou hladinu mir-23a (P < 0,0001) a mir-142-5p (P = 0,0089) v krevním séru pacientů s nádorem žaludku (obr. 14). Vzhledem k příznivému vývoji na trhu s molekulárně biologickým materiálem a zavedení nových metod na našem pracovišti byly microrna Ready-to-Use PCR, Human panel I+II, V3.R Exiqon Arrays v případě vzorků krevního séra pacientů a zdravých kontrol nahrazeny hlubokým sekvenováním (Illumina). Tyto analýzy v současné době stále probíhají (obr ). V roce 2015 byl zakoupen veškerý materiál potřebný pro hluboké sekvenování. Po osekvenování všech vzorků krevního séra budou získaná data vyhodnocena pomocí standardních i vícedimenzionálních biostatistických metod s cílem identifikovat mirna s rozdílnou expresí v séru pacientů a zdravých kontrol a s prognostickým potenciálem. Takto identifikované mirna budou srovnány s výsledky profilování nádorových tkání a paralelních sliznic. Následně bude vybráno 5-10 mirna pro další validaci na rozsáhlejším nezávislém souboru pacientů pomocí qrt-pcr podle požadavků REMARK a STARD. V roce 2015 byla též podána grantová žádost do AZV MZ ČR (Sekvenční FDG-PET a mirna jako biomarker změny strategie předoperační léčby u lokálně pokročilého karcinomu žaludku a gastroesofageální junkce). normalized log expression healthy tissue mir-21 P < tumour tissue normalized log expression healthy tissue mir-107 P = tumour tissue normalized log expression healthy tissue mir-143 P = tumour tissue normalized log expression healthy tissue mir-93 P < tumour tissue normalized log expression heatlhy tissue mir-10b P = tumour tissue normalized log expression heatlhy tissue mir-145 P = tumour tissue Obr. 1: Porovnání exprese mir-21, mir-107, mir-143, mir-93, mir-10b a mir-145 v nádorové tkáni pacientů a ve zdravé sliznici. 110

111 1 mir-10b P = mir-10b P = mir-10b P = normalized log expression I II III IV stage normalized log expression I II III grade normalized log expression intest dif Obr. 2: Zvýšená exprese mir-10b koreluje s klinickým stádiem, gradem a difúzním typem nádoru žaludku. mir-143 P = mir-145 P = normalized log expression intest dif normalized log expression intest dif Obr. 3: Zvýšená exprese mir-143 a mir-145 koreluje s difúzním typem nádoru žaludku. mir-107 P = normalized log expression M0 M1 Obr. 4: Exprese mir-107 je signifikantně zvýšená v nádorové tkáni pacientů se vzdálenými metastázami. 111

112 100 mir-10b P = Percent survival DFS lower than 0.13 higher than 0.13 Obr. 5: Kaplan-Meierova analýza hladiny mir-10b korelují s celkovým bezpříznakovým přežíváním pacientů s nádory žaludku (P = 0,0380). 100 mir-21 P = Percent survival DFS lower than higher than Obr. 6: Kaplan-Meierova analýza hladiny mir-21 korelují s celkovým bezpříznakovým přežíváním pacientů s nádory žaludku (P = 0,0173). 112

113 100 mir Percent survival DFS lower than 6.00 higher than 6.00 Obr. 7: Kaplan-Meierova analýza hladiny mir-143 korelují s celkovým bezpříznakovým přežíváním pacientů s nádory žaludku (P = 0,0494). 100 mir-145 P = Percent survival DFS lower than higher than Obr. 8: Kaplan-Meierova analýza hladiny mir-145 korelují s celkovým bezpříznakovým přežíváním pacientů s nádory žaludku (P = 0,0354). 113

114 100 mir-10b P = Percent survival OS lower than higher than Obr. 9: Kaplan-Meierova analýza hladiny mir-10b korelují s celkovým přežíváním pacientů s nádory žaludku (P = 0,0490). 100 mir-21 P = Percent survival OS higher than lower than Obr. 10: Kaplan-Meierova analýza hladiny mir-21 korelují s celkovým přežíváním pacientů s nádory žaludku (P = 0,0078). 114

115 100 mir-145 P = Percent survival OS lower than higher than Obr. 11: Kaplan-Meierova analýza hladiny mir-145 korelují s celkovým přežíváním pacientů s nádory žaludku (P = 0,0384). 100 mir-10b/mir-21/mir-143/mir-145 P = Percent survival DFS low levels high levels Obr. 12: Kombinovaná Kaplan-Meierova analýza hladiny mir-10b, mir-21, mir-143 a mir-145 korelují s celkovým bezpříznakovým přežíváním pacientů s nádory žaludku (P = 0,0091). 115

116 100 mir-10b/mir-21/mir-145 P = Percent survival OS low levels high levels Obr. 13: Kombinovaná Kaplan-Meierova analýza hladiny mir-10b, mir-21 a mir-145 korelují s celkovým přežíváním pacientů s nádory žaludku (P = 0,0056). 10 mir-21 P = mir-23a P < mir-27a P < normalized log expression healthy donors GC patients normalized log expression healthy donors GC patients normalized log expression healthy donors GC patients 1 mir-142-5p P = mir-376c P = normalized log expression healthy donors GC patients normalized log expression healthy donors GC patients Obr. 14: Analýza exprese mir-21, mir-23a, mir-27a, mir-142-5p a mir-376c v krevním séru pacientů s nádorem žaludku a v krevním séru zdravých kontrol. 116

117 Obr. 15: Koláčové grafy vyjadřující průměrné zastoupení jednotlivých sekvencí ve vzorcích nádorové tkáně a zdravé sliznice. Obr. 16: Koláčový graf vyjadřující průměrné zastoupení jednotlivých sekvencí v krevním séru zdravých dárců. Obr. 17: Zastoupení délek jednotlivých fragmentů po odstranění adaptorů ve vzorcích nádorové/zdravé tkáně. 117

118 Obr. 18: Zastoupení délek jednotlivých fragmentů po odstranění adaptorů ve vzorcích krevního séra. Výstupy a publikace za rok 2015: VŠIANSKÁ, M., Radka OBERMANNOVÁ, Peter GRELL, Renata EMMEROVÁ, Ondřej SLABÝ, Petra VYCHYTILOVÁ a Rostislav VYZULA. MikroRNA jako diagnostický, prognostický a prediktivní biomarker u karcinomu žaludku - připravovaný pilotní projekt testování v souboru pacientů MOÚ Brno. In XXXIX. brněnské onkologické dny a XXIX. konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky, Brno V současné době je dále připravována výsledková publikace, která bude odeslána do mezinárodního časopisu s IF v roce Grantová žádost do AZV MZ ČR Sekvenční FDG-PET a mirna jako biomarker změny strategie předoperační léčby u lokálně pokročilého karcinomu žaludku a gastroesofageální junkce. Plán pro rok 2016: 1) Sestavit soubor párových vzorků krevního séra od pacientů s nádory žaludku před chirurgickým zákrokem a 1-3 měsíce po chirurgickém zákroku. 2) S využitím technologie NGS (Illumina) identifikovat mirna s deregulovanou expresí v krevním séru pacientů s nádory žaludku a nalézt mirna s prognostickým potenciálem. 3) Validovat sestavený panel cirkulujících mirna na nezávislé kohortě pacientů podle požadavků REMARK a STARD pomocí qrt-pcr. 4) Změřit expresi identifikovaných mirna ve vzorcích krevního séra odebíraného před a po chirurgickém zákroku. 118

119 3. SEKVENČNÍ LÉČBA METASTATICKÉHO KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU EGFR INHIBITORY MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÉ CHARAKTERISTIKY UMOŽŇUJÍCÍ RACIONÁLNÍ INDIKACI LÉČBY Hlavní řešitel: Spoluřešitelé: MUDr. Igor Kiss, Ph.D. doc. RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D., doc. MUDr. Marek Svoboda, Ph.D. Anotace: Kolorektální karcinom je jedno z nejčastějších nádorových onemocnění. V léčbě metastatického onemocnění je indikovaná chemoterapie v kombinaci s cílenou léčbou. V podmínkách České republiky je úhrada této nákladné léčby vázaná na záznam výsledků léčby do registru nákladné onkologické léčby v případě kolorektálního karcinomu s názvem CORECT. Data z registru jsou 2x ročně aktualizovaná a výsledky prezentovány odborné veřejnosti. Z analýzy dat vyplynulo, že 45 z 5572 pacientů je léčena EGFR inhibitory v sekvenci, tj. po selhání chemoterapie v kombinaci s cetuximabem jsou následně léčeni dalším EGFR I panitumumabem a to nejčastěji v monoterapii. V literatuře nejsou publikována data zkoumající tuto sekvenci léčby a přestože bychom očekávali, že zvláště při sekvenci cetuximab panitumumab léčba nebude efektivní, detekovali jsme různé léčebné odpovědi : parciální remise na panitumumabu po progresi na cetuximabu, dlouhé doby do progrese (i pacienti déle než 10 měsíců), apod. V rámci projektu budou biologicky charakterizovány nádory, které dobře reagovaly na sekvenční podání anti-egfr terapie za využití technologie NGS a případně budou nalezeny biomarkery umožňující tyto pacienty identifikovat. Cíle projektu: Cílem výzkumného projektu je analyzovat klinická data pacientů v REGISTRU CORECT (45 pacientů) a korelovat je s mutačním stavem onkogenů KRAS, NRAS a BRAF, a s hladinami mikrorna za účelem identifikace biomarkerů umožňujících predikovat léčebnou odpověď na jednotlivé EGFR inhibitory. Metodika: Technologie sekvenace nové generace, konkrétně technologie společnosti Illumina MiSEq. Následná validace bude provedena metodikou qrt-pcr. Stav řešení / výsledky řešení v roce 2015: V souladu s popisem projektu byla u 36 vzorků pacientů výzkumnými pracovníky realizačního týmu provedena metodou sekvenace nové generace analýza mutací onkogenů KRAS, NRAS a BRAF. Tito pacienti byli léčeni sekvencí Erbitux (cetuximab) -> Vectibix (panitumumab). Celkem u 7 pacientů, u kterých byl dle záznamů v registru nemutovaný KRAS (wt-kras), (N=6) nebo nebyl znám (N=1), byla metodou sekvenace prokázána KRAS mutace (Obr. 1). Do detailní analýzy bylo zařazeno z celkového počtu pacientů celkem 26 pacientů, kteří byli sekvencí Erbitux i Vectibix léčeni až do progrese onemocnění. Ke zmenšení souboru došlo z důvodu zhoršení stavu bez progrese (N = 3), nežádoucího účinku souvisejícího s biologickou léčbou (N = 3), ztrátě pacientů ze sledování (N = 2), nežádoucího účinku nesouvisející s biologickou léčbou (N = 1) a intolerance léčby (N = 1). Následovala korelace klinických dat těchto 26 pacientů v registru CORECT a korelace s mutačním stavem onkogenů KRAS, NRAS a BRAF, a také s hladinami mir-31-5p a mir-31-3p za účelem identifikace biomarkerů umožňujících predikovat léčebnou odpověď na jednotlivé EGFR inhibitory. Statistická analýza provedená metodou Kaplan-Meirových křivek přežití v závislosti na přežití bez známek progrese onemocnění byla provedena zaprvé na základě přežití bez 119

120 známek progrese od data zahájení léčby Vectibixem dle odpovědi na léčbu Erbituxem. Pacienti rozdělení dle nejlepší léčebné odpovědi dosažené během léčby Erbituxem, 19 responderů (R) a 7 non-responderů (NR) se lišili mediánem progrese 3,4 vs. 2,2 měsíce (P=0,497), (Obr. 2). Zadruhé byla analýza provedena na základě přežití bez známek progrese od data zahájení léčby Erbituxem dle přítomnosti KRAS, NRAS nebo BRAF mutace. V tomto případě byli pacienti rozděleni na základě přítomnosti KRAS, NRAS nebo BRAF mutací na pacienty s mutací (N=7) a na pacienty bez mutace (N=19). Metodou Kaplan-Meierovy křivky přežití se neprokázala signifikantní závislost z hlediska přežití bez známek progrese (PFS), (P=0,386), (Obr. 3). Mediány času do progrese byly u nemutovaných versus mutovaných pacientů 6,4 a 4,4 měsíce. Zatřetí byla provedena analýza na základě přežití bez známek progrese od data zahájení léčby Vectibixem dle přítomnosti KRAS, NRAS nebo BRAF mutace. Rozdíly mezi skupinami nemutovaných a mutovaných pacientů ani tentokrát nebyly signifikantní (P=0,409). Medián PFS byl 2,8 vs. 3,4 měsíce (Obr. 4). Začtvrté byla sestrojena Kaplan- Meierova křivka přežití v závislosti na přežití bez známek progrese od data zahájení léčby Erbituxem dle hladiny mir-31-3p (mir-31*). Pacienti s nízkou hladinou exprese (cut-off stanoven pomocí ROC křivky na hodnotu 0,005), (N=7) měli medián PFS 12,3 měsíce, pacienti s nízkou hladinou exprese této mirna měli medián PFS 5 měsíců, (P=0,082), (Obr. 5). Nakonec byla provedena analýza Kaplan-Meierovou křivkou v závislosti přežití bez známek progrese od data zahájení léčby Erbituxem dle hladiny mir-31-5p. Cut-off hodnota pro rozdělení pacientů do dvou kategorií s nízkou hladinou exprese (N=6) a vysokou hladinou exprese (N=20) byla na základě ROC křivky stanovena jako 0,018. Mezi skupinami pacientů s nízkou a vysokou hladinou exprese mir-31-5p byl pozorován signifikantní rozdíl (P=0,038). Mediány PFS byly 12,3 měsíce pro pacienty s nízkou hladinou exprese vs. 4,9 měsíce pro pacienty s vysokou hladinou exprese (Obr. 6). Výsledky: Obr. 1: Výsledky srovnání mutací KRAS, NRAS, BRAF dle registru CORECT a metodou sekvenování. 120

121 Obr. 2: Přežití bez známek progrese od data zahájení léčby Vectibixem dle odpovědi na léčbu Erbituxem. Obr. 3: Přežití bez známek progrese od data zahájení léčby Erbituxem dle přítomnosti KRAS, NRAS nebo BRAF mutace. 121

122 Obr. 4: Přežití bez známek progrese od data zahájení léčby Vectibixem dle přítomnosti KRAS, NRAS nebo BRAF mutace. Obr. 5: Přežití bez známek progrese od data zahájení léčby Erbituxem dle hodnoty mir-31-3p (mir-31*). 122

123 Obr. 6: Přežití bez známek progrese od data zahájení léčby Erbituxem dle hodnoty mir-31-5p. Publikace vzešlé z projektu v roce 2015: V tomto roce jsme ve spolupráci s italským pracovištěm experimentální medicíny ve Ferraře dokončili dvě výsledkové publikace (1-2) do zahraničních časopisů s impakt faktorem. Doposud získané výsledky z tohoto projektu byly také aktivně prezentovány formou posteru na XXXIX. Brněnských onkologických dnech a XXIX. Konferenci pro nelékařské zdravotnické pracovníky a také na konferenci XXI. Biologické dny, Pokroky a výzvy současné nádorové biologie v Brně (3-4). Formou posteru byla data prezentována také na XI.Diagnostic, Predictive and Experimental Oncology Days v Olomouci (5). (1) MicroRNA expression profiling identifies mir-31-5p/3p as associated with time to progression in wild-type RAS metastatic colorectal cancer treated with cetuximab. MLČOCHOVÁ, Jitka, Petra VYCHYTILOVÁ, Manuela FERRACIN, Barbara ZAGATTI, Lenka RADOVÁ, Marek SVOBODA, Radim NĚMEČEK, Stanislav JOHN, Igor KISS, Rostislav VYZULA, Massimo NEGRINI a Ondřej SLABÝ. MicroRNA expression profiling identifies mir-31-5p/3p as associated with time to progression in wild-type RAS metastatic colorectal cancer treated with cetuximab. Oncotarget, New York: Impact Journals, 2015, Neuveden, October, s. nestránkováno. ISSN (2) Prediction of response to anti-egfr antibody-based therapies by multigene sequencing in colorectal cancer patients. LUPINI, Laura, Cristian BASSI, Jitka MLČOCHOVÁ, Gentian MUSA, Marta RUSSO, Petra VYCHYTILOVÁ, Marek SVOBODA, Silvia SABBIONI, Radim NĚMEČEK, Ondřej SLABÝ a Massimo NEGRINI. Prediction of response to anti-egfr antibody-based therapies by multigene sequencing in colorectal cancer patients. BMC Cancer, LONDON: BIOMED CENTRAL LTD, 2015, roč. 15, October, s ISSN

124 (3) MiR-31-5p zvyšuje prediktivní hodnotu KRAS/NRAS/BRAF u pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem léčenýmch cetuximabem. MLČOCHOVÁ, Jitka, Petra VYCHYTILOVÁ, Lenka RADOVÁ, Laura LUPINI, Christian BASSI, Manuela FERRACIN, Barbara ZAGGATI, Radim NĚMEČEK, Rostislav VYZULA, Marek SVOBODA, Massimo NEGRINI a Ondřej SLABÝ. MiR-31-5p zvyšuje prediktivní hodnotu KRAS/NRAS/BRAF u pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem léčenýmch cetuximabem. InXXXIX. brněnské onkologické dny a XXIX. konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky, Brno (4) Využití metody sekvenování nové generace (NGS) k analýze mutačního stavu členů EGFR signální dráhy u pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem (mcrc) léčených cetuximabem. NĚMEČEK, Radim, Jitka BERKOVCOVÁ, Iva BABÁNKOVÁ, Jitka MLČOCHOVÁ, Petra VYCHYTILOVÁ, Ondřej SLABÝ a Marek SVOBODA. Využití metody sekvenování nové generace (NGS) k analýze mutačního stavu členů EGFR signální dráhy u pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem (mcrc) léčených cetuximabem. In XXXIX. brněnské onkologické dny a XXIX. konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky, Brno (5) MiR-31-5p/3p predikují čas do progrese u pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem s nemutovaným RAS léčených cetuximabem. MLČOCHOVÁ, Jitka, Petra VYCHYTILOVÁ, Manuela FERRACIN, Barbara ZAGATTI, Lenka RADOVÁ, Marek SVOBODA, Radim NĚMEČEK, Stanislav JOHN, Igor KISS, Rostislav VYZULA, Massimo NEGRINI a Ondřej SLABÝ.In XI.Diagnostic, Predictive and Experimental Oncology Days (December 2-3, 2015), Olomouc Plán pro rok 2016 (případně další): Cíle projektu byly splněny a projekt tak dále nebude pokračovat. 124

125 4. IDENTIFIKACE DIAGNOSTICKÝCH A PREDIKTIVNÍCH MIKRORNA U PACIENTŮ S KARCINOMEM PANKREATU Hlavní řešitel: MUDr. Igor Kiss, Ph.D., doc. RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D. Anotace: MikroRNA je dobře zdokumentovanou strukturou krátké (22 nukleotidů) endogenní nekódující RNA, která ovlivňuje stabilitu a translaci mrna. MikroRNA jsou schopny post-transkripčně regulovat genovou expresi a podle bioinformatických modelů mohou regulovat až jednu třetinu lidských genů, přičemž některé z těchto genů jsou významnými onkogeny či nádorovými supresory. Změny v expresních profilech mirna již byly pozorovány u většiny solidních nádorů. Mechanistické studie v nádorové buňce zase prokázaly schopnost jednotlivých mirna vykazovat jak funkci nádorového supresoru, tak onkogenu. Tato pozorování zásadním způsobem rozšířila koncept molekulární patogeneze nádorových onemocnění a naznačila potenciál mirna nejen jako diagnostických markerů, ale také jako potenciálních terapeutických cílů. U pacientů se solidními nádory byly úspěšně využity specifické expresní profily mirna k predikci léčebné odpovědi na vybrané terapeutické režimy či stanovení prognózy nebo upřesnění diagnostiky u metastáz neznámého původu. Studie s takovým designem byly úspěšně provedeny také u karcinomu pankreatu. Například tkáňové mir-21 nebo mir-196a pozitivně korelují s celkovým přežíváním pacientů s karcinomem pankreatu. Sérové mir-155 a mir-196a zase umožnily odlišit pacienty s chronickou pankreatitidou od pacientů s karcinomem. Zdá se tedy, že mirna budou velice dobře použitelné jako nová třída biomarkerů u karcinomu pankreatu. Rozdíly v hladinách mirna mezi nádorovou tkání a normální tkání pankreatu naznačují jejich možné využití jako terapeutických cílů. Cíle projektu: 1) Identifikace mikrorna s rozdílnou expresí v tkáni karcinomu pankreatu ve srovnání s tkání chronické pankreatitidy a nenádorového pankreatu 2) Korelace mikrorna s klinicko-patologickými charakteristikami a identifikace mikrorna s prognostickou a prediktivní funkcí 3) Identifikace diagnostických mikrorna v krevní plazmě Metodika: V naší studii bychom pomocí vysokokapacitního přístupu identifikovali mikrorna specifické pro tkáň karcinomu pankreatu (5), oproti tkáni chronické pankreatitidy (5) a zdravému pankreatu (5). Plánujeme zpracování tkáně cca 80 pacientů s karcinomem pankreatu, 20 s chronickou pankreatitidou a 20 zdravých slinivek, celkově tedy 120 vzorků. U pacientů bude vždy analyzován současně vzorek nádorové tkáně a bude-li to možné i vzorek okolní, makroskopicky nepostižené tkáně pankreatu. Ze získaného biologického materiálu bude izolována RNA a provedena vysokokapacitní analýza 754 mirna u celkem 15 vzorků. Na nezávislém souboru pacientů bude provedena validace identifikovaných mirna pomocí metody Real-Time PCR a následně budou statisticky vyhodnoceny z hlediska jejich možného využití jako prognostických či prediktivních biomarkerů. U nejvíce významných mirna bude provedena jejich funkční charakterizace in vitro (viabilita, buněčný cyklus, apoptóza, invazivita, migrace). 125

126 Stav řešení: V roce 2015 bylo navázáno na předchozí projekty IPO, v rámci kterých jsme vytvořili detailně klinicky charakterizovanou kohortu 80 pacientů s karcinomem pankreatu, 20 vzorků chronické pankreatitidy a 10 vzorků zdravé sliznice (doc. MUDr. Leoš Křen, PhD, FN Brno) a provedli jsme pilotní studii zabývající se analýzou exprese mikrorna u těchto pacientů. Od minulého roku rovněž probíhá nábor nových pacientů do studie, kdy od každého pacienta je odebírána nádorová tkáň, zdravá sliznice, předoperační a pooperační krev a z nádorové tkáně jsou zakládány primární buněčné linie (sběr vzorků zajišťují prof. MUDr. Zdeněk Kala, CSc, doc. MUDr. Leoš Křen, PhD, FN Brno). K dnešnímu datu máme k dispozici 46 vzorků nádorové tkáně, 46 vzorků zdravé sliznice, 36 párových vzorků před- a pooperační krve a 41 úspěšně založených primárních linií. Ze vzorků nádorové tkáně, zdravé sliznice a krevní plazmy byla úspěšně izolována celková RNA obohacená o frakce krátkých RNA (mirvana TM mirna Isolation Kit, Ambion, USA; respektive Qiagen mirneasy Serum/Plasma kit, Qiagen, GmbH, Německo), byla změřena koncentrace a čistota získané RNA (NanoDrop ND-1000) a rovněž její kvalita (Agilent Bioanalyzer 2100). Pro další analýzy bylo využito pouze vzorků, u kterých byl poměr A260/A280 > 2, poměr A260/A230 > 1,8 a RIN 8. V potřebných případech byla izolace opakována, dokud nebylo dosaženo stanovených kritérií pro kvalitu vzorku. Získaná RNA byla využita pro stanovení exprese 11 mirna (mir-155, mir-196a, mir-21, mir-217, mir-34a, mir-210, mir-203, mir-10b, mir-221, mir-222, mir-181a). Zároveň byla provedena studie, jejíž cílem bylo identifikovat vhodnou endogenní kontrolu, která by nepodléhala degradaci ve FFPE vzorcích, a byla tak dostatečně stabilní. Celkem bylo testováno 5 kandidátních endogenních kontrol (RNU6B, RNU48, RNU44, mir-1233, mir-1260). Pomocí softwaru GeNorm a NormFinder byla identifikována mir-1233 jako optimální endogenní kontrola s nejnižší mírou variability a vysokou mírou exprese. Analýzy zabývající se expresí mirna v tkáni potvrdily zvýšené hladiny mir-21 (P = 0,0018; obr.1), mir-203 (P = 0,0222; obr.1), mir-181a (0,0284; obr.1), mir-222 (0,0012; obr.1), mir-221 (P < 0,0001; obr.1), mir-210 (P < 0,0001; obr.1), mir-155 (P = 0,0001; obr.1), mir-10b (P = 0,0003; obr.1), mir-196a (P < 0,0001; obr.1) a sníženou hladinu mir-217 (P = 0,0001; obr.2) u pacientů s nádorem pankreatu, což je v souladu s předchozími studiemi, a tedy i naším předpokladem. MiR-34a byla v nádorové tkáni zvýšená (P = 0,0111), což je v rozporu s předchozím pozorováním. Zároveň bylo prokázáno, že mir-217 dokáže odlišit nádorovou tkáň od tkáně chronické pankreatitidy (senzitivita 83,33 %, specificita 77,78 %, AUC 0,8642) a tkáň chronické pankreatitidy od nádorové tkáně (senzitivita 64,86 %, specificita 61,11 %, AUC 0,6652). V další fázi studie byly na základě literatury vybrány 4 mirna (mir-34a, mir-217, mir-21, mir-198), u kterých je předpokládán prognostický potenciál. Exprese těchto mirna byla analyzována na souboru 80 nádorových tkání a následně byla provedena ROC analýza a Kaplan-Meierova analýza přežití. Bylo prokázáno, že zvýšená hladina mir-21 a mir-198 souvisí s kratší dobou do progrese (mir-21, P = 0,0011, obr.3; mir-198, P = 0,0009, obr.4-5) a kratší dobou celkového přežívání pacientů (mir-21, P = 0,0427, obr.3; mir-198, P = 0,0097, obr.4-5). S cílem identifikovat nové mirna s prognostickým potenciálem bylo dále vybráno 6 vzorků nádorové tkáně od pacientů se špatnou prognózou a 10 vzorků nádorové tkáně od pacientů s dobrou prognózou (MUDr. Igor Kiss, PhD, MOU; MUDr. Jiří Tomášek, PhD, MOU; MUDr. Petr Karásek, MOU) a následně bylo provedeno expresní profilování mirna s využitím Affymetrix MicroRNA GeneChips 2.0 Array (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA). Data byla vyhodnocena s využitím standardních i vícedimenzionálních biostatistických metod, přičemž bylo identifikováno 42 mirna s rozdílnou expresí mezi pacienty s dobrou a špatnou prognózou po provedení chirurgického výkonu na hladině významnosti P < 0,001 (obr. 6), 15 mirna na hladině významnosti P < 0,0001 (obr. 7) a 4 mirna na hladině významnosti P < 0,00001 (obr. 8). V letošním roce byly rovněž zahájeny in vitro analýzy. Pro 126

127 tyto účely byly zakoupeny 2 stabilní buněčné linie (PANC-1 a BxPC3) a pro detailní studium zapojení mirna do patogeneze nádorů slinivky břišní byly na základě předchozích výsledků vybrány 2 mirna mir-217, která vykazuje vysoký diagnostický potenciál, a mir-21, u které se předpokládá významná souvislost s progresí onemocnění. K dnešnímu dni byla provedena optimalizace tranzientní transfekce obou mirna do buněčných linií (obr. 9-12) a detailní funkční charakterizace (viabilita, buněčný cyklus, apoptóza, invazivita, migrace, schopnost zakládat kolonie, stanovení cílových molekul) bude dále probíhat v průběhu roku 2015 (veškerý potřebný materiál byl zakoupen v roce 2014). V roce 2014 byla též připravena výsledková publikace, která je v současné době odeslána do zahraničního časopisu s IF, a dále byla podána grantová žádost do AZV MZ ČR. Výsledky: normalized log expression healthy tissue mir-222 P = tumour tissue normalized log expression healthy tissue mir-203 P = tumour tissue normalized log expression healthy tissue mir-181a P = tumour tissue normalized log expression healthy tissue mir-210 P < tumour tissue normalized log expression healthy tissue mir-155 P = tumour tissue normalized log expression healthy tissue mir-10b P = tumour tissue 127

128 mir-196a P < mir-221 P < normalized log expression healthy tissue tumour tissue normalized log expression healthy tissue tumour tissue normalized log expression healthy tissue mir-34a P = tumour tissue normalized log expression healthy tissue mir-21 P = tumour tissue Obr. 1: Porovnání exprese 10 vybraných mirna v nádorové tkáni a zdravé sliznici u pacientů s nádorem slinivky břišní. normalized log expression healthy tissue mir-217 P = tumour tissue normalized log expression healthy tissue mir-217 P < pancreatitic tissue tumour tissue Obr. 2: Porovnání exprese mir-217 v nádorové tkáni, tkáni chronické pankreatitidy a zdravé sliznici. 128

129 100 mir-21 P = mir Survival [%] Survival [%] DFS (days) OS (days) Obr. 3: Kaplan-Meierovy křivky přežití pacienti s vysokou hladinou mir-21 mají kratší čas do progrese a kratší celkové přežívání. 100 mir-198 P = mir-198 P = Survival [%] Survival [%] DFS (days) OS (days) Obr. 4: Kaplan-Meierovy křivky přežití pacienti s vysokou hladinou mir-198 mají kratší čas do progrese a kratší celkové přežívání. Survival [%] mir-21 and mir-198 P < Survival [%] mir-21 and mir-198 P = DFS (months) high level of one/both mirnas low level of both mirnas OS (months) high level of one/both mirnas low level of both mirnas Obr. 5: Kaplan-Meierovy křivky přežití kombinovaná analýzy mir-21 a mir

130 Obr. 6: Rozdílná exprese 42 mirna u pacientů s dobrou prognózou (modrá lišta) a špatnou prognózou (žlutá lišta), P < 0,

131 Obr. 7: Rozdílná exprese 15 mirna u pacientů s dobrou prognózou (modrá lišta) a špatnou prognózou (žlutá lišta), P < 0,0001 Obr. 8: Rozdílná exprese 4 mirna u pacientů s dobrou prognózou (modrá lišta) a špatnou prognózou (žlutá lišta), P < 0,

132 Obr. 9: Optimalizace tranzientní transfekce 10nM pre-mir-217 do buněčné linie PANC-1. míra exprese mir-217 míra exprese mir-217 Obr. 10: Optimalizace tranzientní transfekce 10nM pre-mir-217 do buněčné linie BxPC3. 132

133 Obr. 11: Optimalizace tranzientní transfekce 70nM anti-mir-21 do buněčné linie PANC-1. míra exprese mir-21 míra exprese mir-21 Obr. 12: Optimalizace tranzientní transfekce 70nM anti-mir-21 do buněčné linie BxPC3. Publikační aktivita: 133

134 VYCHYTILOVÁ-FALTEJSKOVÁ, Petra, Igor KISS, Soňa KLUSOVÁ, Jan HLAVSA, Vladimír PROCHÁZKA, Zdeněk KALA, Jan MAZANEC, Jitka HAUSNEROVÁ, Leoš KREN, Markéta HERMANOVÁ, Jiří LENZ, Petr KARÁSEK, Rostislav VYZULA, Ondřej SLABÝ. MiR-21, mir-34a, mir-198 and mir-217 as diagnostic and prognostic biomarkers for chronic pancreatitis and pancreatic ductal adenocarcinoma. Diagnostic Pathology, 2015 Apr 24;10:38. doi: /s Plán pro rok 2016: Cíle projektu byly splněny a projekt tak dále nebude pokračovat. 134

135 5. VYTVOŘENÍ A CHARAKTERIZACE SOUBORU PACIENTŮ S KARCINOMEM ŽALUDKU A PILOTNÍ ANALÝZY POTENCIÁLNÍCH BIOMARKERŮ NA BÁZI MIKRORNA Hlavní řešitel: Ph.D. MUDr. Milana Šachlová, CSc. et Ph.D., doc. RNDr. Ondřej Slabý, Anotace: Nádory žaludu jsou čtvrtým nejčastějším úmrtím na nádorová onemocnění a jedna z nejčastějších příčin úmrtí na nádorová onemocnění na světě. Ačkoliv se zaváděním novým léčebných strategií léčebné výsledky zlepšují, celková prognóza pacientů s pokročilým onemocněním zůstává stále velice špatná. Je proto zapotřebí nalézt nové biomarkery umožňující stratifikaci těchto pacientů do skupin jak podle rizika onemocnění tak podle očekávané léčebné odpovědi, což by umožnilo více individualizovány přístup k těmto pacientů. CEA, CA 19-9 a CA 72-4 představují běžně užívané biomarkery karcinomu žaludku, nicméně jejich nízká senzitivita a specificita jak v primární diagnostice tak v prognóze onemocnění jejich přínos významně limituje. V posledních letech jsou v souvislosti s karcinomem žaludku velice často studovány mikrorna a to jak na úrovni vlastní kancerogeneze tak jako potenciální biomarkery umožňující jak přesnou diagnostiku tak citlivé stanovení prognózy onemocnění případně predikci léčebné odpovědi. Tato problematika již byla zpracován řadou přehledných sdělení. Cíle projektu: Cílem naši studie je především vytvořit detailně klinicky charakterizovaný soubor pacientů s karcinomem žaludku všech klinických stádií léčených na MOU (N=100) umožňující retrospektivní provádění biomarkerových studií. A dále verifikovat diagnostický (nádorová vs. nenádorová tkáň případně krevní serum)/prognostický (DFS, OS)/prediktivní potenciál (odpověď na léčbu) vybraných mirna (let-7 family, mir-30 family, mir-21) na tomto souboru v pilotní studii. Stav řešení: V prvním roce projektu byla úspěšně sestavena detailně klinicky charakterizovaná kohorta 60 pacientů s karcinomem žaludku (MOU) a následně byla provedena pilotní studie zabývající se analýzou exprese mikrorna (mirna) u těchto pacientů. Od každého pacienta byla k dispozici nádorová tkáň, nenádorová sliznice a krevní sérum. Ze vzorků byla izolována celková RNA obohacená o frakce krátkých RNA (mirvana mirna Isolation Kit, Ambion; mirneasy Serum/Plasma Kit, Qiagen), byla změřena koncentrace a čistota získané RNA (NanoDrop ND-1000) a rovněž její kvalita (Agilent Bioanalyzer 2100). Pro další analýzy bylo využito pouze vzorků, u kterých byl poměr A260/A280 > 2, poměr A260/A230 > 1,8 a RIN 8. V potřebných případech byla izolace opakována, dokud nebylo dosaženo stanovených kritérií pro kvalitu vzorku. Získaná RNA byla následně využita pro stanovení exprese 5 mirna (mir-375, mir-338-3p, mir-21, mir-143, let-7a), které byly vybrány na základě literatury. Analýzy zabývající se expresí těchto mirna v tkáni potvrdily zvýšenou hladinu mir-21 (P = 0,0023) a sníženou hladinu mir-375 (P = 0,0034), mir-338-3p (P = 0,026), mir-143 (P = 0,0041) a let-7a (P = 0,041), což je v souladu s předchozími studiemi. Hladiny let-7a byly dále rovněž snížené v séru pacientů s karcinomem žaludku oproti séru zdravých dárců. Výsledky této pilotní práce tedy naznačují, že mirna by mohly v budoucnu sloužit jako nové biomarkery u pacientů s nádory žaludku. 135

136 Výstupy za rok 2015: Byla zaslána grantová žádost a deslána do soutěže AZV MZ ČR v roce Plán pro rok 2015: 1) Rozšířit soubor pacientů s nádory žaludku (cca 100 pacientů). 2) Analyzovat prognostický potenciál 6 vybraných mirna (mir-93, mir-145, mir-21, mir-143, mir-107, mir-10b) u pacientů s nádory žaludku (korelace exprese mirna a DFS/OS). 3) Provést expresní profilování mirna v séru pacientů s nádory žaludku s cílem identifikovat nové prognostické biomarkery. 4) Validovat vybrané prognostické mirna (cca 5 mirna) na nezávislém souboru pacientů 6. ANALÝZA MUTAČNÍHO STAVU ČLENŮ EGFR SIGNÁLNÍ DRÁHY U PACIENTŮ S KOLOREKTÁLNÍM KARCINOMEM LÉČENÝCH ERBITUXEM METODOU SEKVENOVÁNÍ NOVÉ GENERACE Hlavní řešitelé projektu: Mgr. Jitka Berkovcová, Ph.D., MUDr. Radim Němeček, doc. MUDr. Marek Svoboda, Ph.D., MUDr. Pavel Fabian, Ph.D. Anotace projektu Projekt využivá nové vysokokapacitní technologie sekvenování nové generace k analýze mutačního stavu členů EGFR signální dráhy u pacientů s kolorektálním karcinomem léčených erbituxem. Význam projektu zpočívá i v přípravě zavedení technologie do klinické praxe v rámci molekulární patologie. Cíle projektu Cílem projektu je vyšetřit mutační stav významných členů EGFR signální dráhy u pacientů s kolorektálním karcinomem na terapii erbituxem. Mutační stav genů bud vyšetřen nejen u nádorových buněk primárních tumorů, ale také u nádorových buněk metastáz. Výsledky obou analýz budou následně vyhodnoceny i s ohledem k výsledkům léčby. Při vyšetření bude optimalizována metoda sekvenování nové generace (NGS, NextGen Sequencing) na platformě MiSeq (illumina), u které se očekává brzké uplatnění v diagnostické praxi prediktivní onkologie. Metodika K vyšetření jsme použili komerční TruSight Tumor panel (illumina), který je určen k přípravě DNA knihovny pro následné sekvenování nové generace na platformě MiSeq. Panel obsahuje 21 genů s biologickým významem u solidních nádorů (viz tabulka č. 1). Jedná se o amplikonové sekvenování, které pokrývá všechny exony s nejčastějšími mutacemi detekovanými u nádorových onemocnění. Metoda je určena pro vyšetření nádorové DNA izolované z parafinových bloků. DNA bude izolována kolonkovou metodou Sample Preparation Kit (Roche). 136

137 Tabulka č.1 EGFR KRAS NRAS BRAF C-KIT PDGFR ERBB2 AKT1 ALK CTNNB1 MET PIK3CA PTEN p53 MAP2K1 APC FBXW7 PTEN SRC GNAQ FGFR Stav řešení v roce 2015 V roce 2015 jsme provedli sekvenační vyšetření pomocí metody NGS u 13 pacientů s původně nemutovaným kras genem v kodonu 12 a 13 na terapii erbituxem. Od každého pacienta byly analyzovány párové vzorky operovaných primární tumorů a metastáz. Mutační stav primárních tumorů a metastáz byl ve vysoké shodě v genech TP53, APC, CTNNB1, KRAS, PIK3CA, PTEN a FBXXW7. Metastázy obecně obsahovaly signifikantně více mutací, než primární tumory. Potvrdili jsme potenciálně negativně prediktivní roli mutace v genu FBXW7 ve vztahu k odpovědi na anti-egfr terapii. Dále jsme pomocí NGS detekovali nové aktivační mutace v původně nemutovaných nádorech, které nebyly předchozími vyšetřeními zjištěny. Téměř všechny vedly k selhání anti-egfr terapie. Tabulka: Charakteristika nejčastěji mutovaných genů Gen Pacientů s mutací Celkem mutací Popis Incidence u CRC Reference KRAS 6 9 Oncogene % Mirone TP Tumor supressor gene % TCGA Network APC 4 7 Tumor supressor gene % TCGA Network FBXW7 4 6 Tumor supressor gene % Lupini PIK3CA 4 6 Oncogene 0,11% Mirone MET 3 3 Oncogene 0,02% Misale PTEN 2 3 Tumor supressor gene % Mirone KIT 2 2 Oncogene rare Liang STK Tumor supressor gene rare Launonen AKT1 2 2 Oncogene 1-6 % Carpten FOXL2 2 2 Transcription factor unknown Yoshida CTNNB1 1 2 Oncogene 1-5 % TCGA Network NRAS 1 1 Oncogene 3-5 % Misale BRAF 1 1 Oncogene 5-8 % Misale Plán pro rok 2016 V současnosti probíhá vyšetření nádorové tkáně primárního tumoru a metastáz pomocí metody NGS u výše popsaných zbývajících 10 pacientů. 137

138 Publikace výsledků projektu v roce 2015 Mutational analysis of primary and metastatic colorectal cancer samples underlaying the resistance to cetuximab-based therapy. Nemecek R, Berkovcova J, Radova L, Kazda T, Mlcochova J., Vychodilová-Faltejskova P, Slaby O, Svoboda M. Under Review in OncoTargets and Therapy. Využití metody sekvenování nové generace (NGS) k analýze mutačního stavu členů EGFR signální dráhy u pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem (mcrc) léčených cetuximabem. NĚMEČEK, Radim, Jitka BERKOVCOVÁ, Iva BABÁNKOVÁ, Jitka MLČOCHOVÁ, Petra VYCHYTILOVÁ, Ondřej SLABÝ a Marek SVOBODA. Využití metody sekvenování nové generace (NGS) k analýze mutačního stavu členů EGFR signální dráhy u pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem (mcrc) léčených cetuximabem. In XXXIX. brněnské onkologické dny a XXIX. konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky, Brno Mechanismy vzniku a vývoje kolorektálního karcinomu. Němecek R, Svoboda M. In XXXIX. brněnské onkologické dny a XXIX. konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky, Brno Číslo abstraktu: XVI/ 123 Může výběr materiálu ovlivnit prediktivní vyšetření metodou sekvenování nové generace (NGS)? Berkovcová Jitka; Radová Lenka; Rathouzská Šárka; Němeček Radim; Svoboda Marek; Fabian Pavel. In XXXIX. brněnské onkologické dny a XXIX. konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky, Brno Číslo abstraktu: XXX/

