Masarykova univerzita. Lékařská fakulta VYUŽITÍ IMUNOHISTOCHEMICKÝCH METOD V DIAGNOSTICE TUMORŮ ŠTÍTNÉ ŽLÁZY. Bakalářská práce

Transkript

1 Masarykova univerzita Lékařská fakulta VYUŽITÍ IMUNOHISTOCHEMICKÝCH METOD V DIAGNOSTICE TUMORŮ ŠTÍTNÉ ŽLÁZY Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant Vedoucí diplomové práce: MUDr. Jitka Kyclová Autor: Jakub Pavlík, DiS. Brno, duben 2013

2 Anotace Jméno a příjmení autora: Jakub Pavlík, Dis. Název bakalářské práce: Využití imunohistochemických metod v diagnostice tumorů štítné žlázy Pracoviště: Vedoucí bakalářské práce: FN Brno Ústav Patologie MUDr. Jitka Kyclová Rok obhajoby bakalářské práce: 2013 Souhrn: Cílem této práce bylo přehledně zpracovat problematiku onemocnění štítné žlázy, zejména nádorového onemocnění a zhodnotit přínos imunohistochemických vyšetřovacích metod v diagnostice tyreoidálních malignit. Úvodní část obsahuje poznatky o jednotlivých onemocněních štítné žlázy a klasifikaci. Speciální část popisuje teoretické poznatky z dané laboratorní problematiky a informace o používaných markerech (HBME-1, gal-3 a CK-19). V experimentální části se zabývám problematikou zpracování tkáně pro histologické vyšetření a metodikou detekce těchto markerů, následným vyhodnocením a porovnáním expresí použitých markerů s dostupnou studií. Jejich exprese byla sledována na dvaceti vzorcích, které byly suspektní na nádorové onemocnění štítné žlázy. Naše výsledky zahrnovaly nejvíce diagnózu papilárního karcinomu a výsledky prokázaly silnou pozitivitu použitých markerů. Klíčová slova: nádory štítné žlázy, imunohistochemie, CK-19, HBME-1, gal-3 Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.

3 Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracoval samostatně pod vedením a konzultací MUDr. Jitky Kynclové a uvedl v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje. V Brně dne Podpis autora

4 Poděkování Tímto bych chtěl poděkovat své rodině za podporu a pomoc v těžkých chvílích, paní MUDr. Jitce Kyclové za její vedení a paní Haně Rychtecké za její praktické poznatky z oblasti imunohistochemie.

5 OBSAH 1 ÚVOD Štítná žláza Onemocnění štítné žlázy Kongenitální malformace Regresivní a oběhové změny Atrofie Amyloidóza Záněty Akutní thyreoiditida Subakutní granulomatozní thyreoiditida (de Quervainova) Chronická lymfoplazmocelulární thyreoitida (Hashimotova) Chronická sklerotizující thyreoiditida (Reidelova) Další - speciální formy Hyperplazie Rozdělení strumy dle struktury Rozdělení strumy dle patogeneze Rozdělení strumy dle výskytu Rozdělení strumy dle poměru koloidu a parenchymu Nádory štítné žlázy Benigní nádory Maligní nádory Folikulární adenom štítné žlázy Folikulární karcinom štítné žlázy Papilární karcinom štítné žlázy Medulární karcinom Nediferencovaný karcinom Nízce diferencovaný karcinom štítné žlázy TNM klasifikace nádorů Thyreoideální syndromy Hypotyreóza Hypertyreóza Graves-Basedowa nemoc Speciální část Imunohistochemie Protilátky

6 Polyklonální protilátky Monoklonální protilátky Imunohistochemické metody Markery imunohistochemické detekce štítné žlázy Marker Galectin Marker Cytokeratin Marker HBME Experimentální část Principy zpracování tkáně Odběr materiálu Fixace tkáně Zalévání tkáně do parafinu Odvodnění tkáně Prosycení tkáně látkou rozpouštějící parafin Prosycení tkáně parafinem Zalití tkáně do parafinu Krájení tkáňových bločků Barvení tkáňových řezů pomocí imunometod Odparafinování tkáňových řezů Blokace endogenní peroxidázové aktivity Odmaskování antigenů Aplikace primární protilátky a detekčního systému Vizualizace a dobarvení jader Odvodnění a projasnění Uzavírání a pozorování Praktická realizace experimentu Odběr a fixace Zalévání tkáně do parafinu Odvodnění, prosycení tkáně látkou rozpouštějící parafin, prosycení parafinem Zalití tkáně do parafinu a krájení Barvení tkáňových řezů pomocí imunometod Odparafinování tkáňových řezů Blokace endogenní peroxidázové aktivity Odmaskování antigenů Aplikace primární protilátky a detekčního systému Vizualizace Dobarvení jader, odvodnění a projasnění

