Pokračování kultivačních metod

Transkript

1 Pokračování kultivačních metod Fenotyp je tvořen všemi pozorovatelnými charakteristikami nebo znaky organizmu: jako je morfologie, růst, biochemické nebo fyziologické vlastnosti. Fenotyp je výsledek projevu genů daného organizmu, právě tak jako vlivů vnějšího prostředí, faktorů prostředí a jejich možných interakcí. Genotyp daného organizmu je zděděný soubor instrukcí uložený v genomu.

2 Rozdělení metod a přístupů užívaných k identifikaci mikroorganismů Klasický přístup (sledování fyziologických vlastností) - morfologie - nutriční požadavky - chemie buněčné stěny - struktura zásobních látek - obsah a složení pigmentů - schopnost využívat různé zdroje energie - patogenita - nároky na vodu, teplo, kyslík, tolerance k ph - citlivost k antibiotikům

3 Kultivační metody Metoda plotnová je používána pro průkaz (kvalita) nebo stanovení počtu (kvantita) určitých skupin, rodu nebo druhu bakterií Výhody vysoká citlivost - REFERENČNÍ METODA (ISO, EN) Nevýhody dlouhá doba do dosažení výsledků kvantita je vyjádřena jako CFU (KTJ) ne počtem bakterií

4 Kultivační metody Variantou klasické kultivační metody pro stanovení počtu (kvantita) určitých skupin nebo rodu bakterií jsou Spirálová plotnová metoda Petrifilmy Hygikulty

5 Spirálová plotnová metoda

6 Most probable number counts MPN Jedná se o metodu zjišťování počtu živých mikroorganismů ze vzorků s nízkou kontaminací. Používá se kultivace ve vhodném tekutém mediu ve třech různých ředěních, např. Navážka 10 g, 1,0 g a 0,1 g. Medium musí dát jasnou odpověď, zda je nárůst pozitivní.

7 Most probable number counts

8 Most probable number counts

9 Výpočet MPN Vzorek syrového hamburgeru byl asepticky nakrájen a navážen. Porce byly vloženy do nádob s nabohacovacím mediem (PPV) užívaním pro izolaci rodu Salmonella. Celý ISO protokol byl proveden z každé baňky, počet baněk ze kterých byly izoláty potvrzeny jako Salmonella byl získán následujícím způsobem: Množství hamburgeru vloženého do každé baňky s PPV počet baněk ze kterých byla S. izolovaná 20 g 2,0 g 0,2 g Výpočet množství S. na 1 g Z tabulky ukazuje, že průměrně 4.6 bakterií (Salmonella) bylo inokulováno do každé ze středního souboru baněk t.j.ty, které byly inokulovány 2 gramy hamburgeru. Jestliže 4.6 bylo ve 2 gramech hamburgeru, je to rovno 2.3 v 1 gram.

10 Kultivační metody - Petrifilmy Petrifilmy jsou destičky potažené kultivačními médii ve formě gelu. Destičky se inokulují 1 ml naředěného vzorku a inkubují v termostatu. Výhody destička je opatřena mřížkou pro snazší počítání kolonií speciální indikátory zbarvují narostlé kolonie a tím je zvýrazňují

11 Kultivační metody - Hygikulty Hygikult je plastová destička oboustranně pokrytá kultivačním médiem, umístěná ve sterilní nádobce. Je určen k rychlému monitorování úrovně mikrobiální kontaminace v potravinářských provozech. Výhody snadnost použití mimo laboratoř Nevýhody sortiment destiček je omezen pouze na indikátorové mikroorganizmy

12 Membránová filtrace Metoda slouží k zakoncentrování bakterií kultivační metoda mikroskopie filtry z nylonu, PVC, polykarbonátu, polyesteru, kovu Výhody filtrací většího objemu lze zvýšit citlivost metody teplý agar nepoškozuje bakterie

13 Mikroskopické metody Klasické metody - stanovení počtu bakterií po obarvení preparátu Moderní metody - epifluorescence spojuje metodu filtrace a fluorescenční mikroskopie Princip spočívá ve vazbě fluorochromového barviva na DNA (RNA) mikrobů (DEFT, BACTOSCAN) Výhody rychlost provedení Nevýhody metoda detekuje i mrtvé buňky

14 Rozlišení živých a mrtvých buněk Barviva se schopností pronikat membránou umožňují rozlišit živé buňky od mrtvých. Epifluorescentní barviva směsná populace Micrococcus luteus a Bacillus cereus obarvená LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit. Bakterie s intaktní cyt. membránou vykazují zelenou fluorescenci, bakterie s poškozenou membránou svítí červeně. Je to umožněno multiexpozicí za použití speciálního optického filtru, vhodného pro simultánní zobrazení DAPI, fluoresceinu a Texas Red barvy,molecular Probes, Inc.