139 8. VYUŽITÍ METOD SEKVENOVÁNÍ NOVÉ GENERACE (NGS) KE SLEDOVÁNÍ NÁDOROVÉ HETEROGENITY U PACENTŮ S KOLOREKTÁLNÍM KARCINOMEM Hlavní řešitel: Mgr. Jitka Berkovcová, Ph.D. Spoluřešitelé: MUDr. Pavel Fabian, Ph.D., Mgr. Jana Lochmanová, Mgr. Lenka Radová, Ph.D. Anotace projektu Podmínkou cílené anti-egfr terapie u pacientů s metastazujícím kolorektálním karcinomem je stanovení mutací RAS genů. Dosud užívané molekulární metody mají kvalitativní charakter. Rozhodující pro volbu metody je její senzitivita a specificita. Sekvenování nové generace (NGS) je vysoce senzitivní, ale zároveň i specifické. Do jisté míry umožňuje i kvantifikaci přítomného markeru v nádoru. Díky těmto vlastnostem NGS testování vede k upřesnění predikce cílené protinádorové terapie pacientů. Kromě toho NGS umožňuje sledovat heterogenitu nádorových buněk na základě přítomnosti různých variant genů. Cíle projektu Cílem projektu byla detailní mutační analýza EGFR signální dráhy biologického materiálu pacientů s kolorektálním karcinomem. Porovnávali jsme vzdáleně oddálené odběry rozsáhlých tumorů, případně morfologicky odlišné klony u jednoho pacienta. U těchto vzorků byly sledované různé varianty sekvenovaných genů a vyhodnocena jejich frekvence. Materiál a metody Do souboru bylo zařazeno 16 pacientů (12 mužů a 4 ženy) s operovaným kolorektálním karcinomem v první polovině roku Přesná charakteristika testovaného souboru je popsaná v tabulce č. 2. Jako hlavní kritérium byla zvolena velikost nádoru (>30 mm), nebo pacienti s více nádorovými ložisky. Celkem byla izolována DNA z 38 vzorků s vysokým zastoupením nádorové populace (40-70 %). DNA byla izolována kitem cobas DNA Sample Preparation (Roche). U každého vzorku bylo získáno 100µl DNA. Byla přeměřena koncentrace a čistota jednotlivých vzorků. Následně byla testována schopnost DNA amplifikovat se pomocí kitu FFPE QC (illumina). Příprava DNA knihovny proběhla pomocí TruSight Tumor kitu (illumina). Tento kit je designován tak, že jsou výsledně sekvenovány hot spots 26 genů (viz tabulka č. 1). Celkem bylo sekvenováno 175 amplikonů. Během hodnocení kvality DNA byla stanovena hodnota C T pro každý vzorek. Podle této hodnoty byly DNA ředěny do hybridizačních reakcí se směsí FPA oligo, resp. FPB oligo. Hybridizace probíhala přes noc při teplotě 40 C po prvotní denaturaci při 95 C. Po té byly odmyty nenasednutá oliga a připravena jejich extenze a ligace. Denaturovaná takto připravená DNA byla použita jako templát do PCR, během které došlo k její amplifikaci a značení příslušnými indexy. Po ukončené PCR byly knihovny na magnetických kuličkách zbaveny krátkých fragmentů DNA. Kontrola knihoven proběhla na Agilent DNA 1000 chipech. Koncentrace jednotlivých knihoven byla měřena pomocí fluorometru Qubit. Po přepočtu na molaritu byly knihovny normalizovány na 4nM. Takto naředěné knihovny byly denaturovány a poolovány ekvimolárně (ve stejném poměru). Výsledná poolovaná knihovna byla naředěna na 10pM, do které byla přidána 1% 20pM PhiX knihovna. Finální knihovna 12 vzorků byla sekvenována pomocí 300v2 sekvenačního kitu a standardní Flow. Základní analýza sekvencí byla provedena pomocí softwarů illumina dostupných v BaseSpace. Vyhodnocení sekvenčních dat bylo provedeno softwarem illumina Variant Studio. Následné datové úpravy proběhly pomocí balíků R/Bioconductor. 139

140 Tabulka č. 1: Výčet sekvenovaných oblastí genů. chromozom gen exon ref. 1 NRAS 2,3,4,5 NM_ ALK 23 NM_ MSH6 5 NM_ CTNNB1 3 NM_ FOXL2 1 NM_ PIK3CA 2,3,8,10,21 NM_ PDGFRa 12,14,18 NM_ KIT 9,11,13,17,18 NM_ FBXW7 8,9,10,11 NM_ APC 17 - část NM_ EGFR 18,19,20,21 NM_ MET 2,5,14,16,17,18,19 NM_ BRAF 11,15 NM_ GNAQ 4,5,6 NM_ PTEN 1,2,3,4,5,6,7,9 NM_ FGFR2 5 NM_ KRAS 2,3,4,5 NM_ AKT 4 NM_ MAP2K1 2 NM_ CDH1 8,9,12 NM_ TP53 celý gen NM_ ERBB2 20 NM_ SMAD4 9,12 NM_ STK11 1,4,6,8 NM_ SRC 14 NM_ GNAS 5 (6), 7 (8) N (N000516) Kvantifikace přítomných variant: Nejprve při výběru materiálu pro testování patolog zhodnotil procentuální zastoupení nádorové tkáně, ze které byla následně DNA izolována. Další kvantifikace proběhla při vyhodnocování sekvenaních dat, kdy byla sledována frekvence alternativní varianty v celkovém počtu čtení daného nukleotidu. Tato frekvence alternativní varianty potom byla přepočtena na původní zastoupení nádorových buněk ve výchozím materiálu. Tím výpočtem bylo získáno procento nádorových buněk nesoucích danou variantu genu. Tabulka č. 2: Charakteristika testovaného souboru. č.pac. pohlaví věk velikost typ ohraničení infiltrace leukocyty 1. Muž 69 38mm nespecifikován neohraničen ne 3 grading 140

141 2. Žena 79 95x60x15mm mucinózní ohraničen ano 2 3. Muž 85 45mm mucinózní ohraničen ne 2 4. Muž mm, 2.45mm, smíšený nespecifikován mucinózní neohraničen neohraničen ne 2 5. Muž 60 40mm nespecifikován neohraničen ne 3 6. Žena 50 20x15mm nespecifikován neohraničen ne 3 7. Muž 67 30mm nespecifikován neohraničen ne 3 8. Muž 58 60mm nespecifikován neohraničen ne 3 9. Muž 64 28mm nespecifikován neohraničen ano Muž 68 30mm + tu sigmatu nespecifikován neohraničen ne Žena 68 40mm nespecifikován ohraničen ne Muž 62 85x60x30mm mucinózní ohraničen ne Žena ,75x60x50mm 2.24mm mucinózní neohraničen ano 3 nespecifikován ohraničen ano Muž 82 48x45mm mucinózní ohraničen ne Muž 78 35x22mm nespecifikován neohraničen ne Muž mm 2.20mm 3.60x45x25mm nespecifikován ohraničen ano 3 nespecifikován ohraničen ano 3 nespecifikován neohraničen ano 3 Výsledky: Námi izolovaná DNA z tkáňových bloků dosahuje velice dobré kvality a ze všech vzorků bylo možné připravit DNA knihovny. Q Skore 30 bylo dosaženo u více jak 96 % sekvencí. Průměrná coverage dosahuje 4000 čtení. U 7 pacientů jsme detekovali mutaci v genu KRAS v kodonu 12 nebo 13, u 3 pacientů V600E mutaci v genu BRAF. Nejčastěji prokázané varianty byly v genu TP53, a to u 12 pacientů. U 6 pacientů molekulární analýza prokázala rozdíly na úrovni subpopulací. U 1 pacienta (pacient č. 4), u kterého byla nalezena morfologicky odlišná ložiska primárního tumoru, jsme potvrdili tuto rozdílnost i na molekulární úrovni. Přestože obě ložiska nesou mutace ve stejných genech (KRAS, TP53 a APC), jedná se ve všech třech případech o mutace odlišné, což vypovídá o velmi podobné karcinogenezi obou ložisek. Další rozdíly byly detekovány na úrovni nádorových subpopulací. Podrobné výsledky jsou popsané v tabulce č. 3. Tabulka č. 3: Popis detekovaných variant genů s jejich frekvencí v jednotlivých vzorcích, červeně jsou označeny nalezené rozdíly. č. pac. vzorek zast. nád.b. 1. gen varianta frekvence gen varianta frekvence gen varianta frekvence ST15 50% FBXW7 G557V 60% TP53 R213* 100% ST16 40% FBXW7 G557V 60% TP53 R213* 100% 141

142 ST17 50% BRAF V600E 50% GNAQ R183* 50% CDH1 W638* 34% FBXW7 frameshift 10% ST18 60% BRAF V600E 50% GNAQ R183* 50% ST19 50% KRAS G13D 100% TP53 R273C 100% ST20 60% KRAS G13D 100% TP53 R273C 100% ST21 50% KRAS G13D 100% TP53 R273C 100% ST22 50% KRAS G12S 100% TP53 frameshift % APC frameshift 100% ST23 60% KRAS G12V 60% TP53 Q192* 100% APC E1322* 85% ST24 50% KRAS G12D 55% TP53 G262V 75% ST25 40% KRAS G12D 50% TP53 G262V 75% ST26 50% TP53 R282W 100% ST27 60% TP53 R282W 100% ST28 50% PTEN C83R 6% MET P1153L 8% ST29 40% ST30 60% TP53 V272L 100% ST31 70% TP53 V272L 70% ST32 60% APC E1309* 40% TP53 G245A 50% ST33 50% APC E1309* 60% TP53 G245A 70% ST34 70% KRAS G12V 60% APC frameshift 40% ST35 70% KRAS G12V 65% APC frameshift 45% ST36 60% APC R1399H 40% APC frameshift 85% TP53 Y163H 80% ST37 40% APC R1399H 70% APC frameshift 100% TP53 Y163H 100% ST38 40% C-KIT V829A 56% TP53 R273C 63% ST39 40% KRAS G12D 40% MSH6 L1063P 43% FBXW7 R658* 39% EGFR G779C 9% TP53 R248Q 31% TP53 C176Y 33% ST40 70% BRAF V600E 24% MSH6 P1082L 67% PIK3CA K111N 30% ST41 70% BRAF V600E 28% MSH6 P1082L 71% PIK3CA K111N 29% FGFR2 R136* 10% ST42 50% BRAF V600E 55% MSH6 P1082L 29% ST43 50% BRAF V600E 43% PIK3CA H1047R 27% GNAQ Y192C 30% ST44 40% KRAS G12V 100% PIK3CA E545K 60% ST45 50% KRAS G12V 70% PIK3CA E545K 45% ST46 50% KRAS G12V 58% TP53 V197M 10% ST47 50% KRAS G12V 37% ST54 50% ST55 50% ST56 50% PIK3CA V22L 34% FBXW7 D480Y 7% C-KIT R800W 7% ST57 50% PIK3CA V22L 29% 142

143 ST58 50% ST59 60% Závěr: Naše výsledky ukazují, že NGS je vhodná pro FFPET vzorky, ale i u této molekulární metody je nutné zdůraznit správnou fixaci materiálu. Díky paralelnímu vyšetření několika sekvencí vede NGS k úspoře biologického materiálu. Potvrdili jsme stabilní rozložení přítomných mutací genu KRAS napříč nádorovou populací. To odpovídá představě, že pro analýzu klinicky relevantních prediktorů nehraje místo odběru roli. Toto vše z NGS dělá metodu spolehlivou pro prediktivní vyšetření u pacientů s plánovanou cílenou terapií. Vedle toho detekujeme s vysokou senzitivitou i minoritní genové varianty v morfologicky odlišných částích tumoru. Z tohoto pohledu je NGS vhodným nástrojem ke studiu intratumorové heterogenity. Publikace vzešlé z projektu: BERKOVCOVÁ, Jitka, Lenka RADOVÁ, Šárka RATHOUZSKÁ a Pavel FABIAN. Využití metody sekvenování nové generace v intratumorové heterogenitě kolorektálního karcinomu. In: Diagnostic, predictive and experimental oncology days. Olomouc, 2014, s. 28. BERKOVCOVÁ, Jitka, Iva BABÁNKOVÁ, Lenka RADOVÁ, Šárka RATHOUZSKÁ, Radim NĚMEČEK, Marek SVOBODA a Pavel FABIAN. Může výběr materiálu ovlivnit prediktivní vyšetření metodou sekvenování nové generace (NGS)? In: XXXIX. brněnské onkologické dny: XXIX. konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky. Praha: ČLS JEP, 2015, s ISSN X. Plán pro rok 2016: Díky tomuto projektu se podařilo zavést NGS do diagnostické praxe Specializované laboratoře Oddělení onkologické patologie MOÚ. Uvedenou metodu TruSight Tumor od roku 2015 používáme pro vyšetřování pacientů z Kliniky dětské onkologie, FN Brno. Pacienti s kolorektálním karcinomem jsou vyšetřovaní metodou NGS od podzimu roku 2015, pro přípravy knihovny je používán kit EliGene Colorectum. 143

144 8. STUDIUM SIGNÁLNÍ DRÁHY EGFR A EXPRESNÍCH PROFILŮ MIKRORNA V PREDIKCI ODPOVĚDI NA CÍLENOU ANTI-EGFR TERAPII U PACIENTŮ S KOLOREKTÁLNÍM KARCINOMEM S NEMUTOVANOU VARIANTOU ONKOGENU KRAS. Hlavní řešitelé projektu: doc. RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D., MUDr. Radim Němeček, doc. MUDr. Marek Svoboda, Ph.D., prof. MUDr. Rostislav Vyzula, CSc. Anotace projektu Kolorektální karcinom patří v České republice k nejčetnějším nádorovým onemocněním. I když se spektrum terapeutických přístupů pro onemocnění ve stádiu vzdálených metastáz rozšířilo o možnosti cílené léčby, není pětileté celkové přežívání (OS) zdaleka uspokojivé. Zavedení cílené anti-egfr terapie (cetuximab, panitumumab) vedlo k signifikantnímu zlepšení přežívání, avšak pouze u limitované části těchto pacientů, jejichž nádorové buňky nevykazují alterace na některé z nižších úrovní signální kaskády EGFR. V predikci anti- EGFR terapie se dnes rutinně používá mutační status onkogenu KRAS. Anti-EGFR terapie je indikována pouze pacientům s nemutovaným onkogenem KRAS (přibližně 55 %). Bohužel i v této podskupině pacientů je objektivní odpověď pozorována pouze u cca 20 % a stabilizace u cca 30 % případů. Hlavním cílem našeho projektu je proto nalézt nové molekulární markery umožňující predikovat odpověď na anti-egfr terapii ve skupině pacientů s nemutovaným onkogenem KRAS. Cíle projektu 1) V nádorech retrospektivního souboru pacientů s mcrc léčených anti-egfr cílenou léčbou stanovit mutační status KRAS, BRAF, PIK3CA a expresní hladiny EGFR a PTEN. 2) Biostatistickými nástroji vyhodnotit prediktivní potenciál markerů signální dráhy EGFR ve vztahu k času do progrese a celkovému přežití pacientů s mcrc podstupujících anti-egfr terapii. 3) U retrospektivního souboru pacientů s mcrc stanovit profily exprese mirna v nádorech tlustého střeva a konečníku metodou Real-Time PCR arrays (cca 700 mirna). 4) Biostatistickými nástroji integrovat data o expresi mirna s klinicko-patologickými parametry (především citlivostí k léčbě anti-egfr, parametry přežití a mutačnímu statutu jednotlivých efektorových molekul signální dráhy EGFR) a identifikovat mirna s prediktivním významem (prediktivní mirna). 5) Komplexně vyhodnotit prediktivní markery anti-egfr terapie a navrhnout jejich zapojení do léčebného schématu pacientů pacientů s mcrc. 6) V in-vitro a in-vivo podmínkách ověřit mechanisticky význam identifikovaných mirna v signalizaci EGFR v nádorové buňce a na úrovni proteinové exprese schopnost vybraných prediktivních mirna regulovat translaci cílových informačních RNA (mrna). Metodika Klinickými pracovníky realizačního týmu budou do studie proporcionálně selektováni pacienti (přibližně 100), jejichž biologický nativní materiál je deponován v bance biologického materiálu (BBM) MOÚ nebo jako FFPE materiál v archivu Oddělení onkologické a experimentální patologie, na základě léčebného režimu zahrnujícího anti- EGFR terapii. Z tkáně přibližně 100 tumorů od cílové skupiny pacientů bude izolována DNA a mirna (mirvana, Ambion), změřena její koncetrace (NanoDrop) a zkontrolována čistota a kvalita (Agilent BioAnalyzer 2100). DNA bude použita pro mutační analýzy KRAS (TheraScreen KRAS, Roche), BRAF, PIK3CA a EGFR. Bude provedena FISH analýza 144

145 amplifikace genu EGFR a IHC analýza proteinové exprese. Na reálných vzorcích bude optimalizována metoda kvantitativního stanovení vybraných mirna metodou Real-Time PCR (senzitivita, účinnost amplifikace, výběr vhodné endogenní kontroly, aj.). Následně budou stanoveny hladiny mirna pomocí metody Real-Time PCR arrays verze 3.0 (cca 700 mirna), systému TaqMan LDA s využitím plně standardizovaných technologií společnosti Applied Biosystems na přístroji Sequence Detection System ABI 7900HT. Získané hodnoty exprese mirna z uvedených vzorků budou vyhodnoceny standardními i vícedimenzionálními biostatistickými metodami s cílem identifikovat mirna s rozdílnou expresí v nádorové a příslušné nenádorové tkáni, ale především mirna s vysokou variabilitou exprese v rámci studovaných skupin pacientů. Tyto mirna (předpoklad cca 20 mirna) budou dále analyzovány v následující fázi projektu. Výsledky těchto analýz společně s výsledky analýz signální dráhy EGFR budou biostatisticky zpracovány především se zaměřením na parametry přežití (PFS - progression free surrvival, OS - overall survival). Na genové a proteinové úrovni in-vitro a in-vivo bude ověřena schopnost mirna, jejichž prediktivní vlastnosti budou potvrzeny druhou fází projektu, tlumit translaci vybraných cílových informačních RNA (mrna). Cílové mrna, jejichž proteinové produkty budeme stanovovat, vybereme na základě dvou kriterií: 1) hladiny pravděpodobnosti regulačního vztahu s danou mirna vyjádřené hodnotou P v dostupných internetových mirna databázích (mirbase a TargetScan); 2) biologické funkce proteinu v souvislosti s nádorovou biologií, či patogenezí nádorů tlustého střeva a konečníku. Počítáme s validací možného regulačního vztahu vybraných mirna a přibližně proteinů in-vivo za použití imunohistochemického značení a metody tissue arrays (TMA), což bude provedeno zkušeným patologem, který je součástí realizačního týmu. Přímý regulační vliv dané mirna bude u vybraných proteinů analyzován in-vitro na buněčných liniích nádorů tlustého střeva DLD1, SW837 a HCT116, které v naší laboratoři standardně používáme pro in-vitro studie, metodou transientní i stabilní transfekce (Lipofectamine - Invitrogen, Amaxa) komerčně nasyntetizovaných prekurzorů dané mirna, případně antisense mirna a následným stanovením hladin zkoumaných proteinů metodou Western blot. Ovlivnění fenotypu buněk budeme analyzovat na úrovni buněčné proliferace, buněčného cyklu, apoptózy a invazivních vlastností (matrigelová assay). Stav řešení v roce 2015 V souladu s popisem projektu bylo výzkumnými pracovníky realizačního týmu provedeno experimentální ověření regulačního vlivu identifikované mikrorna, mir-31-5p na úrovni mrna, a také na úrovni proteinů. V tomto roce jsme provedli in vitro experimenty zaměřené na analýzu funkce mir-31-5p v EGFR signální dráze. Potenciální cíle mir-31-5p jsme stanovili pomocí Affymetrix microarray. Buněčné linie odvozené od kolorektálního karcinomu (HCT-116, DLD-1 a HT-29) byly natransfekovány hsa-pre-mir-31-5p a negativní kontrolou (scrambled oligonukleotid). V buňkách transfekovaných pre-mir-31-5p jsme pozorovali vzrůst hladiny exprese této mirna 525x oproti negativní kontrole. Bylo nalezeno 148 genů, jejichž hladina byla signifikantně snížená (FC< 1,92 P < 0,01) a 84 genů, jejichž hladina byla signifikantně zvýšená (FC< 1,87 P < 0,01) mezi buňkami se zvýšenou hladinou exprese mir-31-5p a buňkami s normální hladinou exprese této mirna (mock). Dále jsme zkoumali vliv transfekce na buněčný cyklus a apoptózu u buněčné linie HCT- 116+/+, kde jsme zkoumali rozdíly mezi neovlivněnými buňkami (negativní kontrola), buňkami transfekovananými hsa-pre-mir-31 a buňkami transfekovanými scrambled oligonukleotidem (mock, kontrola transfekce). Nebyl pozorován signifikantní rozdíl mezi buňkami se zvýšenou hladinou exprese mir-31-5p a buňkami s normální hladinou exprese této mirna (Obr. 1, Obr. 2). Dále byla studována viabilita buněčné linie HCT-116, rozdíly mezi negativní kontrolou (neovlivněné buňky), mock (kontrola transfekce), pre-mir

146 (buňky se zvýšenou hladinou exprese mir-31) nebyly signifikantní (Obr. 3). Nakonec jsme ověřili regulační vliv identifikované mir-31-5p na úrovní proteinů pomocí metody western blot. Pozorovali jsme nevýznamné navýšení aktivity EGFR signální dráhy po navýšení hladiny mir-31-5p a přidání růstového faktoru EGF (epidermální růstový faktor). Obr. 1: Vliv transfekce na buněčný cyklus u buněčné linie HCT-116. První sloupec znázorňuje neovlivněné buňky (negativní kontrola), druhý sloupec buňky, které slouží jako kontrola transfekce (mock, použito scrambled oligonukleotid), třetí jsou buňky se zvýšenou hladinou exprese mir-31 pomocí transientní transfekce hsa-pre-mir-31 a lipofectaminu. Obr. 2: Vliv transfekce na apoptózu u buněčné linie HCT-116. První sloupec znázorňuje neovlivněné buňky (negativní kontrola), druhý sloupec buňky, které slouží jako kontrola transfekce (mock, použito scrambled oligonukleotid), třetí jsou buňky se zvýšenou hladinou exprese mir-31 pomocí transientní transfekce hsa-pre-mir-31 a lipofectaminu. 146

147 Obr. 3: MTT test u buněčné linie HCT-116 znázorňující závislost absorbance na času (hodiny). V grafu jsou znázorněny tři různé skupiny: 1. neovlivněné buňky (negativní kontrola), dále buňky, které slouží jako kontrola transfekce (mock, použito scrambled oligonukleotid), třetí jsou buňky se zvýšenou hladinou exprese mir-31 pomocí transientní transfekce hsa-pre-mir-31 a lipofectaminu. Plán pro rok ) Experimentální ověření regulačního vlivu identifikovaných mikrorna na úrovni mrna, případně proteinů. 2) Experimentální ověření prediktivních vlastností identifikovaných mikrorna na rozšířeném souboru prospektivně sbíraných pacientů léčených anti-egfr terapií. Publikační a přednášková aktivita v roce 2015 V tomto roce jsme ve spolupráci s italským pracovištěm experimentální medicíny ve Ferraře dokončili dvě výsledkové publikace (1-2) do zahraničních časopisů s impakt faktorem. Dále jsme publikovali výsledkovou publikaci do zahraničního časopisu také s impakt faktorem (3). Doposud získané výsledky z tohoto projektu byly také aktivně prezentovány formou posteru na XXXIX. Brněnských onkologických dnech a XXIX. Konferenci pro nelékařské zdravotnické pracovníky a také na konferenci XXI. Biologické dny, Pokroky a výzvy současné nádorové biologie v Brně (4-5). Formou posteru byla data prezentována také na XI. Diagnostic, Predictive and Experimental Oncology Days v Olomouci (6). 1. MicroRNA expression profiling identifies mir-31-5p/3p as associated with time to progression in wild-type RAS metastatic colorectal cancer treated with cetuximab. MLČOCHOVÁ, Jitka, Petra VYCHYTILOVÁ, Manuela FERRACIN, Barbara ZAGATTI, Lenka RADOVÁ, Marek SVOBODA, Radim NĚMEČEK, Stanislav JOHN, Igor KISS, 147

148 Rostislav VYZULA, Massimo NEGRINI a Ondřej SLABÝ. MicroRNA expression profiling identifies mir-31-5p/3p as associated with time to progression in wild-type RAS metastatic colorectal cancer treated with cetuximab. Oncotarget, New York: Impact Journals, 2015, Neuveden, October, s. nestránkováno. ISSN Prediction of response to anti-egfr antibody-based therapies by multigene sequencing in colorectal cancer patients. LUPINI, Laura, Cristian BASSI, Jitka MLČOCHOVÁ, Gentian MUSA, Marta RUSSO, Petra VYCHYTILOVÁ, Marek SVOBODA, Silvia SABBIONI, Radim NĚMEČEK, Ondřej SLABÝ a Massimo NEGRINI. Prediction of response to anti- EGFR antibody-based therapies by multigene sequencing in colorectal cancer patients. BMC Cancer, LONDON: BIOMED CENTRAL LTD, 2015, roč. 15, October, s ISSN Mutational analysis of primary and metastatic colorectal cancer samples underlaying the resistance to cetuximab-based therapy. NĚMEČEK Radim, Jitka BERKOVCOVÁ, Lenka RADOVÁ, Tomáš KAZDA, Jitka MLČOCHOVÁ, Petra VYCHYTILOVÁ- FALTEJSKOVÁ, Ondřej SLABÝ, Marek SVOBODA. Mutational analysis of primary and metastatic colorectal cancer samples underlaying the resistance to cetuximab-based therapy. Oncotargets and Therapy (Prosinec 2015, submitováno). 4. MiR-31-5p zvyšuje prediktivní hodnotu KRAS/NRAS/BRAF u pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem léčenýmch cetuximabem. MLČOCHOVÁ, Jitka, Petra VYCHYTILOVÁ, Lenka RADOVÁ, Laura LUPINI, Christian BASSI, Manuela FERRACIN, Barbara ZAGGATI, Radim NĚMEČEK, Rostislav VYZULA, Marek SVOBODA, Massimo NEGRINI a Ondřej SLABÝ. MiR-31-5p zvyšuje prediktivní hodnotu KRAS/NRAS/BRAF u pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem léčenýmch cetuximabem. InXXXIX. brněnské onkologické dny a XXIX. konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky, Brno Využití metody sekvenování nové generace (NGS) k analýze mutačního stavu členů EGFR signální dráhy u pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem (mcrc) léčených cetuximabem. NĚMEČEK, Radim, Jitka BERKOVCOVÁ, Iva BABÁNKOVÁ, Jitka MLČOCHOVÁ, Petra VYCHYTILOVÁ, Ondřej SLABÝ a Marek SVOBODA. Využití metody sekvenování nové generace (NGS) k analýze mutačního stavu členů EGFR signální dráhy u pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem (mcrc) léčených cetuximabem. In XXXIX. brněnské onkologické dny a XXIX. konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky, Brno MiR-31-5p/3p predikují čas do progrese u pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem s nemutovaným RAS léčených cetuximabem. MLČOCHOVÁ, Jitka, Petra VYCHYTILOVÁ, Manuela FERRACIN, Barbara ZAGATTI, Lenka RADOVÁ, Marek SVOBODA, Radim NĚMEČEK, Stanislav JOHN, Igor KISS, Rostislav VYZULA, Massimo NEGRINI a Ondřej SLABÝ.In XI.Diagnostic, Predictive and Experimental Oncology Days (December 2-3, 2015), Olomouc

149 9. VYTVOŘENÍ DIAGNOSTICKÉ SADY CIRKULUJÍCÍCH MIKRORNA PRO NEINVAZIVNÍ ČASNOU DIAGNOSTIKU A SLEDOVÁNÍ PACIENTŮ S KOLOREKTÁLNÍM KARCINOMEM. Hlavní řešitelé projektu: doc. RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D. a MUDr. Milana Šachlová, CSc. et Ph.D., MUDr. Pavel Fabian, Ph.D., doc. MUDr. Marek Svoboda, Ph.D., prof. MUDr. Rostislav Vyzula, CSc. Anotace: Kolorektální karcinom (CRC) zůstává více než dvě generace významným problémem české populace. Od roku 1960 stoupá výskyt tohoto onemocnění a od 90. let minulého století zaujímá ČR spolu s Maďarskem vedoucí postavení ve světových statistikách. V ČR činí počet nových onemocnění CRC (diagnózy C18, C19, C20) ročně kolem a téměř osob na tuto nemoc zemře. Je tragickou skutečností, že CRC působí tak velké ztráty, třebaže je to jeden z nejlépe prevencí ovlivnitelných a léčitelných nádorů, pokud se diagnostikují v časném stadiu. Časná diagnostika má pro přežití pacientů s CRC naprosto zásadní význam. Vysoká a neustále narůstající incidence a mortalita činí z tohoto onemocnění nejen závažný medicínský, ale i socioekonomický problém. Za účelem časné diagnostiky CRC byl v ČR v roce 2000 zahájen dvouetapový screeningový program TOKSkolonoskopie. Test na okultní (skryté) krvácení (TOKS), který je bezplatně indikován u asymptomatických jedinců každé dva roku po dosažení 50 let věku (v roce 2005 přibližně 240 tis. testovaných), hodnotí praktičtí lékaři ve svých ordinacích. Osoby s pozitivním TOKS se následně indikují ke kolonoskopii na gastroenterologickém pracovišti. I přes jednoznačný přínos, který znamenalo zavedení tohoto programu, není situace uspokojivá. Senzitivita TOKS se pohybuje kolem 30 %, protože krvácení tumoru může mít intermitentní (střídavý) charakter, výrazně narůstá pokud je test proveden v trojím opakování. Tomuto nárůstu ovšem brání špatná kompliance pacientů. Přínos tohoto postupu komplikuje také odmítavý postoj pacientů k absolvování kolonoskopie v případě pozitivního TOKS. Kolonoskopie potvrzuje diagnózu CRC pouze přibližně v 6 % a polypy ve 30 % případů s pozitivním TOKS, v ostatních případech se jedná o krvácení z jiných příčin či falešně pozitivní výsledek. Neuspokojivá situace je v i případě dispenzarizace pacientů s CRC a monitorování efektu léčby, případně časného záchytu progrese onemocnění. Senzitivita rutinně používaného biomarkeru CEA pro záchyt progrese onemocnění se pohybuje okolo 60 %, u zbylých pacientů je návrat onemocnění diagnostikován až na základě symptomů, terapeutické možnosti u těchto pacientů jsou poté limitovány a jejich přežívání výrazně zhoršeno. Již dlouhou dobu jsou proto vyvíjeny snahy směřující k nalezení neinvazivně detekovatelného biomarkeru pro časnou detekci CRC. Jedním z moderních přístupů identifikace biomarkerů nádorových onemocnění, a to jak na tkáňové úrovni, tak i v séru nebo v plasmě, je založen na profilování exprese mikrorna (mirna). MiRNA tvoří skupinu přibližně tisíce krátkých, nukleotidů dlouhých, tzv. nekódujících RNA. Slouží tedy jako regulační prvky, které řídí expresi genu na post-transkripční úrovni, tj. na úrovni molekul mrna. Schopnost mirna inhibovat translaci onkogenů a nádorových supresorů dává předpoklad jejich zapojení do procesů kancerogeneze. Důkazů o funkcích mirna v regulaci apoptózy, buněčné proliferace a diferenciace neustále přibývá. Analýza 149

150 expresních profilů mirna je proto stále častěji využívána pro účely molekulární diagnostiky nádorových onemocnění, analogicky jako je tomu u studií založených na DNA čipech a profilování kódujících RNA. Z hlediska analytického využití je podstatná skutečnost, že mirna jsou vysoce stabilní v krevním séru a plasmě, a vyskytují se zde v relativně vysokých hladinách. S cílem identifikovat cirkulující mirna markery sloužící k diagnostice CRC byly zatím provedeny dvě studie s velice slibnými výsledky. Ng et al. identifikoval pomocí Real-Time PCR profilování plazmový profil mirna specifický pro CRC, ze kterého vybrali dvě mirna mir-17-3p a mir-92 pro další validace. Na tomto nezávislém validačním souboru definoval jejich analytické vlastnosti (senzitivita 89 % a specifita 70 %) a popsal jejich pokles při srovnání před- a po-operačních hladin. Huang et al. identifikoval v plazmě pacientů s CRC zvýšené hladiny mir-29a a mir-92a (dříve mir-92), které dále validoval na souboru 100 pacientů s CRC, 37 pacientů s adenomy a 59 kontrolách. Obě testované mirna se ukázaly jako potenciálně použitelné diagnostické markery. MiR-92a dosáhla na studovaném souboru senzitivity 84 % při specificitě 71 %, mir-29a zase senzitivity 69 % a specificity 89 %, jejich kombinace potom senzitivity 84 % a specificity 85 % v odlišení séra pacientů s CRC od kontrolních osob. I v tomto případě obě studované mirna vykazovaly signifikantní pokles hladin po chirurgickém odstranění nádoru. Cíle projektu: 1) Identifikovat expresní profily mirna v nádorové tkáni CRC a nenádorovém střevním epitelu, předoperačně odebraném krevním séru důkladně klinicko-patologicky charakterizovaných pacientů s CRC a v krevním séru srovnatelného souboru (věk, pohlaví) kontrolních osob bez nádorového onemocnění v anamnéze. 2) Biostatisticky vyhodnotit získané profily mirna (cíl 1) v nádorové a nenádorové tkáni, a v krevním séru pacientů a kontrol. Identifikované sady mirna specifické pro nádorovou tkáň a krevní sérum pacientů s CRC porovnat, a na základě shodných mirna sestavit diagnostický panel mirna. 3) Validovat a revidovat diagnostický panel mirna (cíl 2) na základě jeho stanovení v předoperačních a pooperačních vzorcích krevního séra, a dále u nezávislého souboru pacientů a kontrol odebíraného před diagnostickou endoskopií. 4) Provést rozsáhlou validaci analytických parametrů na nezávislém souboru pacientů kontrol odebíraných před diagnostickou endoskopií (senzitivita), dále u pacientů s idiopatickými střevními záněty a karcinomem žaludku (specifita), a jejich vyhodnocení v kontextu rutinně používaných sérových markerů CEA a CA19-9, a TOKS u podskupiny indikované ke kolonoskopii na základě na základě TOKS. 5) U vzorků krevního séra odebíraného v rámci sledování pacientů s CRC podstupujících adjuvantní terapii otestovat možné využití diagnostického panelu mirna pro časných záchyt progrese onemocnění, a srovnat jejich analytické vlastnosti s rutinně používanými sérovými markery CEA a CA ) Na základě získaných poznatků navrhnout možné využití diagnostického panelu mirna v časném záchytu CRC u asymptomatických pacientů, případně pro screeningové účely, a dále časný záchyt progrese a monitorování pacientů s CRC podstupujících adjuvantní terapii. Metodika: V prvním roce projektu (Phase I - Marker discovery) byl sestaven retrospektivní soubor 50 pacientů s CRC (nádorová tkáň, nenádorová tkáň a krevní sérum) z Banky biologického 150

151 materiálu Masarykova onkologického ústavu (MOÚ, spolupříjemce 1, dr. Fabian) a 50 kontrol (osob bez nádorového onemocnění v anamnéze, sběr proběhl v dietetické poradně MOÚ, případně na Gastroenterologické ambulanci MOÚ dr. Šachlová při endoskopii s negativním nálezem). Byl rovněž zahájen nábor nových pacientů. Na těchto souborech byla provedena izolace celkové RNA (mirvana, Ambion, USA) a dále stanovena exprese 754 mirna za použití TaqManTM Human mirna Array verze 3.0 pomocí systému TaqMan Low Density Arrays (TLDA) založeným na kvantitativní PCR detekci s využitím plně standardizovaných technologií (Applied Biosystems) na přístroji Sequence Detection System ABI Prism 7900HT (CEITEC, dr. Slabý a VŠ nelekář). Získané hodnoty exprese mirna, normalizované pomocí vhodně zvolené endogenní kontroly, byly vyhodnoceny standardními i vícedimenzionálními biostatistickými metodami s cílem identifikovat mirna s rozdílnou expresí v nádorové a příslušné nenádorové tkáni tlustého střeva, v séru pacientů a kontrol. MiRNA vykazující významné rozdíly exprese v tkáni i krevním séru (přibližně 5-10 mirna) byly postoupeny dále do první validační fáze projektu (Phase II - Marker validation and selection). Ve druhém roce projektu bylo na nezávislém souboru 50 pacientů s CRC, jejichž krevní sérum bude odebráno v Gastroenterologické ambulanci MOÚ před diagnostickým endoskopickým výkonem, a 50 kontrol, validovány vlastnosti mirna identifikovaných v první fázi za použití individuálních mirna TaqMan Real-Time PCR assays (Applied Biosystems, USA). Dále byla analýza těchto mirna provedena u 40 párových vzorků krevního séra pacientů s CRC odebraného před a po-operačně. Diagnostické mirna, jejichž analytický potenciál byl potvrzen, a jejichž hladiny vykazovaly pokles v krevním séru po chirurgickém výkonu u pacientů s CRC, byly dále testovány v druhé validační fázi (Phase III large-scale validation). Ve třetím roce byl sestaven retrospektivní soubor pacientů s karcinomem žaludku (25 vzorků krevního séra) a idiopatickými střevními záněty (25 vzorků krevního séra pacientů s Crohnovou chorobou, 25 vzorků krevního séra pacientů s ulcerózní kolitidou) pro testování specifity testu, a ukončen nábor pacientů pro druhou validační fázi projektu (celkem 200 pacientů s CRC, přičemž značná část z nich bude indikována ke kolonoskopii na základě TOKS, 100 kontrol). Dále byla vytvořena sestava vzorků od 20 pacientů s CRC podstupujících adjuvantní terapii (od každého 5 vzorků krevního séra, 3 vzorky před prokazatelnou progresí a 2 vzorky následně). Dodání vzorků bylo zajištěno spolupříjemcem 1 (MOÚ, dr. Šachlová, dr. Fabian, prof. Vyzula). Budou zahájeny laboratorní analýzy diagnostického panelu mirna, které prošly první validační fází (přibližně 3-5 mirna). V první polovině čtvrtého roku řešení byla dokončena laboratorní část druhé validační fáze (CEITEC, dr. Slabý) a provedeny biostatistické analýzy definující analytické vlastnosti mirna diagnostického panelu pro diagnostiku a záchyt progrese. Analytické vlastnosti byly srovnány se senzitivitou a specifitou rutinně užívaných sérových biomarkerů CEA a CA19-9 a samostatně analyzovány u podskupiny pacientů indikovaných ke kolonoskopii na základě TOKS (CEITEC, dr. Svoboda). V druhé polovině čtvrtého roku řešení bude připravena publikace do zahraničního časopisu s IF, případně podklady pro registraci patentu. Stav řešení: Cíl 1) V souladu s popisem projektu byl sestaven retrospektivní soubor pacientů s kolorektálním karcinomem (CRC) nádorová tkáň, nenádorová tkáň a krevní sérum z Banky biologického materiálu Masarykova onkologického ústavu (MOÚ, spolupříjemce dr. Fabian) a kontrol (osob bez nádorového onemocnění v anamnéze, sběr proběhl v dietetické poradně MOÚ a na Gastroenterologické ambulanci MOÚ, spolupříjemce dr. Šachlová). Za celou dobu řešení 151

152 projektu bylo dále nasbíráno 300 vzorků krevního séra od zdravých kontrol, 1400 vzorků krevního séra od pacientů s CRC, adenomy, střevními záněty a dále od zdravých dárců před kolonoskopií, 40 vzorků od pacientů s nádory žaludku a 17 párových vzorků před a po chirurgickém zákroku (dr. Šachlová). Z tohoto souboru vzorků byla izolována celková RNA obohacená o frakce krátkých RNA (mirvana TM mirna Isolation Kit, Ambion, USA; mirneasy Serum/Plasma kit, Qiagen), byla změřena koncentrace a čistota získané RNA (NanoDrop ND-1000, Qubit) a rovněž její kvalita (Agilent Bioanalyzer 2100). Pro další analýzy bylo využito pouze vzorků, u kterých byl poměr A260/A280 > 2, poměr A260/A230 > 1,8 a RIN 8. V potřebných případech byla izolace opakována, dokud nebylo dosaženo stanovených kritérií pro kvalitu vzorku. Pro účely expresního profilování byla RNA z krevního séra izolována vždy z 12 alikvotů (2,4 ml), aby byla získána dostatečná koncentrace. Vzhledem k příznivému vývoji na trhu s molekulárně biologickým materiálem a zavedení nových metod na našem pracovišti byly TaqMan Low Density Arrays plánované v tomto grantovém projektu nahrazeny hlubokým sekvenováním (MiSeq, Illumina). Do reakce bylo použito 1000 ng RNA, následně byla provedena ligace adaptorů, reverzní transkripce, PCR amplifikace a gelová purifikace (TruSeq Small RNA Sample Prep Kit, Illumina). Takto připravená DNA knihovna byla podrobena hlubokému sekvenování s využitím systému MiSeq (Illumina) a získaná data byla analyzována pomocí standardních i vícedimenzionálních biostatistických metod. Celkem byl stanoven expresní profil mirna u 3 párových vzorků nádorové a nenádorové tkáně a dále u 144 CRC pacientů (12 poolů), 96 zdravých kontrol (8 poolů) a 36 pacientů s polypy (3 pooly). Expresním profilováním vzorků tkáně bylo získáno 57 mirna s deregulovanou expresí v nádorové tkáni (P < 0,01; obr. 1), přičemž 28 mirna mělo zvýšené hladiny v nádorové tkáni a 29 mirna mělo hladiny v nádorové tkáni snížené. Expresním profilováním vzorků krevního séra bylo celkem identifikováno 54 mirna (P < 0,01; obr. 2) s deregulovanou expresí u CRC pacientů oproti zdravým kontrolám a 26 mirna (P < 0,005; obr. 3) s rozdílnou expresí u pacientů s polypy vůči zdravým kontrolám. mir-451a mir-30a mir mir mir mir-26a-1 mir-26a-2 mir-215 mir-93 mir-17 mir-20a mir-145 mir-195 mir-10a mir-21 mir-378a mir-378i mir-497 mir-144 mir-424 mir-181d mir-196a-1 mir mir mir-29c mir-139 mir-204 mir-7-1 mir-7-3 mir-7-2 mir-584 mir-1247 mir-27a mir-135b mir-552 mir-592 mir-24-2 mir-708 mir-450b mir-9-3 mir-9-1 mir-9-2 mir-149 mir-338 mir-4454 mir-154 mir mir mir-450a-1 mir-450a-2 mir-1246 mir-95 mir-503 mir-29b-1 mir-299 mir-2277 mir _001_1 1_001_3 1_001_1 1_001_2 1_001_4 1_001_2 Obr. 1: Expresním profilováním mirna v nádorové tkáni a paralelní zdravé střevní sliznici pomocí NGS bylo získáno 57 mirna s významně deregulovanou expresí (P < 0,01). 152