7 3.2.4 Montování a uzavírání Zpracování a porovnání získaných dat Výsledky markerů u papilárního karcinomu Výsledky markerů u folikulárního adenomu Výsledky markerů u adenomatoidního uzlu Výsledky tumorových markerů u folikulárního karcinom Závěr Literatura Příloha I Tabulka výsledků diagnostiky tumorových markerů Příloha II Doplňující fotografie Seznam obrázků Obr. 1 Popis štítné žlázy [1], histologický snímek stavby fyziologického folikulu [2] Obr. 2 Amyloidní struma, HE, 200x, difúzní amorfní materiál v interfolikulární oblasti. [4] Obr. 3 HE Nález u subakutní thyreoitidy, obrovské mnohojaderné buňky (de Quervainovy) [5] Obr. 4 Destrukce parenchymu štítné žlázy, lymfoplazmocelulární infiltrace se zarodečnými centry (vlevo)[6], Nález onkocytárně změněných thyreocytlů (vpravo) [7] Obr. 5 Folikulární varianta papilokarcinomu 40x HE Obr. 6 Psammomatozní tělísko (vlevo)[8] a matnicová jádra u papilárního karcinomu (vpravo)[9] Obr. 7 Collumnar cell varianta [10] Obr. 8 Medulární karcinom polygonální buňky [11] Obr. 9 Nediferencovaný karcinom štítné žlázy [12] Obr. 10 Nízce diferencovaný karcinom [13] Obr. 11 Imunoglobulin [14] Obr. 12 Princip LSAB systému [15] Obr. 13 Princip EnVision [16] Seznam grafů Graf 1 Procentuální výskyt různých nádorů štítné žlázy dle (Fölsch, a další, 2003) Seznam tabulek Tab. 1 Hyperplazie fyzický nález na krku dle WHO Tab. 2 T klasifikace nádorů štítné žlázy (Novák, 2011) Tab. 3 T klasifikace pro anaplastický karcinom (Novák, 2011) Tab. 4 N klasifikace nádorů štítné žlázy (Novák, 2011) Tab. 5 M klasifikace nádorů štítné žlázy (Novák, 2011) Tab. 6 Odvodňovací proces Tab. 7 Proces prosycení tkáně látkou rozpouštějící parafin Tab. 8 Odparafinování proces Tab. 9 Přehled použitých protilátek a jejich ředění Tab. 10 Proces odvodňování preparátů Tab. 11 Proces projasnění preparátů Tab. 12 Výsledky markerů u vzorků papilárního karcinomu Tab. 13 Výsledky markerů u vzorků folikulárního adenomu Tab. 14 Výsledky markerů u vzorků adenomatoidního uzlu

8 Seznam použitých zkratek AA AEC AJCC Anti TG Anti TPO CEA CK-19 DAB Fab Fc ft4 gal-3 HBME-1 HE HLA HRP Ig IL LSAB PBS SAA T3 T4 Tg TNF TTF-1 TSH TRH UICC WHO Amyloid associated 3-amino-9-ethylkarbazol American Joint Committee on Cancer Protilátka proti thyreoglobulinu Protilátka proti thyreoideální peroxidáze Karcinoembrionální antigen Cytokeratin-19 3,3-diaminobenzidin Fragmemt s antigenní specificitou Fragment readily crystalized Volná frakce tyroxinu Galectin-3 Antigen Hector Battifora Mesothelial cell Hematoxylin-eosin Human Leukocyte Antigen Horseradish peroxidase (křenová peroxidáza) Imunoglobulin Interleukin Labeled StreptAvidin Biotin Fosfátový pufr Serum amyloid associated protein Trijodtyroid Tyroxin Tyreoglobulin Tumor necrosis faktor Thyroid Transcription factor-1 Hormon stimulující štítnou žlázu Tyreotropin stimulující hormon International Union Against Cancer World Health Organisation (Světová zdravotnická organizace)