15 Impedanční metoda Metabolická činnost bakterií mění složení kultivačního média, což vede ke změnám vodivosti. Systém je složen ze dvou elektrod ponořených do živného média. Ty jsou připojeny na zdroj střídavého proudu a měříme jimi impedanci. Stoupající vodivost vede k poklesu impedance. Výhody - automatizace Nevýhody vyšší cena přístroje - při smíšených kulturách nestandardní výsledky Využití indikátorové skupiny mikroorganizmů

16 Impedanční metody ( ) Měření změn konduktance nebo impedance Růst bakterií a metabolická aktivita způsobuje změny v chemickém složení kultivačního media, které jsou kontinuálně monitorovány Faktory ovlivňující měření 700 Druh mikroorganismu Složení kultivačního media Teplota Počáteční koncentrace buněk vodivost (Si) doba kultivace (h) 8 10

17 Nutná podmínka pro měření vodivosti Medium musí obsahovat - selektivní složky - diagnostické složky - přítomnost TMAO :trimethyl amin oxid, - u salmonel TMAO reduktasa tvoří silně nabitou trimethylamoniový iont - účinek na vodivost

18 Imunologické metody Princip metody ELISA Enzymaticky značená specifická protilátka je vázána na vhodný povrch (mikrotitrační destička). Za přítomnosti antigenu (specifické bakterie) vzniká komplex AgAb. Ten je možné detekovat buď přímo spektrofotometricky nebo vizualizovat konjugátem.

19 Imunologické metody Výhody - automatizace - rychlost - vyšetření velkých sérií vzorků Nevýhody vyšší náklady na vyšetření - skríningová metoda Využití detekce bakteriálních patogenů - detekce bakteriálních toxinů

20 Imunologické metody GLISA Gold labelled immuno sorbent assay Salmonella E.coli O157 Campylobacter sp.

21 Imunomagnetická separace Princip jsou-li v substrátu přítomny sledované bakterie, váží se na super-para-magnetické částice obalené specifickou protilátkou. Komplex antigen - protilátka se odseparuje pomocí magnetu a dále zpracuje. Výhody zkracuje dobu kultivace zachycuje i subletálně poškozené buňky

22 Imunomagnetická separace

23 Metabolická aktivita Bioluminiscence ATP je zdrojem energie všech živých buněk. Podstata metody spočívá v reakci ATP s enzymem luciferázou vázanou na luciferin. luciferin Při tvorbě luciferin-adenylátového komplexu se z ATP uvolňuje pyrofosfát. Za přítomnosti kyslíku dochází k uvolnění světla, jehož intenzita je závislá na výchozím množství ATP. Použití rychlá detekce mikrobiální kontaminace v potravinářských provozech (HACCP)

24 Metabolická aktivita LUCIFERIN + LUCIFERASA + ATP LUCIFERIN-LUCIFERASA-AMP+ PP+O2 OXYLUCIFERIN*-LUCIFERASE-AMP+H2O OXYLUCIFERIN + LUCIFERASE + AMP+hμ 560nm

25 Enzymatická aktivita Redukce barviv Resazurinový test je založen na průkazu bakteriálních reduktáz. Ty redukují resazurin rezorufin hydrorezorufin met. modř leukoforma Rychlost barevné změny je závislá na množství mikroorganizmů. Využití rychlá detekce CPM v mléce nebo mase

26 Polymerázová řetězová reakce Autor Kary Mullis Nobelova cena za chemii, 1993 Molekulárně genetická metoda Selektivní zmnožení určité oblasti DNA způsobem podobným in vivo replikaci

27 Polymerázová řetězová reakce Princip Princip PCR je založen na využití DNA polymerázy pro opakované kopírování templátové (vzorové) molekuly DNA. Syntéza je řízena krátkými oligonukleotidy (primery), které nasedají na templátovou DNA na začátku a konci amplifikovaného fragmentu, každý s jiným vláknem původní dvouřetězcové DNA. PCR je velice citlivá metoda umožňující detekci jediné buňky. Mnohonásobné amplifikace je dosaženo opakováním tří základních kroků - denaturace, hybridizace a syntézy nových vláken

28 Polymerázová řetězová reakce Vysvětlení základních pojmů templát DNA, která slouží jako vzor (šablona) pro syntézu nových řetězců. Pro reakci PCR se používá genomová DNA o koncentraci přibližně 10 ug/ml. DNA polymeráza termostabilní enzym používaný k syntéze nové DNA ve směru 5-3 podle sekvence nukleotidů v templátu od místa navázaného primeru až po jeho konec. Enzym Taq DNA, který se nejčastěji používá pro PCR, je izolován z bakterie Thermus aquaticus a umožňuje opakované zahřátí na teplotu 95 C. Enzym zůstává při této teplotě aktivní až 40 minut. dntp - nukleotidtrifosfáty (adenin, guanin, cytosin a thymin)