153 hsa-mir-4436b-3p hsa-mir-1295a hsa-mir-3914 hsa-mir-4538 hsa-mir-4666b hsa-mir-1913 hsa-mir p hsa-mir-6127 hsa-mir p hsa-mir-1299 hsa-mir p hsa-mir-5100 hsa-mir-496 hsa-mir-7977 hsa-mir p hsa-mir-539-3p hsa-mir p hsa-mir-7-1-3p hsa-mir-376a-3p hsa-mir p hsa-mir p hsa-mir-99b-3p hsa-mir-369-3p hsa-mir-589-3p hsa-mir-329-3p hsa-mir-543 hsa-mir-199a-5p hsa-mir-323b-3p hsa-mir-376c-3p hsa-mir-301a-3p hsa-mir-4508 hsa-mir-378c hsa-mir p hsa-mir p hsa-mir-330-3p hsa-mir-27a-3p hsa-mir-425-3p hsa-mir-326 hsa-mir p hsa-mir-4454 hsa-mir-183-5p hsa-mir-4419a hsa-mir-1273e hsa-mir-1303 hsa-mir-1273f hsa-mir-142-5p hsa-mir-484 hsa-mir-186-5p hsa-mir-223-3p hsa-mir-126-5p hsa-mir-21-5p hsa-mir-151a-3p hsa-mir-146a-5p hsa-mir-7641 II-2 II-3 III-2 III-3 Z5 Z2 Z8 Z6 Z3 Z7 Z4 I-3 Z1 IV-1 III-1 I-2 IV-3 IV-2 II-1 I-1 Obr. 2: Expresním profilováním mirna v krevním séru pacientů s CRC a v séru zdravých dárců pomocí NGS bylo získáno 54 mirna s významně deregulovanou expresí (P < 0,01). hsa-mir-23a-3p hsa-mir-126-5p hsa-mir-21-5p hsa-mir-26b-5p hsa-mir-27a-3p hsa-mir-148b-3p hsa-mir-17-5p hsa-mir-1303 hsa-mir-1273f hsa-mir-142-5p hsa-mir-223-3p hsa-mir-26a-5p hsa-mir-423-5p hsa-mir p hsa-mir-548ag hsa-mir p hsa-mir-376a-3p hsa-mir-1255a hsa-mir p hsa-mir-590-3p hsa-mir-98-3p hsa-mir-340-5p hsa-mir-376c-3p hsa-mir-335-3p hsa-mir p hsa-mir-25-5p A1 A2 A-TV1 Z6 Z1 Z5 Z7 Z4 Z8 Z2 Z3 Obr. 3: Expresním profilováním mirna v krevním séru pacientů s polypy a v séru zdravých dárců pomocí NGS bylo získáno 26 mirna s významně deregulovanou expresí (P < 0,005). Cíl 2) Data získaná expresním profilováním mirna pomocí NGS byla vyhodnocena pomocí standardních i vícedimenzionálních biostatistických metod a na základě průniku jednotlivých 153

154 mirna v tkáních a v krevním séru, P-hodnoty, počtu kopií, literatury a dalších parametrů bylo vybráno 13 mirna (mir-186-5p, mir-148a-3p, mir-223-3p, mir-21-5p, mir-146a-5p, mir-27a-3p, mir-23a-3p, mir-126-5p, mir-4419a, mir-484, mir-142-5p, mir-425-3p a mir-376c-3p) s diagnostickým potenciálem do první validační fáze studie pomocí qrt-pcr. Zároveň bylo vybráno 5 mirna (mir-93-5p, mir-106a-5p, let-7a-5p, mir-140-3p, mir-16-5p) za účelem nalézt optimální endogenní kontrolu pro normalizace dat z validační fáze studie. Cíl 3) Do první fáze validační studie bylo celkem zařazeno 80 krevních sér od pacientů s CRC a 80 krevních sér od zdravých dárců. Vzhledem ke skutečnosti, že endogenní kontroly tradičně používané při analýzách exprese mirna v tkáních (RNU6B, RNU48, RNU44) nejsou v krevním séru exprimovány, nebo nejsou dostatečně stabilní, byla provedena samostatná studie s cílem identifikovat vhodné endogenní kontroly ze skupiny mirna přítomné v krevním séru ve vysokých hladinách a s dostatečnou stabilitou. Celkem bylo testováno 5 mikrorna (mir-93-5p, mir-106a-5p, let-7a-5p, mir-140-3p, mir-16-5p) a získaná data byla následně hodnocena pomocí algoritmů GeNorm a NormFinder, které shodně označily mir-93-5p jako nejvhodnější endogenní kontrolu. Následná statistická analýza prokázala signifikantně zvýšené hladiny mir-148a-3p (P < 0,0001), mir-223-3p (P = 0,0316), mir-21-5p (P < 0,0001), mir-27a-3p (P < 0,0001), mir-23a-3p (P < 0,0001), mir-126-5p (P < 0,0001), mir-142-5p (P < 0,0001) a mir-376c-3p (P < 0,0001) (obr. 4). Deregulace ostatních mirna zařazených do první validační fáze studie nebyla potvrzena. Na základě těchto výsledků bylo do druhé validační fáze studie vybráno celkem 5 mirna (mir-21-5p, mir- 23a-3p, mir-27a-3p, mir-142-5p a mir-376c-3p). Exprese těchto mirna byla dále stanovena v předoperačních a pooperačních vzorcích krevního séra (17 párů). Hladiny jednotlivých mirna nevykazovaly signifikantní změny v expresi 1 měsíc po chirurgickém zákroku (obr. 5). Multivariační regresní model identifikoval 4 z těchto 5 mirna (mir-23a, mir-27a, mir-376c, mir-142-5p) jako vhodné diagnostické biomarkery, na základě jejichž exprese bylo možné diagnostikovat CRC se senzitivitou 88 % a specificitou 81 %, AUC = 0,917 (obr. 6). normalized log expression mir-148a-3p P < healthy donors CRC patients normalized log expression mir-223-3p P = healthy donors CRC patients normalized log expression mir-21-5p P < healthy donors CRC patients normalized log expression mir-27a-3p P < healthy donors CRC patients normalized log expression mir-23a-3p P < healthy donors CRC patients normalized log expression mir-126-5p P < healthy donors CRC patients normalized log expression mir-142-5p P < healthy controls CRC patients normalized log expression mir-376c-3p P < healthy donors CRC patients Obr. 4: První validační fáze studie potvrdila signifikantně deregulovanou expresi 8 mirna v krevním séru pacientů s CRC oproti zdravým kontrolám. 154

155 normalized log expression before surgery mir-21 P = after surgery normalized log expression before surgery mir-23a P = after surgery normalized log expression before surgery mir-27a P = after surgery normalized log expression before surgery mir-376c P = after surgery normalized log expression before surgery mir-142-5p P = after surgery Obr. 5: Exprese 5 validovaných mirna ve vzorcích krevního séra pacientů s CRC před chirurgickým zákrokem a 1 měsíc po chirurgickém zákroku. Training cohort Sensitivity (0.813, 0.875) AUC: Specificity Obr. 6: Kombinovaná ROC analýza pro mir-23a, mir-27a, mir-376c a mir-142-5p. Cíl 4) Do druhé validační fáze bylo zařazeno celkem 200 krevních sér od pacientů s CRC, 100 sér od zdravých dárců a 50 sér od pacientů s hyperplastickými, tubulózními a tubulovilózními polypy. Exprese 5 validovaných mirna byla dále změřena u nezávislého souboru pacientů (26) a kontrol (26) s pozitivním TOKS odebíraných před diagnostickou endoskopií pro 155

156 zjištění senzitivity testu, u 20 pacientů s idiopatickými střevními záněty a u 40 pacientů s nádory žaludku pro zjištění specificity. Získané výsledky byly následně rovněž vyhodnoceny v kontextu rutinně používaných sérových markerů CEA a CA19-9. Exprese všech 5 validovaných mirna byla signifikantně zvýšená u pacientů s CRC i ve druhé validační fázi studie (obr. 7), všech 5 mirna rovněž dokázalo spolehlivě odlišit pacienty s CRC a zdravé dárce s pozitivním TOKS (obr. 8). Na základě exprese mir-21, mir-27a a mir-376c bylo rovněž možné spolehlivě odlišit pacienty s CRC od pacientů s nádory žaludku (obr. 9). Na základě exprese mir-27a bylo rovněž možné odlišit pacienty s CRC od pacientů s idiopatickými záněty střev. Exprese mir-21, mir-23a a mir-142-5p signifikantně narůstala od zdravých dárců přes polypy až k pacientům s CRC (obr. 10). Aplikací multivariačního regresního modelu bylo možné odlišit pacienty od zdravých dárců na základě exprese mir-23a, mir-27a, mir-376c a mir-142-5p se senzitivitou 89 % a specificitou 85 %, AUC = 0,922 (obr. 11). normalized log expression healthy donors mir-21 P < CRC patients normalized log expression healthy donors mir-23a-3p P < CRC patients normalized log expression healthy donors mir-27a-3p P = CRC patients normalized log expression healthy donors mir-142-5p P < CRC patients normalized log expression healthy donors mir-376c-3p P < CRC patients Obr. 7: Druhá validační fáze studie potvrdila signifikantně deregulovanou expresi 5 mirna v krevním séru pacientů s CRC oproti zdravým kontrolám vybraných z první validační fáze. 156

157 normalized log expression healthy donors mir-21 P = CRC patients normalized log expression healthy donors mir-23a P = CRC patients normalized log expression mir-27a P < healthy donors CRC patients 1 mir-376c P = mir-142-5p P = normalized log expression healthy donors CRC patients normalized log expression healthy donors CRC patients Obr. 8: Exprese 5 validovaných mirna ve vzorcích krevního séra pacientů s CRC a zdravých kontrol s pozitivním TOKS. normalized log expression healthy donors mir-21 ** *** CRC patients *** GC patients normalized log expression healthy donors mir-23a *** *** n.s. CRC patients GC patients normalized log expression healthy donors mir-27a *** *** *** CRC patients GC patients mir-376c mir-142-5p normalized log expression healthy donors *** ** CRC patients *** GC patients normalized log expression healthy donors *** ** CRC patients ** GC patients Obr. 9: Exprese 5 validovaných mirna ve vzorcích krevního séra pacientů s CRC, zdravých kontrol a pacientů s nádory žaludku. 157

158 normalized log expression 10 1 *** mir-21 *** n.s. 0.1 healthy donors polyps CRC patients normalized log expression *** mir-23a *** n.s healthy donors polyps CRC patients normalized log expression ** mir-142-5p *** *** healthy donors polyps CRC patients Obr. 10: Exprese mir-21, mir-23a a mir-142-5p narůstá ve směru od zdravých dárců přes polypy až po pacienty s CRC. Validation cohort Sensitivity AUC: Specificity Obr. 11: Kombinovaná ROC analýza pro mir-23a, mir-27a, mir-376c a mir-142-5p druhá validační fáze studie. Cíl 5) Soubor 5 validovaných mirna byl testován i v souvislosti s prognózou pacientů s CRC a dále s prognózou pacientů podstupujících adjuvantní terapii. Bylo prokázáno, že pacienti se zvýšenou hladinou mir-21 a mir-23a mají signifikantně kratší celkové přežívání (obr. 12). Zároveň bylo prokázáno, že pacienti se zvýšenou hladinou mir-27a a mir-142-5p mají signifikantně kratší celkové bezpříznakové přežívání (obr. 13). 158

159 Survival due to the threshold OS p< 8e-04 below threshold above threshold Survival time in months Obr. 12: Pacienti se zvýšenou hladinou mir-21 a mir-23a mají signifikantně kratší celkové přežívání než pacienti s nižšími hladinami. Percent survival mir-27a, mir-142-5p P = higher lower DFS Obr. 13: Pacienti se zvýšenou hladinou mir-27a a mir-142-5p mají signifikantně kratší celkové bezpříznakové přežívání než pacienti s nižšími hladinami. Cíl 6) Na základě výše uvedených poznatků se zdá, že panel 4 cirkulujících mirna (mir-23a, mir-27a, mir-376c, mir-142-5p) bude možné využít pro časnou detekci CRC u asymptomatických pacientů, neboť bylo prokázáno, že vykazují vysokou senzitivitu a specificitu. Hladiny mir-21 a mir-23a pak korelují s celkovým přežíváním pacientů, zatímco hladiny mir-27a a mir-142-5p korelují s celkovým bezpříznakovým přežíváním pacientů podstupujících adjuvantní terapii. Výstupy za rok 2015: VYCHYTILOVÁ, Petra, Zdeňka KOSAŘOVÁ, Lenka RADOVÁ, Milana ŠACHLOVÁ, Marek SVOBODA, Rostislav VYZULA a Ondřej SLABÝ. Analýza mikrorna u pacientů s 159

160 kolorektálním karcinomem s využitím sekvenování nové generace. In XXXIX. brněnské onkologické dny a XXIX. konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky, Brno THORENOOR, Nithyananda, Petra VYCHYTILOVÁ, Sonja HOMBACH, Jitka MLČOCHOVÁ, Markus KRETZ, Marek SVOBODA a Ondřej SLABÝ. Long non-coding RNA ZFAS1 interacts with CDK1 and is involved in p53-dependent cell cycle control and apoptosis in colorectal cancer. Oncotarget, New York: Impact Journals, 2015, Neuveden, October, s. Nestránkováno. ISSN VYCHYTILOVÁ, Petra a Ondřej SLABÝ. Circulating Blood-Borne micrornas as Biomarkers in Solid Tumors. In Peter Igaz. Circulating micrornas in Disease Diagnostics and their Potential Biological Relevance. Basel: Springer, s , 48 s. Experientia Supplementum, Volume 106. ISBN Hlavní publikace k tématu je v současné době připravována do mezinárodního časopisu s IF. 10. ANGIOGENEZE U ZHOUBNÝCH NÁDORŮ: STANOVENÍ PREDIKTIVNÍCH MARKERŮ U PACIENTŮ S KOLOREKTÁLNÍM KARCINOMEM LÉČENÝCH ANTIANGIOGENNÍ LÉČBOU Hlavní řešitel projektu: MUDr. Beatric Bencsíková a prof. MUDr. Rostislav Vyzula, Ph.D. Anotace projektu Práce se zabývá sledováním vybraných angiogenních markerů v průběhu onkologické léčby, ve snaze zjistit, zda tyto markery, případně jiné klinické a laboratorní parametry, mohou sloužit jako jeden z ukazatelů odpovědi na léčbu, také jako hledaný prediktivní faktor úspěšnosti léčby v kombinaci s bevacizumabem. Cíle projektu Stanovit pro-angiogenní faktor, který by sloužil jako rutinně detekovatelný marker angiogeneze u onkologických pacientů. Z kandidátních markerů angiogeneze se uvažují cirkulující endoteliální buňky, aktivované endoteliální buňky, endoteliální prekurzory; a solubilní faktory jako je VEGF, angiopoetin-1, angiopoetin-2, PECAM-1 (platelet-endothelial cell adhesion molekule), VEGFR-R2 (receptor pro VEGF), thrombopoetin. Jedním z cílů projektu je porovnat endoteliální buňky, aktivované endoteliální buňky a endoteliální prekurzory coby vhodnější ukazatel angiogeneze a také hodnotit jejich hladinu v porovnání s vybranými solubilními angiogenními faktory. Stanovit klinické a laboratorní parametry predikující odpověď na protinádorovou léčbu založenou na podávání chemoterapie a antiangiogenní látky bevacizumab. Metodika Soubor pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem léčených chemoterapií a bevacizumabem. Vyšetřovaný materiál a schéma jeho odběru: 1) odběr krve na rutinní vyšetření krevního obrazu (stanovení endoteliálních buněk), 2) pro stanovení plazmatických endoteliálních faktorů odběr krve do CTAD odběrové zkumavky, která obsahuje citrát a 160

161 inhibitory aktivace krevních destiček, tj teofylin, adenosin, dipyridamol, 3) krevní obraz+diferenciál, 4) koagulace (Fbg) 5) Treg (flowcytometrie), 6) nádorové markery: CEA, CA Odběry v době stanovení diagnózy, a v průběhu aplikace léčby, při každé návštěvě. Další sledované parametry: diagnóza, histologický nález, způsob léčby, léčebná odpověď. Stav řešení v roce 2015 V roce 2015 byla dokončena analýza souboru čítajícího 1622 pacientů s metastatickým kolorektálním karcinom, kteří byli léčení bevacizumabem a chemoterapií založenou na irinotekanovém nebo oxaliplatinovém režimu. U 40,6 % případů byla nalezene mutace v gen KRAS.Medián PFS dosahoval u pacientů s normálním KRAS genem 11,5 vs 11.4 měsíce pro pacienty s mutovaným KRAS. Medián celkového přežití byl 30,7 vs 38,4 (p = 0.312). Pacienti s mutací KRAS měli časteji plícní metastázy ve srovnání s jinými mutacemi KRAS(32 vs 23,8, p=0,001). Nepozorovali jsme žádné další rozdíly mezi pacienty v závislosti na mutačním stavu KRAS. Mutační stav KRAS nepredikoval úspěšnost léčby- Plán pro rok 2016 Finalizace výsledků a ukončení projektu. Publikace s výsledky projektu za rok 2015 Bencsikova B, Bortlicek Z, Halamkova J, Ostrizkova L, Kiss I, Melichar B, Pavlik T, Dusek L, Valik D, Vyzula R, Zdrazilova-Dubska L. Efficacy of bevacizumab and chemotherapy in the first-line treatment of metastatic colorectal cancer: broadening KRAS-focused clinical view. BMC Gastroenterol Mar 24;15:37. doi: /s PROGNOSTICKÉ FAKTORY U KARCINOMU PANKREATU Hlavní řešitel: MUDr. Petr Karásek Spoluřešitelé: Mgr. Roman Hrstka, Ph.D., prof. MUDr. Markéta Hermanová, Ph.D., Kateřina Káňová Anotace projektu Stav řešené problematiky: Duktální adenokarcinom pankreatu představuje jedno z prognosticky nejméně příznivých onkologických onemocnění s celkových 5-letým přežitím nepřesahujícím 5 %. Mezi konvenční v praxi užívané prognostické faktory patří status T, N a M, grading tumoru, přítomnost perineurální resp. vaskulární invaze a typ resekce u resekabilních karcinomů pankreatu (R0 vs R1). Spolehlivá identifikace molekulárních prognostických markerů umožňuje reproducibilní stratifikaci pacientů dle rizika nejen v v klinických studiích a rovněž je důležitá pro racionální selekci potenciálních terapeutických cílů v rámci hledání a rozvoje možností účinné biologické léčby onkologických onemocnění. Možnosti využití spolehlivých molekulárních prognostických markerů jsou na poli karcinomu pankreatu velmi limitované stejně jako možnosti biologické léčby tohoto typu malignity. Jako potenciální biomarker PDAC je uvažován protein AGR2. Tento protein se obvykle vyskytuje v endoplazmatickém retikulu, dále na povrchu buněk a často dochází k jeho sekreci ven z buněk. Zvýšená exprese tohoto proteinu byla detekována v prekancerózních lézích, nádorových buňkách, buněčných liniích odvozených od karcinomu pankreatu, a také v cirkulujících nádorových buňkách. Na molekulární úrovni AGR2 stimuluje buněčný růst a 161

162 proliferaci, podporuje invazivitu a především schopnost přežívání pankreatických nádorových buněk a významně tak může přispívat k rezistenci na podávanou léčbu. Význam stanovení hladiny proteinu AGR2 v sérech pacientů s PDAC tedy spočívá ve dvou rovinách: 1) prokázat zda přítomnost AGR2 koreluje s výskytem PDAC a 2) zhodnotit zda lze na základě zvýšené hladiny AGR2 stratifikovat pacienty dle citlivosti k podávané léčbě. Cirkulující nádorové buňky (CTC) představují poměrně kontroverzní téma, nicméně v případě PDAC existuje řada publikací podporujících význam stanovení těchto buněk, které vznikají odloučením z primárního nádorového ložiska a dostávají se do krevního řečiště, kde mohou cirkulovat a následně pak zakládat metastázy. Skutečnost, že se protein AGR2 přímo podílí na diseminaci pankreatických nádorových buněk, pravděpodobně mechanismem posttranskripční aktivace katepsinu B a D, tedy proteáz, jež se obecně významně uplatňují při metastazování, představuje pádný argument pro stanovení AGR2 i na úrovni mrna v analyzovaných sérech. Tím spíš, že v rámci genového expresního profilování byl gen AGR2 identifikován jako jeden z nejvýznamnějších markerů CTC. Následně pak byla zvýšená hladina mrna AGR2 potvrzena i v dalších prácích zaměřených na stanovení AGR2 u CTC v sérech pacientů s kolorektálním karcinomem a karcinomem prostaty. Cíle projektu 1. Analýza exprese potenciálních molekulárních prognostických markerů ve tkání duktálního adenokarcinomu pankreatu a jejich srovnání s konvenčními prognostickými faktory karcinomu pankreatu. 2. Stanovení hladiny proteinu AGR2 v séru pocházejícím od pacientů s PDAC. Současně pak budou v sérech pacientů monitorovány hladiny mrna vybraných genů, především AGR2 a CA 19-9, pomocí ddpcr. Expresní profily budou následně korelovány s klinicko-patologickými parametry obsaženými ve zdravotní dokumentaci včetně hladiny CA 19-9stanoveného rutinně na MOÚ a analýzy přežití v daném souboru. Metodika Vyšetření exprese potenciálních molekulárních prognostických markerů imunohistochemicky na formolparafinovém materiálu tkání resekabilních duktálních adenokarcinomů pankreatu, klinické údaje získané z Národního onkologického registru ČR a od klinických lékařů KKOP MOÚ a statistická analýzasledovaných markerů s vybranými klinicko-patologickými parametry. Hladina proteinu AGR2 bude v sérech detekována komerčně dostupným ELISA testem (antibodies-online.com). Současně bude ze séra izolována celková RNA s využitím např. PureLink RNA Micro Scale Kit (Ambion). Pomocí RT-qPCR s využitím technologie digitální PCR budou stanoveny hladiny mrna AGR2, CA 19-9 a případně i dalších tumor specifických respektive epiteliálních markerů (např. CEA, CK20, CK19, MUC1 apod.) s cílem nepřímo analyzovat případnou přítomnost cirkulujících nádorových buněk a tu pak korelovat s přítomností onemocnění a jeho prognózou. Pro analýzu bude využito sérum pacientů, léčených nebo sledovaných v MOÚ pro duktální adenokarcinom pankreatu. V současné době máme pro účel této studie archivovány séra přibližně 150 pacientů s histologicky verifikovaným duktálním adenokarcinomem pankreatu, vyšetřených v MOÚ od začátku roku Paralelně byl shromážděn i adekvátní soubor kontrolních sér pocházejících z preventivních prohlídek. Vzorky byly získány z běžných opakovaných odběrů krve na nádorové markery v průběhu léčby či dispensarisace pacientů. 162

163 Tito pacienti vyjádřili svůj souhlas s výzkumem podpisem informovaného souhlasu. Projekt byl schválen etickou komisí MOÚ dne Stav řešení v roce 2015 V roce 2015 byly u všech pacientů v souboru ze zdravotní dokumentace vyhodnoceny klinické údaje (TNM klasifikace, grading, léčebná odpověď, doba do progrese, přežití, hodnoty markeru Ca 19-9 v průběhu léčby). Dle původního plánu měla být hladina proteinu AGR2 detekována pomocí komerčně dostupného ELISA testu. Celkem byly vyzkoušeny tři komerčně dostupné ELISA kity, nicméně se ukázalo, že tyto produkty nejsou dostatečně specifické či sensitivní, aby byly aplikovatelné na materiál pocházející ze sér pacientů, byť to výrobce deklaroval. Z tohoto důvodu jsme byli nuceni si vyvinout vlastní ELISA test umožňující detekci AGR2 (obr. 1). Toto se nakonec podařilo, a to nejen s použitím purifikovaného proteinu, ale i ve vzorcích pocházejících z buněčných lyzátů či sér pacientů. Současně byly ze sér pacientů vypurifikovány RNA a bude proveden pilotní analýza exprese vybraných biomarkerů. Obr. 1: vývoj ELISA testu, ukázka citlivosti s použitím rekombinantního purifikovaného proteinu AGR2. Plán pro rok Analýza klinicko-patologických korelací sledovaných molekulárních markerů a srovnávací analýza s účinností konvenčních prognostických markerů. - Provedení vlastních analýz hladiny proteinu AGR2 pomocí vlastního ELISA testu a jejich korelace s klinickopatologickými údaji. Přehled publikací za rok 2015 Vychytilova-Faltejskova P, Kiss I, Klusova S, Hlavsa J, Prochazka V, Kala Z, Mazanec J, Hausnerova J, Kren L, Hermanova M, Lenz J, Karasek P, Vyzula R, Slaby O. MiR-21, mir- 34a, mir-198 and mir-217 as diagnostic and prognostic biomarkers for chronic pancreatitis and pancreatic ductal adenocarcinoma. Diagn Pathol Apr 24;10:

164 13. PERIOPERAČNÍ CHEMOBIOTERAPIE V CHIRURGICKÉ LÉČBĚ JATERNÍCH METASTÁZ KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU Řešitelé: MUDr. Lukáš Fiala, doc. MUDr. Roman Šefr, Ph.D. Anotace: Perioperační chemo(bio)terapie (CHBT) zaujímá důležité místo v managementu léčby jaterních metastáz kolorektálního karcinomu (CRC). Zlepšuje přežívání pacientů s primárně resekabilními lézemi a napomáhá konverzi primárně neresekabilních ložisek na resekabilní. Efekt perioperační léčby je možno hodnotit na základě radiologické odpovědi a dále podle stupně patologické remise. Práce se bude zabývat posouzením stavu patologické remise, která bude hodnocena na základě poměrného zastoupení reziduálních nádorových buněk a vazivové tkáně v resekátu jaterního ložiska. Metodika: prospektivní výběr pacientů s jaterními mts CRC léčených v MOÚ s následnou chirurgickou léčbou tamtéž a zhodnocení stupně patologické remise u různých CHBT režimů. Ze souboru pacientů vytipujeme vhodnou skupinu, u které provedeme biopsii jaterního ložiska před zahájením CHBT a budeme zkoumat diskordanci mutačního stavu nádorových buněk jaterní metastázy před a po perioperační CHBT. Stav projektu v roce 2015 a plán pro rok 2016: Sběr dat byl zahájen v roce 2014 a přepdokládáme, že potrvá do roku V roce 2016 již plánujeme 1. předběžnou analýzu. 164

165 TÝM PRO GYNEKOLOGICKÉ NÁDORY Vedoucí týmu: MUDr. Josef Chovanec, Ph.D. Vedoucí chirurgického programu týmu: MUDr. Josef Chovanec, Ph.D. Vedoucí onkologického programu týmu: MUDr. Mária Zváriková Vedoucí radioterapeutického programu týmu: prof. MUDr. Pavel Šlampa, CSc. Vedoucí výzkumného programu týmu: MUDr. Lucie Mouková, Ph.D. Kompletní seznam členů týmu v roce 2015 je dostupný na internetových stránkách MOÚ: Jednoleté projekty: 0 Víceleté projekty : 7 Projekty financované výhradně z IPO 1. Vývoj elektrochemického testu na elektrodových biočipech pro detekci lidských papilomavirů. 2. Detekce alterujících glykanových struktur v sérech a tkáních pacientek s nádorem vaječníků rezistentních k léčbě platinovými deriváty. 3. Diagnostický význam amplifikace genů hterc a MYCC při vzniku a vývoji cervikálních intraepiteliálních dysplázií a karcinomu děložního hrdla. 4. Pilotní studie laváže dutiny děložní za účelem diagnostiky serózních intraepiteliálních karcinomů tuby LUSTIC Study. Projekty spolufinancované z IPO (prostředky IPO pokrývají výdaje na nové a dodatečné experimenty nebo slouží k financování výzkumných pracovníků zapojených do řešení projektu) 5. Současné možnosti léčby refrakterního ascitu u pacientek s pokročilým gynekologickým maligním onemocněním. 6. Predikce odpovědi na léčbu u pacientek s karcinomern ovaria 7. Optimalizace 3D brachyterapie nádorů děložního hrdla a vliv hypoxie nádoru na výsledky léčby 165

166 1. VÝVOJ ELEKTROCHEMICKÉHO TESTU NA ELEKTRODOVÝCH BIOČIPECH PRO DETEKCI LIDSKÝCH PAPILOMAVIRŮ. Řešitel: Mgr. Martin Bartošík, Ph.D. Anotace projektu Projekt řeší vývoj metody umožňující detekci specifických sekvencí DNA pocházejících z vysoce rizikových kmenů HPV (HPV-16, HPV-18, aj.) způsobujících rakovinu děložního hrdla, a to na principu elektrochemické analýzy s použitím elektrodových čipů, umožňující rychlou a relativně levnou paralelní detekci více vzorků současně. Cíle projektu Cílem je vyvinout elektrochemický test (senzor) pro detekci DNA sekvencí HPV-16 a HPV- 18 (popřípadě jiných vysoce rizikových HPV kmenů), i pro detekci mrna kódující primární HPV onkoproteiny E6 (vazbou na p53 inhibuje jeho funkci) a E7 (podporuje přechod do S fáze v rámci buněčného cyklu), protože u pacientek s CIN 2+ dochází často k zvýšené expresi právě genů kódujících E6 a E7 Metodika Metoda je založena na tzv. sendvičovém přístupu, kdy cílová HPV DNA hybridizuje s dvěma různými DNA sondami, z nichž jedna je kovalentně upevněna na elektrodě, případně jiném vhodném pevném podkladu (např. magnetických kuličkách) a druhá je značena tak, aby došlo k následné interakci s enzymem, jehož produkt se stanovuje elektrochemicky. Během projektu se zaměříme na optimalizaci (a) sekvencí specifických DNA sond, (b) podmínek obou hybridizačních kroků, (c) blokování povrchu pro potlačení nespecifických adsorpcí, (d) značení DNA sondy a vazby na vhodný enzymový konjugát (protilátka-peroxidáza; streptavidin-peroxidáza atd.), (e) enzymatické reakce a (f) výběru vhodného enzymatického substrátu. Vývoj metody bude postupovat systematicky od modelových systémů, přes buněčné linie až k případným vzorkům od pacientek. Stav řešení v roce 2015 V roce 2015 jsme (a) navrhli a otestovali několik DNA sond pro různé regiony DNA u HPV-16 i HPV-18; (b) optimalizovali podmínky hybridizace DNA sond s cílovou DNA; (c) navrhli způsob zablokování povrchu magnetických kuliček pro potlačení nespecifických adsorpcí; (d) optimalizovali značení jedné z DNA sond digoxigeninem a následnou vazbu protilátky vůči digoxigeninu; (e) úspěšně detekovali PCR amplikony HPV-16 z nádorových buněčných linií a (f) započali s testováním přítomnosti HPV DNA izolované ze stěrů od pacientek. Publikační aktivita v roce 2015: Publikace se připravuje. Plán pro rok 2016 Pokračování s vývojem metody pro detekci PCR amplikonů přímo ze stěrů od pacientek, jak pro HPV-16, tak i pro HPV-18. Otestování tzv. izotermální amplifikace, která je mnohem rychlejší a technicky jednodušší variantou klasické PCR. Zvýšení citlivosti použitím jiných DNA značek a substrátů pro enzym. Otestování dalších vysoce rizikových kmenů, porovnání s low-risk kmeny. Dokončení publikace. 166

167 2. NÁZEV PROJEKTU: DETEKCE ALTERUJÍCÍCH GLYKANOVÝCH STRUKTUR V SÉRECH A TKÁNÍCH PACIENTEK S NÁDOREM VAJEČNÍKŮ REZISTENTNÍCH K LÉČBĚ PLATINOVÝMI DERIVÁTY. Řešitel: prof. Ing. Lenka Hernychová, Ph.D. Spoluřešitel: MUDr. Josef Chovanec, Ph.D. Anotace projektu Glykanové struktury dodávají bio molekulám vysoký stupeň strukturní diverzity a tím i mnohostranné biologické funkce, jako jsou buněčné rozpoznávání, adheze nebo zapojení v buněčných signálních drahách. Významně se také účastní onkogeneze, např. ve fázích invaze, metastazování a angiogeneze. Analýza glykanových struktur přítomných v nádorových tkáních nebo tělních tekutinách pacientů je tedy slibným nástrojem pro hledání potenciálních nádorových biomarkerů. Cíle projektu Hlavním cílem projektu bude detekovat, identifikovat a charakterizovat statisticky významné specifické glykanové struktury rozdílně kvantitativně případně kvalitativně zastoupené v biologických vzorcích pacientek s nádorem vaječníků odlišně odpovídajících na chemoterapeutickou léčbu. Tyto výsledky pak budou validovány na větším souboru vzorků. Předpokládáme, že nalezené glykanové struktury budou sloužit jako potenciálních specifické nádorové biomarkery vhodné k časnější diagnostice onemocnění a případně i zefektivnění léčby např. odhalením rezistence nádoru ke konkrétní terapii. Metodika Z klinických vzorků sér a tkání pacientek se serózním typem nádoru vaječníků odlišně odpovídajících na chemoterapeutickou léčbu budou izolovány glykanové struktury, které budou analyzovány hmotnostní spektrometrií a biostatistickými nástroji. Budou využity pokročilé metodologické přístupy glykanového profilování, které byly transferovány ze spolupracujícího pracoviště Indiana University, Department of Chemistry, Bloomington, Indiana, USA v rámci studijní stáže naší postgraduální studentky Mgr. Martiny Zahradníkové. Následně bude využito moderní špičkové vybavení proteomické laboratoře RECAMO. Získané výsledky z hmotnostně spektrometrických analýz budou zpracovány na našem pracovišti dostupnými specifickými softwarovými nástroji a programy pro statistickou analýzu dat. Stav řešení v roce 2015 K analýzám byly využity retrospektivně odebrané vzorky pacientek s nádorem vaječníků uložené v Bance biologického materiálu MOÚ. Konkrétně se jednalo o 20 vzorků sér a tkání pacientek se sérozním nádorem vaječníků rezistentních k léčbě cisplatinou, 14 vzorků sér a tkání senzitivních k léčbě cisplatinou. Na těchto vzorcích byla provedena pilotní studie glykanového profilování. Výsledky byly prezentovány na vědeckých konferencích a byly podkladem pro sepsání publikace do recenzovaného časopisu. Publikační aktivita v roce 2015 Články Zahradníková, M., Vojtěšek, B., Hernychová, L. Cukry zasahují aneb glykomika na poli nádorových biomarkerů. Klin Onkol 2015;28(Suppl 2):2S20 2S25. (bez IF) 167

168 Přednášky, postery Zahradníková, M., Řehulka, P., Link, M., Vojtěšek, B., Novotný, M.V., Hernychová, L. Uplatnění manuální chromatografické separace permethylovaných N-glykanů přítomných v sérech pacientek s nádorem vaječníků. In: Sborník příspěvků: 4. Konference České společnosti pro hmotnostní spektrometrii , Hradec Králové, Česká republika. Olomouc: Česká společnost pro hmotnostní spektrometrii ISBN Str. 41. Zahradníková, M., Nenutil, R., Vojtěšek, B., Novotný, M.V., Hernychová, L. Příběh glykomiky v centru RECAMO: Rakovina vaječníku ve vztahu k léčbě platinovými deriváty. In: Sborník abstrakt: 6th RECAMO joint meeting Through cancer research towards applied molecular oncology , Brno, Česká republika. Brno: Masarykův onkologický ústav ISBN Str. 8. Zahradníková, M., Nenutil, R., Vojtěšek, B., Novotný, M.V., Hernychová, L. Glykanové profilování sér pacientek s rakovinou vaječníku senzitivních na léčbu platinovými deriváty. In: Klin Onkol 2015;28(Suppl1):S153-S154: Sborník abstrakt: XXXIX. brněnské onkologické dny a XXIX. konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky , Brno, Česká republika. ISSN X. Plán pro rok 2016 Pokračování v izolaci glykanových struktur z nádorových tkání vaječníků, isotopická permetylace s (12)C nebo (13)C-značeným methyl jodidem umožňující kvantifikaci glykanů, analýza vzorků na hmotnostním spektrometru, hodnocení dat včetně biostatistické analýzy, selekce alterujících statisticky významných glykanových struktur. Cílem je najít v sérech pacientek glykanové struktury, které se vyskytovaly v nádorových tkáních. Výsledky budou prezentovány na vědeckých konferencích, a budou podkladem pro sepsání publikace do recenzovaného časopisu. 3. DIAGNOSTICKÝ VÝZNAM AMPLIFIKACE GENŮ HTERC A MYCC PŘI VZNIKU A VÝVOJI CERVIKÁLNÍCH INTRAEPITELIÁLNÍCH DYSPLÁZIÍ A KARCINOMU DĚLOŽNÍHO HRDLA Hlavní řešitel projektu: MUDr. Lucie Mouková, Ph.D. Anotace projektu Karcinom děložního hrdla je celosvětově třetí nejčastější maligní onemocnění u žen se čtvrtou nejvyšší mortalitou. Byť jsou preventivní programy poměrně rozvinuté, incidence ani mortalita onemocnění se příliš nemění. Změnu v této situaci by mohlo přinést plošně zaváděné očkování proti dvěma nejagresivnějším kmenům lidských papillomavirů HPV16 a 18, jenž jsou prokazatelně popsanými původci kancerogeneze děložního hrdla. Nicméně je stále nutné analyzovat nové biomarkery časné progrese lehkých dysplazií děložního hrdla v invazivní karcinom. Cíle projektu 168

169 1. Identifikovat buňky infikované HPV a analyzovat vybrané cytogenetické markery (amplifikace genu hterc, amplifikace genu MYCC) u vzorků prekancerózních cervikálních intraepiteliálních dysplázií získaných od pacientek MOÚ v Brně pomocí techniky FISH s využitím nově vyvinuté sondy Vysis Cervical FISH Probe. 2. Zhodnotit korelaci mezi chromozomovými abnormalitami a cytologickým, histologickým a klinickým stádiem onemocnění. 3. Posoudit přínos molekulárně cytogenetické metody jako pomocného screeningového nástroje ke zjištění, které vzorky obsahují vysoce rizikovou infekci HPV a chromozomové aberace spojené s potenciálem progrese do vyšších stádií a rakovinného bujení. 4. Analyzovat dávku genů u vzorků karcinomu děložního hrdla pomocí techniky array-cgh s využitím vysoce hustotních oligonukleotidových DNA čipů. Stav řešení v roce 2015 V současnosti probíhá klinické sledování pacientů za účelem pozdější aktualizace výsledků. Plán pro rok 2016 Aktualizace klinických dat. 4. PILOTNÍ STUDIE LAVÁŽE DUTINY DĚLOŽNÍ ZA ÚČELEM DIAGNOSTIKY SERÓZNÍCH INTRAEPITELIÁLNÍCH KARCINOMŮ TUBY LUSTIC STUDY. Hlavní řešitel: MUDr. Gabriel Jelenek Ciel štúdie: Súčasná štúdia mieri k odpovedi vedeckej otázky, či uvoľnené bunky zo STICs sú transportované do dutiny maternice cez vajcovody a či je možné tieto bunky detekovať v laváži dutiny maternice a proximálnej časti vajcovodu. Metódy: Vyšetřenie 20 lavážnych vzoriek a ich 20 korešpondujúcich STIC pozitívnych vzoriek u žien, ktoré budú súhlasiť s bilaterálnou adnexektómiou z dovodu zvýšeného rizika HGSC (vačšina s BRCA mutáciou), bez histórie oklúzie tuby z dovodu sterilizácie. Do štúdie možu byť zaradené ženy, ktoré sa rozhodnú odstrániť obojstranne salpinx ale ponechať ováriá, ako aj ženy, ktoré sa rozhodnú pre bilaterálnu adnexektómiu s hysterektómiou. U tejto vysoko rizikovej kohorty približne u 10% (4-17) STICs budú detekované vo finálnej histopatológii. To znamená, že približne 200 žien bude zahrnutých v štúdii. Laváž dutiny maternice a proximálnej časti vajcovodov bude prevedená pred obojstrannou adnexektómiou. Laváž može byť uskutočnená ambulantne alebo na operačnom sále technikou ALPINE. Histopatologickým vyšetrením budú štandardne spracované rezy fimbriálneho konca vajcovodov tzv. SEE-FIM protokol (Sectioning and Extensively Examining the FIMbria). Pacieti budú náborovaný do štúdie, kým sa nezíska 20 prípadov STICs. U premenopauzálnych žien ALPINE procedúra bude uskutočnená v luteálnej fáze menstruačného cyklu k optimalizácii šance záchytu STICs buniek. Stav řešení v roce 2015: příprava protokolu studie Plán pro rok 2016: zahájení studie 169

170 5. SOUČASNÉ MOŽNOSTI LÉČBY REFRAKTERNÍHO ASCITU U PACIENTEK S POKROČILÝM GYNEKOLOGICKÝM MALIGNÍM ONEMOCNĚNÍM. Řešitelé: MUDr. M. Náležinská, MUDr. J. Chovanec, Ph.D., MUDr. Ondřej Sláma, Ph.D. Anotace: Protizánětlivý a anti VEGF účinek kortikoidu vede ke snížení permeability cév peritonea a k potlačení zánětlivé reakce v souvislosti s karcinomatózou peritonea, což jsou patofyziologické jevy, které se na etiologii maligního ascitu významně podílejí. Prodloužení interpunkčního intervalu, stabilizace sérové hladiny albuminu. Důraz bude kladen na udržení optimální kvality života u pacientek s vysokoobjemovými punkcemi Cíl studie: využití triamcinolon acetátu v aplikaci do dutiny břišní po předchozí odlehčovací punkci u pacientky s refrakterním maligním ascitem. Stav řešení v roce 2015: příprava protokolu studie Publikační aktivita v roce 2015: Nalezinska M, Chovanec J, Slama O.: Recurent malignit ascites in patiens with advanced ovarian cancer: a review of therapeutic approaches accenting assesment of quality of life ESGO, October 2015, Nice, France Plán pro rok 2016: zahájení studie 6. PREDIKCE ODPOVĚDI NA LÉČBU U PACIENTEK S KARCINOMEM OVARIA Hlavní řešitel (za MOÚ): MUDr. Alena Filková. Spoluřešitelé: MUDr. Josef Chovanec, Ph.D., MUDr. Svatopluk Dobeš a MUDr. Josef Umlauf, Ph.D., MUDr. Lucie Mouková, Ph.D. Hlavní nositel projektu Fakultní nemocnice Hradec Králové Projekt je kofinancován: NT/ /2013 Anotace projektu Projekt řeší molekulární biologii ovariálních karcinomů ve vztahu k odpovědi na léčbu. Cíle projektu a metodika Cílem projektu je stanovení molekulárně-biologických markerů vhodných k predikci odpovědi na léčbu u pacientek s karcinomem ovaria prostřednictvím: 1. Zhodnocení genových polymorfismů ABCB1,ABCC1,GST metodou alelické diskriminace, jimi kódovaných proteinů rezistence Pgp, MRP1 stanovených imunohistochemicky, chemorezistence/chemosensitivity in vitro zjištěnou MTT testem u pacientek s nově diagnostikovaným karcinomem ovaria v letech a retrospektivně u pacientek s již stanovenými Pgp, MRP1 a chemorezistencí/chemosensitivitou in vitro z 170