9 1 ÚVOD Cílem této práce je přehledně zpracovat problematiku onemocnění štítné žlázy, zejména nádorového onemocnění a zhodnotit přínos imunohistochemických vyšetřovacích metod v diagnostice tyreoidálních malignit. Onemocněním štítné žlázy se věnuje převážně první úvodní kapitola. Specializovaná kapitola popisuje problematiku analyzovaných markerů exprimovaných při onemocněních štítné žlázy a dále jejich detekce použitými imuno metodami. Experimentální část klade důraz na některé z vybraných imunohistochemických metod, které jsou používány k diagnostice již zmíněných onemocnění. Metody byly zvoleny na základě již používaných postupů v laboratoři, kde byla provedena i samotná praktická část této práce. Pro přehlednost této části je třeba náležitě popsat úlohu a funkci všech procesů. Jedná se zejména o přípravu a konečnou detekci odebrané tkáně štítné žlázy. Z nasbíraných dat výsledů imunohistochemických metod je pak možné provést základní statistické úsudky. Tyto informace poslouží k prvotnímu vytyčení záměru práce a povedou k následnému porovnání s aktuálními dosaženými výsledky laboratorní diagnostiky. 1.1 Štítná žláza Štítná žláza je nepárový orgán, který se nalézá na přední straně krku, naléhající na hrtan a průdušnici. Je tvořena pravým a levým lalokem. Tyto laloky jsou spojeny úzkým můstkem - isthmem. V místě spojení se může vyskytovat lobulus pyramidalis, který může dosahovat až ke kořeni jazyka, kde se v embryonálním období zakládá vývoj štítné žlázy. Na povrchu štítné žlázy je vazivové pouzdro, ze kterého vybíhají vazivová septa a dělí štítnou žlázu na jednotlivé laloky a lalůčky. (Klika, a další, 1988) Štítná žláza je tvořena téměř kulatými folikuly, jedná se tedy o žlázu folikulární. Folikuly jsou vystlány jedinou vrstvou epitelu. Epitel bývá výrazně variabilní. Ve folikulech se nalézá jako plochý nebo cylindrický typ. (Mačák, a další, 2004) Změna tvaru je závislá na produkci thyreoglubulinu, přičemž plochý epitel je klidový a cylindrický produkční. Cytoplazma folikulárních buněk je bazofilní, se značným obsahem drsného endoplazmatického retikula a sekrečních granul. Povrch folikulárních buněk vybíhá v mikroklky, jejichž počet je závislý na funkčním a produkčním stavu. Folikulární buňky secernují do folikulu koloid, který je bohatý na thyreoglobulin. (Klika, a další, 1988) - 9 -

10 Obr. 1 Popis štítné žlázy [1], histologický snímek stavby fyziologického folikulu [2] Thyreoglobulin je ve folikulu skladován a po hormonálním podmětu TSH konvertován na tyroxin (T4) a trijodtyronin (T3), které jsou následně vstřebávány folikulárníni buňkami a předány do krevního oběhu. (Mačák, a další, 2004) Mezi bazální membránou folikulu a folikulárními buňkami se mohou objevovat parafolikulární buňky, taktéž zvané C-buňky. Tyto buňky zpravidla utvářejí shluky 3-5 buněk a produkují hormon kalcitotnin. (Povýšil, a další, 2007) 1.2 Onemocnění štítné žlázy Onemocnění štítné žlázy lze rozdělit do několika tříd. Kongenitální malformace Regresivní a oběhové změny Záněty Hyperplázie Nádory Thyroidealní syndromy Kongenitální malformace Mezi kongenitální malformace štítné žlázy patří aplazie, hypoplazie a perzistentní ductus thyreoglossus. Aplazie a hypolazie se projeví jako kongenitální hypotyreóza, avšak tyto malformace jsou vzácné. Při perzistením ductus thyreoglossus se objevují krční cysty, ve kterých se vyskytuje serózní, hlenovitý nebo koloidní obsah. (Povýšil, a další, 2007)

