Vývoj biomarkerů. Jindra Vrzalová, Ondrej Topolčan, Radka Fuchsová FN Plzeň, LF v Plzni UK

Transkript

1 Vývoj biomarkerů Jindra Vrzalová, Ondrej Topolčan, Radka Fuchsová FN Plzeň, LF v Plzni UK

2 Proč potřebujeme laboratoř? Proč potřebujeme biomarkery? Časná diagnostika Správná diagnostika a stratifikace pacientů (určení rizika a prognózy) léčba šitá na míru Sledování léčby Odpověď: Kvůli personalizované medicíně

3 Náš cíl Ideální biomarker 1. specifický pro dané onemocnění 2. negativní v nepřítomnosti daného onemocnění 3. koncentrace korelující s klinickým stádiem onemocnění 4. sensitivní chceme léčit/klasifikovat všechny pacienty Nesplňuje žádný jednotlivý biomarker Hledání nových biomarkerů Kombinace biomarkerů nové analytické přístupy multiplex

4 Porozumění jednotlivým proteinům Celkové porozumění biol. procesům Výběr technologie Počet sledovaných proteinů Elisa, RIA xmap etc. Microarraye MS

5 Základní výzkum objev biomarkeru Odlišná exprese u kontrol a u pacientů kandidáti na biomarker Srovnávací (semi-kvantitativní) analýza - porovnání velkého množství proteinů, jejich variace a modifikace v buňkách, tkáních a biologických tekutinách a jejich korelace se vznikem, progresí nebo remisí onemocnění Semi-kvantitativní proteomika Dvourozměrná gelová elektroforéza (2DGE) Srovnávací přístupy se značením nebo bez (e.g., Isotope Coded Affinity Tags, itraq, Stable Isotope Labeling with AminoAcids in Cell Culture) LC-MS Citlivost (concentration sensitivity level = CSL) není nižší než 10 nm.

6 Základní výzkum 2D elektroforéza MS v tandemu se sep. technologies HPLC / MS ESI, MALDI, SELDI CZE / MS

7 Základní výzkum technologie proteinových čipů Značení všech proteinů ve vzorku Přímé srovnání chorobné/zdravé b.m. Protein microarrays and proteomics, Gavin MacBeath

8 Cyklus vzniku biomarkeru

9

10 Vývoj biomarkeru

11 Vývoj biomarkeru

12 Validace biomarkeru Požadavek: imunoesej nebo MS technika musí prokázat, že je bezpečná a efektivní pro určený klinický účel sběr vzorků minimalizace vstupního biasu Přednostně: při stanovení by neměl být znám klinický výsledek prospektivní Retrospektivně pouze pokud je bias preanalytických podmínek, skladovacích podmínek a dalších relevantních faktorů kontrolován/monitorován Charakteristiky klinického využití testu musí být testovány na dostatečně velkém počtu pacientů s onemocněním, pro které bude test používán Klinické testování markeru by mělo být vždy prováděné finální verzí analytické soupravy a přístroje, ve více laboratořích a pečlivě zhodnoceno analytickými a statistickými postupy

13 Úzké hrdlo při vývoji biomarkerů Nové přístupy k identifikaci a kvantifikaci proteinů a jejich vzájemných interakcí Sekvenování velkého množství proteinů a peptidů na MS Proteinové mikročipy Multiplexové imunoeseje na mikrokuličkách Pochopení molekulárních mechanismů nemocí vzrůstá Konstantní množství schválených proteinových biomarkerů FDA průměr ~1,5 proteinu/rok v posledních 15 letech Oproti více než 1,200 kandidátů na biomarkery publikovaných ve vědecké literatuře (pouze pro onkologické aplikace)

14 Bariéry biomarkerů Třídění kandidátů Analytické nástroje Technologická variabilita Nařízení, zákony Sběr vzorků Kontrola kvality Návrh experimentů Reagencie Sady dat

15 Příčiny Úzkého hrdla Technologická variabilita v rámci a mezi jednotlivými proteomickými platformami Nesprávný sběr vzorků, skladování a zpracování Neschopnost vyselektovat správné biomarkery již před časově a finančně náročnými klinickými testy Nedostatek znalostí vědců o požadavcích na biomarkery pro validační a zákonný proces Nedostatečná dostupnost vysoce kvalitních reagencií a souborů dat v rámci vědeckého světa Nutnost zlepšit analýzu dat - porovnávání velkých souborů dat a vícerozměrná data Nesprávný návrh experimentálních studií biomarkerů na klinických vzorcích

16 The National Cancer Institute s Clinical Proteomic Technologies for Cancer initiative NCI-CPTC

17 Rozhodující kroky při vývoji nové IVD založené na více proteinech (kombinaci) Přesné zjištění analytických vlastností metodiky Nezávislá klinická validace testu tj. validace na nezávislém souboru vzorků Zajistit, aby vlastnosti metody byly popsány na základě analýzy nezatížené vstupním biasem Preanalytika vzrůstá význam aspektů spojených s odběrem vzorku, jeho transportem a skladováním a musí být součástí preklinického a kinického testování IVD interference a zkřížená reaktivita je velmi důležitá u proteinových esejí Kontroly (interní, externí, postupu atd.) musí být stanoveny pro metodiky před jeho uvedením na trh. Pro standardizaci využívat mezinárodní standardy a kontrolní materiály s návazností Studie stability reagencií, variace mezi šaržemi nezbytné pro všechny soupravy

18 Verifikace biomarkerů Klinický bioanalytik verifikuje (ověřuje) metodiku předtím validovanou výrobcem Post-marketingové analytické ověření probíhá rutinně jako součást kontroly kvality Cíl: ověřit zda IVD (přístroj, kontroly, reagencie ) splňují specifikace a podmínky na daném pracovišti Obvykle mezilehlá preciznost, opakovatelnost, linearita, bias, spodní limit detekce a kvantifikace Při hodnocení multiplexové proteinové metody je vhodné použití výpočtu skóre pro jednotlivé pacienty? Jak provádět studie pro validaci/verifikaci skóre? Jedním z přístupů je analýza dostatečného množství pacientů a kontrol (diagnóza stanovena na základě dalších vyšetření) a porovnání skóre s konečnou klinickou diagnózou

19 Podmínky pro přechod (multiplexových) biomarkerů do rutinní klinické praxe Proteomika a bioinformatika zaznamenala v posledním desetiletí velký rozvoj platforem a technologií pro identifikace biomarkerů chorob Bez správného designu studií a využívání robustních analytických technik přijde očekávání a úsilí vložené do biomarkerů nazmar Panely analytů musí být optimalizovány na základě klinických požadavků Validace panelů analytů vyžaduje studie na rozsáhlých kohortách Plné využití biomarkerů pouze v kombinaci s multiparamatrickým hodnocením

20 Která cesta je ta správná? Multiplexing????? Najdi cestu k biomarkerům Nanodiagnostika založená na biosenzorech Integrace genomiky a proteomiky

21 Literatura