171 čerstvé nádorové tkáně v letech Zjištění jejich vlivu na odpověď na primární léčbu (progression free survival (PFS), overall survival (OS),vedlejší účinky). 2. Stanovení genových polymorfismů interleukinu 8, genové exprese endoglinu, FGF, angiopoetinu pomocí real-time PCR v nádorové tkáni vaječniku ve vztahu k proangiogenním faktorům (VEGF, TGFά, TGFβ, bfgf) v krvi (ELISA). Jejich zhodnocení v závislosti na typu primární léčby a odpovědi na primární léčbu (PFS, OS) u pacientek s nově zjištěným karcinomem ovaria v letech a retrospektivně z rozmražené ovariální nádorové tkáně u pacientek diagnostikovaných Zjištění kardiotoxicity standardní primární chemoterapie paklitaxel+karboplatina versus paklitaxel+karboplatina+ bevacizumab pomocí EKG, TK, ECHO srdce a markerů kardiotoxicity (NT-proBNP,cTnT, ctni, CKMB, MYO, h-fabp,gpbb) pomocí cardiac array pro biočipovou technologii a elektrochemiluminiscenční imunoanalýzy. Zjištění vlivu chemorezistence a genových polymorfismů na výskyt kardiotoxicity u pacientek s karcinomem ovaria. Projekt naplní cíle a priority RPVIII podporou molekulárně-biologických přístupů využitelných k vymezení principů individualizace léčby a tím prodloužení přežití. Stav řešení / výsledky řešení v roce 2015 Do grantového projektu bylo od listopadu 2013 do listopadu 2015 zařazeno 49 pacientek, 20 pacientek splnilo požadovaná kritéria výběru: histopatologická diagnóza, radikální operační výkon následovaný chemoterapií v kombinaci paklitaxel+cbdca nebo paklitaxel + CBDCA + bevacizumab. U těchto pacientek jsou v současnosti sbírána a analyzována data. Publikační a přednášková aktivita Počty zařazených pacientek dosud neumožňují zpracování ani předběžných výsledků Plán pro rok 2016 Ukončení projektu, analýza dat. 7. OPTIMALIZACE 3D BRACHYTERAPIE NÁDORŮ DĚLOŽNÍHO HRDLA A VLIV HYPOXIE NÁDORU NA VÝSLEDKY LÉČBY Hlavní řešitel projektu: MUDr. Denis Princ, prof. MUDr. Pavel Šlampa, CSc. Anotace projektu V současnosti jsou za nejdůležitější prognostické faktory u nádorů děložního hrdla léčených primárně chemoradioterapií (CHRT) považovány klinickopatologické znaky. V poslední době je studováno v souvislosti s přežitím a/nebo odpovědí na CHRT mnoho buněčných biologických markerů souvisejících se změnou metabolického stavu nádorové tkáně zejména markerů hypoxie. Cíle projektu Studium buněčných biomarkerů spojených s lepším přežíváním pacientek při rutinní chemoradioterapii a optimalizace 3D brachyterapie nádorů děložního hrdla. Metodika 171

172 Stanovení panelu molekulárních markerů u vzorků primárních nádorů děložního hrdla odrážejících metabolický stav nádorového onemocnění a jeho potenciální citlivost a rezistenci k radioterapii. Stav řešení v roce 2015 Analýza literárních zdrojů, příprava podkladů a vytvoření souboru pacientek. Plán pro rok 2016 Analýza souboru pacientek. Stanovování panelu molekulárních markerů u vzorků primárních nádorů děložního hrdla. Ostatní publikace týmu viz podrobný přehled publikační aktivity Karlsen, M. A., Høgdall, E., Christensen, I. J., Borgfeldt, Ch., Kalapotharakos, G., Zdrazilova-Dubska, L., Chovanec, J., et al: A novel diagnostic index combining HE4, CA125 and age may improve triage of women with suspected ovarian cancer - An international multicenter study in women with an ovarian mass. Gynecological Oncology, 2015;138(3): Chovanec, J.: Nová léčebná modalita karcinomu ovaria. Acta medicinae, ISSN X, 2015, 1, (9), s.: Chovanec, J.: Olaparib v léčbě karcinomu vaječníků. Farmakoterapie,2015;11(5): Náležinská M, Kalábová R, Tomíšková M.: Případ domnělé pneumotoxicity topotekanu. Onkologie 2015;3 Chovanec, J.: Nejčastější gynekologické nádory. In: Tomášek, J. a kol.: Onkologie - minimum pro praxi. 1. vyd. Praha; Axonite. 2015, ISBN , s.:

173 TÝM PRO NÁDORY MOZKU A MÍCHY (CNS) Vedoucí týmu: prof. MUDr. Pavel Šlampa, CSc. Vedoucí onkologického programu týmu: MUDr. Radek Lakomý, Ph.D. Vedoucí radioterapeutického programu týmu: prof. MUDr. Pavel Šlampa, CSc. Vedoucí výzkumného programu týmu: doc. RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D. Kompletní seznam členů týmu v roce 2015 je dostupný na internetových stránkách MOÚ: SEZNAM PROJEKTŮ ŘEŠENÝCH V ROCE 2015 Jednoleté projekty: 0 Víceleté projekty: 5 Projekty financované výhradně z IPO 1. Klinické hodnocení diagnostické proveditelnosti a morfologicko-funkční korelace vyšetření PET/CT při použití 11 C-Methioninu inj. u pacientů s primárním nebo sekundárním postižením mozku nádorovým procesem. 2. Základní klinické prognostické a prediktivní faktory u glioblastoma multiforme. Projekty spolufinancované z IPO (prostředky IPO pokrývají výdaje na nové a dodatečné experimenty nebo slouží k financování výzkumných pracovníků zapojených do řešení projektu) 3. Využití stereotaktické radioterapie a radiochirurgie v léčbě nádorů mozku. Provádění a zhodnocení toxicity a efektu aplikace stereotaktického ozáření na lineárním urychlovači pomocí mikrokolimátoru v léčbě primárních a sekundárních nádorů mozku. 4. Korelace obrazu MR spektroskopie v oblasti hipokampu a poškození kognitivních funkcí u pacientů po ozařování mozkovny. 5. Význam spektrální magnetické rezonance v léčbě a sledování pacientů s nádory CNS. 173

174 1. KLINICKÉ HODNOCENÍ DIAGNOSTICKÉ PROVEDITELNOSTI A MORFOLOGICKO-FUNKČNÍ KORELACE VYŠETŘENÍ PET/CT PŘI POUŽITÍ 11 C-METHIONINU INJ. U PACIENTŮ S PRIMÁRNÍM NEBO SEKUNDÁRNÍM POSTIŽENÍM MOZKU NÁDOROVÝM PROCESEM Identifikační číslo protokolu: BT-11C-2011 EUDRACT NUMBER: Jméno a adresa zadavatele: Jméno, titul a adresa lékaře, zodpovědného za klinické hodnocení ze strany zadavatele: Jméno a titul zkoušejícího a adresa centra provádění klinického hodnocení: Masarykův onkologický ústav, Žlutý kopec 7, Brno doc. MUDr. Marek Svoboda, Ph.D. Masarykův onkologický ústav Žlutý kopec 7, Brno MUDr. Radek Lakomý, Ph.D. Masarykův onkologický ústav Žlutý kopec 7, Brno Název zkoumaného přípravku: 11 C-Methionin inj. Centra: Masarykův onkologický ústav Brno Fáze klinického hodnocení: I./II. fáze klinického hodnocení Anotace Jedná se o klinické hodnocení nového radiofarmaka, které je využito v rámci vyšetření pozitronovou emisní tomografií (PET/CT) u pacientů s primárním mozkovým nádorem nebo sekundárním postižením mozku nádorovým procesem. Zadavatel a iniciátorem klinického hodnocení je Masarykův onkologický ústav. Cílem je ověření specificity hodnoceného radiofarmaka v rámci PET/CT vyšetření nádorového procesu mozku, ověření možnosti rozlišení nádorové tkáně od ostatních patologických procesů, případně zdravé tkáně tak, abychom mohli lépe naplánovat chirurgické výkony a ozařování. Stejně tak významně pomůže při hodnocení odpovědi nádoru na aplikovanou léčbu. Cíle projektu Primární cíl Prokázat akumulaci radiofarmaka v nádorové tkáni přítomné v mozku. 11 C-Methioninu inj., podaného v dávce 500MBq Sekundární cíle Hodnocení bezpečnosti aplikovaného přípravku Srovnání akumulace radiofarmaka 11 C-Methioninu inj., podaného v dávce 350MBq a 500MBq, v nádorové tkáni přítomné v mozku (tento sekundární cíl by byl zvolen tehdy, pokud by bylo zobrazení při 500MBq dostačující a bylo by tak možné uvažovat o snížení dávky podaného radiofarmaka) 174

175 Metodika a) kritéria pro účast pacientů: Vstupní kritéria: Histologicky potvrzený primární mozkový nádor high grade gliom Histologicky potvrzený extrakraniálně lokalizovaný primární nádor sekundárně postihující mozek Postižení mozku nádorovým procesem potvrzené pomocí MRI vyšetření MRI vyšetření provedené max. 28 dnů před studiovým PET/CT vyšetřením Věk 18 let Podepsaný Informovaný souhlas ECOG 0-2 Laboratorní hodnoty: 1. bilirubin < 2x horní hranice normálu 2. kreatinin < 2x horní hranice normálu 3. trombocyty > 50 x 10 9 /L minimálně 3 týdny od aplikace poslední protinádorové léčby (první 4 subjekty hodnocení by neměli být předléčeni chemoterapií ani radioterapií, aby se omezil možný vliv této léčby na kvalitu vyšetření) Schopnost subjektu hodnocení spolupracovat dle požadavků protokolu Vylučující kritéria: Aktivní infekční onemocnění Hypersenzitivita na jakoukoli součást hodnoceného přípravku Přítomnost jakýchkoli duševních, rodinných, sociálních či geografických skutečností, které by mohly být překážkou postupu v souladu s protokolem. Tyto skutečnosti musejí být se subjektem hodnocení před jeho zařazením do klinického hodnocení prodiskutovány Těhotné a kojící ženy Hmotnost subjektu hodnocení nad 204 kg nebo deformita trupu bránící prostupu přes otvor v gantry o průměru 70 cm Klaustrofobie nebo neschopnost ležet 15 min bez pohnutí b) výroba a aplikace radiofarmaka Léčivou látkou přípravku je L-(S-methyl-[ 11 C])methionin. Tato léčivá látka nemá v lékopisech samostatnou monografii. Vzhledem k výsledkům kontrol při validaci výrobního postupu a ke krátkému poločasu rozpadu radionuklidu 11 C bude kontrola kvality léčivé látky před jejím použitím pro výrobu konečného přípravku prováděna jen výjimečně po závažných změnách v postupu výroby léčivé látky. V rutinním režimu při výrobě pro klinické hodnocení je kontrolována každá vyrobená šarže konečného přípravku. Léčivá látka je připravována výrobcem přípravku v PET Centru Brno a PET Centru Praha ÚJV Řež, a. s. v komerčně dodaných modulech TRACERlab FX C. Pro zajištění konstantní jakosti léčivé látky je při výrobě dodržován validovaný a schválený výrobní postup, řízený počítačovým programem a při syntéze jsou používány výhradně ověřené substance a materiály od schválených dodavatelů. 175

176 Příprava injekcí 11 C-Methioninu inj. probíhá podle standardního operačního postupu v laboratoři k tomuto účelu určené. Příprava se provádí v prostředí třídy čistoty A, za dodržení podmínek pro přípravu injekcí a manipulace s radioaktivními látkami. Náběr jednotlivých injekcí je prováděn na základě požadavku oddělení nukleární medicíny pro konkrétního subjektu hodnocení. Připravena injekce obsahující radiofarmakum je určena k i.v. aplikaci. Pacientům je aplikován 11C-Methionin inj. o aktivitě 500MBq nebo 350 MBq. Následují akvizice aktivity 11C pomocí PET kamery. c) zhodnocení akumulace 11 C-Methioninu v nádorové tkáni Zhodnocení zda je dávka 500MBq nebo 350 MBq dostačující, bude provedeno v interim analýze, která proběhne po zhodnocení PET/CT obrazů prvních 12 subjektů hodnocení na základě hodnot T/B. T/B je definováno jako SUV max v oblasti léze děleno SUV max pozadí, přičemž SUV je standardizovaná hodnota akumulace (Standardized Uptake Value) a vyjadřuje poměr akumulované koncentrace radioindikátoru v lézi a průměrné koncentrace v celém těle (tj. aplikované aktivity normované na hmotnost pacienta): SUV=C/(A inj /W) kde C [kbq/g] je tkáňová koncentrace radioaktivity v lézi, A inj [MBq] je aplikovaná aktivita, W [kg] je hmotnost (váha) pacienta (subjektu hodnocení). Ukázka obrázku z PET/CT kamery viz obr. č. 1. d) počet subjektů klinického hodnocení: 16 e) statistické metody V rámci statistického hodnocení budou využity hodnoty SUVmax (Standardized Uptake Value) ve vybraných místech PET/CT obrazu. Použitím těchto hodnot bude srovnána akumulace zkoumaného radiofarmaka v nádorové tkáni a ve tkáni zdravé. Dosavadní stav řešení projektu: Projekt byl dle plánu ukončen k 12/2014. Podařilo se zařadit potřebný počet pacientů. V současnosti je zpracovávána závěrečná zpráva. Z hlediska výroby radiofarmaka, kontroly jeho kvality, přípravy aktivní stříkačky pracovníky Úseku radiofarmacie ústavní lékárny MOÚ, transportu aktivní stříkačky potrubní poštou do aplikační místnosti PET MOÚ ani při následné aplikaci radiofarmaka pacientům, se nevyskytly žádné problémy. Aplikace radiofarmaka probíhala u pacientů se zajištěným žilním přístupem, před a po aplikaci se sledovaly parametry dle protokolu studie umožňující zhodnotit event.přítomnost reakce na podání léku. Doposud byly zaznamenány 2 závažné nežádoucí příhody (SAE). Obě tyto závažné nežádoucí příhody vznikly v období Follow up (následné sledování pacientů po provedení PET/CT vyšetření) a byly dány do souvislosti se základním onemocněním. Nebyly zaznamenány žádné nežádoucí účinky. Nebyly zaznamenány žádné nežádoucí účinky. Všechna vyšetření proběhla bez větších problémů. Akvizice dat probíhaly dle protokolu studie, tj. 3x po sobě akvizice 11C-MET PET mozku ve stanovaných časových odstupech, pak následovala akvizice celotělového scanu (viz obrázek č 1. a 2.) Žádný z pacientů v průběhu akvizice dat nepožádal o přerušení vyšetření vzhledem ke svému zdravotnímu stavu, nebo z jiných příčin. Účinnost je hodnocena na základě hodnot T/B ratio v určitých časových intervalech po aplikaci 11 C-Methioninu inj. 176

177 Obrázek č. 1: 11C-MET PET scan mozku pacienta ZM (obraz MR, fúze obrazů MR/PET a obraz PET znázorňující rozsáhlá ložiska zvýšené proliferace v oblasti pravé hemisféry mozku přítomné v obraze MR. Obrázek č. 2: Obrázky z PET/CT vyšetření pacienta zařazeného do klinického hodnocení. Zobrazen 3 řezy z PET/CT vyšetření. Každý řez je zobrazen na MRI (a), PET/CT(b) a jako fůze těchto zobrazení (c) Řez č. 1 a b c Řez č

178 a b c Řez č. 3 Plán pro rok 2016: Klinické hodnocení bylo ukončeno a v roce 2015 proběhlo zpracování výsledků a byla vypracováná závěrečná zpráva. V roce 2016 plánuje výrobce registraci přípravku. 2. ZÁKLADNÍ KLINICKÉ PROGNOSTICKÉ A PREDIKTIVNÍ FAKTORY U GLIOBLASTOMA MULTIFORME Hlavní řešitel projektu: MUDr. Radek Lakomý, Ph.D., doc. RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D. Anotace projetu Glioblastom (GBM) je nejčastějším intrakraniálním nádorem astrocytárního původu. Patří mezi nejvíce letální nádory, jejichž prognóza je i při optimální léčbě (úspěšném neurochirurgickém zákroku a chemoradioterapii) infaustní s mediánem přežití měsíců od stanovení diagnózy. Práce podává přehled o aktuálních klinických prognostických a prediktivních faktorech u glioblastomu, které následně validuje na vlastním souboru pacientů s glioblastomy léčených pooperační radioterapií, nebo chemoradioterapií s temozolomidem. V současnosti existuje pouze málo prací zaměřených na studium významu mikrorna (mirna) u GBM. Deregulace mirna je jednou z kauzálních událostí v kancerogenezi a invazivitě GBM a jsou tak rovněž potenciální markery chemo- a imuno-rezistence GBM. Hlavní cílem předkládaného projektu je identifikovat mirna s rozdílnou expresí v GBM a nenádorové mozkové tkáni metodou Real-Time PCR mirna Arrays a pomocí biostatistických nástrojů integrovat data o expresi mirna s klinicko-patologickými parametry (především citlivostí k 178

179 léčbě alkylačními činidly, a parametry přežití) za účelem identifikace mirna s prediktivním významem. Předpokládáme, že prediktivní mirna, případně jejich cílové molekuly na proteinové úrovni, budou využitelné k predikci účinnosti moderních přístupů k léčbě GBM novými alkylačním činidly (temozolomid) nebo buněčnou imunoterapií, a stanou se dalším krokem směrem k individualizaci léčby a dosažení lepších léčebných výsledků u pacientů s GBM. Cíle projektu Zhodnocení klinických prognostických a prediktivních faktorů u pacientů s glioblastomy, kteří podstoupili komplexní onkologickou léčbu operace, radioterapie a chemoterapie. Hlavním cílem projektu je přispět k molekulární charakterizaci glioblastoma multiforme pomocí analýzy expresních profilů mikrorna v primárních tumorech a využít získané poznatky k predikci odpovědi na moderní léčebné postupy založené na temozolomidu nebo buněčné imunoterapii u pacientů s glioblastomem. Metodika Statistická analýza souboru pacientů s glioblastomy léčených pooperační chemoradioterapií s temozolomidem. V projektu počítáme s izolací mirna (mirvana, Ambion) a stanovením exprese 700 mirna za použití TaqMan Human mirna Array verze 2.0 pomocí systému TaqMan Low Density Arrays (LDA) založeným na kvantitativní PCR detekci z nativní tkáně přibližně 50 primárních glioblastomů, 20 anaplastictických astrocytomů od cílové skupiny pacientů, kteří jsou dispenzarizování na Klinice komplexní onkologické péče MOU,a přibližně 20 vzorků nenádorové tkáně (úrazy, arteriovenózní malformace) od kontrolní skupiny pacientů s jejichž biologickým materiálem (nativním i FFPE) v současnosti MOU disponuje. Hladiny mirna budou stanoveny pomocí metody Real-Time PCR a systému TaqMan LDA s využitím plně standardizovaných technologií společnosti Applied Biosystems na přístroji Sequence Detection System ABI 7900HT. Získané hodnoty exprese mirna z uvedených vzorků budou vyhodnoceny standardními i vícedimenzionálními biostatistickými metodami s cílem identifikovat mirna s rozdílnou expresí v nádorové a příslušné nenádorové tkáni, ale především mirna s vysokou variabilitou exprese v rámci studovaných skupin pacientů. Tyto mirna (předpoklad cca 20 mirna) budou analyzovány v dalším fázi projektu. Dále budeme metodou MLPA analyzovat metylační stav MGMT ve studovaném souboru pacientů. Výsledky těchto analýz budou biostaticky zpracovány především se zaměřením na klinickou odpověď na indikovanou léčbu. Stav řešení v roce 2015 Sestaven retrospektivní soubor pacientů s glioblastomem léčených v MOÚ. Byly vyhodnoceny klinické prognostické a prediktivní faktory platné pro naše podmínky. Soubor se stal základem pro další výzkum, zejména v oblasti molekulárních prediktorů. Plán pro rok 2016 Bude pokračovat aktualizace dat a prospektivní zařazování dalších pacientů. Budou pokračovat validační analýzy mikrorna exprese. Publikace s výsledky projektu v roce 2015 Šlampa P., Kazda T., Lakomý R., Pospíšil P., Slabý O.: Kombinace radioterapie a systémové léčby gliomů. XXII. JOD Lakomý R., Kazda T.: Nádory CNS. V: Tomášek, J. a kol. Onkologie - minimum pro praxi. Axonite CZ, 1. vydání, Praha, edice Asclepius, 2015, s

180 3. VYUŽITÍ STEREOTAKTICKÉ RADIOTERAPIE A RADIOCHIRURGIE V LÉČBĚ NÁDORŮ MOZKU. PROVÁDĚNÍ A ZHODNOCENÍ TOXICITY A EFEKTU APLIKACE STEREOTAKTICKÉHO OZÁŘENÍ NA LINEÁRNÍM URYCHLOVAČI POMOCÍ MIKROKOLIMÁTORU V LÉČBĚ PRIMÁRNÍCH A SEKUNDÁRNÍCH NÁDORŮ MOZKU. Hlavní řešitel projektu: MUDr. Ludmila Hynková Anotace projektu Řešená práce se zabývá zavedením stereotaktických metod ozařování pomocí tzv. X-nože k léčbě intrakraniálních patologických lézí do klinické praxe. Cíle projektu Zhodnocení efektivity a toxicity léčby (akutní a pozdní). Metodika Sběr výsledků prováděné léčby dvěma základními přístupy stereotaktickou radiochirurgií a stereotaktickou radioterapií u primárních nádorů mozku (meningiomy, high-grade gliomy, low-grade gliomy, rezidua/recidivy mozkových nádorů) a sekundárních nádorů mozku (metastázy). Fyzikální data získávána z vyhodnocení dávkově-objemových histogramů, klinická data dlouhodobým sledováním léčených pacientů pomocí zobrazovacích metod (MR/CT) a hodnocením toxicity dle skórovacích stupnic. Stav řešení v roce 2015 Statisticky byla zhodnocena data pacientů léčených v rozmezích let Byla provedena aktualizace standardu intrakraniálního stereotaktického ozařování na pracovišti. Publikace Nikl T., Kazda T., Dvořák D., Vrzal M., Pospíšil P., Burkoň P., Novotný T., Kryštof P., Šlampa P., Procházka T.: Plánování radioterapie mozku: optimalizace workflow na ose lékařfyzik s využitím Eclipse Scripting API. XXII JOD Šlampa, P., Kazda T., Lakomý, R., Pospíšil, P. Standard a novinky v chemoradioterapii gliomů. XX. den prof. Vladimíra Staška, Praha, , Sborník témat a přednášek, s (ISBN ) Kuklova, Kazda. Utilization of Prognostic Indexes for Patients with Brain Metastases in Daily Radiotherapy Routine - is the Complexity and Intricacy Still an Issue? International Summer School on Clinical and Experimental Oncology for Medical Students. July, 2015, Vienna, Kazda T., Kuklová A., Pospíšil P., Burkoň P., Slávik M., Hynková L., Jančálek R., Šlampa P.: Validita prognostickych indexů pro pacienty s mozkovými metastázami v běžné klinické praxi: důsledky pro indikaci paliativní radioterapie. S50 BOD 2015 Burkoň P., Slávik M., Kazda T., Procházka T., Vrzal M.:Možnosti stereotaktické radioterapie v léčbě metastáz efektivita a indikace z pohledu radiačního onkologa. S51 BOD

181 Plán pro rok 2016 Provedení nového statistické zhodnocení výsledků za období s využitím nových prognostických indexů. 4. KORELACE OBRAZU MR SPEKTROSKOPIE V OBLASTI HIPOKAMPU A POŠKOZENÍ KOGNITIVNÍCH FUNKCÍ U PACIENTŮ PO OZAŘOVÁNÍ MOZKOVNY Hlavní řešitel: MUDr. Petr Pospíšil, prof. MUDr. Pavel Šlampa, CSc., MUDr. Tomáš Kazda Anotace V posledních letech se v odborné literatuře diskutuje význam poškození neuronálních kmenových buněk účinky ionizujícího záření. Ve svém důsledku se toto poškození může projevit poklesem kognitivních funkcí. Neuronální kmenové buňky jsou lokalizovány mimo jiné i v oblasti hipokampu, který jak známo hraje významnou roli v procesu tvorby krátkodobé paměti, uchovávání informací a při prostorové orientaci atd. V důsledku těchto poškozením dochází také změnám biochemických procesů, které nastávají současne se změnami strukturální. Tyto změny lze detekovat např. spektrální magnetickou rezonancí. Při poklesu signálu určitých metabolitů na spektrální magnetické rezonanci lze usuzovat na neuronální depleci, pravděpodobně ve frakci neuronálních kmenových buněk, a tím naznačit mechanismus postradiačního poškození kognitivních funkcí. Předmět projektu Nalezení a popis vzájemné souvislosti úbytku neuronálních kmenových buněk projevujících se biochemickými změnami na úrovni metabolitů v oblasti hipokampů detekovaných pomocí spektrální magnenické rezonance a změnami kognitivních funkcí u onkologických pacientů s mozkovými metastázami lečenými pomocí radioterapie celého mozku. Cíle projektu U pacientů s mozkovými metastázami léčenými WBRT analyzovat postradiační změny v oblasti hipokampu pomocí spektrální magnetické rezonance, současně sledovat některé kognitivní funkce a popsat jejich případnou alteraci, která přispívá ke snížené kvalitě života těchto pacientů. Nalézt a popsat vzájemnou souvislosti mezi biochemickými změnami na úrovni metabolitů v oblasti hipokampu a změnou kognitivních funkcí. Přispět k optimalizaci léčby pacientů s mozkovými metastázami např. zavedením hipokampus-šetřících radioterapeutických postupů do klinické praxe. Stav řešení v roce 2015 Průběžně jsou zařazování pacienti indikovaní k paliativní radioterapii na oblast mozku. Publikační a přednášková aktivita 181

182 Kazda T., Pospisil P., Vrzal M., Sevela O., Prochazka T., Jancalek R., Slampa P., Laack NN.: Volumetric modulated arc therapy for hippocampal-sparing radiotherapy in transformed lowgrade glioma: A treatment planning case report. Cancer Radiother.2015 May;19(3): IF 1,411 Kazda T., Kuklova A., Pospisil P., Burkoň P., Slávik M., Hynková L., Prochazka T., Vrzal M., Stavik M., Slampa P., Jancalek R.: Utilization of Prognostic Indexes for Patients with Brain Metastases in Daily Radiotherapy Routine - is the Complexity and Intricacy Still an Issue? Klin Onkol. 2015;28(5): Jancalek, Pospisil, Bulik, Kazda. Proton MR spectroscopy in the assessment of hippocampal radiation injury and the correlation to neurocognitive function impairment: an initial experience. EANS 2015 Annual Meeting, October, Madrid, Spain Jancalek, Pospisil, Kazda, Bulik, Dobiaskova. Hippocampal proton MR spectroscopy in the assessment of radiation injury and the correlation to neurocognitive function impairment. 20th Annual Scientific Meeting and Education Day of the Society for Neuro-Oncology. San Antonio, Texas, USA. November 19-22, 2015 Plán pro rok 2016: Zařazování pacientů, analýza dat. 5. VÝZNAM SPEKTRÁLNÍ MAGNETICKÉ REZONANCE V LÉČBĚ A SLEDOVÁNÍ PACIENTŮ S NÁDORY CNS. Hlavní řešitel za MOÚ: MUDr. Tomáš Kazda Projekt je realizován ve spolupráci s ICRC FN USA (doc.mudr. Radim Jančálek, Ph.D.) Anotace Gliomy s vysokým stupněm malignity (high-grade gliomy, HGG) jsou nejčastějšími primárními mozkovými nádory u dospělých. Přes veškeré pokroky v léčbě těchto závažných nádorů zůstává mortalita stále vysoká (6,5 případů na 100 tisíc obyvatel za rok). Vliv pooperačního ozáření mozkovny dávkou 60Gy na zlepšení přežití u pacientů s HGG byl randomizovanou studií poprvé popsán Walkerem v 70. letech 20. století, čímž se radioterapie (RT) stala základem onkologické léčby těchto nádorů. Role pooperační chemoterapie byla zásadně přehodnocena na základě výsledků randomizované studie publikované Stuppem v roce V současné době představuje pooperační chemoradioterapie (CHRT) s temozolomidem metodu volby u vysoce maligních gliálních nádorů. I přes multidisciplinární přístup k léčbě pacientů s HGG tyto nádory často recidivují pod obrazem nově zjištěné léze na konvenční magnetické rezonanci (MR), sytící se po podání kontrastní látky. Většina těchto lézí, které jsou obvykle doprovázeny okolním edémem, se nachází v místě nebo poblíž místa původního HGG, tedy v místě cílového objemu RT a zahrnují jak pravou recidivu/progresi (dále jen recidivu) HGG, tak i léze tento stav napodobující, jako jsou časné radiografické změny po lokální terapii HGG (stereotaktická radiochirurgie), časné pozdní změny v prvních 6 měsících po CHRT s temozolomidem označované jako pseudoprogrese a/nebo odložené pozdní poradiační poškození zahrnující radionekrózu. Jedná se přitom o stavy relativně časté, jelikož výskyt pozdní radionekrózy je v 182

183 literatuře uváděn kolem 5 % a až 50% pacientů s HGG podstupující konkomitantní CHRT vykazuje mezi 6 týdny až 3 měsíci klinickou a/nebo grafickou pseudoprogresi danou časnou radionekrózou nebo chemonekrózou. Diagnostické odlišení mezi těmito změnami v souvislosti s onkologickou léčbou a pravou recidivou HGG zůstává stále problematické. Vzhledem k vyšším rizikům biopsie u těchto pacientů je v posední době snaha o využití pokročilých zobrazovacích technik k neinvazivní diagnostice recidivy HGG. Cíl projektu Cílem plánovaného projektu je zjištění efektivity pokročilých MR technik, jako je difuzně vážený obraz a protonová MR spektroskopie, v odlišení recidivy high-grade gliomů od strukturálních změn mozku v souvislosti s proběhlou léčbou onkologickou. Metodika Všichni pacienti, léčeni s diagnózou HGG na Masarykově onkologickém ústavu, budou v rámci standardního protokolu prospektivně sledováni klinicky a konvenčními zobrazovacími metodami. Iniciální MR vyšetření s kontrastní látkou bude provedeno před začátkem onkologické léčby a bude sloužit k plánování RT. Následné MR vyšetření bude provedeno 6 týdnů po ukončení RT a následně každé 3 měsíce. V případě progrese grafického nálezu na dvou po sobě jdoucích strukturálních MR vyšetřeních budou pacienti zařazeni do navrhované studie. U těchto pacientů bude doplněno MR vyšetření difuzně váženého obrazu a protonová MR spektroskopie z místa sytícího se po podání kontrastní látky. V případě trvající progrese nálezu na následném MR vyšetření s odstupem dalších 3 měsíců bude provedena biopsie z odpovídajícího místa mozku sytícího se po podání kontrastní látky a provedeno histopatologické vyšetření odebrané tkáně k odlišení recidivy HGG od radionekrózy. Difuzně vážený obraz (DWI) je MR technika měřící pohyby molekul vody v tkáních na buněčné úrovni. Změny mikroprostředí HGG po léčbě onkologické zahrnují buněčný otok následovaný buněčnou smrtí s vysokým aparentním difuzním koeficientem (apparent diffusion coefficient, ADC). Na druhou stranu je snížení ADC typické pro nádory, což je dáno zvýšením počtu a velikosti buněk. Omezení výtěžnosti DWI vyšetření ovšem představuje neschopnost odlišit HGG od okolního edému. Protonová MR spektroskopie (MRS) představuje metodu metabolického zobrazení, která umožňuje zkoumání prostorového rozložení koncentrace některých metabolitů v normální a patologické tkáni. MR spektra zdravého mozku, získané vyšetřením MRS, jsou velmi konstantní. K jejich změně dochází většinou v důsledku nežádoucích biochemických procesů, které následují makroskopické strukturální změny. I když MRS nedokáže určit specifické metabolity pro nádorovou tkáň, může stanovit specifické rozdíly ve změnách koncentrací metabolitů v porovnání s koncentrací těchto metabolitů ve zdravé mozkové tkáni. HGG jsou charakteristické zvýšenou úrovní cholinu a redukcí intenzity signálů N-acetylaspartátu, čehož lze využít v odlišení recidivy HGG od změn mozku v souvislosti s proběhlou onkologickou léčbou. Způsob získávání dat Do studie bude zařazeno nejméně 35 pacientů s HGG a progresí nálezu na kontrolní MR po 6 týdnech od ukončení RT nebo na následných MR vyšetřeních prováděných každé 3 měsíce. U všech pacientů zařazených do studie, bude dále provedeno vyšetření DWI vyjádřené jako ADC a protonová MR spektroskopie zaměřená na hladiny metabolitů cholin (Cho), N- acetylaspartát (NAA), kreatinin (Cr) a lipidy s laktátem (Lip+Lac) v místě ložiska sytícího se po podání kontrastní látky. Následně budou vypočteny metabolické poměry Cho/NAA, Cho/Cr, NAA/Cr, Lip+Lac/Cr. K normalizaci dat budou použity hodnoty získané vyšetřením odpovídajících kontralaterálních oblastí mozku bez patologických strukturálních změn na 183

184 MR. V případě přechodné progrese grafického nálezu do 3 měsíců od léčby onkologické bude nález hodnocen jako pseudoprogrese. V případě odložené nebo trvající progrese grafického nálezu bude stav hodnocen jako recidiva HGG nebo radionekróza. U těchto pacientů bude provedena biopsie z odpovídajícího místa sycení kontrastní látkou na MR a provedeno histopatologické vyšetření odebrané tkáně dle aktuální WHO klasifikace k odlišení recidivy HGG a radionekrózy. Bude stanovena senzitivita a specificita kombinace vyšetření strukturální MR, DWI a MRS. Stav řešení v roce 2015 Do studie jsou průběžně zařazováni pacienti. V roce 2015 proběhlo provní vyhodnocení projektu a výsledky byly publikovány. Plán pro rok 2016 Pokračuje nábor pacientů a sběr a vyhodnocování dat. Publikační aktivita Bulik M, Kazda T, Slampa P, Jancalek R.: The Diagnostic Ability of Follow-Up Imaging Biomarkers after Treatment of Glioblastoma in the Temozolomide Era: Implications from Proton MR Spectroscopy and Apparent Diffusion Coefficient Mapping. Biomed Res Int. 2015;2015: doi: /2015/ IF 1,57 Kazda T., Hardie JG., Pafundi DH, Kaufmann TJ, Brinkmann DH, Laack NN.: Evaluation of RANO response criteria compared to clinician evaluation in WHO grade III anaplastic astrocytoma: implications for clinical trial reporting and patterns of silure. J Neurooncol (2015) 122: DOI /s z,IF 3,07 Pospisil P., Kazda T., Bulik M., Dobiaskova M., Burkon P., Hynkova L., Slampa P., Jancalek R.: Hippocampal proton MR spectroscopy as a novel approach in the assessment of radiation injury and the correlation to neurocognitive function impairment: initial experiences. Radiat Oncol Oct 17;10(1):211. doi: /s , IF 2,546 Abstrakta/postery Seaberg, Kazda T., Laack N.N., Pafundi DH, Anderson, Sarkaria, Brown, Galanis, Brinkmann: Impact of evaluation timing in determining patterns of failure in glioblastoma. Radiotherapy and Oncology 2015;115 (S1):730 3 rd ESTRO FORUM 2015, April, Barcelona, Spain. Pospisil P., Kazda T., Nahodilova J., Bulik M., Slampa P., Jancalek R.: 1H magnetic resonance spectroscopy for investigation of hippocampal radiation Indry. Radiotherapy and Oncology 2015;115 (S1):731 3 rd ESTRO FORUM 2015, April, Barcelona, Spain. Kazda T., Pospisil P., Jancalek R., Bulik M., Nahodilova J., Prochazka T., Hynkova L., Burkon P., Slampa P.: Hippocampal N-acetylaspartate (NAA) decline after whole brain radiotherapy (WBRT): Implications for MR spectroscopy in radiation injury assessment. EORTC-EANO-ESMO Conference 2015: Trends in Central Nervous Systém Malignancies, March, Istanbul, Turkey. 184

185 Jancalek R., Bulik M., Kazda T.: Developing role of advanced MRI techniques for diagnosis of glioblastoma relace after komplex oncology treatment. EORTC-EANO-ESMO Conference 2015: Trends in Central Nervous Systém Malignancies, March, Istanbul, Turkey. Jancalek, Pospisil, Bulik, Kazda. Proton MR spectroscopy in the assessment of hippocampal radiation injury and the correlation to neurocognitive function impairment: an initial experience. EANS 2015 Annual Meeting, October, Madrid, Spain Jancalek, Pospisil, Kazda, Bulik, Dobiaskova. Hippocampal proton MR spectroscopy in the assessment of radiation injury and the correlation to neurocognitive function impairment. 20th Annual Scientific Meeting and Education Day of the Society for Neuro-Oncology. San Antonio, Texas, USA. November 19-22, 2015 Šedo J., Šlampa P., Pavlik T., Kazda T., Sláma O., Petera J., Vyzula R., Dušek L.: et al., Eticko-ekonomicke aspekty financovani radioterapie z veřejného zdravotního pojištění. S33, BOD 2015 Pospíšil P., Kazda T., Bulík M., Dobiášková M., Hynková L., Burkoň P., Jančálek R., Šlampa P.: Změny koncentrace N-acetylaspartátu v oblasti hippokampu po celomozkovém ozáření hodnocené pomocí MR spektroskopie: využití pro zhodnocení, XXII. JOD 185

186 TÝM PRO NÁDORY HLAVY A KRKU Vedoucí týmu: MUDr. Renata Červená Vedoucí chirurgického programu týmu: MUDr. Radek Pejčoch /FN Brno/ Vedoucí onkologického programu týmu: MUDr. Jiří Tomášek, Ph.D. Vedoucí radioterapeutického programu týmu: MUDr. Renata Červená Vedoucí výzkumného programu týmu: doc. MUDr. Pavel Smilek, Ph.D. /FN USA/ Kompletní seznam členů týmu v roce 2015 je dostupný na internetových stránkách MOÚ: SEZNAM PROJEKTŮ ŘEŠENÝCH V ROCE 2015 Jednoleté projekty: 0 Víceleté projekty: 1 Projekty financované výhradně z IPO 1. MikroRNA a nádory oblasti hlavy a krku Projekty spolufinancované z IPO (prostředky IPO pokrývají výdaje na nové a dodatečné experimenty nebo slouží k financování výzkumných pracovníků zapojených do řešení projektu) 2. Možnosti molekulárně řízené radikální radioterapie nebo radiochemoterapie dle profilu mikrorna u pacientů se spinocelulárními karcinomy hlavy a krku 186

187 1. MIKRORNA A NÁDORY OBLASTI HLAVY A KRKU Hlavní řešitel: MUDr. Marek Slávik, doc. MUDr. Ondřej Slabý, Ph.D., prof. MUDr. Pavel Šlampa, CSc. Anotace Radioterapie společně s chirurgií je základním pilířem léčby nádorů orofaciální oblasti. Na rozdíl od minulosti, kdy základním postupem byl operační výkon s případným následným pooperačním ozářením či radioterapie samotná, se v posledních letech stále více uplatňuje integrace léčebných metod i s využitím chemoterapie či biologické léčby, zejména v rámci orgán záchovných postupů, které nabízí srovnatelné léčebné výsledky při lepší kvalitě života. Kombinace léčebných modalit významně zlepšuje léčebné výsledky, tyto ale nejsou i přes veškerou intenzifikaci léčby v posledních letech zcela uspokojivé. Míra lokálních recidiv může být až 15-50%.V souvislosti s nádory ORL oblasti bylo studováno mnoho molekulárních markerů s cílem najít relevantní prediktivní a prognostické faktory. Výsledky jsou však rozporuplné a molekulární prediktory u nádorů ORL oblasti nejsou rutinně stanovovány. V dnešní době jsou z dostupných molekulárních markerů nejdůležitější exprese EGFR, tato je spojena s horší prognózou u pacientů s nádory hlavy a krku a dále HPV pozitivita, která má v dnešní době největší význam ve vztahu k prognóze onemocnění v pozitivním slova smyslu. Celkové přežití těchto pacientů je přibližně o 50% lepší. Tento fakt by v budoucnu mohl znamenat event. snížení intenzity léčebného režimu u této skupiny pacientů. Dobrými kandidáty na prediktivní a prognostické markery u různých typů malignit se jeví mikrorna, kterých spojitost se vznikem nádorových onemocnění byla poprvé popsána v roce 2002 a jejich zkoumání se v posledních letech věnuje velké úsilí. Bylo prokázáno, že poruchy v expresi mikrorna hrají v kancerogenezi důležitou roli. MikroRNA jsou krátké, nukleotidů dlouhé jednořetězcové RNA, které vznikají z dlouhého primárního transkriptu (pri.mirna) a vlásenkové prekurzorové struktury (pre-mirna) účinkem ribonukleáz v jádře a cytoplazmě a jejíchž hlavní funkcí je posttranskripční regulace genové exprese cestou suprese translace cílové mrna nebo iniciací její degradace. Jedna mikrorna ovlivňuje díky neúplné komplementaritě i stovky mrna. Za jednu z hlavních příčin selhání frakcionované radioterapie v léčbě ORL malignit je považována akcelerovaná repopulace maligních buněk tedy děj, kdy dochází k rychlému nárůstu klonogenních nádorových buněk (CSC- cancer stem cells). V důsledku tohoto děje, kdy se klonogennní nádorové buňky začnou dělit na dceřinné klonogenní buňky, počet těchto buněk geometricky stoupá. Doba nástupu akcelerované repopulace se pro karcinomy hlavy a krku udává mezi resp. 28. dnem. Kinetika a radiobiologický mechanizmus repopulace byl rozsáhle studován. Bylo zjištěno, že zvláště u dobře diferencovaných tumorů se na odpovědi přežívajících klonogenních buněk a tím na zahájení repopulace podílí aktivní signální regulační mechanizmy via EGFR a zejména regulační mechanizmy sebeobnovy. V souvislosti s těmito dráhami bylo popsaných již několik mikrorna podílejících se na jejich aktivaci a inhibici, např. Mir34, let7, mir-199b-5p, mir15a mir 199b-5p aj. V naší práci se chceme zabývat problematikou mikrorna v souvislosti s kurativní kombinovanou léčbou spinocelulárních karcinomů oblasti hlavy a krku (konkomitantní radiochemoterapií jen s RT!), s cílem identifikovat specifický biomarker na úrovni mikrorna s vlivem na prognózu onemocnění, a dále nalézt biomarker akcelerované repopulace, který by byl prediktivním faktorem léčebné odpovědi. Tyto markery pomohou ošetřujícímu lékaři v predikci léčebného 187