11 1.2.2 Regresivní a oběhové změny Regresivní změny jsou vyvolány poruchou funkce buněk, která může vést až k odumření buněk nebo tkáně. Nejtěžší změnou z hlediska závažnosti je nekróza, mírnější změny poté atrofie a dystrofie. (Mačák, a další, 2004) Atrofie Atrofie je jeden z druhů regresivní změny, který má za následek zhoršení funkce normálně vyvinutého orgánu v důsledku úbytku zdravé tkáně. (Mačák, a další, 2004) Příčinnou těchto změn u štítné žlázy by mohl být útlum hypothalamo-hypofýzo-thyreoideální osy, aterosklerotické vaskulární změny nebo chronické záněty. Při prohlubující se atrofii může být doprovázena syndromem hypotyreózy. (Povýšil, a další, 2007) Amyloidóza Amyloidóza je stav, při kterém dochází k hromadění látek proteinového charakteru v mimobuněčném prostoru (Obr. 2). (Mačák, a další, 2004) Amyloidóza postihující štítnou žlázu často doprovází generalizovanou amyloidózu typu AA. (Povýšil, a další, 2007) Amyloidóza typu AA je sekundární druh amyloidózy, u tohoto druhu amyloidózy lze prokázat AA protein (Amyloid Associated), při čemž v játrech vzniká jeho prekuzor SAA (serum amyloid associated protein). Jeho produkci stimuluje IL-1, IL-6 a TNF α. (Mačák, a další, 2004) Za výjimečných okolností může dojít k masivnímu postižení se zvětšením štítné žlázy (struma amlyoidea) vedoucí k ukládání depozit amyloidu v intersticiu (Obr. 2) za současné atrofie žlázového parenchymu a doprovodné hypotyreózy. Depozita amyloidu jsou také často přítomna u medulárního karcinomu z C-buněk. (Povýšil, a další, 2007) Obr. 2 Amyloidní struma, HE, 200x, difúzní amorfní materiál v interfolikulární oblasti. [4]

12 U benigních nádorů a v hyperplastických (nodózních) strumách se dále často nachází nekróza, hyalinoza, dystrofická kalcifickace a hemosiderinová pigmentace. (Povýšil, a další, 2007) Záněty Zánět je základní obranný a reparační mechanizmus, jehož cílem je udržení stálého vnitřního prostředí. I tento proces může při určitých podmínkách organismus poškozovat. (Bartůňková, a další, 2005) Probíhá ve tkáni jako reakce na lokální poškození infekčního, mechanického, chemického, toxického nebo buněčného původu. (Mačák, a další, 2004) Zánětlivá onemocnění štítné žlázy lze rozdělit do několika jednotek: Akutní thyreoiditida Subakutní granulomatozní thyreoiditida (Quervainova) Chronická lymfoplazmocelulární thyreoitida (Hashimotova) Chronická sklerotizující thyreoiditida (Reidelova) Další formy Akutní thyreoiditida Akutní thyreoiditida je vzácné onemocnění často se vyskytující v souvislosti se septickým stavem, traumatem, při diagnostické punkci štítné žlázy nebo chirurgickým výkonem na krku. Taktéž je možný nález v souvislosti s hnisavou pyelonefritidou nebo výjimečně i jako metastatický absces při endokarditidě. Toto onemocnění se vyskytuje jen vzácně a zpravidla u imunologicky oslabených pacientů nebo u osob s výraznou poruchou imunity. (Vlček, 2010) Hlavním klinickým projevem je velmi bolestivé, obvykle jednostranné zduřeni štítné žlázy s lokálním zarudnutím a vysokými teplotami. (Vlček, 2010) U toho typu zánětu je přítomna vysoká sedimentace a granulocytóza. Funkce štítné žlázy je zachována. (Vlček, 2010) Subakutní granulomatozní thyreoiditida (de Quervainova) Subakutní granulomatozní thyreoiditida de Quervainova je pravděpodobně virového původu, bez prokázané autoimunitní komponenty. Vyskytuje se převážně u žen středního věku nejčastěji po prodělané respirační virové infekci. Tento druh zánětu bývá méně často