29 Polymerázová řetězová reakce Vysvětlení základních pojmů primery jsou oligonukleotidy (obvykle bazí), které svou sekvencí odpovídají DNA templátu a které vymezují úsek templátu, který bude amplifikován master mix reakční směs zajišťující optimální podmínky pro průběh reakce. Je složena z koncentrovaného pracovního pufru obsahujícího hořečnaté ionty zajišťujícího vhodné podmínky pro aktivitu polymerázy, směsi dntp, polymerázy, specifických primerů a vody. termocykler (teplotní cyklátor) - je zařízení, ve kterém za optimálních teplotních podmínek probíhá PCR reakce. marker velikostní standard, používá se k odhadu velikostí DNA produktů na základě pohyblivosti v agarózovém gelu

30 Amplifikace DNA tři opakující se kroky: 1. denaturace 2. annealing 3. polymerace Enzym DNA polymerase používá primery jako startovací body pro syntézu nového řetězce Při teplotě 94 C se oddělují řetězce DNA C nasedají primery Polymeráza pokračuje v syntéze nového řetězce komplementárně k cílové DNA sekvenci Cílová DNA sekvence, ohraničená primery, je zdvojená a proces může znovu začít

31 Teploty řídící PCR Denaturace DNA C Prodlužování, extense 72 C Nasednutí, annealing velká variabilita teplot. Hlavní faktor - GC% primerů. Primery bohaté na GC - 63 C, 62 % Primery s nízkým obsahem GC - 45 C 33 %

32 Způsoby detekce PCR produktu po ukončení amplifikační reakce pomocí barviv integrujících s DNA (Ethidium bromid) radioaktivní značka přímo v PCR produktu nebo hybridizační sondě (radioaktivní izotopy) neradioaktivní značka digoxigenin, biotin (protilátky konjugované s enzymem), fluorescenční barviva a enyzmy

33 Elektroforetická detekce produktu PCR Nejčastěji agarosová gelová elektroforéza Fragmenty DNA elektrické pole podle velikosti Může být detekován až 1 ng DNA Gel barven ethidium bromidem Ethidium bromid interkalační činidlo vážící se mezi vlákna DNA a floreskuje po ozářením UV o λ nm

34 Výsledky PCR Mr Mr marker 100bp 1500 bp 1. Pozitivní kontrola 2. Negativní kontrola 500 bp 3. DNA C. jejuni 4. DNA C. coli 287 bp 100 bp

35 Analýzy po elektroforetickém rozdělení hybridizační analýza PCR produkt přenést na membránu Southern blot hybridizace s označenou specifickou DNA sondou štěpení restrikčními enzymy specifický produkt PCR fragmenty DNA o známé délce

36 Moderní metody identifikace PCR V podstatě jde o amplifikaci (zmnožení) DNA nebo RNA (poté jde o RT-PCR, reverzní transkripce). Zahrnuje několik odlišných reakcí, které tvoří cyklus: 1. denaturace - DNA templát je denaturován (oddělení řetězců), 2. annealing - oligonukleotidové primery se váží (hybridizace) na oddělené řetězce templátu (primery se volí tak, aby byla amplifikována celá potřebná sekvence), 3. polymerace - tvoří se nové komplementární řetězce působením polymerasy.

37 Moderní metody identifikace PCR PCR se používá převážně pro amplifikaci úseků DNA do 2000 bazí. S větší délkou roste pravděpodobnost chyb polymerasy. Používané oligonukleotidové primery mají mezi nukleotidy, důležitá je rovnoměrná distribuce oblastí bohatých na G/C a A/T páry, specifický annealing a pevnost vazby při C. Pro PCR je důležitá čistá práce, tj. vyhýbat se kontaminacím v laboratoři (rukavice, nekontaminované chemikálie atd.). Real-time termocykléry - amplifikovaná DNA je detekována v exponenciální fázi citlivými on-line metodami (fluorescence -proby, barviva).

38 Moderní metody identifikace Využití PCR a jejich modifikací ve výzkumu a praxi Základní výzkum Aplikovaný genetický výzkum Klinické disciplíny Ostatní aplikace izolace genů nebo jejich částí sekvenování DNA mutageneze in vitro, modifikace konců DNA analýza klonů z genomových knihoven příprava značených sond prenatální diagnostika dědičných chorob detekce mutací v genech studium polymorfismu genů populační genetika detekce patogenních bakterií, virů, prvoků a hub typizace patogenních mikroorganismů identifikace onkogenů typizace nádorů stanovení pohlaví archeologie soudnictví kriminalistika potravinářská mikrobiologie