188 efektu konkomitantní léčby u konkrétního pacienta s možností zvážení další intenzifikace léčby či změně léčebného postupu v případě horší prognózy. Hypotéza Domníváme se, že u pacientů se spinocelulárním karcinomem oblasti hlavy krku existuje spefický profil mikrorna prokazatelný v tělních tekutinách, který je spjatý s horší prognózou onemocnění i s horším fenotypem nádoru. U takového nádoru se předpokládá velká pravděpodobnost akcelerované repopulace v průběhu léčby, která vede k horšímu efektu léčby. Cíl projektu Základním cílem práce je nalezení rozdílných specifických profilů mikrorna na úrovni biopsií, tělných tekutin (sliny, plazma) a neinvazivně získaného biologického materiálu (stěry z dostupné nádorové tkáně) v předem definovaných skupinách pacientů s lepší a horší prognózou onemocnění. Vedlejším cílem je identifikace markeru akcelerované repopulace. Očekávané výsledky Rozdílnost v profilech mikrorna v biopsiích a tělných tekutinách či stěrech z nádorové tkáně pacientů s lepší prognózou (tj. HPV pozitivních, EGFR negativních, s velkou expresí CD44) a pacientů s horší prognózou onemocnění ( EGFR pozitivita, HPV negativita, s velkou expresí CD44). Zároveň změna v profilu mikro RNA v průběhu frakcionované radioterapie odrazí nástup repopulace v nádorové tkáni v průběhu léčby, a identifikuje skupinu pacientů, u kterých k tomuto ději dochází. Rozdíly v expresi mikrorna u těchto skupin pacientů budou korelovat s rozdílným intervalem RFS (relaps free survival). Stav řešení v roce 2015 Probíhá výběr pacientů do retrospektivní části výzkumu. Zajišťování vzorků, sběr dat. Byla přijata žádost o finanční podporu v rámci grantové soutěže AZV ČR Plán pro rok 2016 Projekt bude pokračovat součástí grantu AZV ČR. 188

189 2. MOŽNOSTI MOLEKULÁRNĚ ŘÍZENÉ RADIKÁLNÍ RADIOTERAPIE NEBO RADIOCHEMOTERAPIE DLE PROFILU MIKRORNA U PACIENTŮ SE SPINOCELULÁRNÍMI KARCINOMY HLAVY A KRKU Hlavní řešitel: Spoluřešitelé: Anotace: prof. MUDr. Pavel Šlampa, CSc. MUDr. Marek Slávik, doc. RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D. (MOÚ) Doc. MUDr. Pavel Smilek, Ph.D. (FN USA) Radioterapie je jedním ze základních pilířů léčby nádorů ORL oblasti. Intenzifikace léčby sice zlepšuje léčebné výsledky, tyto ale stále nejsou uspokojivé. V tomto projektu se zabýváme problematikou mikrorna v souvislosti s kurativní radioterapií spinocelulárních karcinomů oblasti hlavy a krku, s cílem identifikovat biomarkery na úrovni mikrorna, schopné rozlišit jednotlivé molekulární podtypy nádorů hlavy a krku (HPV+/, EGFR+/, CD44+/ ) a umožňující predikovat léčebnou odpověď a prognózu onemocnění u pacientů podstupujících kurativní radioterapii nebo radiochemoterapii. Takové biomarkery by následně mohly mít vliv na přispůsobení intenzity léčby u jednotlivých subtypů v případě lepší či horší prognózy. Cíle projektu: Identifikace mikrorna umožňujících predikci odpovědi na kurativní radioterapii, bezpříznakové a celkové přežívání pacientů s nádory hlavy a krku. Navržení možné adaptace léčebného režimu (navýšení dávky, akcelerace radioterapie, konkomitantní chemoterapie) na základě nalezených profilů mikrorna. Metodika a Stav řešení/výsledky projektu: V květnu roku 2015 byla zahájena studie jejíž cílem je identifikace mikrorna umožňujících predikovat odpověď na kurativní radioterapii, bezpříznakové a celkové přežívání pacientů s nádory hlavy a krku, což by mohlo vést k navržení možné adaptace léčebného režimu (navýšení dávky, akcelerace radioterapie, konkomitantní chemoterapie). Pro první období řešení tohoto projektu je počítáno se sestavením retrospektivního souboru pacientů, jeho imunohistopatologickou charakterizací a následnou analýzou mikrorna. Souběžně bude probíhat zařazování pacientů do prospektivní části studie. Do retrospektivní analýzy pacientů se spinocelulárními karcinomy oblasti hlavy a krku byly tedy zařazeni pacienti léčení na Klinice radiační onkologie MOÚ a LF MU, u kterých byla základní terapeutickou modalitou kurativní radioterapie. Do souboru bylo celkem zahrnuto celkem 197 pacientů léčených v období od začátku roku 2007 do konce roku Dle anatomické lokalizace primárního tumoru, byli pacienti rozděleni do skupin se spinocelulárními karcinomy dutiny ústní, karcinomy orofaryngu, karcinomy laryngu a karcinomy hypofaryngu. Pacienti s nasofaryngeálními karcinomy byli ze souboru vyloučeni vzhledem k odlišným biologickým charakteristikám a jiné léčebné strategii u tohoto typu onemocnění. Dále byla provedena charakteristika pacientů dle TNM stádia onemocnění, histopatologického gradingu a dle případné konkomitantní systémové léčby. Všichni pacienti byli primárně indikováni ke kurativní radioterapii jakožto základní léčebné modalitě. U všech byla použita technika léčby IMRT- tedy radioterapie s modulovanou intenzitou. Aplikace radioterapie byla dle standardů Kliniky radiační onkologie MOÚ a LF MU v Brně, 189

190 a to buď standardně v jednotlivé dávce 2,0 Gy denně s intencí aplikace celkem 35 frakcí záření. Dále bylo možné použití techniky SIB- simultánního integrovaného boostu s mírnou akcelerací s využitím aplikace rozdílné dávky záření do různých oblastí dle míry rizika v jedné frakci záření (neboli modelování dávky s aplikací nejvyšší dávky do oblasti primárního tumoru a postižených uzlin), přičemž celková dávka v tumoru biologicky odpovídá 70,0 Gy. Další možností byla technika konkomitantního boostu s využitím 2 frakcí denně od 18. frakce záření. Celková dávka odpovídá i v tomto případě minimálně 70,0 Gy standardní frakcionace resp. i vyšší. Pacienti byli léčeni samostatnou kurativní radioterapií nebo kurativní radioterapií v s konkomitantní systémovou léčbou s chemoterapií na báze platinového derivátu nebo cílenou léčbou cetuximabem. Celkem bylo konsekutivně zařazeno 197 pacientů, z toho 166 (84 %) bylo mužů a 31 (16 %) žen. Dle lokalizace primárního tumoru se jednalo o 92 (47 %) pacientů s tumory orofaryngu, 66 (33,5 %) pacientů s tumory laryngu, 24 (12 %) pacientů s tumory hypofaryngu a 15 (7,5 % ) pacientů s tumory dutiny ústní. Na základě TNM klasifikace byla v největší míře zastoupena pokročilá stadia onemocnění stadium III u 25 (13 %) a stadium IV u 123 (62 %) pacientů. Většina pacientů byli kuřáci 128 (65 %) s průměrem 22 (3-80) cigaret denně. Z počtu 69 nekuřáků bylo 41 stopkuřáků s anamnesou nekouření více než rok, v minulosti kouřili v průměru 18 (2-40) cigaret denně. Pravidelní denní příjem alkoholu přiznávalo 104 (53 %) pacientů. Z tohoto počtu bylo nejvíce konzumentů piva a to 88 (45%) pacientů s průmerem 2 piva denně. Víno pravidelně v průměru 0,3 dcl denně buďto samostatně nebo v kombinaci s pivem či tvrdým alkoholem konzumovalo 16 (8 %) pacientů. Alkohol v koncentrované formě přiznalo 25 (13 %) pacientů a to v průměru 4 půldecové skleničky týdně většinou v kombinaci s pivem či vínem. 2 pacienti byli vyléčení alkoholici. Údaje o příjmu alkoholu však můžou být s ohledem na delikátnost problematiky a neanonymní sběr dat značně podhodnocené. Léčených samostatnou radioterapií (RT) bylo 97 (49 %) pacientů, konkomitantní radiochemoterapií (CTRT) na báze platinového derivátu v aplikaci á 3 týdny á 100 mg / m2 nebo v týdenní aplikaci 40 mg /m2 po dobu RT bylo léčeno 55 pacientů. V kombinaci s cílenou léčbou monoklonální anti EGFR protilátkou cetuximabem (ERT) bylo léčeno celkem 45 (23 %) pacientů v aplikaci 400 mg /m2 nasycovací dávky a pak 250 mg /m2 1x týdně po dobu radioterapie. U 23 (11,6 %) pacientů byla aplikována i neoadjuvantí chemoterapie s cílem zmenšení primárního tumoru před RT v kombinaci ciplatina / fluorouracil (CF) a u 4 pacientů i s taxanem (CFT), v rozsahu 1-3 cykly s mediánem počtu 2 cyklů. Po ukončení kurativní léčby byli pacienti standardně sledování cestou odborné ambulance kliniky radiační onkologie MOÚ v Brně a odborné ambulance Kliniky otorinolaryngologie a chirurgie hlavy a krku Fakultní nemocnice u sv. Anny v Brně. Po kurativní léčbě byla bloková krční disekce (BKD) pro suspektní perzistenci nemoci provedena u 33 (16,7 %) pacientů, nález v blokovém krčním disekátu byl negativní u 16 (48,5 %) pacientů, 1 pozitivní uzlina byla u 10 (30,5 %) pacientů 2 pozitivní uzliny byly nalezeny u 3 (9 %) pacientů, 3 u 1 (3 %) a 4 pozitivní uzliny u 3 (9 %) pacientů. Medián doby sledování je 66,9 měsíce. Medián v parametru OS (overall survival),tedy celkového přežití od stanovení diagnózy na základě Kaplan-Meierovy analýzy je 52,4 měsíce, 5-leté přežití je 44 % bez ohledu na jednotlivé sublokality. Recidiva onemocnění- lokální či vzdálená byla zaznamenána u celkem 87 (44 %) pacientů. Z toho recidiva lokální byla u 78, (39 %) pacientů. Nejčastějším místem lokální recidivy byla oblast původně postižených sliznic a to celkem u 69 (35 %) pacientů. Relaps v regionálních uzlinách byl zaznamenán u 31 (15,7 %) pacientů, z toho samostaně- tedy bez 190

191 slizniční recidivy to bylo u 9 (4,5 %) pacientů. Resekce v případě lokální recidivy byla realizována u celkem 25 (32 %) pacientů s lokální recidivou. Vzdálenou diseminaci mělo celkem 28 (14 %) pacientů. Nejčastějším místem vzdálené diseminace byly plíce v počtu 18 (64 %) případů. Medián parametru PFS (progression free survival) tedy intervalu bez progrese nemoci od ukončení léčby do verifikace recidivy byl pro lokální recidivu 51,7 měsíců (95% CI 29,3 nedosaženo), 5 leté přežití bez lokální recidivy bylo 49 %. Klinicko-patologická charakteristika retrospektivního souboru pacientů je přehledně zpracována v tabulce 1. Z archívu bioptického materiálu I. PAÚ FN u sv. Anny v Brně LF MU a z dalších pracovišť patologie, na kterých byla provedena primární diagnostika spinocelulárního karcinomu, byly získány formolparafinové (FFPE) bloky předmětných biopsií s příslušnými bioptickými nálezy. Diagnóza spinocelulárního karcinomu a přítomnost nádorového infiltrátu v předmětném tkáňovém bločku byla ověřena v následně zpracovaných preparátech barvených přehledně hematoxylinem eosinem. V současnosti probíhá imunohistochemická analýza exprese EGFR, CD44, p53 a p16 níže specifikovaným postupem. V současnosti je provedena imunohistochemická analýza sledovaných markerů u 1/3 pacientů zahrnutých do souboru s plánovaným dokončením imunohistochemického vyšetření exprese sledovaných markerů v průběhu následujících 2 měsíců. Následně bude provedeno histopatologické hodnocení výsledků vyšetření exprese sledovaných markerů a jejich analýza. Z předmětných bloků tkáně je současně s přípravou tkáňových řezů na imunohistochemickou analýzu získáván materiál pro analýzu mirna na pracovišti CEITEC. Celková RNA obohacená o krátké RNA byla doposud získána ze 49 FFPE vzorků a izolace dalších vzorků nadále probíhá. Od období 6/2015 byli postupně zařazováni i pacienti do prospektivní části projektu. Pacienti jsou léčeni s kurativním záměrem radioterapií případně konkomitantní radiochemoterapií pro spinocelulární karcinomy oblasti dutiny ústní, orofaryngu, laryngu a hypofaryngu. Celkem bylo zařazeno zatím 19 pacientů, z toho 5 žen a 14 mužů ve věku let. U pacientů byl po podepsání informovaného souhlasu proveden odběr bioptické tkáně a materiál archivován v - 80 C pro další analýzy mikrorna. Odběr periferní krve a slin, případě stěru z nádorové tkáně v případě dobré dostupnosti nádoru probíhá u zařazených pacientů v období před zahájením radioterapie a pak jednou týdně v průběhu léčby zářením, následně v době sledování v intervalu 2, 4 týdnů, 3 měsíců od ukončení léčby a pak á 3 měsíce. Vzorky biologického materiálu jsou anonymizovány označeny datem odběru a archivovány v -80 C. Pacienti jsou dále sledováni standardním způsobem v ambulanci kliniky radiační onkologie MOU a Kliniky otorynolaryngologie a chirurgie hlavy a krku ve FNUSA. CT vyšetření po léčbě je indikováno v období přibližně 2 měsíců od ukončení léčby. ORL vyšetření pacientů po léčbě je minimálně každé 3 měsíce, může být i častěji. Další zobrazovací metody jsou indikovány dle klinického stavu pacienta a dle standardních postupů v léčebném sledování u těchto pacientů. Tabulka 1 Klinicko-patologická charakteristika retrospektivního souboru pacientů Počet pacientů N=197 Pohlaví Muži(n, %) 166, 84% Ženy (n, %) 31, 16% Věk v době dg Median (rozsah) 59,2 (37,7 85,2) Průměr (±SD) 58,9 (±8) Anatomie (n,%) 191

192 OF - orofarynx 92 (47%) L - larynx 66 (33,5%) HF - hypofarynx 24 (12%) DU-dutina ústní 15 (7,5%) T staging (n,%) N=197, 1 28, 14% 2 44, 22% 3 42, 21% 4 83, 43% N staging (n,%) N= , 33,5% 1 26, 13% 2 3, 1,5% 2b 50, 25% 2c 37, 19% 3 15, 8% M staging (n,%) N=197 O 197, 100% Stadium (n,%) N= , 13% 1a 2, 1% 2 21, 10,5% 2b 1, 0,5% 3 25, 13% 4a 93, 47% 4b 30, 15% Grade (n,%) N= 168, údaj nezjištěnu N= , 15% 2 102, 61% 3 40, 24% Overall survival- celkové přežití (měsíce) Median (95% CI) 52,4 (38,5 63,4) 5-y OS 44% Doba sledování (měsíce) Median 66,9 PFS - lokální rekurence- LR (měsíce) Median (95% CI) 51,7 (29,3 nedosažen) 5-y PFS_LR 49% Výskyt vzdáleného relapsu nepřítomen (n, %) 167 (85%) PFS - vzdálená rekurence - DR (měsíce) Median (95% CI) nedosažen 5-y PFS_DR 79% Léčba (n,%) N=197, CTRT (chemoradioterapie) 55, 28% ERT (radioterapie s cetuximabem) 45, 23% RT (radioterapie) 97, 49% Radioterapie N=197, Dávka RT (median, rozsah) 70 (36-74,2) Počet frakcí (median rozsah) 35 (15-42) Akcelerace (ano n,%) 31, 16% Chemoterapie q3w (n, %) 28, 14% 1 cyklus 3, 11% 2 cykly 16, 57% 3 cykly 9, 32% Chemoterapie q1w (n, %) 27, 14% 192

193 Median počtu cyklů (rozsah) 5 (1-8) Cetuximab - počet aplikací 8 25, 60% 7 5, 11% 6 5, 11% 5 2, 7% 5 5, 11% Doba od 1.potíží do stanovení dg. (měsíce) Median (rozsah) 2,5 (0-24) Doba od stanovení dg. do zahájení RT (měsíce) Median (rozsah) 2,03 (0,33-6,92) Recidiva celkem (lokální + vzdálená) (n,%) N=87,44% Recidiva lokální (sliznice + LU) ) (n,%) N=78, 39% Recidiva vzdálená ) (n,%) N=28, 14% Recidiva jen vzdálená (bez lokální recidivy) ) (n,%) N=9, 4,5% Recidiva v RT poli sliznicích ) (n,%) N=69, 35% Recidiva v LU (n,%) N=31, 15,7% Recidiva jen v LU (bez rec. v sliznicích) ) (n,%) N=9, 4,5% Resekce recidivy (n,%) N=25, 32% Počet pozitivnich uzlin po BKD při perzistenci N=33, 16,7% 0 16, 48,5% 1 10, 30,5% 2 3, 9% 3 1, 3% 4 3, 9% Místo vzdáleného relapsu N=28, 14% Plíce 18, 64% Kosti 5, 18% Játra 1, 4% Jiné 4, 14% Váhový ubytek během RT (kg) N=196, NA=1 Median (rozsah) 3, 0-24 Váhový ubytek před RT (kg) N=194, NA=3 Median (rozsah) 0 (0-25) Karnofsky index před léčbou N=197 Median (range) 90 (60-100) Karnofsky index po léčbě N=195 Median (range) 80 (50-100) Plán na rok 2016: Nábor pacientů probíhá kontinuálně dále, v roce 2016 je předpoklad náboru alespoň pacientů. Bude provedena imunohistochemická analýza exprese EGFR, CD44, p53 a p16u zbývajících 2/3 pacientů. Následně bude provedeno histopatologické hodnocení výsledků vyšetření exprese sledovaných markerů a jejich analýza. Studium relevantních diagnostických a prediktivních mikrorna z tkání a tělních tekutin. Publikační aktivita: Publikace z uvedeného projektu je naplánována na rok

194 TÝM PRO NÁDORY KŮŽE A MELANOM Vedoucí týmu: doc. MUDr. Vuk Fait, CSc. Vedoucí chirurgického programu týmu: doc. MUDr. Vuk Fait, CSc. Vedoucí onkologického programu týmu: MUDr. Alexandr Poprach, Ph.D. Vedoucí radioterapeutického programu týmu: prof. MUDr. Pavel Šlampa, CSc. Vedoucí výzkumného programu týmu: MUDr. Ivo Kocák, Ph.D. Kompletní seznam členů týmu v roce 2015 je dostupný na internetových stránkách MOÚ: SEZNAM PROJEKTŮ ŘEŠENÝCH V ROCE 2015 Jednoleté projekty: 0 Víceleté projekty: 1 Projekty financované výhradně z IPO 1. Sentinelová biopsie u maligního melanomu (SNB) Projekty spolufinancované z IPO (prostředky IPO pokrývají výdaje na nové a dodatečné experimenty nebo slouží k financování výzkumných pracovníků zapojených do řešení projektu) SENTINELOVÁ BIOPSIE U MALIGNÍHO MELANOMU (SNB) Hlavní řešitel projektu: doc. MUDr. Vuk Fait, CSc. Anotace Vyhledávání sentinelových uzlin /ULTRASTAGING/ u melanomu je metoda logická a dobře pochopitelná, a na první pohled i velmi jednoduchá. Jak však ukazují výsledky mnoha center včetně našeho, ke svému zvládnutí vyžaduje určitý čas (počet případů) i dobrou znalost chirurgie lymfatických metastáz včetně techniky radikálních dissekcí jednotlivých lymfatických oblastí. Metoda by tedy měla být tedy používána pouze v centrech s dostatečnou erudicí a množstvím pacientů a dostatečným technickým i personálním vybavením. Indikace Hlavní indikací k sentinelové biopsii je kožní maligní melanom s potenciálem lymfatického metastazování. Tento potenciál postrádají melanomy in situ (LMM, lentigo maligna melanom, M. Dubreiulh) a, superficiální melanomy (SSM). U nodulárních melanomů, superficiálních melanomů s nodularitou a akrolentiginosních melanomů je jednoznačné určení hranice obtížnější, obvykle se za hranici, kdy se riziko lymfatického metastazování významně zvyšuje, považuje tloušťka melanomu dle Breslow nad 1mm. (pt2 a více), tato hranice však není striktní a snižuje se až k 0,5mm. V našem ústavu považujeme za indikaci k sentinelové biopsii v případě již odstraněné morfy hranici 1,0mm, s možností snížení u pacientů s vysokým rizikem nebo velmi mladých, za racionální považujeme v těchto případech indikace při Breslow nad 0,5mm. V případě klinicky 194

195 diagnostikovaných morf, pak jakoukoliv klinickou známku nodularity nebo rozsáhlejší regrese. Kontraindikace k sentinelové biopsii jsou povětšinou relativní, obvykle se jedná o velmi vysoký věk, vysoké riziko operace při relativně malém riziku disseminace, relativní kontraindikací jsou i stavy po velmi širokých exscisích a především po lalokových plastikách, kdy je přesnost nálezu odpovídající sentinelové uzliny výrazně snížena, podobně je relativní kontraindikací stav po lymfangoitidách nebo kožních zánětech blízké oblasti. Metodika Lymfoscintigrafie Lymfoscintigrafie probíhá na pracovišti nukleární medicíny pomocí 99mTc-koloidů. (99mTc je radionuklid s energií 140 KEv a poločasem rozpadu 6 hod.) Podle zvyklostí pracoviště je možno zvolit jednodenní nebo dvoudenní protokol tedy lymfoscintigrafie i chirurgické řešení v jeden den, nebo lymfoscintigrafie první den a chirurgický zákrok druhý den. Naše pracoviště dává z organizačních důvodů přednost jednodennímu protokolu. Oba protokoly jsou hodnoceny co do úspěšnosti stejně, jednodenní protokol má slabinu v relativně velkém radiačním pozadí, tedy menším kontrastu aktivních uzlin, dvoudenní protokol naopak může při horší kvalitě koloidu způsobovat označení i uzlin druhého řádu a tedy větší operační poškození pacienta a zátěž patologa, z pohledu chirurga pak může být problémem i nižší aktivita sentinelových uzlin. Dvoudenní protokol se nám v našich podmínkách jeví jako nevýhodný z důvodů nutného zvýšení aplikované dávky, (do operace proběhnou 3 4 poločasy rozpadu), nutnost užití koloidu s většími částicemi, aby nedocházelo k odplavování farmaka ze sentinelové uzliny což vše jsou faktory prodražující vlastní zákrok. Jednodenní protokol klade zvýšené nároky na organizaci práce a koordinaci činnosti oddělení nukleární medicíny a chirurga, optimální je při existenci pracoviště nukleární medicíny a chirurgie v jednom zařízení. 99mTc-koloid (preparát Nanocoll, koloid o velikosti částic 80nm)) o aktivitě do 100 MBq v objemu 0,2ml se aplikuje intradermálně nebo subkutánně do okolí tumoru z jednoho nebo více vpichů podle velikosti morfy, následně je pomocí gamakamery sledován transport radiofarmaka lymfatickým řečištěm a jeho vychytávání v sentinelové uzlině nebo uzlinách. Transport je rychlý, v řádu minut je radionuklid deponován v regionální mízní uzlině, díky velikosti částic v ní setrvává hodiny, i když je pozorován i transport do vyšších etáží. Přibližná poloha sentinelové uzliny je zakreslena na kůži. V případě, že nádor je lokalizován na rozvodí mezi jednotlivými lymfatickými povodími, není neobvyklý záchyt dvou a více sentinelových uzlin v různých lymfatických povodích (např. obě axilly i obě inguiny při lokalizaci tumoru uprostřed zad). Po zakreslení lokalizace sentinelové uzliny na kůži a popisu průběhu vyhledávání, odchází pacient na chirurgické oddělení a následuje chirurgický zákrok. Chirurgická fáze Chirurgické vyhledání sentinelové uzliny probíhá za kombinace metody peroperačního mapování (barvení) a radionavigovaného vyhledávání, samostatně se v současné době tyto metody používají pouze v případech kompletního selhání druhé metodiky, nebo ve zcela specifických případech (například drobný melanom v obličeji, bez reexscise jizvy použití barvení by mělo za následek dlouho přetrvávající tetováž). 195

196 Pro obě metody vyhledávání platí, že odstranění uzliny by mělo být co nejšetrnější, uzlina by měla být kompletní a bez zhmoždění. Kromě uzlin detekovaných barvivem a/nebo radionavigací je vždy vhodné odstranit i případné uzliny jakkoliv makroskopicky suspektní. Lokalizace sentinelových uzlin Lokalizace sentinelových uzlin lze rozdělit na typické a atypické až raritní. Typickými lokalitami, kde se nachází většina sentinelových uzlin pro trupové a končetinové melanomy jsou axilly a inguiny. Méně častou lokalitou, ovšem nikoliv raritní je lokalizace v oblasti zevních ilických uzlin. Velmi vzácnou lokalizací je pak popliteální oblast. U trupových melanomů je zvláštní, ale předvídatelnou lokalitou mezisvalová oblast lopatky tato oblast je zajímavá kromě jiného tím, že při lymfoscintigrafii z pouze jedné projekce lze tuto uzlinu nesprávně lokalizovat do axilly. Za zvláštní lokalizace považujeme také případy, kdy poměrně dobře lateralizovaná morfa (především na trupu) je drénovaná do kontralaterální oblasti. Za raritní považujeme uzliny lokalizované zcela mimo obvyklá centra, například v podkoží trupu mimo lopatku, uzliny intramammární, eventuálně uzliny ležící při průběhu v. brachialis na paži u melanomů lokalizovaných na předloktí. Obrázek: Sentinelová uzlina na krku v supraklavikulární oblasti Pro oblast hlavy a krku, ale i v některých případech pro horní část hrudníku jsou spádovými krční a nadklíčkové uzliny. Lokalizaci sentinelové uzliny lze sice ve většině případů klinicky předvídat, vzácnější, vzácné i raritní lokalizace uzlin jsou však natolik časté, že na klinický úsudek se nelze spoléhat a předoperační lymfoscintigrafii je nutno považovat za conditio sine qua non. V této souvislosti stojí za zdůraznění velmi častá lokalizace melanomu mezi lopatkami nebo uprostřed zad, tedy stav kdy na základě empirie nelze lymfatický spád odhadnout. 196

197 Vyhledávání pomocí barviva Prvním krokem je aplikace vitálního barviva do bezprostředního okolí melanomu nebo jizvy po exscisi. Teoreticky lze použít patentní modř nebo isosulfanovou modř, v našich podmínkách je dostupná pouze patentní modř, která má však výhodu v intenzivnějším zbarvení a lepším průniku. Následuje kožní incise při okraji lymfatické oblasti, určené lymfoscintigrafií, pokud možno v místě nejpravděpodobnějšího průběhu lymfatického kolektoru. Obrázek: Intradermální aplikace patentní modři Obrázek: Zbarvená lymfatická uzlina v třísle s přívodnou lymfatickou cévou 197

198 Postupně, opatrnou preparací je nutno nalézt zbarvený lymfatický kolektor, tento se obvykle nachází pod úrovní Scarpovy fascie, nicméně není to absolutním pravidlem. Po nalezení je nutno kolektor sledovat směrem do lymfatické oblasti, po první zbarvenou uzlinu, kterou je nutno odstranit. Je nutno zdůraznit expozici kolektoru od okraje lymfatické oblasti po uzlinu, nelze se spolehnout na prosté nalezení zbarvené uzliny, neboť barvivo přechází do dalších uzlin a zbarvená uzlina nemusí být nutně sentinelová. Posléze je nutno zkontrolovat, zda se nebarví další kolektor a eventuálně proces opakovat. Vyhledávání pomocí radionavigace Vyhledávání pomocí radionavigace využívá skutečnosti, že při správně zvolené velikosti částic radiokoloidu jsou tyto v lymfatické uzlině zachyceny a nepronikají dále, tedy že je výrazný rozdíl v aktivitě sentinelové uzliny a okolí včetně dalších uzlin. Není nutno (a ani nelze) sledovat lymfatický kolektor. Předoperačně je nutno vyhledat přibližnou lokalizaci sentinelové uzliny přes kůži pro nejvhodnější zvolení kožního řezu. Kožní řez lze zvolit přímo nad uzlinou, nicméně je vhodnější jej volit tak, aby jizva nepůsobila problémy při případné dissekci této oblasti. Po proniknutí kůží je nejvhodnější postupovat tupou preparací přímo kolmo k depu maximální aktivity, za průběžné kontroly směru. Zde je velmi zásadní role asistence, neboť se operuje obvykle z velmi malého řezu, a mezi kontrolami směru je nutno zachovat ránu ve stejném postavení, i drobný posun háku může znamenat preparaci jiným, nesprávným směrem. Po nalezení uzliny je zapotřebí tuto opatrně odstranit, po odstranění je nutno znovu zkontrolovat její aktivitu ex vivo, sentinelová uzlina může být někdy méně nápadná uzlina ležící za touto uzlinou. Aktivita sentinelové uzliny ex vivo by měla být desetinásobná oproti aktivitě pozadí. Následně je nutno zkontrolovat, zda není v oblasti další uzlina s vysokou aktivitou, pokud je, je nutno ji také odstranit. Obrázek: Vyhledávání sentinelové uzliny v axille radionavigací 198

199 Vyhledávání kombinací metod Jedná se o nejpoužívanější metodu, s nejvyšším procentem úspěšnosti a s nejnižší falešnou negativitou, a tedy v současnosti o jedinou, kterou lze doporučit k rutinnímu používání. Metoda je kombinací obou přístupů a tedy záleží na okolnostech, který převažuje. Vzhledem k tomu, že rychlejší a na preparaci méně náročná je metodika radionavigační, obvykle její přístup převažuje, pravidlem je však preparace takovým způsobem, který umožní vizualizaci a preparaci nabarveného lymfatika. Z čistě technického pohledu je výhodou i to, že odstraňovaná uzlina je obvykle zbarvená, a existuje tedy lepší vizuální kontrola. Patologické zpracování Standardní technika Barvivem označená, nativně (bez fixativa) dodaná lymfatická uzlina se zorientuje podle nejdelší osy a změří. Jde-li o lymfatickou uzlinu o maximální tloušťce cca 3 4 mm a délce do 15 mm, je fixována vcelku. Obrázek: Resekát melanomu a sentinelová uzlina Je-li uzlina objemnější, pak se v podélné ose rozdělí žiletkovým nožem řezem zastihujícím hilus obvykle na dvě stejné poloviny za účelem docílení optimální difúze fixačního roztoku, doporučovaná tloušťka řezu pro správnou difúzi fixativa za standardních podmínek by neměla přesáhnout 3 4 mm. Další zpracování sentinelové uzliny následuje po fixaci neutrálním formalínem v časovém odstupu cca hodin: uzlina se dělí v paralelně orientovaných řezech podél nejdelší osy, přičemž tloušťka jednotlivých řezů je v rozmezí 1 2 mm. Tyto řezy jsou pro zachování přesné orientace v lymfatické uzlině číslovány ve směru od jednoho okraje k druhému. 199

200 Nejčastěji se získají z jedné sentinelové lymfatické uzliny tímto způsobem 2 4 řezy pro další histologické zpracování. Jedná-li se o větší lymfatickou uzlinu, jejíž podélný rozměr přesahuje 15 mm, je rozčleněn každý paralelní řez příčně na dvě části (značené a, b). Celá lymfatická uzlina je bezezbytku kompletně zpracována včetně perinodální tukové tkáně. Po standardním zpracování v autotechnikonu jsou jednotlivé paralelní řezy zality do parafinových bloků. Z každého parafinového bloku se v první fázi hodnocení prohlížejí 3 standardní řezy, krájené v rozmezí mikrometrů, o síle řezu 2 4 mikrometry, v základním barvení hematoxylinem-eosinem. V případě negativního, nebo nejasného nálezu se provádí na dalším následném řezu v každém parafinovém bloku imunohistochemické barvení s protilátkou Melan A. Pouze v indikovaných případech nejasná reakce, agregáty névových buněk aj. se využívá dalších protilátek, zvl. HMB-45, eventuálně. S100P, Ki67. Je-li v lymfatické uzlině makroskopicky jednoznačně patrná metastáza, uzlina se zpracovává standardním způsobem podle její velikosti, obvykle 2 řezy, barvení hematoxylin-eosin. Obrázek: Metastáza v sentinelové uzlině Obrázek: Mikrometastázy v sentinelové uzlině 200

201 Za pozitivní nález se považuje detekce 1 a více morfologicky nebo imunohistochemicky korelujících buněk v sentinelové lymfatické uzlině. Stejně jako metodika vyhledávání, i metodika patologického zpracování se vyvíjí. Výše popsaný způsob je způsob, kterým byly vyšetřovány sentinelové uzliny do roku 2005, poté na základě revize materiálu u pacientů s falešnou negativitou byl způsob standardního vyšetřování sentinelových uzlin v našem ústavu od dále rozšířen o další vyšetřování v případě, že výše uvedený způsob nenalezne metastázu, doplňuje se kompletní prořezání všech bloků po 100 µm s řezem a barvením hematoxylinem eosinem z každého plátku a imunohistochemickým barvením Melan A a S100 z každého pátého řezu. Zavedení popsané metodiky výrazně snížilo falešnou negativitu, která je hodnocena průběžně, nicméně s odstupem několika let, k definitivnímu zhodnocení nutno vyčkat ještě minimálně 5let, nicméně předběžné výsledy naznačují, že by falešná negativita nyní neměla výrazně přesáhnout 5%. Nadstandardní a experimentální metody Metoda a koncept sentinelové uzliny znamená i poměrně velkou výzvu a příležitost pro výzkum v oblasti patologie a souvisejících oblastech zpracování tkání. Bez ohledu na samotnou techniku jsou téměř všechny metody zaměřeny na co nejpřesnější vyhledávání mikrometastáz. Relativně nejjednodušším postupem je extenzivnější vyšetření uzliny. Je prokázáno, že čím tenčí jsou plátky, na které je uzlina rozdělena, tím větší je pravděpodobnost záchytu mikrometastázy v podstatě je menší pravděpodobnost, že řez mikrometastázu může minout. Ke zvýšení pravděpodobnosti záchytu mikrometastázy klasickým postupem lze využít další zúžení extenzivně vyšetřované oblasti (určení jakési sentinelové oblasti v sentinelové uzlině). Každý, kdo se sentinelovými biopsiemi zabývá, zná velmi dobře situace, kdy je zbarven pouze jeden pól uzliny, eventuálně lze detekovat vyšší aktivitu v jedné oblasti větší uzliny, tyto oblasti jsou pochopitelně oblastí, kde lymfa ze spádové oblasti prvně vniká do uzliny, a zde je zcela v souladu s konceptem sentinelové uzliny vyšší pravděpodobnost záchytu metastáz. Určení oblasti pomocí vitálního barviva není vhodné, neboť se pohybuje 201

202 poměrně rychle a difusí proniká dále i během transportu na patologii. Podobný problém je s radionuklidem, i když zde existuje jistá možnost využít autoradiografie. Jedna z možností jak dále zpřesnit výsledky byla navržena Haighem, který doporučuje do běžného lymfatického barviva přidávat karbonové částice, které se vychytávají v lymfatické uzlině. V tomto případě pak patolog může doplnit další potvrzení o tom, že vyšetřovaná uzlina je skutečně sentinelovou. Tento postup není šířeji přijat, kromě jiného i pro problémy, které s sebou nese použití karbonových barviv. Další možností je využívání většího spektra imunohistochemických vyšetření, včetně možnosti in situ hybridizací. Kvalitativně jinou možností je vyšetření metodikou reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) na přítomnost mrna, charakteristické pro metastatický melanom. Nejčastěji je využívána mrna pro tyrosinázu, která se vyskytuje především v metastatickém melanomu, ale i v névocytech a Schwannových buňkách. Výhodou tohoto postupu je extrémně vysoká citlivost metody, klinické studie odpovídají tomu, že skutečně pacienti s RT- PCR positivní sentinelovou uzlinou mají vyšší pravděpodobnost relapsu, nevýhodou je to, že část uzliny, využitá pro toto vyšetření nemůže být vyšetřena histologicky, a tedy neexistuje morfologický korelát. Další nevýhodou je to, že pozitivní reakci mohou vykazovat i fragmenty buněk, které nemají metastatický potenciál a pochopitelně i nenádorové buňky, které mají přítomnu tuto molekulu, konkrétně u tyrosinázy naevové buňky, které jsou v uzlinách nezřídka přítomny (a dokonce mohou někdy být místem vzniku melanomu přímo v uzlině). Hodnocení výsledků a klinický dopad Stav sentinelové uzliny určuje s vysokou přesností stav regionálních lymfatických uzlin a je schopna zachytit uzlinové regionální metastázy s nejvyšší přesností. Vyšší přesnost detekce regionálních metastáz má pochopitelně vliv i na celkové zpřesnění stagingu a prognózy pacienta. V této souvislosti je nutno zdůraznit, že ačkoliv je stav regionálních uzlin jedním z nejdůležitějších prognostických faktorů, není jediným, a tedy negativní nález v sentinelové uzlině neznamená automaticky dobrou prognózu, a není schopen vyloučit haematogenní metastazování. Pozitivita sentinelové uzliny, bez ohledu na samotnou velikost metastázy (jakkoliv může být zajímavá) je vždy indikací ke kompletní dissekci (lymfadenektomii) příslušné lymfatické oblasti. Je třeba zdůraznit, že právě pacienti, u nichž je sentinelovou biopsií odhalena klinicky latentní metastáza, a tedy podstoupí dissekci, z metody sentinelové biopsie nejvíce profitují. Potřebnost dissekce postižené lymfatické oblasti v případě pozitivní sentinelové uzliny nebyla kontrolována randomizovanou studií, nicméně přímo vyplývá z dříve proběhlých randomizovaných studií s elektivní dissekcí. Tyto studie nikdy přesvědčivě neprokázaly přínos elektivní dissekce při přítomnosti klinicky nedetekabilních metastáz. Některé studie však prokázaly jasný přínos jak v době přežití, tak v bezpříznakovém období, u pacientů s latentními uzlinovými metastázami ve srovnání s pacienty, kteří dissekci podstoupili až při klinické manifestaci uzlinových metastáz. Pozitivita sentinelové uzliny dále znamená posun (upstaging) v klasifikaci nádoru a tedy je významným faktorem při indikaci adjuvantní systémové terapie. Jako každý pokrok, přinesl i některé nové otázky jednou z nich je třeba to, kdy lze shluk nádorových buněk již skutečně pokládat za metastázu. Tyto změny se kromě jiného odrazily i v TNM klasifikaci, která s diagnostikou sentinelových uzlin již přímo počítá. Technika a vyšetřování sentinelových uzlin vyžaduje odpovídající vybavení i zkušenost. Z toho vyplývá nutnost jisté centralizace. Pacient s důvodným podezřením na melanom by měl být vždy odeslán na specializované pracoviště, které nabízí i 202

203 sentinelové biopsie. Velká část melanomů je však diagnostikována až histologicky po odstranění nesuponované pigmentové morfy. Zde je důrazným doporučením tyto morfy zásadně neodstraňovat s velkým bezpečnostním lemem a především při potvrzení melanomu, a to i v případě nekompletní exscize, nedoresekovávat, ale odeslat na specializované pracoviště. Pacienti Metoda sentinelové biopsie u maligního melanomu byla zavedena v roce 1994, do začátku roku 2013 bylo operováno 2088 pacientů. Rok Počet pac. Nalezeno Úspěšnost ,3% ,2% ,9% ,2% ,7% ,2% ,7% ,3% ,7% % % % ,3% ,4% ,7% ,7% ,7% ,4% ,7% % Celkem ,2% Publikace v roce 2015 Chirurgické postupy v léčbě maligního melanomu. Fait V, Chrenko V, Šimůnek R. In. Sborník XXII. Jihočeské onkologické dny, Český Krumlov, Číslo abstraktu: 05. Opuštění regionální lymfadenektomie u melanomu při pozitivní sentinelové uzlině? Fait V. In Sborník XXXIX. Brněnské onkologické dny a XXIX. Konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky, Brno, Číslo abstraktu: XIV/ 50 Plán pro rok 2016 Zpracování souboru, příprava publikace 203

204 TÝM PRO NÁDORY PLIC A PLEURY Vedoucí týmu: MUDr. Helena Čoupková Vedoucí chirurgického programu týmu: doc. MUDr. Václav Jedlička, Ph.D. Vedoucí onkologického programu týmu: MUDr. Helena Čoupková Vedoucí radioterapeutického programu týmu: MUDr. Marek Slávik Vedoucí výzkumného programu týmu: MUDr. Stanislav Špelda Kompletní seznam členů týmu v roce 2015 je dostupný na internetových stránkách MOÚ: SEZNAM PROJEKTŮ ŘEŠENÝCH V ROCE 2015 Jednoleté projekty: 0 Víceleté projekty: 1 Projekty financované výhradně z IPO 1. Vliv užítí PET/CT vyšetření při plánování radioterapie na TCP a NTCP Projekty spolufinancované z IPO (prostředky IPO pokrývají výdaje na nové a dodatečné experimenty nebo slouží k financování výzkumných pracovníků zapojených do řešení projektu) VLIV UŽÍTÍ PET/CT VYŠETŘENÍ PŘI PLÁNOVÁNÍ RADIOTERAPIE NA TCP A NTCP Hlavní řešitel projektu: prof. MUDr. Pavel Šlampa, CSc. Anotace PET/CT vyšetření mění zjištěný rozsah onemocnění u různých malignit (nejvíce u NSCLC, nádory hlavy a krku) ve srovnání s prostým CT vyšetřením. Z toho plynou i změny v plánování radioterapie. Literárně vede znalost rozsahu onemocnění dle PET/CT spíše ke zmenšení cílových objemů, tedy i k možnosti eskalace dávky v tumoru a rizikových oblastech a eventuelní šetření zdravých tkání. Nejen že má vliv na velikost cílových objemů, vede rovněž někdy ke změně vlastního přístupu k léčbě, tedy mění strategii léčby. Cíl projektu Srovnání plánování radioterapie za pomoci prostého CT vyšetření a hybridního PET/CT vyšetření u nemalobuněčných plicních karcinomů a nádorů hlavy a krku. U těchto diagnóz je alespoň literárně trend k selektivnímu ozařování mediastinálních, resp. krčních uzlin, či 204

205 dokonce používání involved field techniky. Dále by bylo vhodné zařadit do souboru i nemocné s limited disease SCLC, karcinomem jícnu, maligními lymfomy, karcinomy rekta a cervixu. Srovnávanými veličinami by mohli být následující: strategie léčby (kurativní vs. paliativní), objem GTV, CTV, velikost portálového pole, DVH kritických struktur (V20, V30 plicní tkáně). Bylo-li by to možné, mohly by se porovnat i hodnoty NTCP a TCP (bude-li k dispozici program pro matematické radiobiologické modelování). V průběhu follow-up by se sledovaly akutní a chronické nežádoucí projevy postradiační toxicity a korelovaly by se s hodnotou NTCP. Metodika Budou vytvořeny 2 srovnávací plány vzniklé z jednoho fúzního PET/CT vyšetření v ozařovacích podmínkách nejdříve jeden pouze na základě CT dat a druhý již se znalostí nálezu z PET komponenty. Na základě těchto plánů by byly spočítány výše uvedené sledované charakteristiky a porovnány. Follow-up by probíhal v pravidelných intervalech s hodnocením léčebné odpovědi a postradiační toxicity. Stav řešení v roce 2015 Probíhá zařazování pacientů a průběžná tvorba duplicitních plánů a hodnocení parametrů aplikace a toxicity léčby. Publikace v roce 2015 Burkoň P., Kazda T., Slávik M.: Efekt akcelerované radioterapie u plicního adenokarcinomu. Klin Onkol. 2015;28(1):63-4 Burkoň P, Slávik M, Kazda T, Procházka T, Vrzal M. Možnosti stereotaktické radioterapie v léčbě metastáz efektivita a indikace z pohledu radiačního onkologa. In Sborník XXXIX. Brněnské onkologické dny a XXIX. Konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky, Brno Číslo abstraktu: VI/ 362. Plán pro rok 2016 Zařazování pacientů a průběžná analýza výsledků. 205

206 TÝM PRO NÁDORY SKELETU A MĚKKÝCH TKÁNÍ Vedoucí týmu: MUDr. Dagmar Adámková Krákorová, Ph.D. Vedoucí chirurgického programu týmu (nádory skeletu): doc. MUDr. Pavel Janíček, CSc. Vedoucí chirurgického programu týmu (nádory měkkých tkání): MUDr. Radim Šimůnek Vedoucí onkologického programu týmu: MUDr. Dagmar Adámková Krákorová, Ph.D. Vedoucí radioterapeutického programu týmu: prof. MUDr. Pavel Šlampa,CSc. Vedoucí výzkumného programu týmu: Mgr. Jitka Berkovcová, Ph.D. Kompletní seznam členů týmu v roce 2015 je dostupný na internetových stránkách MOÚ: SEZNAM PROJEKTŮ ŘEŠENÝCH V ROCE 2015 Jednoleté projekty: 0 Víceleté projekty: 1 Projekty financované výhradně z IPO 1. Prognostické faktory konvenčního osteosarkomu dospělých pacientů Projekty spolufinancované z IPO (prostředky IPO pokrývají výdaje na nové a dodatečné experimenty nebo slouží k financování výzkumných pracovníků zapojených do řešení projektu) PROGNOSTICKÉ FAKTORY KONVENČNÍHO OSTEOSARKOMU DOSPĚLÝCH PACIENTŮ Hlavní řešitel: MUDr. Dagmar Adámková Krákorová, Ph.D. Anotace Osteosarkom je nejčastější primární maligní kostní nádor (viz obrázek níže). Představuje pouhé 0,2 % ze všech zhoubných nádorů. Incidence se pohybuje kolem 3 případů na 1 milion obyvatel za rok. Obecně se osteosarkomy dělí na nízce a vysoce maligní. U nízce maligních je metodou volby radikální chirurgický výkon bez nutnosti adjuvantní onkologické léčby. Prognóza je příznivá s 5letým přežitím kolem 90 %. Vysoce maligní, konvenční, high--grade osteosarkomy jsou velmi agresivním systémovým onemocněním. Charakteristická je bimodální věková distribuce, první vrchol křivky nastává ve druhé dekádě života, druhý, nižší, po 60. roce života. Současná léčebná strategie spočívá v podání předoperační a/nebo pooperační chemoterapie a chirurgické resekci všech operabilních lézí. Cíle projektu Cílem analýzy bylo zhodnocení dlouhodobého přežití ve vztahu k prognostickým faktorům u dospělých pacientů léčených pro konvenční osteosarkom. Metody Byla vyhodnocena klinická data 36 pacientů dospělého věku (rozmezí let, průměr 37,5 roku, medián 28,5 roku), kteří byli nově diagnostikováni cestou mezioborového týmu a léčeni 206

207 pro konvenční osteosarkom končetin či trupu v letech v Brně. 45 % pacientů bylo starších 30 let, 36 % starších 40 let. 31 % pacientů mělo vzdálené metastázy v době stanovení diagnózy. Analýza se týkala demografických dat, lokalizace, velikosti, rozsahu onemocnění, byl hodnocen histopatologický efekt chemoterapie, rozsah chirurgického řešení, hladina alkalické fosfatázy (ALP) a laktátdehydrogenázy (LD) v séru, index proliferační aktivity Ki 67 a další možné prognostické faktory ve vztahu k léčebné odpovědi, přežití (OS) a přežití bez známek onemocnění (EFS). Stav řešení v roce 2014 Výsledky projektu byly publikovány v letech 2012 a T.č. probíhá sledování pacientů původní 36 členné kohorty a aktualizace dat. Plán pro rok 2015 Probíhá klinické sledování pacientů za účelem pozdější publikace aktualizovaných výsledků- Plán týmu pro rok : 1. Zpracování výsledků léčby konv. osteosarkomu dospělých od r Zpracování souboru pacientů s ES/PNET dospělého věku léčených od roku 2002 dle společných/pediatrických léčebných protokolů (ve spolupráci s s FN Motol) 207

208 TÝM PRO ENDOKRINNÍ NÁDORY, NÁDORY NEZNÁMÉHO PŮVODU A JINÉ VZÁCNÉ SOLIDNÍ MALIGNITY Vedoucí týmu: MUDr. Jiří Tomášek, Ph.D. Vedoucí diagnostického programu: MUDr. Jana Stupalová Vedoucí onkologického programu týmu: MUDr. Jiří Tomášek, Ph.D. Vedoucí radioterapeutického programu týmu: MUDr. Renata Červená Vedoucí endoskopického programu: MUDr. Milana Šachlová, Ph.D. et CSc. Vedoucí výzkumného programu týmu: doc. RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D. Kompletní seznam členů týmu v roce 2015 je dostupný na internetových stránkách MOÚ: SEZNAM PROJEKTŮ ŘEŠENÝCH V ROCE v roce 2015 nebyl v rámci týmu řešený žádný výzkumný projekt Publikace v roce 2015 MOŽNOSTI MOLEKULÁRNÍ GENETIKY V URČENÍ PRAVDĚPODOBNÉHO MÍSTA PŮVODU NÁDORU. Svoboda Marek; Slabý Ondřej. In: Sborník XXXIX. Brněnské onkologické dny a XXIX. Konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky, Brno Číslo abstraktu: V/ 71. NÁDORY NEZNÁMÉHO ORIGA DEFINICE A EPIDEMIOLOGIE. Svoboda Marek; Navrátil Jiří; Halámková Jana. In: Sborník: XXXIX. Brněnské onkologické dny a XXIX. Konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky, Brno Číslo abstraktu: XXVII/ 67 SYSTÉMOVÁ LÉČBA NÁDORŮ NEZNÁMÉHO ORIGA. Halámková Jana; Tuček Štěpán; Kiss Igor; Svoboda Marek. In: XXXIX. Brněnské onkologické dny a XXIX. Konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky, Brno Číslo abstraktu: XXVII/

209 TÝM PRO PREVENCI NÁDORŮ A PÉČI O OSOBY SE ZVÝŠENÝM RIZIKEM VZNIKU NÁDORŮ Vedoucí týmu: MUDr. Katarína Petráková, Ph.D. Vedoucí programu dispenzární péče: MUDr. Markéta Palácová Vedoucí genetického programu: doc. MUDr. Lenka Foretová, Ph.D. Vedoucí chirurgického programu: doc. MUDr. Oldřich Coufal, Ph.D. Vedoucí programu screeningu karcinomu prsu: MUDr. Helena Bartoňková Vedoucí programu screeningu kolorektálního karcinomu: MUDr. M. Šachlová, CSc. et Ph.D. Vedoucí programu screeningu karcinomu hrdla děložního: MUDr. Lucie Mouková, Ph.D. Vedoucí programu pro zdravou výživu: Mgr. Veronika Březková Vedoucí programu pro odvykání kouření: Ing. Iva Hrnčiříková Vedoucí programu komunikace s veřejností: PhDr. Zuzana Joukalová Kompletní seznam členů týmu v roce 2015 je dostupný na internetových stránkách MOÚ: SEZNAM PROJEKTŮ ŘEŠENÝCH V ROCE 2015 Jednoleté projekty: 0 Víceleté projekty: 4 Projekty financované výhradně z IPO 1. Výzkum etiologie hereditárních nádorových onemocnění pomocí sekvenování nové generace (NGS) s využitím panelů rizikových genů Projekty spolufinancované z IPO (prostředky IPO pokrývají výdaje na nové a dodatečné experimenty nebo slouží k financování výzkumných pracovníků zapojených do řešení projektu) 2. Hereditární nádorová onemocnění a) Mezinárodní výzkumné projekty b) Dílčí genetická vyšetření 3. Cílený screening kolorektálního karcinomu u diabetiků 2. typu a osob s vysokým kardiovaskulárním rizikem: multicentrická prospektivní studie 4. Vytvoření diagnostické sady cirkulujících mikrorna pro neinvazivní časnou diagnostiku a sledování pacientů s kolorektálním karcinomem 209

210 1. VÝZKUM ETIOLOGIE HEREDITÁRNÍCH NÁDOROVÝCH ONEMOCNĚNÍ POMOCÍ SEKVENOVÁNÍ NOVÉ GENERACE (NGS) S VYUŽITÍM PANELŮ RIZIKOVÝCH GENŮ Hlavní řešitel: RNDr. Eva Macháčková, Ph.D., doc. MUDr. Lenka Foretová, Ph.D., Mgr. Jana Házová Anotace projektu V současné době bylo popsáno již více než 200 nádorových syndromů. Ve většině populací jsou však dostupné pouze informace o mutačním spektru ve vysoce rizikových genech limitované počtem vyšetřených jedinců. Pokroky v sekvenační technologii tzv. sekvenování nové generace (next--generation sequencing NGS) umožnily masivní testování sekvence desítek až stovek genů současně, což umožňuje testování známých i potenciálně rizikových genů, které jsou součástí signálních a reparačních drah významných pro nádorovou predispozici. Výrazné rozšíření spektra analyzovaných genů vede nejen k identifi kaci kauzálních mutací ve vysoce rizikových genech, ale také k detekci. celé řady mutací s dosud nedeterminovanou mírou rizika nebo k detekci středně rizikových variant, které ovšem mohou ve vzájemných kombinacích výrazně navyšovat relativní riziko nádorové predispozice v postižených rodinách. V současné době jsou nabízeny k vyšetření různé multigenové komerční panely cílené na predikci rizika ke vzniku nádorového onemocnění. K těm rozsáhlejším patří TruSight Cancer Target Genes panel (Illumina), který je jedním z nejčastěji používaných komerčních panelů v laboratořích západní Evropy. Cíle projektu Zavedení a využití sekvenování nové generace v diagnostické laboratoři OEGN. Optimalizace postupů pro NGS technologie (sekvenování nové generace) a jejich zavedení do diagnostické praxe. Rozšíření spektra analyzovaných genů, které způsobují predispozici k nádorovému onemocnění. Metodika Vzorky genomické DNA získané z periferní krve, od pacientů s vysoce rizikovou osobní a rodinnou onkologickou anamnézou bez detekované mutace v genech BRCA, TP53, CDKN2A, nebo HNPCC genech a kteří souhlasili s vyšetřením DNA za účelem identifikace mutace v genech způsobujících predispozici k nádorovému onemocnění. Sekvenování nové generace (NGS Next-Generation Sequencing). Byly testovány 2 alternativní postupy na NGS platformě MiSeq (Illumina). 1) Vyšetření pomocí komerčně dostupného TruSight Cancer Target Genes panelu (Illumina), jehož principem je tagmentace genomické DNA a enrichment/hybridizační postup, kdy jsou získány sekvence 94 genů (tumor supresorové geny, geny reparačních mechanizmů) 2) Vyšetření pomocí SeqCap EZ Choice (NimbleGen, Roche) postupu, jehož principem je sonikace genomické DNA a enrichment/hybridizační postup.seqcap EZ Choice protokol umožňuje zákaznický výběr z 578 nádorově predispozičních genů, kde jsme zvolili panel 54 genů významných pro klinicky podchytitelné nádorové syndromy. 3) Bioinformatická analýza dat, ověření klinicky významných výsledků pomocí Sangerova sekvenování a biologická interpretace Stav řešení v roce 2015 Bylo provedeno vyšetření pomocí TruSight Cancer Target Genes panelu u 50 vzorků genomické DNA získané z periferní krve a u 1 vzorku DNA izolovaného z parafínového 210

211 bloku z nenádorové uzliny. NGS vyšetření odhalilo prokazatelně patogenní mutace v genech BAP1, ATM, ERCC2, PALB2, RAD51C, BRIP1, MUTYH, FANCA, FANCI, SDHB, PMS2 a řada variant v dalších genech s predikovaným patogenním efektem, kde v současné době chybí potvrzení/vyloučení klinické významnosti. V řadě případů se jedná o kombinace několika nálezů s různou mírou rizika. Z hlediska diagnostického vyšetření je nevýhodou TruSight Cancer Target Genes panelu poměrně nerovnoměrné pokrytí v rámci sekvenovaných úseků, kde v rámci jednoho pacienta a jednoho genu mohou být sekvence některých oblastí genu zastoupeny více než s 1000x zatímco v jiných se mohou vyskytnout až výpadky sekvenovaných úseků. Bylo provedeno vyšetření 10 vzorků DNA pomocí SeqCap EZ Choice (NimbleGen, Roche) postupu, které byly vyšetřeny také na TruSight Cancer panelu. U postupu byla SeqCap EZ Choice byla zaznamenána vyšší uniformita pokrytí cílových sekvencí. U těchto vzorků byly zachyceny další pravděpodobně rizikové missense varianty v genech BARD1, MRE11 a POLD1, které nejsou součástí vyšetření u TruSight Cancer Target Genes panelu. Publikace v roce 2015 Macháčková E., Házová J., Sťahlová Hrabincová E., Vašíčková P., Navrátilová M., Svoboda M., Foretová L. Retrospektivní NGS studie u vysoce rizikových pacientů s hereditární predispozicí k nádorovému onemocnění Masarykově onkologickém ústavu. Klin Onkol 2016; 29(Suppl 1): S35-S45. E. Machackova, J. Hazova, P. Vasickova, E. Stahlova Hrabincova, M. Navratilova, M. Svoboda, L. Foretova. Pilot study with TruSight Cancer genes panel in high risk patients at MMCI - Czech Republic. ESHG 2015, Glasgow, Scotland, 6-9 června 2015: European Journal of Human Genetics 2015; 23 (Suppl 1): 265. Macháčková E., Házová J., Vašíčková P., Sťahlová Hrabincová E., Svoboda M., Foretová L. Retrospektivní NGS studie u vysoce rizikových pacientů s hereditární predispozicí k nádorovému onemocnění v MOÚ. Celostátní sjezd Společnosti lékařské genetiky ČLS JEP: Týden lékařské genetiky v Brně září 2015; Sborník abstraktů: 175. VYŠETŘENÍ HEREDITÁRNÍ PREDISPOZICE K NÁDOROVÉMU ONEMOCNĚNÍ POMOCÍ NGS TECHNOLOGIE. Macháčková Eva; Házová Jana; Vašíčková Petra; Sťahlová Hrabincová Eva; Navrátilová Marie; Svoboda Marek; Foretová Lenka. In: Sborník XXXIX. Brněnské onkologické dny a XXIX. Konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky, Brno Číslo abstraktu: XII/ 370. NOVÉ METODY TESTOVÁNÍ A NOVÉ GENY U HEREDITÁRNÍCH NÁDOROVÝCH SYNDROMŮ. Foretová Lenka; Házová Jana; Vašíčková Petra; Sťahlová Hrabincová Eva; Navrátilová Marie; Svoboda Marek; Macháčková Eva. In: Sbornik XXXIX. Brněnské onkologické dny a XXIX. Konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky, Brno 2015, Číslo abstraktu: XII/ 369. Plán pro rok 2016 Pokračování ve vyšetřování mutací v 94 genech u rizikových jedinců se závažnou osobní i rodinnou anamnézou onkologického onemocnění bez detekované kauzální mutace v genech BRCA1, BRCA2, MLH1, MSH2, MSH6, TP53 nebo APC dle indikace. Publikování výsledků. 211

212 Ve spoluprácí s klinickými lékaři volba optimálních panelů vyšetřovaných genů na základě diagnózy nebo skupiny diagnóz. Nastavení léčebných a preventivních programů pro nosiče klinicky rizikových mutací. Příprava na zavedení testovacího panelu CZECANCA CZech CAncer panel for Clinical Application do klinické praxe. 2. HEREDITÁRNÍ NÁDOROVÁ ONEMOCNĚNÍ Hlavní řešitel: doc. MUDr. Lenka Foretová, Ph.D. Laboratoř OEGN je dlouhodobě podporována z institucionálních prostředků určených pro výzkum, ať již se v minulosti jednalo finance z výzkumných záměrů nebo v současnosti o prostředky institucionální podpory. Laboratoř se zaměřuje genomové mutační analýzy. Výsledky slouží i pro mezinárodní projekty. a) Mezinárodní výzkumné projekty I. Genomics of kidney cancer / Pooled genome-wide analysis of kidney cancer risk KIDRISK Anotace projektu Mezinárodní studie genetické epidemiologie nádorů ledvin. Cíle projektu Identifikace genů, které zvyšují riziko nádorů ledvin v populaci pomocí GWS a NGS Zjištění asociace mezi geny souvisejícími s nádory ledvin a rizikovými faktory životního stylu a prostředí Zjištění funkční důležitosti genetických variant pomocí studií nádorové tkáně Stanovení prediktorů špatné prognózy a přežití Metodika Nově diagnostikovaní pacienti s nádorem ledvin, podrobné dotazníkové a klinické údaje, follow-up data, kolekce vzorků krve, tkáně. Izolace DNA, použití GWS a NGS při hledání rizikových faktorů nádorů ledvin v genomické DNA. Stav řešení / výsledky řešení v roce 2015: K dispozici je kolekce celkem 150 pacientů a kontrol a k nim patřičná klinická, epidemiologická a laboratorní data. Plán pro rok 2016 Analýza dat a publikační výstupy. Další pokračování studie s názvem Pooled genome-wide analysis of kidney cancer risk (KIDRISK). Kolekce pacientů, dat, vzorků, použití NGS u vybraných pacientů. II) International BRCA1/2 Carrier Cohort (IBCCS) Study Anotace projektu 212

213 Mezinárodní studie nosičů BRCA mutací BRCA1/2-dlouhodobý follow-up. Cíle projektu Přesněji stanovit věk, pohlaví a specifická nádorová rizika ve vztahu k mutaci Stanovit význam známých reproduktivních rizikových faktorů při určení rizik Zkoumat efektivnost profylaktických operací a dalších screeningově/preventivních možností u vysoce rizikových nosiček Vytvořit databázi nosičů pro další možné použití ve studiích v budoucnu Stav řešení / výsledky řešení v roce 2015 V současnosti máme k dispozici: každoročně je zařazeno kolem nově diagnostikovaných nosiček BRCA1/2 mutace, follow-up data se sbírají u téměř 400 nosiček. Plán pro rok 2016 Pokračování ve follow-up již sledovaných, využití dat a vzorků pro molekulárně genetické analýzy a epidemiologické studie. Publikace. III) ENIGMA Consortium Anotace projektu Mezinárodní iniciativa zaměřená na stanovení výše rizika a klinické významnosti u vzácných sekvenčních variant (UV) nejasného významu v genech BRCA1 a BRCA2 detekovaných u pacientek s dědičnou predispozicí ke vzniku nádoru prsu a/nebo ovaria Cíle projektu Evaluace významnosti vzácných sekvenčních variant v genech BRCA1 a BRCA2 detekovaných u rizikových osob na základě multifaktoriální analýzy zahrnující: Ko-segregace variant s onemocněním v rizikových rodinách Funkční testy Analýzy aberantních forem sestřihu Predikce významnosti na základě proteinových modelů Histopatologická data a LOH (ztráta heterozygosity v nádorech) Pravděpodobnostní model na základě klinických dat z rodinné a osobní anamnézy Stav řešení / výsledky řešení v roce 2015 K dispozici máme klinická data u rodin s detekovanými variantami nejasného významu, segregační analýzy a data pro centrální databázi Enigma. V rámci spolupráce OEGN s IHOK FN Brno došlo k testování možných nestřihových variant a ověření patogenicity mutačních změn. Plán pro rok 2016 Sběr klinických a histopatologických dat, segregační analýzy, analýza aberantních forem sestřihu u variant vybraných na základě predikce. Publikace. b) Genetická vyšetření v laboratoři OEGN zavedená s podporou prostředků pro Rozvoj výzkumné organizace. 213

214 V rámci výzkumného projektu byla v OEGN laboratoři zavedena metoda genetické diagnostiky nádorových syndromů metodou sekvenování nové generace (NGS Next- Generation Sequencing), kdy byly testovány 2 alternativní postupy na NGS platformě MiSeq (Illumina): 1) Vyšetření pomocí komerčně dostupného TruSight Cancer Target Genes panelu (Illumina), jehož principem je tagmentace genomické DNA a enrichment/hybridizační postup, kdy jsou získány sekvence 94 predispozičních genů. 2) Vyšetření pomocí SeqCap EZ Choice (NimbleGen, Roche), jehož principem je sonikace genomické DNA a enrichment/hybridizační postup. Při počátečním rozvržení experimentu je v tomto případě možná zákaznická volba cílových sekvencí vyšetřovaných genů, kde jsme navolili panel vyšetření 54 genů významných pro klinicky podchytitelné nádorové syndromy. Díky sekvenování nikoliv individuálních genů, ale spektra mnoha různých genů, se rozšiřují možnosti zachycení většího počtu možných etiologických příčin dědičných nádorových onemocnění. Výsledky a zkušenosti byly prezentovány na tuzemských i zahraničních konferencích. I) Hereditární nepolypózní kolorektální karcinom (HNPCC, Lynchův syndrom) HNPCC je nejčastější formou dědičného kolorektálního karcinomu. HNPCC je syndrom s autozomálně dominantní dědičností, jehož příčinou jsou mutace v některém z mismatch reparačních (MMR) genů, neboli genů kódujících proteiny opravující chybné párování bazí. Odhad incidence v západní populaci je 1:1000 1:2000 a penetrance dosahuje 75%. Nejčastější příčinou HNPCC syndromu jsou mutace v genu MLH1 (lokus 3p22) nebo MSH2 (lokus 2p21), méně často v genu MSH6 (lokus 2p16). V letech byly optimalizovány a validovány podmínky pro vyšetření genů MLH1, MSH2 a MSH6 a vyšetření bylo v roce 2007 nabídnuto klinickým lékařům k diagnostickým účelům. V roce 2011 bylo vyšetření akreditováno dle ČSN EN ISO 15189:2007 jako SOP-2: Hereditární nepolypózní kolorektální karcinom (HNPCC, Lynchův syndrom): mutační analýza genů MLH1, MSH2, MSH6 metodou HRM, sekvenováním a MLPA II) Li-Fraumeni syndrom Li-Fraumeni je jedním z nejzávažnějších nádorových syndromů s autozomálně dominantní dědičností. Jedná se o vzácné onemocnění, ale s velmi agresivním projevem. Příčinou je u většiny případů mutace v genu TP53 (lokus 17p13.1), které relativně často vznikají de novo. Typickým fenotypovým projevem syndromu jsou tyto malignity: sarkomy měkkých tkání, osteosarkom, karcinomy prsu, mozkové nádory, adrenokortikální karcinomy v dětském věku, rhabdomyosarkomy a leukémie. V roce 2007 byly optimalizovány a validovány podmínky pro vyšetření genu TP53 a vyšetření bylo v roce 2008 nabídnuto klinickým lékařům k diagnostickým účelům. V roce 2011 bylo vyšetření akreditováno dle ČSN EN ISO 15189:2007 jako SOP-3: Hereditární syndrom Li-Fraumeni: mutační analýza genu TP53 metodou přímého sekvenování a MLPA. III) Hereditární syndrom maligního melanomu Populační celoživotní riziko pro onemocnění zhoubným melanomem se v ČR pohybuje kolem 1-1,5% a z toho jen asi 10% případů vykazuje familiární zátěž. V souvislosti s autozomálně dominantní dědičností maligního melanomu byly popsány zárodečné mutace v genu 214

215 CDKN2A (cyklin-dependent kinase inhibitor 2A). Gen CDKN2A (lokus 9p21) je exprimován ve formě několika alternativních transkripčních variant. Z hlediska nádorové predispozice jsou nejvýznamnější produkty genu CDKN2A exprimované ve všech tkáních, které se účastní kontroly průběhu buněčného cyklu ve fázi G1: protein p16/ink4a - inhibitor cyklin dependentní kinázy CDK4 a CDK6 protein p14/arf který interakcí s MDM1 brání degradaci p53 proteinu. V roce 2006 byla provedena optimalizace a validace vyšetření kompletní kódující sekvence CDKN2A genu pro obě varianty p16/ink4a a p14/arf a vyšetření bylo nabídnuto klinickým lékařům k diagnostickým účelům. V roce 2011 bylo vyšetření akreditováno dle ČSN EN ISO 15189:2007 jako SOP-4: Hereditární syndrom familiárního melanomu: mutační analýza genu CDKN2A metodou přímého sekvenování a MLPA IV) Hereditární syndrom difúzního karcinomu žaludku Vzácný autozomálně dominantní nádorový syndrom s časným výskytem difúzního nádoru žaludku s kumulativním rizikem až 83% do věku 80 let. Dochází k infiltraci stěny žaludku nádorovými buňkami a typická je přítomnost tzv. buněk pečetního prstenu. Zvýšené riziko je zároveň pro vznik kolorektálního karcinomu a lobulárního karcinomu prsu. Příčinou dědičné formy hereditárního karcinomu žaludku jsou zárodečné mutace v genu CDH1 (lokus 16q22), který kóduje protein E-cadherin. E-cadherin je transmembránový glykoprotein (adhezivní protein), který je součástí cytoskeletonu a má významnou úlohu v kontaktní inhibici proliferace, zároveň se podílí na řízení diferenciace epiteliálních tkání. V roce 2008 byla provedena optimalizace a validace vyšetření genu CDH-1 a vyšetření bylo nabídnuto klinickým lékařům k diagnostickým účelům. V roce 2011 bylo vyšetření akreditováno dle ČSN EN ISO 15189:2007 jako SOP-5: Hereditární syndrom difúzního karcinomu žaludku: mutační analýza genu CDH1 (E-cadherin) metodou přímého sekvenování a MLPA. V) Vyšetření genu CHEK2 Produkt genu CHEK2 (alternativně CHK2, homolog Cds1 a RAD53) je významnou protein kinázou, která se podílí na regulaci buněčného cyklu. Při poškození DNA je CHEK2 protein kináza významná pro aktivaci celé řady proteinů (mimo jiné také p53, BRCA1), které se podílejí na řízení DNA reparace a apoptózy. V současné době jsou některé mutace v CHEK2 genu popisovány jako nízko-středně penetrantní alely způsobující genetickou predispozici ke vzniku nádoru prsu. Některé studie popisují zvýšenou predispozici ke vzniku nádoru prostaty, plic, ovaria, mozkových nádorů a osteosarkomů. V roce 2005 byla provedena optimalizace a validace vyšetření 2 rizikových mutací v genu CHEK (delece 2 exonů v centrální části genu a mutace c.1100delc); v roce 2008 byly zařazeny další 2 mutace jejichž výskyt byl zachycen v české populaci (sestřihová mutace c.444+1g>a a missense mutace p.ile157thr). Vyšetření bylo nabídnuto klinickým lékařům k diagnostickým účelům. V roce 2011 bylo vyšetření akreditováno dle ČSN EN ISO 15189:2007 jako SOP-6: Multiorgánová nádorová predispozice: vyšetření populačně nejčastějších mutací v genu CHEK2 metodou HRM, PCR a sekvenováním. VI) Molekulárně genetické potvrzení Gilbertova syndromu Jako Gilbertův syndrom je označována benigní forma nekonjugované hyperbilirubinemie. Homozygotní genotyp: (TA)7/(TA)7 v TATA boxu UGT1A1 genu (označován také jako polymorfismus UGT1A1*28) je nejčastější příčinou Gilbertova syndromu v bělošské populaci - až u 90% jedinců s klinickými příznaky Gilbertova syndromu. U jedinců s homozygotním genotypem (TA)7/(TA) 7 dosahuje hladina jaterní UDP-glucorunosyltransferázové aktivity 215

216 pouze cca 30% normálních hodnot. Snížená exprese UGT1A1 genu může způsobit komplikace u metabolizace některých léčiv (především irinotecanu) podávaných onkologickým pacientům. Chemoterapie irinotecanem bývá u jedinců s Gilbertovým syndromem doprovázena gastrointestinální toxicitou a toxicitou na kostní dřeň, způsobenou aktivním metabolitem irinotecanu: SN-38 (7-ethyl-10-hydroxycamptothecin). V roce 2011 bylo vyšetření inzerce di-nukleotidu TA v oblasti TATA boxu genu UGT1A1 nabízeno klinickým lékařům k diagnostickým účelům. VII) Analýza aktivačních mutací v hot spot oblastech genů KIT a PDGFRA v nádorové tkáni u gastrointestinálních stromálních nádorů (GIST) Geny c-kit a PDGFRA kódují příbuzné proteiny z rodiny tyrozin kinázových receptorů, které v mutované formě mají výrazně onkogenní efekt. Aktivační mutace se nejčastěji se vyskytují v juxtamembránové doméně (exon 11 genu KIT; exon 12 genu PDGFRA) a vedou k ligand-independetní aktivaci tyrozinkinázy. Mutace v genech KIT a PDGFRA výrazně ovlivňují odpověď GIST pacientů na léčiva typu tyrozin kinázových inhibitorů (např.gleevec). Mutační analýza KIT a PDGFRA má význam pro aplikaci cílené terapie a predikci odpovědi GIST na léčbu imatinibem. V roce 2010 byla v OEGN-laboratoři provedena optimalizace a validace vyšetřovacích postupů pro analýzu hot spot oblastí genů KIT (exony 9, 11, 13, 17) a v genu PDGFRA (exony 10, 12, 14, 18) a vyšetření bylo nabídnuto klinickým lékařům k diagnostickým účelům. V roce 2011 bylo vyšetření akreditováno dle ČSN EN ISO 15189:2007 jako SOP-7: Gastrointestinální stromální nádory: vyšetření somatických mutací v genech KIT a PDGFRA metodou přímého sekvenování. V současnosti je vyšetření realizováno na Oddělení onkologické patologie MOÚ. 216

217 2. CÍLENÝ SCREENING KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU U DIABETIKŮ 2. TYPU A OSOB S VYSOKÝM KARDIOVASKULÁRNÍM RIZIKEM: MULTICENTRICKÁ PROSPEKTIVNÍ STUDIE Hlavní řešitel v MOÚ: MUDr. Milana Šachlová, CSc. et Ph.D. (MOÚ je spoluřešitel, hlavní řešitel ÚVN Praha, Kofinancováno: NT/ /2012) Anotace Existují literární podklady pro tvrzení, že diabetická populace představuje populaci se zvýšeným rizikem kolorektálního karcinomu. Pro zátěž kardiovaskulární i onkologickou morbiditou/mortalitou byly identifikovány do vysoké míry stejné rizikové faktory a existují stejná režimová doporučení, zahrnující zásady zdravé výživy, pohybového režimu, boje proti stresu, vynechání kouření a škodlivého pití alkoholu. Ze současných poznatků a zkušeností lze vyslovit předpoklad, že vyšší riziko kardiovaskulární mortality provází zároveň vyšší riziko onkologických onemocnění, zejména nádorů trávicího traktu a nejčastějšího CRC. Cíl projektu: Ověřit předpoklad, že osoby se zvýšeným kardiovaskulárním rizikem dle SCORE >10% [pohlaví, kouření, systolický TK (mmhg), hladina celkového cholesterolu (mmol/l)] a diabetici 2. typu (DM) v české populaci jsou zároveň nositeli vyššího rizika kolorektální neoplázie. Identifikací a výběrem těchto osob pro provedení kolonoskopie pak ověřit předpoklad, že u této skupiny osob je efektivní cílený screening. Zároveň ověřit průchodnost, efektivitu a bezpečnost cíleného jednostupňového screeningu a určit jeho věkový interval. Vypracovat příslušná doporučení odborných společností. Publikovat výsledky v periodiku s mezinárodní významností a mezinárodně výsledky prezentovat. Metodika Charakteristika a velikost cílové skupiny: do studie bude zařazeno celkem konsekutivních jedinců vyšetřených ve 40 ordinacích všeobecných praktických lékařů a v 16 ordinacích diabetologů, kteří splňují kritéria pro screening kolorektálního karcinomu vyjma věku (asymptomatičtí, negativní rodinná a osobní anamnéza kolorektální neoplázie). Vzhledem k možnému rozšíření věkové hranice pro screening KRK do nižších věkových skupin budou zařazeni jedinci ve věku let. Ti budou rozděleni do dvou skupin (1:1) jedinců s vysokým kardiovaskulárním rizikem (SCORE >10%) a/nebo DM 2. typu bude zařazeno do cílové skupiny a jedinců do kontrolní skupiny (se SCORE < 10% a bez diagnózy DM 2. typu). Jedinci z obou skupin budou následně kolonoskopicky vyšetřeni v 8 vybraných gastroenterologických pracovištích z České republiky. Jedním z nich je i Masarykův onkologický ústav. Jedná se o multicentrickou prospektivní studii, která vyžaduje interdisciplinární spolupráci tří odborností; gastroenterologické, diabetologické a všeobecného praktického lékařství. Dopad projektu přesahuje hranice těchto odborností a je významný pro celý český zdravotnický systém. Statistické centrum bude průběžně shromažďovat data od všeobecných praktických lékařů, diabetologů a z endoskopických pracovišť. Předávání dat bude probíhat v elektronickém prostředí přes webovou aplikaci. Hlavní nulová hypotéza: Podíl nemocných s pokročilou neoplazií (prevalence) se neliší ve skupině nemocných s diabetem 2. typu nebo vyšším rizikem ICHS od skupiny osob bez těchto rizik. Vedlejší nulové hypotézy: 217

218 Compliance pacientů se studií (pacienti souhlasící se studií/všichni oslovení pacienti) se neliší v cílové skupině od kontrolní skupiny. Compliance pacientů s kolonoskopií (pacienti s absolvovanou kolonoskopií/pacienti souhlasící se studií) se neliší v cílové skupině od kontrolní skupiny. Hlavní sledovaná veličina: Prevalence pokročilé neoplázie v cílové a kontrolní skupině Vedlejší sledované veličiny: Podíl pacientů souhlasících se studií mezi všemi oslovenými pacienty Podíl pacientů s absolvovanou kolonoskopií mezi všemi pacienty souhlasícími se studií Stav řešení v roce 2015 Byla provedena metodická, materiálová a softwarová příprava projektu. Byl připraven velmi podrobný dotazník v elektronické podobě. Byly zajištěny přístupová práva k dotazníku (zadává se přes internet). Byly uzavřeny smlouvy s jednotlivými gastroenterology, praktickými lékaři, diabetology. Probíhá průběžná identifikace probandů v praxích a průběžné odesílání na kolonoskopii. Data se zadávají do registru. Nyní probíhá zpracování dat k vyhodnocení grantu. Stav k datu za celý projekt: Osloveno 2063 pacientů Podepsali IS 2055 Vyplněných formulářů PL 1807 Cílová skupina 884 Kontrolní skupina 923 Počet primárních koloskopií 1089 Počet TOKS 718 Počet vyplněných formulářů PL + kolonoskopie 1602 Předběžný závěr: Pacienti s kardiovaskulárním rizikem a DM 2. typu mají vyšší prevalenci pokročilého adenomu. Tato data pomohou k modifikaci screeningového programu v ČR. Plán pro rok 2016 Projekt bude ukončen z hlediska své náborové části. Bude pokračovat sledování, analýzy dat. 3. VYTVOŘENÍ DIAGNOSTICKÉ SADY CIRKULUJÍCÍCH MIKRORNA PRO NEINVAZIVNÍ ČASNOU DIAGNOSTIKU A SLEDOVÁNÍ PACIENTŮ S KOLOREKTÁLNÍM KARCINOMEM Hlavní řešitel projektu: doc. RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D. a MUDr. Milana Šachlová, CSc. et Ph.D. Podrobně je projekt rozveden u Týmu pro gastrointestinální nádory. 218

219 Ostatní projekty FUNKČNÍ DIAGNOSTIKA A MOLEKULÁRNÍ PATOLOGIE A) FUNKČNÍ DIAGNOSTIKA SEZNAM PROJEKTŮ ŘEŠENÝCH V ROCE Klinické hodnocení diagnostické proveditelnosti a morfologicko-funkční korelace vyšetření PET/CT při použití 11 C-Methioninu inj. u pacientů s primárním nebo sekundárním postižením mozku nádorovým procesem 2. Vaskulitidy velkých cév možnosti využití 18F-FDG PET a PET/CT vyšetření 3. PET/CT s využitím 18F-cholínu 1. KLINICKÉ HODNOCENÍ DIAGNOSTICKÉ PROVEDITELNOSTI A MORFOLOGICKO-FUNKČNÍ KORELACE VYŠETŘENÍ PET/CT PŘI POUŽITÍ 11 C-METHIONINU INJ. U PACIENTŮ S PRIMÁRNÍM NEBO SEKUNDÁRNÍM POSTIŽENÍM MOZKU NÁDOROVÝM PROCESEM Hlavní řešitelé: MUDr. Marek Svoboda, Ph.D., MUDr. Radek Lakomý, Ph.D., MUDr. Zdeněk Řehák, Ph.D. Podrobnosti k tomuto projektu jsou uvedeny u týmu pro nádory CNS 2. VASKULITIDY VELKÝCH CÉV MOŽNOSTI VYUŽITÍ 18F-FDG PET A PET/CT VYŠETŘENÍ Hlavní řešitel projektu: MUDr. Zdeněk Řehák, Ph.D. Anotace Předmětem je zhodnocení přínosu FDG PET a PET/CT vyšetření u pacientů s vaskulitídami velkých tepen. Na souboru 60 nemocných, u kterých bylo toto vyšetření provedeno v rámci diferenciálního vyšetřování nemocných s horečkou neznámého původu bylo prokázáno, že známky vaskulitídy velkých tepen jsme detekovali dříve než jinými zobrazovacími vyšetřeními Podařilo se nám rovněž prokázat i pokles akumulace FDG ve velkých tepnách při terapii kortikosteroidy. Cíle práce Cíl 1. Ověření, zda vysoká akumulace 18F-FDG ve stěnách velkých tepen u pacientů vyšetřených z důvodů protrahovaných febrilií skutečně odpovídá vaskulitidě velkých tepen. Srovnání s nálezy jiných zobrazovacích vyšetření u těchto pacientů. 219

220 Cíl 2. Ověření, zda míra akumulace FDG zobrazitelná pomocí PET nebo PET/CT vyšetření, koreluje s laboratorními parametry aktivity choroby a zda je tak možné pomocí PET (PET/CT) vyšetření monitorovat i další vývoj choroby. Metodika Našim 60 pacientům bylo aplikováno radiofarmakum v rozmezí MBq s průměrem 337,3 MBq a mediánem 332 MBq FDG. Bohužel z provozních důvodů nebylo možné všechna vyšetření provést jen na jednom typu přístroje. Ke každé provedené iniciální PET (PET/CT) studii jsme zaznamenali i hodnoty FW a CRP (v intervalu +/- 7 dní od tohoto vyšetření). K potvrzení námi navržené diagnózy jsme volili přímý průkaz histologické vyšetření z excize spánkové tepny (nebo její větve). Jako další, nepřímý průkaz jsme zvolili terapeutický test (potvrzení diagnózy klinickým lékařem revmatologem s dokumentovaným poklesem laboratorních parametrů zánětu při kortikoterapii v imunosupresivních dávkách). Jako kontrolní soubor byl měřen vzorek 100 onkologických nemocných v rámci sledování po proběhlé onkologické terapii. Všechna tato měření byla prováděna jen na PET skeneru ve stejných 7 místech velkých tepen a v játrech a hodnocena jako pozitivní nebo negativní stejným způsobem. Měření na vzorku zdravých dobrovolníků vzhledem k specifikům PET vyšetření nebylo možné získat. Jsme si vědomi, že skladba kontrolního souboru nebyla ideální. Jiná zobrazovací vyšetření srovnání: Dále jsme porovnávali výsledky PET (PET/CT) vyšetření i s jinými zobrazovacími vyšetřeními. Z nukleárně medicínských vyšetření se jednalo jen o scintigrafické vyšetření s 99mTc značenými leukocyty nebo scintigrafii se značenými fragmenty antigranulocytárních protilátek. Z radiologických vyšetření pak zejména s ultrasonografií, CT angiografií nebo MR angiografií. Z dalších vyšetření i echokardiografií a transezofageální echokardiografií. U těchto sledovaných vyšetření jsme předpokládali, že by případná patologie nebo abnormalita velkých tepen mohla být detekována. Všechna histologická vyšetření tepen byla provedena až po vyšetření PET (PET/CT). Výsledky V rámci diferenciální diagnostiky pacientů s suspektní malignitou a projevy tzv. horečky neznámého původu zde jsou diagnostikováni pacienti s obrovskobuněčnou arteritídou (OBA), primárním důvodem bylo ale vyloučení malignity. Potvrzení z tohoto typu vaskulitidy si vyžádalo systematickou práci na souboru těchto pacientů (včetně potvrzení diagnózy, srovnání s jinými vyšetřovacími metodami a sledování efektu léčby). V roce 2013 se nám podařilo publikovat soubor 39 takto diagnostikovaných pacientů (potvrdili jsme vysokou senzitivitu našeho vyšetření k OBA, potvrdili jsme, že PET/CT detekuje tuto nemoc dříve než jiné zobrazovací metody konveční pro OBA a že lze monitorovat efekt terapie kortikosteroidy u této diagnózy. Výsledky byly publikovány jako originální práce v České radiologii. Dále se podařilo na základě aplikace nestandardního typu snímání (vycházejícího ze zobrazení mozku pro neurologické indikace) provést relativně podrobnější snímání povrchových hlavových tepen a prokázat tak zánět i v temporálních a okcipitálních tepnách (dosud se stále má za to, že zánět v tepnách tohoto kalibru PET/CT vyšetřením prokázat nelze). Tento průkaz byl publikován v americkém časopise Clinical Nuclear Medicine (IF 2,995). Probíhá další práce na tomto souboru nemocných, a k evidujeme takto primo-diagnostikovaných pacientů již 60! (největší soubor na světě). Mimochodem byla 220

221 zahájena i práce na souborech pacientů jiných typů vaskulitid (Takaysuova arteritída, polyarteritis nodosa, Wegenerova granulomatóza, vaskulitidy provázející SLE) a s revmatickou polymyalgií - i tyto pacienty s onkologickou diagnostikou spojuje to, že prvním projevem jejich onemocnění může být "horečka neznámého původu", která patří i k projevům některých typů nádorových onemocnění. Stav řešení projektu: výzkumná část projektu byla ukončena k V současnosti probíhá publikování výsledků a klinické sledování pacientů za účelem pozdější aktualizace výsledků. Obrázek č. 1 - FDG PET/CT zobrazení vaskulitídy ve "whole body" a "brain" protokolu snímání 221

222 3. DIAGNOSTICKÁ PROVEDITELNOST A MORFOLOGICKO- FUNKČNÍ KORELACE VYŠETŘENÍ PET PŘI POUŽITÍ [18F]- FLUOROCHOLIN INJ. U PACIENTŮ S KARCINOMEM PROSTATY. KLINICKÁ STUDIE II/III. FÁZE. NÁZEV ZKOUMANÉHO PŘÍPRAVKU: [18F]-Fluorocholin inj. IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO PROTOKOLU: RD-FCH-2014 EUDRACT NUMBER: VERZE PROTOKOLU: 1.3 DATUM VERZE PROTOKOLU: JMÉNO A ADRESA ZADAVATELE: Masarykův onkologický ústav, Žlutý kopec 7, Brno JMÉNO ZKOUŠEJÍCÍHO: doc. MUDr. Jan Doležel, Ph.D. TRVÁNÍ KLINICKÉHO HODNOCENÍ: Zahájení: 1/2015 Ukončení je plánováno na 12/2016 POČET SUBJEKTŮ KLINICKÉHO HODNOCENÍ: Podrobnosti viz část Tým pro urologické malignity B) MOLEKULÁRNÍ PATOLOGIE Hlavní řešitel: MUDr. Pavel Fabian, Ph.D. a Mgr. Jitka Berkovcová, Ph.D. Souhrn V roce 2011 jsme za pomocí prostředků institucionální podpory významně rozšířili provoz specializované laboratoře na Oddělení onkologické a experimentální patologie o nové molekulárně genetické metody. Při laboratoři působí multioborový tým složený z kliniků, patologů, biochemiků, genetiků a výzkumných pracovníků, což je zárukou dalšího rozvoje v této oblasti. Mimo poskytování molekulárně genetických vyšetření nádorové tkáně pro účely diagnostiky a prediktivní onkologie, bude laboratoř i zázemím pro testování nových molekulárních prediktorů navržených výzkumníky RECAMO a jejich závádění do klinické praxe. Laboratoř zahájila svůj plný provoz k a v témže roce získala pro nabízená vyšetření i akreditaci u ČIA. Laboratoř byla vybavena real-time PCR analyzátorem Cobas 480 a v současnosti realizuje mutační analýzy genů: K-ras, B-raf a EGFR. Výsledky těchto analýz mají přímý dopad na léčbu pacientů s nádory tlustého střeva a konečníku, plic a maligního melanomu. Bez uvedených vyšetření není možné zahájit cílenou protinádorovou léčbu, neboť její efektivita je v přímé vazbě na výsledek mutačních analýz. Metody Stanovení mutačního stavu genu k-ras: Ke stanovení mutačního stavu genu k-ras využíváme komerční set cobas KRAS mutační test firmy Roche. Tento kit je přímo určen pro in vitro diagnostiku. Principem metody je real time PCR a TaqMelt analýza amplifikovaných produktů. Kit je schopen detekce mutací 222

223 v kodonech 12 a 13 (exon 2) a 61 (exon 3). Senzitivita tohoto testu je 5% mutované DNA ve vzorku. Metoda je v laboratoři akreditovaná dle ČSN EN ISO (u ČIA Český institut pro akreditaci) jako F-SOP-03. Na základě publikování výsledků klinických studií došlo v roce 2013 ke změně v indikování prediktivních vyšetření molekulárních biomarkerů nezbytných pro zahájení anti-egfr cílené léčby u metastatického kolorektálního karcinomu. Masarykův onkologický ústav mohl na nově vzniklou situaci reagovat bezprostředně, neboť, a to i díky prostředkům institucionální podpory, disponoval potřebným technickým vybavením. V roce 2013 bylo rozšířeno spektrum genetického vyšetření o stanovení mutačního stavu v genu n-ras (exony 2, 3 a 4, resp. kodony 12, 13, 59, 61, 117 a 146) a o stanovené mutačního stavu v kodonech 59, 117 a 146 genu k-ras. Vyšetření se provádí pomocí kitu RAScan od firmy Transgenomic se značkou CE IVD. Tato metoda dosahuje senzitivity 2 5 % pozitivní DNA ve vzorku. Vyšetření probíhá na platformě DHLP (denaturing high-performance liquid chromatography). Stanovení mutačního stavu genu b-raf: K vyšetření mutací kodonu V600 genu b-raf využíváme cobas 4800 BRAF V600 mutační test firmy Roche, určený pro in vitro diagnostiku. Principem této metody je PCR amplifikace vyšetřované DNA užitím komplementárního primerového páru, který vymezuje exon 15 genu b-raf, a dvou oligonukleotidových fluorescenčně značených TaqMan sond, které jsou specifické pro wild type (wt) sekvenci a mutovanou sekvenci (záměna 1799 T > A). Publikovaná citlivost této metod je méně než 5% mutované DNA ve vyšetřovaném vzorku. Metoda je v laboratoři akreditovaná dle ČSN EN u ČIA jako F-SOP-04. Stanovení mutačního stavu genu egfr: U genu egfr vyšetřujeme mutační stav pomocí cobas EGFR mutačního testu firmy Roche, který je rovněž validovaný pro in vitro diagnostiku. Základem metody je PCR amplifikace v reálném čase a detekci vyšetřované DNA užitím komplementárních primerových párů a oligonukleotidových fluorescenčně značených sond ve třech samostatných PCR. Díky tomu je test schopen detekovat až 43 mutací v exonech Uváděná citlivost této metody je 5% mutované DNA ve vyšetřovaném vzorku. Metoda je v laboratoři akreditovaná dle ČSN EN u ČIA jako F-SOP-05. Stanovení mutačního stavu genů c-kit a pdgfr: Vyšetření mutačního stavu genů c-kit a pdgfr je prováděno dle F-SOP-06 metodou přímé sekvenace exonů 9, 11, 13 a 17 genu c-kit a exonů 10, 12, 14 a18 genu pdgfr, které předchází izolace DNA a následná PCR amplifikace specifickými primery. Ty jsou navrženy tak, aby byly namnoženy kompletní sekvence exonů i s částí přiléhajících intronů. Po té jsou jednotlivé amplikony přečištěny pro potřeby sekvenčních reakcí. Analýza výsledku je prováděna porovnáváním sekvencí jednotlivých amplikonů s referenčními sekvencemi. Při nalezení mutace je prověřena databáze, zda tato mutace již byla publikována v souvislosti s odpovědí na biologickou léčbou u GIST. Plán pro rok Rozvíjet v praxi metodu NGS (next generation sequencing) pro vyšetření mutací v nádorové DNA. 2. Zavedení a testování vyšetření mikrosatelitní instability a jejih korelace s klinicko patologickými znaky a parametry přežití u kolorektálního karcinomu (CRC). 223

224 AD 2. KLINICKO PATOLOGICKÉ ZNAKY A PARAMETRY PŘEŽITÍ U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU (CRC) VE VZTAHU K MIKROSATELITNÍ INSTABILITĚ. Anotace projektu Mezinárodní multicentrická retrospektivní studie, financování z grantu poskytnutého švédskou stranou. Studie zhodnotí klinicko patologické znaky a údaje o přežití ve vztahu ke stavu DNA mismatch repair systému v nádorových buňkách. Zahrnuta centra ve Švédském království a v České republice, plánováno zhodnotit celkem nejméně 400 pacientů. Cíle projektu Potvrdit či vyvrátit hypotézu o lepším přežití nemocných s CRC s nádory s vysokou mikrosatelitní instabilitou / defektním mismatch repair systémem (dmmr). Sekundární cíl stanovit četnost nádorů s dmmr v české populaci. Metodika Vyhledání souboru pacientů s kolorektálním karcinomem stadia II. Sběr iniciálních i průběžných klinicko patologických dat. Detekce mismatch repair proteinů MSH2, MLH1, PMS2 a MSH 6 metodou immunohistochemie. Statistické zhodnocení. Stav řešení / výsledky řešení v roce 2015 Splněny všechny cíle pro rok 2015 všichni pacienti z MOÚ s CRC stadia II za vybrané roky ( ) zahrnuti do studie, provedeno immunohistochemické vyšetření všech vzorků z MOÚ a z FN Královské Vinohrady. Celkem 200 pacientů. Publikace vzešlé z projektu v roce 2015 (ve standardním citačním formátu) zatím žádné Plán pro rok 2016 (případně další) Pokračování projektu dle plánu vyšetření dalších 200 vzorků další česká centra a pacienti zařazení švédskou stranou. Dle výsledků společná publikace celého projektu se švédskými a českými partnery nejméně 1 článek v peer reviewed časopise s IF. Dále separátní publikace o četnosti dmmr v české populaci. 224

225 Regional Centre for Applied Molecular Oncology, RECAMO Regionální aplikované centrum aplikované a molekulární onkologie Financováno: - do roku 2014: CZ.1.05/2.1.00/03.010, Evropský fond pro regionální rozvoj, OP VaVpI - od roku 2015: Národní program udržitelnosti I, LO1413, MŠMT Kofinancováno: z prostředků institucionální podpory, aplikovaného výzkumu a dalších zdrojů Výkonný ředitel RECAMO: doc. MUDr. Dalibor Valík, Ph.D. Vědecký ředitel RECAMO: RNDr. Bořivoj Vojtěšek, DrSc. Seznam členů týmů RECAMO viz 225

226 RECAMO2020 Národní program udržitelnosti I, LO1413, MŠMT Řešitel: doc. MUDr. Dalibor Valík, Ph.D. Anotace projektu Nádorová onemocnění se stále vyznačují vysokou úmrtností. K většině úmrtí dochází následkem pozdní diagnózy a nedostatku přesné, specifické a včasné léčby. U velkého počtu pacientů je nicméně nádorové onemocnění stále diagnostikováno až v pokročilém stádiu, protože v klinické praxi je k dispozici zatím pouze několik dostatečně citlivých a specifických biomarkerů. Možným řešením tohoto problému je identifikace biomarkerů využitelných pro časnou diagnózu onemocnění a pro výběr optimální léčebné strategie. Hlavním problémem je příliš zdlouhavý proces převádění poznatků základního výzkumu v biomedicíně na účinné léky a diagnostické postupy v praxi. Souhrnné cíle projektu 1. Získat vysoce kvalitní výsledky v rámci biomedicínského výzkumu a zpřístupnit je pro praktické využití v oblasti komplexní onkologické péče. 2. V souladu s původními záměry projektu RECAMO rozvinout některé ze současných laboratorních onkologických výzkumů směrem k jejich využití v klinické praxi (přechod z Onkologického výzkumu k Aplikované molekulární onkologii). 3. Udržet a dále rozvíjet stávající infrastrukturu včetně personálního zajištění multidisciplinární výzkumné skupiny tvořené vědeckými pracovníky, lékaři a dalšími klinickými specialisty v rámci jednoho výzkumného centra, které je vybavené state of the art technologiemi umožňujícími výzkum nových biomarkerů relevantních pro diagnostiku, zobrazovací metody, monitorování onemocnění, stanovení prognózy a léčby nádorových onemocnění. Krátkodobé cíle projektu RECAMO: 1. Identifikace biomarkerů využitelných pro časnou diagnózu onemocnění a pro výběr optimální léčebné strategie. 2. Nové poznatky v oblasti nádorové biologie a jejich převedení do diagnostických a léčebných postupů klinické praxe. Dílčí výzkumné cíle se vztahují k diagramu RECAMO2020, ve kterém jsou rozepsány konkrétní výzkumné aktivity a jejich napojení na Národní priority orientovaného výzkumu, experimentálního vývoje a inovací. 1.3 Nádorová onemocnění Nádorová biologie ve vztahu k diagnostickým a terapeutickým cílům Analýza vztahů hostitel-nádor jako prostředek individualizace diagnostiky a léčby 2. Nové diagnostické a terapeutické metody 2.1 In vitro diagnostika Prohloubení znalostí v oblasti -omických a vysokokapacitních metod Nové technologie IVD 2.2 Nízkomolekulární léčiva Nové nízkomolekulární sloučeniny Identifikace nových terapeutických cílů, nové metody a postupy pro biologické testování 3.3 Nádorová onemocnění Skríning a prevence výskytu nádorů 226

227 3.3.2 Identifikace rizikových faktorů a jedinců v populacích Dlouhodobé cíle projektu RECAMO 1. Transparentní onkologický výzkum zaměřený na kvalitu s potenciálem praktické aplikace. 2. Součinnost výzkumných infrastruktur jako jsou banky biologického materiálu BBMRI a akademická klinická hodnocení CZECRIN s výzkumnými aktivitami zaměřenými na řešení konkrétních problémů. 3. Mezinárodní konkurenceschopnost centra RECAMO, které už nyní přitahuje zájem značného množství domácích i zahraničních vědeckých pracovníků nejvyšší úrovně. Metodika RECAMO je vybaveno přístrojovou technikou nezbytnou pro přípravu a produkci rekombinantních proteinů a studium jejich biochemických vlastností. Sekvence DNA kódující proteiny budou klonovány do různých expresních systémů s využitím techniky rekombinantního klonování (Gateway). Primární struktura studovaných proteinů bude pozměněna metodou cílené mutageneze. Pro velkokapacitní purifikaci proteinů z prokaryotických buněk (různé produkční kmeny bakterií) i eukaryotických (hmyzích) buněk bude využit systém kapalinové chromatografie ÄKTA s příslušnými afinitními kolonami. Tento systém bude používán také pro gelovou filtraci (gelovou permeační chromatografii) nedostatečně purifikovaných proteinů. Purifikované proteiny budou dále sloužit pro produkci protilátek a biochemické a interakční studie. Pro studium interakcí protein-protein a proteinpeptid bude kromě standardních metod (imunoprecipitace a další typy pull-down assays, studium lokalizace v buňce) využita i technika HDX ( hydrogen/deuterium exchange ) ve spojení s hmotnostní spektrometrií. Pro tyto účely je RECAMO vybaveno hmotnostním spektrometrem LTQ ORBITRAP (Thermo) a HDX dávkovačem (Thermo). Interakce proteinprotein a kvartérní struktura proteinů budou také studovány pomocí analytické gelové permeační chromatografie (ProSEC300S, Agilent Technologies). Biochemické vlastnosti studovaných proteinů budou analyzovány pomocí vhodných kolorimetrických, fluorescenčních a luminiscenčních metod s využitím multidetekčního readeru (TECAN Infinite M1000 PRO). Tyto metody budou sloužit například pro high-throughput funkční analýzu specifických nízkomolekulárních inhibitorů s klinickým potenciálem. Highthroughput analýza bude usnadněna zapojením automatizované stanice (Biomek NXP Laboratory Automation Workstation) a multidetekčního readeru (FilterMax F5 Multimode Microplate Reader). Pro identifikaci interakčních vazebných partnerů rekombinantních proteinů obsahujících SBP ( streptavidin binding peptide ) purifikovaných z eukaryotických systémů budou využity metody hmotnostní spektrometrie. Metody proteomické analýzy budou dále využity k identifikaci proteinů s potenciálním klinickým významem (prognostické a prediktivní markery, cíle léčby). RECAMO je vybaveno technologiemi MALDI LTQ ORBITRAP a QTRAP, které kromě základní identifikace proteinů umožní studovat i změny posttranslačních modifikací proteinů (např. změny ve fosforylaci proteinů, které jsou důsledkem aktivace buněčných signálních drah) a kvantifikaci proteinů (značení SILAC, itraq). Z klinického hlediska významné geny budou vyhledávány také pomocí expresního profilování. Úloha takto identifikovaných genů/proteinů bude dále ověřena pomocí funkčních studií. RECAMO je vybaveno pro široké spektrum metod zahrnujících tkáňové kultury a studium vlastností nádorových buněk. Buněčná morfologie a intracelulární lokalizace studovaných proteinů bude zjišťována pomocí světelné a fluorescenční mikroskopie (RECAMO je vybaveno fluorescenčním mikroskopem Olympus BX41 a invertovaným fluorescenčním mikroskopem Nikon Eclipse Ti; je plánovaná instalace 227

228 motorizovaného invertovaného mikroskopu s konfokální jednotkou pro life cell imaging ). Analýza buněčného cyklu, buněčné morfologie a exprese membránových proteinů bude prováděna pomocí průtokové cytometrie (cytometr BD FACSVerse). RECAMO je také vybaveno průtokovým cytometrem spojeným se sorterem (BD FACSAria III), který umožňuje identifikovat a třídit různé buněčné populace (například nádorové kmenové buňky, které se vyznačují expresí specifických povrchových markerů) a je také možné jej využít pro přípravu stabilně transfekovaných buněčných linií se zvýšenou hladinou studovaného proteinu ( single cell cloning ). Pro přechodnou i stabilní transfekci buněk budou využity různé metody, které už byly v RECAMO úspěšně zavedeny (lipofekce, elektroporace nukleofektor AMAXA of firmy Lonza) a to včetně systému, který umožňuje indukovat expresi cílového genu tetracyklinem. Pro studium interakcí protein-protein bude kromě biochemických metod (in vitro) využito i metod studia in vivo v transfekovaných buňkách (BRET assay Bioluminiscence Resonance Energy Transfer) a in situ ve fixovaných nádorových buňkách a tkáních (PLA Proximity Ligation Assay). Nově vyvinuté látky s potenciálním protinádorovým účinkem budou testovány na buněčných liniích odvozených od různých typů lidských nádorových onemocnění s využitím standardních metod (testy cytotoxicity MTT, WST, analýza buněčného cyklu) a také systému xcelligence (Roche), který umožňuje studovat buněčnou proliferaci, migraci a invazivitu v reálném čase. Bude také měřen oxidační stres v buňkách vyvolaný testovanými látkami a to pomocí fluorescenční metody (Oxiselect In Vitro ROS/RNS fluorescent assay, Cell Biolabs) nebo látky DHE (dihydroethidium) v kombinaci s průtokovou cytometrií. Klinický význam studovaných proteinů bude ověřen pomocí detekce změn genové exprese v reálných vzorcích od pacientů a to na úrovni mrna (kvantitativní PCR v reálném čase HT Real-Time PCR System, Applied Biosystems; digitální PCR - QX 200 Droplet Reader, BioRad) i na úrovni proteinu (imunohistochemické barvení). RECAMO může s výhodou využívat souboru vzorků biologického materiálu, který je uchováván bankou biologického materiálu MOÚ (využití biologického materiálu je v souladu s platnými zákony a pravidly MOÚ). Pro imunohistochemické barvení budou připraveny složené tkáňové bloky ( tissue microarrays, TMA), které bude možné hodnotit pomocí robotického slide scanneru ( robotic scanner for virtual microscopy Pannoramic MIDI, 3DHISTECH; na konec roku 2014 je plánovaná instalace multispektrálního zařízení pro detekci fluorescence, které navíc umožní kvantifikaci proteinů a vyhodnocení jejich vzájemné lokalizace). Plánovaná je také instalace sekvenátoru (NextSeq 500 sequencing system), který je nezbytný pro high-throughput analýzu sekvencí nukleových kyselin. RECAMO je také vybaveno elektrochemickým analyzátorem (potenciostat/galvanostat), který lze využít pro různé elektroanalytické techniky (voltametrii, potenciometrii, ampérometrii). V kombinaci s vhodnou elektrodou (zlatou, rtuťovou, uhlíkovou) jsou tyto metody využitelné například pro detekci onkogenů a tumor supresorových genů, bakteriálních a virových nukleových kyselin, mikrorna, nebo metylací DNA. Umožňují rovněž studium interakce DNA s nízkomolekulárními látkami (např. protinádorovými léčivy), nebo analýzu konformačních či strukturních změn bílkovin způsobenými denaturací, agregací, přítomností mutací či interakcí s jinými látkami. V Masarykově onkologickém ústavu jsou k dispozici také zobrazovací metody PET (pozitronová emisní tomografie) a MRI (magnetická rezonance), které budou využity pro techniku molekulárního zobrazování. Budeme pokračovat ve spolupráci s ÚJV Řež, Veterinární a farmaceutickou univerzitou Brno a Ústavem přístrojové techniky AV ČR, kde budou vyvíjeny a zdokonalovány techniky pro zobrazování nádorů a jejich mikroprostředí in vivo. 228

229 Stav řešení / výsledky řešení v roce 2015 Konkrétní výsledky výzkumu jsou součástí publikací v tuzemských i zahraničních recenzovaných časopisech a prezentací na odborných tuzemských a zahraničních konferencích (viz seznam publikací v příloze). Jsou také nedílnou součástí projektů, které jsou v rámci pracoviště řešeny (viz výše). Plán pro rok 2016 Plán výzkumu projektu se odvíjí od dlouhodobých cílů pracoviště RECAMO, blíže je dán plány jednotlivých projektů řešených na pracovišti. SEZNAM HLAVNÍCH PROJEKTŮ TRANSLAČNÍHO VÝZKUMU ŘEŠENÝCH V RECAMO V ROCE Využití proteinů p63/p73 a jejich signálních drah jako prediktivních markerů v klinické onkologii 2. Úloha proteinů rodiny Anterior gradient při vzniku a vývoji nádorových onemocnění 3. Úloha chaperonového systému v maligní transformaci a odpovědi na protinádorovou terapii 4. Centrum nových přístupů k bioanalýze a molekulární diagnostice 5. Analýza chaperonového systému a indentifikace nových biomarkerů u gynekologických malignit 6. Nový panel proteinů korelujících se stavem lymfatických uzlin u low-grade nádorů prsu: Klinická verifikace a úloha v invazivitě nádorových buněk 7. Elektrochemické metody pro bioanalýzu nukleových kyselin a jejich aplikace v diagnostice nádorových onemocnění. 8. Proteomická analýza molekulárních podtypů meduloblastomu: odhalení klinicky významných markerů. 9. Charakterizace nových organometalických sloučenin s potenciálním protinádorovým účinkem. 10. IntegRECAMO: Intellectual Anchor 229

230 HLAVNÍ PROJEKTY RECAMO 1. VYUŽITÍ PROTEINŮ P63/P73 A JEJICH SIGNÁLNÍCH DRAH JAKO PREDIKTIVNÍCH MARKERŮ V KLINICKÉ ONKOLOGII. NT/ /2013, IGA MZ ČR Řešitel: Mgr. Jitka Holčáková, Ph.D. Anotace projektu Zhoubné novotvary mléčné žlázy představují druhou nejčastější malignitu u žen ve vyspělých zemích světa. Podskupina tzv. triple-negativních karcinomů mléčné žlázy, vyznačujících se negativní expresí estrogenového (ER), progesteronového (PR) a Her-2 receptoru, patří ke karcinomům s nejhorší prognózou, u nichž dosud neexistuje cílená léčba. Vzhledem k velké molekulární heterogenitě triple-negativních karcinomů existuje reálný předpoklad, že v případě zavedení individuálního přístupu a cílené léčby může nastat významný pokrok v terapii tohoto onemocnění. Byly publikovány studie o citlivosti buněčných linií odvozených od triple-negativních karcinomů mléčné žlázy k cisplatině, případně kombinaci cisplatiny s dalšími látkami a to v souvislosti s produkcí proteinů p63 a p73. S využitím unikátních buněčných linií odvozených od karcinomu mléčné žlázy inducibilně produkujících p63 a protilátek proti jednotlivým izoformám proteinů p63 a p73 provedeme analýzu úlohy těchto proteinů v citlivosti nádorových buněk k cisplatině, případně k cisplatině v kombinaci s dalšími protinádorovými látkami. Cílem projektu je nalézt expresní spektra genů a specifické proteiny, které budou sloužit k predikci citlivosti u triple-negativních karcinomů mléčné žlázy k cisplatině či dalším protinádorovým látkám. Cíle projektu 8. Charakterizace úlohy izoforem p63 ve vztahu k fenotypu kmenových buněk se zaměřením na povrchové markery, adhezi, proliferaci, invazivitu a odolnost vůči genotoxickému stresu na buněčné linii odvozené od karcinomu mléčné žlázy. 9. Příprava reportérových systémů s promotorem p63 pro analýzu regulačních proteinů. 10. Hledání cílových genů izoforem p63 po působení chemoterapeutických látek pomocí qrt-pcr, případně s využitím PCR čipů mapujících genovou expresi. 11. Hledání vazebných partnerů izoforem p63 po působení chemoterapeutických látek s využitím metody imunoprecipitate se specifickými protilátkami a identifikace pomocí hmotnostní spektrometrie. 12. Analýza vlivu DNA poškozujících látek na hladinu p63 izoforem a identifikace mechanismů zodpovědných za snižování hladiny proteinu p Hledání proteinových markerů a expresních spekter charakteristických pro buňky citlivé k DNA poškozujícím látkám. 14. Stanovení hladin izoforem p63 a p73 a proteinů spojených se signálními drahami p63/p73 identifikovaných jako potenciální markery citlivosti ke genotoxickým látkám na úrovni mrna a proteinu v souboru vybraných triple-negativních karcinomů mléčné žlázy. Tyto expresní profily budou analyzovány vzhledem k významným klinicko-patologickým ukazatelům nádorů včetně objektivní odpovědi na léčbu a přežití pacientek. Metodika Základní část projektu bude provedena na upravené buněčné linií MDA-MB-468 odvozené od triple negativního karcinomu mléčné žlázy. Tato buněčná linie inducibilně exprimuje protein p63 a umožní nám pomocí genomických a proteomických přístupů charakterizovat úlohu p63 a jeho izoforem v nádorové buňce a v její odpovědi na genotoxický stres. V 230

231 bioptickém nádorovém materiálu bude exprese p63 a p73 analyzována na úrovni mrna pomocí PCR v reálném čase (qrt-pcr) a na úrovni proteinů pomocí imunohistochemického barvení (IHC) a imunochemických metod. Intenzita exprese bude statisticky hodnocena ve vztahu k rutinně stanoveným klinicko-patologickým znakům nádorů, bezpříznakovému i celkovému přežití pacientek. Současně bude analyzována i exprese proteinů, předem vytipovaných na základě studie na buněčných liniích, jako potenciálních markerů citlivosti k cisplatině, případně dalším látkám. Cílem projektu je identifikace nových prediktivních a prognostických ukazatelů využitelných k zefektivnění samotné terapie. Stav řešení / výsledky řešení v roce 2015 Výsledky výzkumu získané za rok 2015 byly publikovány v impaktovaných časopisech a prezentovány na mezinárodních a domácích sympoziích. Publikační aktivita za rok 2015 Články 3. Dvořáková, P., Nekulová, M., Holčáková, J., Vojtěšek, B., Hernychová, L. Analýza změn fosfoproteomu nádorové buněčné linie MDA- MB- 468 v odpovědi na expresi izoforem p63 pomocí hmotnostní spektrometrie. Klin Onkol 2015;28(Suppl 2):2S11 2S19. (bez IF) 4. Orzol, P., Holcakova, J., Nekulova, M., Nenutil, R., Vojtesek, B., Coates, P.J. The diverse oncogenic and tumour suppressor roles of p63 and p73 in cancer: a review by cancer site. Histol Histopathol 2015;30: (IF2014: 2,096) Přednášky a postery 5. Orzol, P., Nekulová, M., Vojtěšek, B., Holčáková, J. DNp63 multifunctionality in triplenegative breast cancer role in cell adhesion and potential interacting partners. In: Klin Onkol 2015;28(Suppl1):S146: Sborník abstrakt: XXXIX. brněnské onkologické dny a XXIX. konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky , Brno, Česká republika. ISSN X. 6. Sommerová, L., Nenutil, R., Selingerová, I., Vojtěšek, B., Hrstka, R. Stanovení exprese AGR2 u estrogen receptor negativních karcinomů mléčné žlázy. In: Klin Onkol 2015;28(Suppl1):S147: Sborník abstrakt: XXXIX. brněnské onkologické dny a XXIX. konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky , Brno, Česká republika. ISSN X. 7. Holcakova, J., Nekulova, M. Orzol, P., Vojtesek, B. Np63 regulates membrane proteins trafficking in breast cancer cells. In: Abstract book: 2nd International p53 conference. p53 isoforms in: cancer, aging development, degenerative diseases, infections , Aix-en-Provence, France. Str Orzol, P., Holcakova, J., Nekulova, M., Muller, P., Vojtesek, B., Coates, P. Np63 is a key regulator of cell adhesion and proliferation in triple-negative breast cancer. In: Abstract book: 2nd International p53 conference. p53 isoforms in: cancer, aging development, degenerative diseases, infections , Aix-en-Provence, France. Str. 50. Plán pro rok 2016 Projekt ukončen k

232 2.ÚLOHA PROTEINŮ RODINY ANTERIOR GRADIENT PŘI VZNIKU A VÝVOJI NÁDOROVÝCH ONEMOCNĚNÍ. P301/13/00956S; GAČR Řešitel: Mgr. Roman Hrstka, Ph.D. Anotace projektu Přesná funkce a regulace proteinu rodiny Anterior gradient je stále ne zcela probádaná, avšak stávající výsledky naznačují, že AGR2 a AGR3 jsou z klinickopatologického hlediska významnými faktory, jenž mohou modulovat odpověď na terapii u rady nádorových onemocnění ať už hormon závislých či nezávislých. Kromě nádorových onemocnění, kde vysoká exprese AGR proteinu úzce souvisí s buněčnou transformací, rezistencí k chemoterapii a metastázováním, byla zvýšená exprese především AGR2 prokázána např. i u astmatu a ulcerózní kolitidy. AGR proteiny patrí do rodiny disulfid izomeráz, přičemž nesou všechny klíčové vlastnosti proteinu typických pro endoplazmatické retikulum. Z toho vyplývají i funkce těchto proteinu v rámci regulace skládání, dozrávání a sekrece proteinu, jež se pak mohou podílet na procesech spojených s maligní transformací. Nové elektrochemické přístupy budou dále rozvíjeny a využity ke studiu konformačních změn proteinu vzhledem k redoxnímu stavu prostředí s cílem přispět ke stávajícím znalostem molekulárních buněčných drah uplatňujících se v signalizaci nádorové buňky. Cíle projektu Detailní charakterizace Anterior Gradient rodiny proteinů přispěje k objasnění molekulárních mechanismu regulace a funkce těchto proteinů a přinese nové poznatky o úloze těchto proteinů v buněčných signálních dráhách nádorové buňky. Metodika 1. Klasické metody molekulární biologie izolace RNA, reverzní transkripce, PCR techniky včetně Real Time PCR, RNA silencing. 2. Klonování sekvencí sestřihových variant AGR2 a AGR3 s využitím Gateway systému pro následnou expresi proteinů AGR2 a AGR3. 3. Metody tkáňových kultur pro kultivaci standardních buněčných línií, transfekce buněčných linií připravenými konstrukty. 4. Imunopreciptace pro detekci interakčních vlastností proteinů. 5. Techniky hotnostní spektrometrie s využitím Orbitrap a Q-trap. 6. Elektrochemické metody Stav řešení / výsledky řešení v roce 2015 Výsledky výzkumu získané za rok 2015 byly publikovány v impaktovaných časopisech a prezentovány na mezinárodních a domácích sympoziích. Publikační aktivita za rok 2015 Články 1. Hrstka, R., Bouchalova, P., Michalova, E., Matoulkova, E., Muller, P., Coates, P.J., Vojtesek, B. AGR2 oncoprotein inhibits p38mapk and p53 activation through a DUSP10-mediated regulatory pathway. Mol Oncol 2015 (in press) (IF2014: 5,331) 2. Hrstka, R., Bouchalova, P., Michalova, E., Matoulkova, E., Muller, P., Coates, P.J., Vojtesek, B. AGR2 oncoprotein inhibits p38mapk and p53 activation through a DUSP10-mediated regulatory pathway. Mol Oncol 2015 (accepted) (IF2014: 5,331) 232

233 3. Ondroušková, E., Hrstka, R. Cirkulující nádorová DNA v krvi a její využití jako potenciálního biomarkeru nádorových onemocnění. Klin Onkol 2015;28(Suppl 2):2S69 2S74. (bez IF) 4. Obacz, J., Brychtova, V., Podhorec, J., Fabian, P., Dobes, P., Vojtesek, B., Hrstka, R. Anterior gradient protein 3 (AGR3) is associated with less aggressive tumors and better outcome of breast cancer patients. Oncotargets Ther 2015;8: (IF2014: 2,311) 5. Obacz, J., Takacova, M., Brychtova, V., Dobes, P., Pastorekova, S., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of AGR2 and AGR3 in cancer: similar but not identical. Eur J Cell Biol 2015;94: (IF2014: 3,825) Přednášky, postery 1. Sommerová, L., Zoumpourlis, V., Nenutil, R., Vojtěšek, B., Hrstka, R. Úloha proteinu AGR2 v procesu EMT. In: Sborník abstrakt: 6th RECAMO joint meeting Through cancer research towards applied molecular oncology , Brno, Česká republika. Brno: Masarykův onkologický ústav ISBN Str Matoulková, E., Hrstka, R., Vojtěšek, B. Vliv 3 UTR oblasti mrna AGR2 na expresi protoonkogenu AGR2. In: Klin Onkol 2015;28(Suppl1):S165: Sborník abstrakt: XXXIX. brněnské onkologické dny a XXIX. konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky , Brno, Česká republika. ISSN X. 2. Obacz, J., Brychtova, V., Podhorec, J., Fabian, P., Dobes, P., Vojtesek, B., Hrstka, R. Anterior gradient protein 3 (AGR3) is associated with less aggressive tumors and better outcome of breast cancer patients. In: Klin Onkol 2015;28(Suppl1):S145-S146: Sborník abstrakt: XXXIX. brněnské onkologické dny a XXIX. konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky , Brno, Česká republika. ISSN X. 3. Sommerová, L., Nenutil, R., Selingerová, I., Vojtěšek, B., Hrstka, R. Stanovení exprese AGR2 u estrogen receptor negativních karcinomů mléčné žlázy. In: Klin Onkol 2015;28(Suppl1):S147: Sborník abstrakt: XXXIX. brněnské onkologické dny a XXIX. konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky , Brno, Česká republika. ISSN X. 4. Matoulková, E., Hrstka, R., Vojtěšek, B. 3 UTR oblast jako regulátor hladiny exprese AGR2. In: Sborník abstrakt: 6th RECAMO joint meeting Through cancer research towards applied molecular oncology , Brno, Česká republika. Brno: Masarykův onkologický ústav ISBN Str Obacz, J., Brychtova, V., Vojtesek, B., Pastorekova, S., Hrstka, R. Uncovering the role of secreted anterior gradient protein 3 (AGR3) in tumor biology. In: Sborník abstrakt: 6th RECAMO joint meeting Through cancer research towards applied molecular oncology , Brno, Česká republika. Brno: Masarykův onkologický ústav ISBN Str Hrstka, R., Bouchalova, P., Michalova, E., Matoulkova E., Vojtesek, B. AGR2 dependent modulation of wild-type p53 activity in response to DNA damage. In: Abstractbook: EMBO Conference - The DNA damage response in cell physiology and disease , Cape Sounio, Greece. Str Matoulkova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. Regulation of AGR2 expression via 3 -UTR. In: Abstractbook: EMBO/EMBL Symposium: The Non-Coding Genome , Heidelberg, Germany. Str Plán pro rok

234 1. Vývoj metody pro testování stability povrchových proteinů samotných nebo jejich komplexů s DNA a proteiny/peptidy ve vztahu k elektrochemickým efektům a jiným faktorům. 2. Analýza vlivu AGR2/AGR3 na vznik a stabilitu komplexu p53-dna a ostatních členů rodiny p Stanovení vybraných AGR2 transkriptů a exprese proteinu AGR2 s cílem potvrdit přímou asociaci mezi zkracováním 3 UTR oblasti AGR2 mrna a zvýšenou hladinou proteinu AGR2 v nádorových buňkách. 4. Potvrdit asociaci mezi expresí AGR2 a signalizací prostřednictvím Her2 u vybraných Her2 a AGR2 pozitivních buněčných línií odvozenýcm o karcinomu mléčné žlázy. 234

235 3. ÚLOHA CHAPERONOVÉHO SYSTÉMU V MALIGNÍ TRANSFORMACI A ODPOVĚDI NA PROTINÁDOROVOU TERAPII P301/11/1678, GAČR Řešitel: RNDr. Bořivoj Vojtěšek, DrSc. Anotace projektu Vývoj nádoru je mnohastupňový proces zahrnující aktivaci onkogenů a inaktivaci nádorových supresorů pomocí mutací nebo epigenetických faktorů (změn). Nedávno publikovaná data ukazují, že nádorové buňky vykazují také abnormální aktivitu chaperonů, které zajišťují správné skládání proteinů. Geneticky nestabilní nádorové buňky obsahují řadu mutovaných onkogenních proteinů, jejichž aktivita je závislá na Hsp90. Z tohoto důvodu je nádorová buňka mnohonásobně senzitivnější vůči inhibici Hsp90 oproti buňce nenádorové. Inhibice Hsp90 v nádorové buňce tak představuje nový, unikátní přístup v protinádorové terapii, který v současné době reprezentuje 15 nízkomolekulárních inhibitorů Hsp90, jejichž protinádorové působení je testováno v desítkách klinických zkoušek. Zavedení inhibitorů Hsp90 do klinické praxe je však komplikováno tím, že odpověď nádorové buňky na inhibici Hsp90 zatím nelze predikovat, protože ani mechanismus hyper-aktivace chaperonů v nádorech není dostatečně popsán. Z tohoto důvodu je náš projekt zaměřen na popis změn chaperonů u nádorů a hledání nových biomarkerů určujících senzitivitu nádoru vůči inhibitorům Hsp90. V nedávné době jsme prokázali, že mutantní nádorový supresor protein p53 je regulován systémem Hsp70/Hsp90 v kombinaci s ko-chaperony, které vedou buď k jeho stabilizaci, nebo degradaci. Cílem projektu je studovat roli chaperonového/ko-chaperonového systému u nádorových onemocnění a identifikovat mechanismy účastnící se hyperaktivace tohoto systémů v nádorových buňkách. Dále se budeme zabývat vlivem ko-chaperonů a celkovým efektem na expresi a aktivitu klientských proteinů s onkogenní funkcí. Cíle projektu Cílem projektu je analýza mechanizmů zodpovědných za funkci a hyperaktivaci chaperonového systému Hsp70/Hsp90 v nádorových buňkách. 1. Vzhledem k tomu, že aktivitu chaperonového systému Hsp70/Hsp90 ovlivňuje řada ko-chaperonů, budeme studovat zastoupení jednotlivých ko-chaperonů v multichaperonových komplexech a budeme analyzovat jejich vliv na (1) aktivitu Hsp90, (2) senzitivitu vůči inhibitorům Hsp90 (3) schopnost stabilizovat nebo degradovat klientské proteiny (4) proliferaci nádorových buněk. 2. Naše práce ukázaly, že vytváření multi-chaperonových komplexů v nádorových buňkách je silně ovlivněno posttranslačními modifikacemi. V rámci projektu proto budeme analyzovat posttranslační modifikace Hsp70, Hsp90 a jejich ko-chaperonů. Budeme sledovat vliv těchto modifikací na: (1) protein-proteinové interakce, (2) aktivitu chaperonů, (3) stabilizaci klientských proteinů (4) proliferaci a agresivitu nádoru. 3. V poslední době byly popsány nové ko-chaperony jejichž vliv na funkci Hsp70 a Hsp90 není známý. Mezi tyto ko-chaperony patří i protein TOMM34, který se skládá z dvou TPR domén, které interagují s Hsp70 i Hsp90. Dílčím cílem našeho projektu je popsat interakci mezi tímto ko-chaperonem Hsp70 a Hsp90 a objasnit roli proteinu TOMM34 v nádorové transformaci. 4. V rámci tohoto projektu budeme rovněž sledovat vliv změn chaperonového systému v nádorech na stabilitu a funkci klientních proteinů. Na základě předchozích prací budeme sledovat expresi a konformaci mutovaného proteinu p53 a jeho homologů. 5. Relevanci výsledků vzešlých z primárního výzkumu budeme validovat na souboru karcinomu ovaria o velikosti 100 vzorků. Detekované změny v chaperonovém 235

236 systému budou korelovány s klinicko-patologickými daty a s expresí známých prediktivních a prognostických markerů (ER, mutace p53, Her2, ) Metodika 1. Změny v expresi genů chaperonového systému budou detekovány na úrovni RNA pomocí real-time PCR, exprese proteinů bude detekována pomocí western-blottingu a pomocí imunohistochemie na vzorcích nádorové tkáně. Lokalizace chaperonů, kochaperonů, HSF1 a klientských proteinů bude detekována metodou nepřímé imunofluorescence. 2. Posttranslační modifikace chaperonů a ko-chaperonů budou identifikovány pomocí hmotnostní spektrometrie. Sledované proteiny budou izolovány pomocí imunoprecipitace a po elektroforetické separaci budou naštěpeny pro MS analýzu. Funkční analýza fosforylovaných nebo nefosforylovaných forem proteinu bude realizována za pomocí bodových mutací ve sledovaných serinech, threoninech nebo tyrosinech. Tyto mutanty napodobujících nebo naopak znemožňující fosforylaci budou analyzovány biochemicky (protein-proteinové interakce), nebo v po transfekci do nádorových buněčných linií. 3. Schopnost jednotlivých genů chaperonového systému působit jako oonkogeny nebo naopak jako nádorové supresory bude analyzována pomocí transformační assay. Sledovaný gen bude ko-transfekován do nenádorové buněčné linie NIH3T3 spolu s onkogenem RAS. Pomocí soft-agar assay bude vyhodnocena schopnost daného genu chaperonového systému podporovat nebo zabránit maligní transformaci. 4. Změny v protein-proteinových interakcích chaperonů budou analyzovány pomocí imunoprecipitace a detekce interagujících proteinů pomocí western blottingu nebo hmotnostní spektrometrie. Změny uspořádání multichaperonových komplexů budou kvantitativně vyhodnoceny pomocí komparativní proteomiky využívající izotopové značení SIALAC a vysokorozlišovacího hmotnostního spektrometru. 5. Interakce mezi Hsp70, Hsp90 a ko-chaperony obsahující TPR doménu (HOP, CHIP, Tomm34) budou detailně analyzovány pomocí syntetických peptidů odpovídajících C- konci Hsp70 nebo Hsp90. Biotinylované peptidy budou využity k pull-down experimentům, fluorescenčně označené peptidy peptidy budou využity pro měření disociačních konstant pomocí fluorescenční polarizace. Stav řešení / výsledky řešení v roce 2015 Výsledky výzkumu získané za rok 2015 byly publikovány v impaktovaných časopisech a prezentovány na mezinárodních a domácích sympoziích. Publikační aktivita za rok 2015 Články 1. Fraser, J.A., Worrall, E.G., Lin Y., Landre, V., Pettersson, S., Blackburn, E., Walkinshaw, M., Muller, P., Vojtesek, B., Ball, K., Hupp, T.R. Phospohomimetic mutation of the N-terminal lid of MDM2 enhances the polyubiquitination of p53 through stimulation of E2-ubiquitin thioester hydrolysis. J Mol Biol 2015;427(8): (IF2014: 4,333) Přenášky, postery 1. Ďurech, M., Trčka, F., Müller, P., Vojtěšek, B. Vliv konformace chaperonu Hsp70 na vazbu ko-chaperonu Tomm34. In: Sborník abstrakt: 6th RECAMO joint meeting Through cancer research towards applied molecular oncology , Brno, 236

237 Česká republika. Brno: Masarykův onkologický ústav Str. 32. ISBN Matoulková, E., Hrstka, R., Vojtěšek, B. Vliv 3 UTR oblasti mrna AGR2 na expresi protoonkogenu AGR2. In: Klin Onkol 2015;28(Suppl1):S165: Sborník abstrakt: XXXIX. brněnské onkologické dny a XXIX. konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky , Brno, Česká republika. ISSN X. 3. Trčka, F., Ďurech, M., Man, P., Vojtěšek, B., Müller, P. Konformační stavy chaperonu HSP70 ovlivňuje vazba kochaperonu Tomm34. In: Klin Onkol 2015;28(Suppl1):S166: Sborník abstrakt: XXXIX. brněnské onkologické dny a XXIX. konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky , Brno, Česká republika. ISSN X. 4. Matoulková, E., Hrstka, R., Vojtěšek, B. 3 UTR oblast jako regulátor hladiny exprese AGR2. In: Sborník abstrakt: 6th RECAMO joint meeting Through cancer research towards applied molecular oncology , Brno, Česká republika. Brno: Masarykův onkologický ústav Str. 50. ISBN Trčka, F., Ďurech, M., Müller, P., Vojtěšek, B. Univerzální adaptory si našly své místo v sekvenci proteinu Tomm34. In: Sborník abstrakt: 6th RECAMO joint meeting Through cancer research towards applied molecular oncology , Brno, Česká republika. Brno: Masarykův onkologický ústav Str. 58. ISBN Matoulkova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. Regulation of AGR2 expression via 3 -UTR. In: Abstractbook: EMBO/EMBL Symposium: The Non-Coding Genome , Heidelberg, Germany. Str Plán pro rok 2016 Projekt ukončen k

238 4. CENTRUM NOVÝCH PŘÍSTUPŮ K BIOANALÝZE A MOLEKULÁRNÍ DIAGNOSTICE P206/12/G151, GA ČR Spoluřešitel: RNDr. Bořivoj Vojtěšek, DrSc. Anotace projektu Projekt je zaměřen na navržení nových technik molekulární diagnostiky založených především na elektrochemické analýze elektrochemických (bio)senzorů. V rámci projektu budou využity různé techniky značení nukleových kyselin a proteinů, včetně enzymatické inkorporace modifikovaných bází, chemické modifikace biopolymerů, (imuno)techniky založené na enzymatické produkci elektroaktivních indikátorů aj. V počátečním stádiu budou pro vývoj využívány především modelové oligonukleotidy, peptidy a purifikované proteiny, zatímco v pozdější fázi bude výzkum zaměřen na optimalizaci vybraných metod pro jejich aplikaci na reálných biologických modelech. Cíle projektu Cílem projektu je vypracovat nové metody analýzy nukleotidových sekvencí, mutací, monitorování genové exprese, DNA-protein interakcí, stanovení genotoxických a ekotoxických látek, léčiv aj., jako nové účinné nástroje pro bioanalýzu a molekulární diagnostiku. Metodika 1. Genová exprese na úrovni RNA bude analyzována pomocí cdna exon array chip (Affymetrix) a qrt-pcr. 2. Proteiny ve vzorcích nádorové tkáně budou detekovány imunohistochemicky, nebo pomocí wetern blotting analýzy. 3. Pro primární analýzu nukleových kyselin nebo proteinů budou sloužit nádorové buněčné kultury. Exprese sledovaných genů bude v těchto buňkách manipulována pomocí sirna, nebo tranzientní transfekce. Stav řešení / výsledky řešení v roce 2015 Výsledky výzkumu získané za rok 2015 byly publikovány v impaktovaných časopisech a prezentovány na mezinárodních a domácích sympoziích. Publikační aktivita za rok 2015 Články 1. Koubkova, L., Vyzula, R., Karban, J., Pinkas, J., Ondrouskova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. Evaluation of cytotoxic activity of titanocene difluorides and determination of their mechanism of action in ovarian cancer cells. Invest New Drugs 2015;33(5): (IF2014: 2,919) 2. Brychtova, V., Mohtar, A., Vojtesek, B., Hupp, T. Mechanisms of anterior gradient-2 regulation and function in cancer. Semin Cancer Biol 2015;33:16-24 (IF2014: 9,330) 3. Healy, A.R., Houston, D.R., Remnant, L., Huart, A., Brychtova, V., Maslon, M.M., Meers, O., Muller, P., Krejci, A., Blackburn, E.A., Vojtesek, B., Hernychova, L., Walkinshaw, M.D., Westwood, N.J., Hupp, T.R. Discovery 1 of a novel ligand that modulates the protein protein interactions of the AAA+ superfamily oncoprotein reptin. Chem Sci 2015;6: (IF2014: 9,211) 4. Cefalu, S., Lena, A.M., Vojtesek, B., Musaro, A., Melino, G., Candi, E. TAp63gamma is required for the late stages of myogenesis. Cell Cycle 2015;14(6): (IF2014: 4,565) 238

239 5. Orzol, P., Holcakova, J., Nekulova, M., Nenutil, R., Vojtesek, B., Coates, P.J. The diverse oncogenic and tumour suppressor roles of p63 and p73 in cancer: a review by cancer site. Histol Histopathol 2015;30: (IF2014: 2,096) 6. Narayan, V., Landré, V., Ning, J., Hernychova, L., Muller, P., Verma, Ch., Walkinshaw, M.D., Blackburn, E.A., Ball, K.L. Protein:protein Interactions Modulate the Docking-Dependent E3-Ubiquitin Ligase Activity of CHIP. Mol Cell Proteomics 2015;14(11): (IF2014: 6,564) 7. Krejci, A., Hupp, T., Lexa, M., Vojtesek, B., Muller, P. Hammock: a hidden Markov model-based peptide clustering algorithm to identify 5 protein-interaction consensus motifs in large datasets. Bioinformatics [Epub ahead of print] (IF2014: 4,981) 8. Obacz, J., Takacova, M., Brychtova, V., Dobes, P., Pastorekova, S., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of AGR2 and AGR3 in cancer: similar but not identical. Eur J Cell Biol 2015;94: (IF2014: 3,825) 9. Bartošík, M., Koubková, L., Karban, J., Červenková Šťastná, L., Hodík, T., Lamač, M., Pinkas, J., Hrstka, R. Electrochemical analysis of novel ferrocene derivative as a potential antitumor drug. Analyst 2015;140(17): (IF2014: 4,107) Přednášky, postery 1. Ďurech, M., Trčka, F., Müller, P., Vojtěšek, B. Vliv konformace chaperonu Hsp70 na vazbu ko-chaperonu Tomm34. In: Sborník abstrakt: 6th RECAMO joint meeting Through cancer research towards applied molecular oncology , Brno, Česká republika. Brno: Masarykův onkologický ústav ISBN Str Koubková, L., Karban, J., Pinkas, J., Vyzula, R., Vojtěšek, B., Hrstka, R. Titanoceny jako protinádorová léčiva. In: Klin Onkol 2015;28(Suppl1):S166: Sborník abstrakt: XXXIX. brněnské onkologické dny a XXIX. konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky , Brno, Česká republika. ISSN X. 3. Koubkova, L., Karban, J., Pinkas, J., Hrstka, R., Vojtesek, B., Vyzula, R. Revealing titanocene compounds mechanism of action. In: Sborník abstrakt: 6th RECAMO joint meeting Through cancer research towards applied molecular oncology , Brno, Česká republika. Brno: Masarykův onkologický ústav ISBN Str Holcakova, J., Nekulova, M. Orzol, P., Vojtesek, B. Np63 regulates membrane proteins trafficking in breast cancer cells. In: Abstract book: 2nd International p53 conference. p53 isoforms in: cancer, aging development, degenerative diseases, infections , Aix-en-Provence, France. Str Trčka, F., Ďurech, M., Müller, P., Vojtěšek, B. Univerzální adaptory si našly své místo v sekvenci proteinu Tomm34. In: Sborník abstrakt: 6th RECAMO joint meeting Through cancer research towards applied molecular oncology , Brno, Česká republika. Brno: Masarykův onkologický ústav ISBN Str Hrstka, R., Bouchalova, P., Michalova, E., Matoulkova E., Vojtesek, B. AGR2 dependent modulation of wild-type p53 activity in response to DNA damage. In: Abstractbook: EMBO Conference - The DNA damage response in cell physiology and disease , Cape Sounio, Greece. Str Plán pro rok Příprava rukopisu o identifikaci mirna rozdílně exprimovaných u pacientek CINIII v různém věku a funkční analýza pro hlubší pochopení jejich úlohy ve vzniku a vývoji karcinomu děložního hrdla. 239

240 2. Optimalizace elektrochemické chip-based assaye pro detekci HPV, včetně odlišení high-risk a low-risk kmenů i mezi HPV16 a HPV18. Zvýšení citlivosti metody a doknčení testování klinických vzorků. 3. Využití vyvinutého elektrochemického protokolu pro testování derivátů ferrocenů, které vykazují cytotoxické vlastnosti a porovnat výsledky s výsledky jiných metod (ICP-MS or LA-ICP-MS). Zhodnotit redoxní chování metalocenů nesoucích jiné kovy např. ruthenocenů, titanocenů. Určit, které ferroceny váží DNA. 4. Podpořit cytostatické vlastnosti vybrabýcg h feerocenů a cp-aren ruthenium komplexů inkorporací N-heterocyklických substituentů. Determinovat cytotoxickou účinnost a funkční analýzy nejaktivnějších látek. 5. Další analýza úlohy proteinů rodiny anterior gradient v regulaci funkce p Studium funkce p63 a ostatních členů rodiny p53 v procesu dělení nádorových buněk a odpovědi na terapii. 7. Vývoj HDX metody pro analýzu interací DNA-protein. Metoda bude využita pro analýzu interakcí p53-dna s využitím purifikovaných proteinů a syntetické DNA s cílem popsat molekulární mechanismy zodpovědné za sekvenčně-specifické a nespecifické interakce. Byly připraveny p53 konstrukty, které vykazují pouze specifické druhy interakcí s DNA a tytobudou využity k popisu interakcí p53 s DNA v živých buňkách. 8. Proteomická analýza chaperonových komplexů v nádorových buňkách. Komplexy chaperonů Hsp70 nebo Hsp90 budou separovány pomocí pull down esejí, které byly vyvinuty v rámci projektu s cílem simulovat stressové podmínky nebo aplikaci terapeutika. Kvantifikace proteinů interagujících s Hsp70 nebo Hsp90 bude provedena metodou SWATH. 240

241 5. ANALÝZA CHAPERONOVÉHO SYSTÉMU A INDENTIFIKACE NOVÝCH BIOMARKERŮ U GYNEKOLOGICKÝCH MALIGNIT. NT/ /2012, IGA MZ ČR Řešitel: RNDr. Bořivoj Vojtěšek, DrSc. Anotace projektu Chaperony hrají klíčovou roli v nádorové transformaci díky jejich schopnosti skládat a stabilizovat řadu mutantních a onkogenních proteinů. Hyper-aktivace chaperonu Hsp90 u gynekologických malignit vede zejména ke stabilizaci steroidních receptorů, mutantního p53 a receptorů pro růstové faktory. Nádorové buňky na rozdíl od normálních tkání vykazují mnohem vyšší aktivitu Hsp90 bez adekvátního zvýšení jeho hladiny. Z tohoto důvodu je komplexní analýza chaperonového systému klíčovou podmínkou pro úspěšné zavedení inhibitorů chaperonů do klinické praxe. Vedle laboratorních experimentů zaměřených na modulaci chaperonů vzhledem k buněčnému růstu a odpovědi na terapii, budeme též analyzovat vztah mezi aktivitou chaperonového systému, hladinou chaperonů, ko-chaperonů a expresí onkogenních klientských proteinů v klinickém materiálu. Exprese genů chaperonového systému bude korelována s klinicko-patologickými daty, s cílem zhodnotit jejich vliv na metastazování, rezistenci k chemoterapii a celkové přežití. Cíle projektu Hlavním cílem je stanovit expresi a aktivitu chaperonů jako přímých konkrétních cílů protinádorové terapie, případně i jako potenciálních prediktivních indikátorů léčebné odpovědi, což v konečném důsledku umožní výběr nejvhodnější terapeutické strategie pro jednotlivé pacienty. Naše recentní výsledky ukazují, že hyper-aktivace chaperonů v nádorech je způsobena vytvářením multi-chaperonových komplexů, jejich post-translačními modifikacemi a rozdílnou expresí ko-chaperonů jako jsou HOP, CHIP a AGR2. Cílem projektu je analyzovat cytoplazmatický chaperon Hsp90 a jeho interakční partnery (CHIP, HOP, Hsp70, Aha1) stejně jako chaperony endoplazmatického retikula, zejména pak AGR2, který se podílí na vzniku rezistence na chemoterapii a na procesu metastazování u gynekologických malignit. Za použití in vitro modelů budou definovány faktory ovlivňující aktivitu Hsp90 a jeho senzitivitu k anti-chaperonové terapii. Konečné výsledky projektu tak pomohou definovat nové cíle anti-chaperonové terapie a umožní nalézt nové prediktivní markery pro terapii založenou na inhibici Hsp90. Metodika 1. Výběr souboru pacientů včetně relevantního klinického materiálu. 2. Stanovení exprese AGR2 na úrovni mrna i proteinu u tohoto souboru. 3. Pilotní imunohistochemická detekce (IHC) chaperonů a ko-chaperonů stejně jako purifikace RNA ze vzorků. 4. Ex vivo kultivace malých biopsií. 5. In vitro analýzy zaměřené na studium funkce chaperonů, ko-chaperonů a rodiny p53 pomocí IHC s využitím nově vyvinutých fosfospecifických protilátek proti Hsp90 a Hsp70. In vitro experimenty budou dále zahrnovat: i) transfekce, ii) aplikaci specifických inhibitorů Hsp90 a studium jejich potenciace s dalšími protinádorovými látkami, iii) testy buněčné proliferace (xcelligence systém, Roche), iv) klonogenní analýzy, v) studium migrace a další. 6. Stanovení exprese proteinů p63 a p73 a jejich potenciální interakce s p53 pomocí Duolink II Fluorescence. 7. Exprese studovaných genů bude stanovena pomocí qrt-pcr, imunochemických a IHC přístupů. 241

242 Stav řešení / výsledky řešení v roce 2015 Výsledky výzkumu získané za rok 2015 byly publikovány v impaktovaných časopisech a prezentovány na mezinárodních a domácích sympoziích. Publikační aktivita za rok 2015 Články 1. Hrstka, R., Bouchalova, P., Michalova, E., Matoulkova, E., Muller, P., Coates, P.J., Vojtesek, B. AGR2 oncoprotein inhibits p38mapk and p53 activation through a DUSP10-mediated regulatory pathway. Mol Oncol 2015 (accepted) (IF2014: 5,331) 2. Zahradníková, M., Vojtěšek, B., Hernychová, L. Cukry zasahují aneb glykomika na poli nádorových biomarkerů. Klin Onkol 2015;28(Suppl 2):2S20 2S25. (bez IF) 3. Obacz, J., Brychtova, V., Podhorec, J., Fabian, P., Dobes, P., Vojtesek, B., Hrstka, R. Anterior gradient protein 3 (AGR3) is associated with less aggressive tumors and better outcome of breast cancer patients. Oncotargets Ther 2015;8: (IF2014: 2,311) Přednášky, postery 1. Zahradníková, M., Řehulka, P., Link, M., Vojtěšek, B., Novotný, M.V., Hernychová, L. Uplatnění manuální chromatografické separace permethylovaných N-glykanů přítomných v sérech pacientek s nádorem vaječníků. In: Sborník příspěvků: 4. Konference České společnosti pro hmotnostní spektrometrii , Hradec Králové, Česká republika. Olomouc: Česká společnost pro hmotnostní spektrometrii Str. 41. ISBN Zahradníková, M., Nenutil, R., Vojtěšek, B., Novotný, M.V., Hernychová, L. Příběh glykomiky v centru RECAMO: Rakovina vaječníku ve vztahu k léčbě platinovými deriváty. In: Sborník abstrakt: 6th RECAMO joint meeting Through cancer research towards applied molecular oncology , Brno, Česká republika. Brno: Masarykův onkologický ústav Str. 8. ISBN Müller, P., Křivánková, K., Vojtěšek, B. Využití knihoven CRISPR endonukleáz pro hledání aktivátorů nádorového supresoru p53. In: Sborník abstrakt: 6th RECAMO joint meeting Through cancer research towards applied molecular oncology , Brno, Česká republika. Brno: Masarykův onkologický ústav Str. 30. ISBN Obacz, J., Brychtova, V., Podhorec, J., Fabian, P., Dobes, P., Vojtesek, B., Hrstka, R. Anterior gradient protein 3 (AGR3) is associated with less aggressive tumors and better outcome of breast cancer patients. In: Klin Onkol 2015;28(Suppl1):S145-S146: Sborník abstrakt: XXXIX. brněnské onkologické dny a XXIX. konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky , Brno, Česká republika. ISSN X. 5. Zahradníková, M., Nenutil, R., Vojtěšek, B., Novotný, M.V., Hernychová, L. Glykanové profilování sér pacientek s rakovinou vaječníku senzitivních na léčbu platinovými deriváty. In: Klin Onkol 2015;28(Suppl1):S153-S154: Sborník abstrakt: XXXIX. brněnské onkologické dny a XXIX. konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky , Brno, Česká republika. ISSN X. 6. Obacz, J., Brychtova, V., Vojtesek, B., Pastorekova, S., Hrstka, R. Uncovering the role of secreted anterior gradient protein 3 (AGR3) in tumor biology. In: Sborník abstrakt: 6th RECAMO joint meeting Through cancer research towards applied molecular oncology , Brno, Česká republika. Brno: Masarykův onkologický ústav Str. 51. ISBN Plán pro rok 2016: Projekt ukončen k

243 6. NOVÝ PANEL PROTEINŮ KORELUJÍCÍCH SE STAVEM LYMFATICKÝCH UZLIN U LOW-GRADE NÁDORŮ PRSU: KLINICKÁ VERIFIKACE A ÚLOHA V INVAZIVITĚ NÁDOROVÝCH BUNĚK. P304/14/19250S, GA ČR Řešitel: Mgr. Pavel Bouchal, Ph.D. Anotace projektu Zasažení lymfatických uzlin je prvním krokem metastatické kaskády, která vede k hlavním příčinám úmrtí pacientek s nádory prsu. V našem dosavadním výzkumu jsme pomocí proteomických, transkriptomických a imunohistochemických technik identifikovali panel proteinů korelujících se stavem lymfatických uzlin u low-grade karcinomů prsu. Cíle projektu Prvním cílem předkládaného projektu je verifikovat změny hladin těchto proteinů na nezávislém širším souboru nádorů prsu a definovat možnosti jejich diagnostického využití jako tkáňových markerů. Druhým cílem je pak popsat jejich úlohu v procesu buněčné migrace a invazivity jako klíčového mechanismu pro zasažení lymfatických uzlin. Metodika Bude provedena in vitro charakterizace vztahu mezi hladinami proteinů a migrací, resp. invazivitou na buněčné úrovni. Pomocí proteomických metod budou identifikovány a dalšími přístupy studovány funkční a protein-proteinové interakce na molekulární úrovni. Očekáváme, že kombinace klinických a systémově biologických dat přinese nové poznatky o proinvazivních mechanismech u identifikovaného panelu proteinů. Stav řešení / výsledky řešení v roce 2015 Výsledky výzkumu získané za rok 2015 byly publikovány v impaktovaných časopisech a prezentovány na mezinárodních a domácích sympoziích. Publikační aktivita za rok 2015 Články 1. Pavliska, L., Knizek, J., Prochazka, V., Bouchal, P., Vojtesek, B., Nenutil, R., Beranek. L. Gnostical t-tests Promising Evaluation Method of Some Medicine and Biological Data. Int J Ecol Econ Stat 2016;37(1): (accepted) (bez IF) 2. Dvořáková, M., Jeřábková, J., Procházková, I., Lenčo, J., Nenutil, R., Bouchal, P. Transgelin is upregulated in stromal cell sof lymf node positive breast cancer. J Proteomics 2015 (accepted) (IF2014: 3,888) 3. Knizek, J., Sindelar, J., Bouchal, P., Vojtesek, B., Nenutil, R., Beranek, L., Kuba, M. Tests of Hypotheses in a Set of Spectral Courses Alias Marker Statistics. Int J Stat Econ 2015 (accepted) (bez IF) 4. Pernikářová, V., Bouchal, P. Targeted proteomics of solid cancers: From quantification of known biomarkers towards reading the digital proteome maps. Expert Rev Proteomics 2015 (accepted) (IF2014: 2,896) 5. Maryáš, J., Bouchal, P PDLIM2 a jeho role v onkogenezi tumor supresor nebo onkoprotein? Klin Onkol 2015;28(Suppl 2):2S40 2S46. (bez IF) 6. Knizek, J., Bouchal, P., Vojtesek, B., Nenutil, R., Beranek, L. Gnostical p-value and Gnostical Power of Test Promising Evaluation Method of Some Medicine and Biological Data. Int J Ecol Econ Stat 2015;36(3): (bez IF) 243

244 7. Pernikářová, V., Sedláček, V., Potěšil, D., Procházková, I., Zdráhal, Z., Bouchal, P., Kučera, I. Proteome-wide dataset generated by itraq-3dlcms/ms technique for studying the role of FerB protein in oxidative stress in Paracoccus denitrificans. Data in Brief 2015: (bez IF) 8. Pernikářová, V., Sedláček, V., Potěšil, D., Procházková, I., Zdráhal, Z., Bouchal, P., Kučera, I. Proteomic responses to a methyl viologen-induced oxidative stress in the wild type and FerB mutant strains of Paracoccus denitrificans. J Proteomics 2015;125: (IF2014: 3,888) 9. Bouchal, P., Dvořáková, M., Roumeliotis, T., Bortlíček, Z., Ihnatová, I., Procházková, I., Ho, J.T.C., Maryáš, J., Imrichová, H., Budinská, E., Vyzula, R., Garbis, S.D., Vojtěšek, B., Nenutil, R. Combined Proteomics and Transcriptomics Identifies Carboxypeptidase B1 and Nuclear Factor κb (NF-κB) Associated Proteins as Putative Biomarkers of Metastasis in Low Grade Breast Cancer. Mol Cell Proteomics 2015;14(7): (IF2014: 6,564) Přednášky, postery 10. Maryáš, J., Dvořáková, M., Struhárová, I., Nenutil, R., Vojtěšek, B., Bouchal, P. Funkční charakterizace potenciálně pro-metastatických proteinů u nádorů prsu. In: Klin Onkol 2015;28(Suppl1):S146: Sborník abstrakt: XXXIX. brněnské onkologické dny a XXIX. konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky , Brno, Česká republika. ISSN X. 11. Faktor, J., Suchá, R., Struhárová, I., Nenutil, R., Bouchal, P. Advantages and drawbacks of SRM, pseudo-srm and SWATH targeted proteomics modes in cancer research. In: Sborník abstrakt: 6th RECAMO joint meeting Through cancer research towards applied molecular oncology , Brno, Česká republika. Brno: Masarykův onkologický ústav ISBN Str Maryáš, J., Dvořáková, M., Struhárová, I., Nenutil, R., Bouchal, P. Investigation of the role of PDLIM2 in breast cancer metastasis. In: Sborník abstrakt: 6th RECAMO joint meeting Through cancer research towards applied molecular oncology , Brno, Česká republika. Brno: Masarykův onkologický ústav ISBN Str Maryas, J., Dvorakova. M., Struharova, I., Nenutil, R., Bouchal, P. Investigation of pro-metastatic role of PDLIM2 protein in breast cancer using functional proteomics. In: Abstract book: 9th European Summer School Advanced proteomics , Brixen, Italy. Str Plán pro rok 2016 Proteomická analýza klinických vzorků nádorů prsu bioinformatická analýza získaných dat pro identifikaci a kvantifikaci proteinů jako potenciálních biomarkerů. Korelace ve vztaku ke klinickopatologickýcm parametrům. Studium mechanismu invazivity nádorových buněk in vitro. 244

245 7. ELEKTROCHEMICKÉ METODY PRO BIOANALÝZU NUKLEOVÝCH KYSELIN A JEJICH APLIKACE V DIAGNOSTICE NÁDOROVÝCH ONEMOCNĚNÍ. P206/14/24931P, GA ČR Řešitel: Mgr. Martin Bartošík, Ph.D. Anotace projektu Deregulace genové exprese často vede ke vzniku závažných chorob včetně rakoviny. Velké úsilí je proto věnováno k hledání nových metod pro její analýzu. V rakovinných buňkách byly mezi jinými pozorovány změny v expresi mikrorna či DNA metylaci. V porovnání s běžně používanými technikami je elektrochemie považována za levnější a rychlejší alternativu s jednodušší instrumentací. Navrhujeme proto aplikovat výsledky našeho nedávného výzkumu elektrochemie nukleových kyselin pro vývoj a optimalizaci postupů, které by vedly ke zlepšení včasné diagnostiky rakoviny. Výzkum bude zaměřen na (i) detekci specifických sekvencí mikrorna jakožto potenciálních biomarkerů za použití elektroaktivního značení a (ii) rozlišení metylované a nemetylované DNA pomocí reakce s hydrogensiřičitanem sodným, který transformuje redukovatelný cytozin na neredukovatelný uracil, ale nemění redukovatelný metylcytozín. Systematickým přístupem bude optimalizován výběr jednotlivých technik, elektrodových povrchů i elektroaktivních značek, a vhodnost metody bude otestována použitím reálných biologických vzorků. Cíle projektu Aplikace elektrochemických metod pro analýzu nukleových kyselin, zejména v souvislosti s deregulací genové exprese uplatňující se v karcinogenezi s důrazem na (i) detekci specifických sekvencí mikrorna a (ii) rozlišení metylované a nemetylované DNA po modifikaci hydrogensiřičitanem sodným. Metodika Separace nukleových kyselin pomocí magentockých kuliček Elektroaktivní značení Voltametrická a chronoamperometrická detekce Konverze cytosinu hydorgensiřičitanem sodným Štěpení nestylované DNA endonukleázami Stav řešení / výsledky řešení v roce 2015 Výsledky výzkumu získané za rok 2015 byly publikovány v impaktovaných časopisech a prezentovány na mezinárodních a domácích sympoziích. Publikační aktivita za rok 2015 Články 1. Bartošík, M., Koubková, L., Karban, J., Červenková Šťastná, L., Hodík, T., Lamač, M., Pinkas, J., Hrstka, R. Electrochemical analysis of novel ferrocene derivative as a potential antitumor drug. Analyst 2015;140(17): (IF2014: 4,107) 2. Paleček, E., Tkáč, J., Bartošík, M., Bertók, T., Ostatná, V. Paleček, J. Electrochemistry of non-conjugated proteins and glycoproteins. Towards sensors for biomedicine and glycomics. Chem Rev 2015;115(5): (IF2014: 46,568) Přednášky, postery 245

246 1. Bartošík, M., Koubkova, L., Hrstka, R., Palecek, E., Vojtesek, B. Bioelectrochemistry in molecular oncology. In: Abstracts: SMOBE Summer meeting on Bioelectrochemistry , Antwerp, Belgie. Str Ďuríková, H., Hrstka, R., Bartošík, M. Detekcia HPV pomocou elektródových biočipov. In: Sborník abstrakt: 6th RECAMO joint meeting Through cancer research towards applied molecular oncology , Brno, Česká republika. Brno: Masarykův onkologický ústav ISBN Str. 42. Plán pro rok Optimalizace senzitivity a selektivity detekce HPV DNA pomocí magnetických kuliček a peroxidázy a následná analýza klinických vzorků. 2. Výběr endonukleázy a optimalizace štěpení pro rozlišení metylované a nemetylované DNA. 3. Detekce sekvencí mikroba pomocí protilátky specifické pro RNA/DNA duplexy. 246

247 8. PROTEOMICKÁ ANALÝZA MOLEKULÁRNÍCH PODTYPŮ MEDULOBLASTOMU: ODHALENÍ KLINICKY VÝZNAMNÝCH MARKERŮ. AZV ČR, P03/15/30657A, Řešitel v MOÚ: prof. Ing. Lenka Hernychová, Ph.D. Anotace projektu Deset procent úmrtí dětí se solidními nádory je způsobeno meduloblastomem. Současná molekulární klasifikace meduloblastomu má prognostický význam. Je však založena na analýze transkriptomu, což je v běžné diagnostické praxi nákladné a jen obtížně realizovatelné. Bude využita kvantitativní proteomika k identifikaci a validaci nových proteinových markerů recentně identifikovaných molekulárních podskupin meduloblastomu a případně i rozdílně exprimovaných markerů uvnitř podskupin. Předpokládané výsledky poslouží k vývoji robustních a spolehlivých imunohistochemických testů pro rutinní diagnostiku molekulárních podskupin meduloblastomu a jsou východiskem pro vývoj cílené léčby meduloblastomu zaměřené na membránové proteiny. Cíle projektu 1. Identifikace a validace nových proteinových markerů recentně identifikovaných molekulárních podskupin meduloblastomu (tj. WNT, SHH, skupina 3, skupina 4). 2. Odhalení proteinů se vztahem k rozdílné klinické prezentaci a prognóze onemocnění i uvnitř jednotlivých podskupin. 3. Ověření hypotézy o podílu tetraspaninů a dalších membránových proteinů (např. chloride intracellular channel 1) v patogenezi meduloblastomu a o jejich rozdílné expresi mezi podskupinami. Metodika 1. Metody hmotnostní spektrometrie (Orbitrap Elite), kapalinová chromatografie. 2. Bioinformatická analýza Proteome Discoverer. 3. Kvantifikace peptidů značených TMT (Tandem Mass Tags, Thermo Scientific) značkami, fragmentační technika HCD (Higher-energy Collisional Dissociation). 4. Imunochemická analýza exprese proteinů. Stav řešení / výsledky řešení v roce Na myších tkáních proběhla optimalizace lyzačních podmínek pro mozkovou tkáň kompatibilních s následnou hmotnostně spektrometrickou analýzou a množství tkáně potřebné pro získání dostatečné koncentrace extrahovaných proteinů nezbytné pro jejich kvantifikaci proteomickými přístupy. 2. Byly přípraveny vzorky lidské mozkové tkáně s meduloblastomem stejným způsobem jako myší tkáň, ale hmotnostně spektrometrická analýza byla pozměněna pro lepší separaci komplexní směsi kapalinovou chromatografií a kvantitativní analýze na hmotnostním spektrometru 3. Byla provedena identifikace a kvantifikace proteinů přítomných v lidském meduloblastomu osmi různých vzorků pacientů a dvou buněčných linií značených deseti různými isobarickými TMT značkami. Publikační aktivita za rok 2015 Články 247

248 1. Coufalova, D., Michalova, E., Vojtěšek, B., Hernychova, L. Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry and its utilization. Mil Med Sci Lett (Voj Zdrav Listy) 2015; 84: xxx (in press) (bez IF) Přednášky, postery - Plán pro rok Bioinformatické hodnocení dat získaných proteomickou analýzou vzorků lidského meduloblastomu a dvou buněčných linií značených deseti různými isobarickými TMT značkami. 2. Analýza dalších vzorků tkáně lidského meduloblastomu a korelace získaných dat s klinicko-patologickými parametry. Statistická analýza. 3. Analýza exprese vybraných proteinů v modelových buněčných liniích a ve vzorcích tkáně různch podskupin meduloblastomů. 248

249 9. CHARAKTERIZACE NOVÝCH ORGANOMETALICKÝCH SLOUČENIN S POTENCIÁLNÍM PROTINÁDOROVÝM ÚČINKEM. Řešitel: Mgr. Roman Hrstka, Ph.D., Mgr. Hana Skoupilová Anotace projektu: Obrovský úspěch protinádorového léčiva cisplatiny stimuloval zájem o další organokovové komplexy. Navázání sacharidového substituentu na ligand představuje slibný koncept při vývoji organokovových protinádorových látek. Strukturní variabilita sacharidů by měla umožnit modifikovat jak cytostatickou aktivitu, tak i farmakologické vlastnosti výsledného komplexu. Na základě našich nedávných úspěšných výsledků navrhujeme syntézu série titanocen dichloridů a difluoridů, které ponesou sacharidové substituenty na cyklopentadienidovém ligandu a série konjugátů ferocenů s iminosacharidy. Cytostatická aktivita připravených látek bude testována na vybraných buněčných liniích. Mechanismus účinku nejaktivnějších komplexů bude detailně zkoumán včetně stanovení množství intracelulárně přijatého kovu, alterací v buněčném cyklu, interakcí s DNA, aktivace signálních drah a exprese genů uplatňujících se při buněčné smrti. Nejslibnější komplexy budou dále synteticky modifikovány s cílem zvýšit jejich protinádorovou účinnost. Cíle projektu: Nalezení nejaktivnějších komplexů ze souboru syntetizovaných organokovových sloučenin, charakterizace jejich účinku, aktivace signálních drah a jejich modifikace za účelem zvýšení jejich protinádorové účinnosti. Metodika 1. MTT assay 2. Práce s buněčnými kulturami 3. Imunochemická analýza 4. Stanovení množství kovu lokalizovaného intracelulárně (ICP-MS, elektrochemicky) 5. Funkční biologické testy (stanovení apoptózy, buněčného cyklu atd.) 6. Reportérové testy (ß-Galaktosidázová assay) 7. PCR, kvantitativní PCR Stav řešení v roce 2015: Seznámení se s metodikami pracoviště RECAMO včetně metodických postupů práce s buněčnými kulturami. Studium relevantní odborné literatury. Publikační aktivita za rok 2015: - Plán pro rok 2016: 1. Analýza cytotoxicity panelu nově syntetizovaných organokovových sloučenin. 2. Výběr nejzajímavějších sloučenin a jejich detailnější charakterizace s využitím dalších modelových systémů s cílem nalézt jejich dráhy působení v nádorové buňce. 3. Testování nově syntetizovaných glykoproteinů a analýza jejich inkorporace do plazmatických membrán. 249

250 10.INTEGRECAMO: INTELLECTUAL ANCHOR MŠMT OP VK CZ.1.07/2.3.00/ Garant projektu: RNDr. Lenka Dubská, Ph.D. Anotace projektu Rozvoj lidského potenciálu v oblasti výzkumu a inovací, především prostřednictvím postgraduálního studia a odborné přípravy výzkumných pracovníků a spolupráce v rámci sítí mezi univerzitami, výzkumnými středisky a podniky. Cíle projektu Cílem projektu IntegRECAMO je integrace špičkových výzkumníků do týmu RECAMO (Regional centre for applied molecular oncology, přenesení jejich zkušeností na mladé české vědce, vytvoření podmínek pro interakce v oboru na mezinárodní úrovni a posílení týmu RECAMO v oblasti podpůrných aktivit VaV. Dále bude cílem přímá edukace pracovníků VaV MOÚ a MU v oblastech souvisejících s onkologickým výzkumem a v oblastech podporujících VaV. Intelektuální ukotvení spočívá jednak v zapojení expertů do projektu, dále ve smyslu široké vědecké spolupráce a také ve smyslu pokrytí dosud nerealizovaných edukačních aktivit v oblastí VaV v onkologii. Realizace projektu přispěje k pokroku v oblasti odborné tj. nádorové biologie a její implikace do klinické praxe a to tím, že budou řešena témata již rozpracovaná v rámci spolupráce odborníků RECAMO a nově integrovaných odborníků. Prostřednictvím řešení těchto projektů bude zapojena cílová skupina, která bude profitovat z integrativního přístupu. Vytváření platformy pro setkávání, především, workshopy, letní školy, umožní setkávání specialistů ze všech oblastí onkologického výzkumu, rámcově výzkumníků (molekulární biologové, chemici, biostatistici, genetici, techničtí experti) a kliniků (onkologové, specialisté v zobrazovacích a laboratorních diagnostických metodách), což umožní diskuzi o nových tématech, zpracování společných projektů a další posun v lékařské vědě. Metodika 1. Podpora vytváření kvalitních týmů výzkumu a vývoje a jejich dalšího rozvoje, zejména inicializačních pracovních pozic a startovacích pracovních pozic, nabídka pozic studentům doktorského studia. 2. Zapojení zahraničních a českých výzkumníků do aktivit RECAMO a to buď přímo do Centra, nebo do aktivit řešených ve spolupráci s Centrem. Příprava zapojení jedinců i týmů do mezinárodních sítí a projektů v oblasti výzkumu a vývoje. 3. Vytváření koncepce a organizaci stáží realizačního týmu IntegRECAMO a cílové skupiny na zahraničních pracovištích. 4. Zapojení cílové skupiny do odborných aktivit: letní školy pro seznámení se s širším kontextem výzkumu v onkologické problematice; jednodenní workshopy věnován konkrétním fokusovaným tématikám v oblasti nádorové biologie a onkologického výzkumu; konference RECAMO Joint Meeting, na které se setkávají pracovníci z Centra spolu se spolupracovníky ze zahraničí. 5. Další vzdělávání pracovníků výzkumu a vývoje v oblasti řízení projektů výzkumu a vývoje, popularizace a komunikace, šíření výsledků vědy a výzkumu do praxe, transferu, technologií a v osvojování si znalostí o ochraně, ohodnocování a správě duševního vlastnictví pracovníků z oblasti výzkumu a vývoje a to zejména formou organizací jednodenních seminářů, které budou připravovány členy realizačního týmu či lektorů. Stav řešení / výsledky řešení v roce

251 1. Proběhlo 9 workshopů/seminářů z oblasti nádorové biologie zaměřených na problematiku v onkologickém výzkumu. 2. Proběhly 2 workshopy/semináře týkající se problematiky ochrany duševního vlastnictví, prezentačních dovedností a projektového managementu projektů. 3. Proběhla Letní škola IntegRECAMO Aplikovaný a klinický onkologický výzkum. 4. Proběhl 5th RECAMO Joint meeting Through cancer research towards applied molecular oncology. 5. Byly organizovány zahraniční stáže pracovníků Centra. 6. Byli přijati zahraniční výzkumní pracovníci do pracovního poměru Centra. Plán pro rok 2016 Projekt ukončen k

252 BANKA KLINICKÝCH VZORKŮ Výkonný ředitel: doc. MUDr. Dalibor Valík, Ph.D. Souhrn vývoje Banka klinických vzorků je v současnosti existující velkou infrastrukturou založenou a spravovanou Masarykovým onkologickým ústavem a je funkčně navázána na projekt OP VaVpI RECAMO. Vznik a provoz biobanky byl jedním z prioritních projektů podporovaných jak výzkumnými záměry, tak z prostředků institucionální podpory. Postupně bylo dosaženo vytčených cílů stabilního chodu biobanky s rutinním sběrem tkáňových vzorků, DNA, RNA a sér pro prospektivní a zpětné analýzy v korelaci s ostatni diagnostikou a pro výzkumné projekty (viz předchozí zprávy). Pokračování chodu a rozvoj biobanky jsou pro několik příštích let zajištěny navazujícími projekty. V roce 2009 se banka stala přidruženým a v roce 2010 řádným členem projektu Rámcového programu EU č.7 BBMRI (Biobanking and Biomolecular Research Infrastructure) a získala financování na provoz a rozvoj pro období do roku 2014 z projektu sítě českých biobank BBMR.CZ OP VaVpI MŠMT ČR. V roce 2011 byla organizačně přičleněna ke startujícímu projektu Regionálního centra aplikované molekulární onkologie (RECAMO), zašťiťujícímu pokračující vědeckovýzkuné aktivity MOÚ. Počet archivovaných vzorků v BBM 2015 Tkáně archivované v parách kapalného dusíku (primární nádory, metastázy, zdravá tkáň) 748 pacientů tzn alikvotů tkání Tkáně archivované v RNA Lateru (primární nádory, metastázy, zdravá tkáň) 781 pacientů tzn.1493 alikvotů tkání Séra archivovaná v parách kapalného dusíku 443 pacientů tzn alikvotů sér Genomová DNA 829 pacientů Dle nejčetnějších diagnóz Nádory prsu pacientů Nádory střev, rekta- 93 pacientů Melanomy - 9 pacientů Nádory gynekologické - 94 pacientů Nádory urologické - 64 pacientů Nádory varlat- 12 pacientů Ostatní diagnózy pacientů 252

253 Podíl tkání uložených v BBM dle nejčetnějších diagnóz % nádory p rsu 28% 35% nádory střev, rekta melanomy 2% 8% 13% 12% nádory g ynekologické nádory u rologické nádory varlat 2% ostatní Výběr vzorků z BBM v roce 2015 Tkáně Ing.Knoflíčková : kontrola kvality RNA u uložených vzorků období 06-12/2014 (C50, C18, C54) (primární nádor, metastáza) 12x Ing.Knoflíčková : kontrola kvality RNA u uložených vzorků období 1-5/2015 (C50, C54, C56, C18, C64) (primární nádor, metastáza, zdravá tkáň) 12x Ing.Knoflíčková : kontrola kvality RNA u uložených vzorků období 6-12/2015 (C50, C54, C56, C18, C64) (primární nádor, metastáza, zdravá tkáň), tkáň v RNA Lateru 12x Mgr.Hernychová: grantový projekt PPV 5/2015 detekce alterujících glykanových struktur v sérech a tkáních pacientek s nádorem vaječníků rezistentních k léčbě platinovými deriváty 22x Σ 58 vzorků tkání Rok Sérum-počet pacientů (celkový počet alikvotů sér) Tkáň -počet pacientů (celkový počet alikvotů tkáně-dusík) Tkáň -počet pacientů (celkový počet alikvotů tkáně-later) (78 alikvotů) (1135 alikvotů) (1073 alikvotů) (1291 alikvotů) (1572 alikvotů) (576 alikvotů) 718 (2257 alikvotů) (2238 alikvotů) 671 (2517 alikvotů) 187 (188 alikvotů) (1827 alikvotů) 646 (2379 alikvotů) 640 (1038 alikvotů) (1626 alikvotů) 734 (2816 alikvotů) 728 (1382 alikvotů) (1509 alikvotů) 715 (2887 alikvotů) 734 (1447 alikvotů) (1739 alikvotů) 818 (3341 alikvotů) 864 (1729 alikvotů) (1536 alikvotů) 837 (3475 alikvotů) 838 (1649 alikvotů) (1597 alikvotů) 804 (4140 alikvotů) 871 (1719 alikvotů) (1562 alikvotů) 843 (4552 alikvotů) 868 (1674 alikvotů) (1612 alikvotů) 824 (4555 alikvotů) 868 (1726 alikvotů) (1313 alikvotů) 748 (4150 alikvotů) 781 (1493 alikvotů) 5859 (17135 alikvotů sér) 9917 (42218 alikvotů tkání) 7379 (14045 alikvotů) 253