13 vyšetřován, protože spontánně odezní. (Povýšil, a další, 2007) Byla prokázána úloha dědičnosti a vztah k antigenu HLA-B35. (Mačák, a další, 2004) U tohoto onemocnění je žláza zvětšená na dvojnásobek až trojnásobek své obvyklé velikosti, při pohmatu bolestivá, s celkovou zvýšenou teplotou až horečkou. Zánět je v akutní fázi spojený s hyperfunkčními příznaky. (Vlček, 2010) V histologickém preparátu se nalézá ložisková disrupce a nekróza folikulů s granulocytární a později granulomatózní zánětlivou odpovědí. Taktéž lze nalézt obrovské mnohojaderné buňky (de Quervainovy, Obr. 3), také lymfocyty, plazmocyty, makrofágy a epiteloidní buňky. Celý zánětlivý proces se hojí fibrotizací. (Povýšil, a další, 2007) Obr. 3 HE Nález u subakutní thyreoitidy, obrovské mnohojaderné buňky (de Quervainovy) [5] U tohoto typu zánětu bývá přítomna zvýšená hodnoty sedimentace, CRP a leukocytóza. Dále je v akutní fázi zvýšený ft 4 a nízká hladina TSH. (Vlček, 2010) Chronická lymfoplazmocelulární thyreoitida (Hashimotova) Chronická lymfoplazmocelulární thyreoitida je častější než de Quervainova thyreoiditida (postihuje 6-10 % žen a 1-2 % mužů). (Vlček, 2010) Jedná se o autoimunitní onemocnění bez objasněného spouštěcího mechanizmu. Pravděpodobně je tento proces vyvolán virovou infekcí. U tohoto onemocnění dochází k defektu T-lymfocytů, zejména potlačení funkce T- supresorů a převahou funkce T-helperů. Po chybné prezentaci HLA-DR antigenů dochází k produkci autoprotilátek B-lymfocyty. Má zpravidla pomalý průběh (i několik let), bez lokální bolestivosti, přechodně jen při opětovném vzplanutí nemoci. Přechodně dochází k příznakům hyperfunkce, která postupně přechází do hypofunkce. Pacienti s rozvinutou formou bývají častěji postiženi primárním B-lymfomem ale i karcinomem štítné žlázy. (Povýšil, a další, 2007)

14 Obr. 4 Destrukce parenchymu štítné žlázy, lymfoplazmocelulární infiltrace se zarodečnými centry (vlevo)[6], Nález onkocytárně změněných thyreocytlů (vpravo) [7] Autoprotilátky nejčastěji postihují mikrosomy (peroxidáza) a v menší míře také thyreoglobulin, T4 a T3. U mnohých pacientů se taktéž vyskytují protilátky proti TSH receptoru.(povýšil, a další, 2007) Protilátky proti TSH blokují jeho funkci, což vede k hypofunkci štítné žlázy. (Mačák, a další, 2004) V histologickém preparátu je nápadné utlačování folikulů lymfatickou tkání s velkým množstvím lymfocytů a ojedinělým výskytem zárodečných center, přičemž se zde nacházejí atrofické a zanikající folikuly (Obr. 4 vlevo). Thyreocyty vykazují onkocytární transformaci (Obr. 4 Vpravo). Tyto buňky také nazývané jako Hürtleho buňky, bývají popisovány jako velké eozinofilní buňky s granulovanou cytoplazmou a excentricky uloženým jádrem. Jejich cytoplazma je vyplněna zvětšenými nepravidelnými mitochondriemi. V pokročilé fázi zánětu dochází k fibrotizaci. (Povýšil, a další, 2007) V laboratorních výsledcích jsou patrné velké vzestupy anti-tpo a anti-tg, později i vzestup hladiny TSH. (Vlček, 2010) Toto onemocnění postihuje nejčastěji ženy mladšího a středního věku, ale může postihovat i dětské pacienty. V závislosti na těchto zjištěních se dá rozdělit i na několik podjednotek např. dětská, postpartuální, subklinická či podle funkce nebo přítomnosti strumy. (Povýšil, a další, 2007) Chronická sklerotizující thyreoiditida (Reidelova) Chronická sklerotizující thyreoiditida se vyskytuje velice vzácně. Jedná se o invazivní thyroiditidu, která má silnou tendenci fibrotizovat. Může postihovat jen část žlázy nebo lalok, vždy se ale rozšiřuje z destruované zmenšené štítné žlázy na pouzdro nebo do okolí (krční

15 cévy). Postižená část štítné žlázy je nahrazena tuhým vazivem, ve kterém se nachází malobuněčná infiltrace.(povýšil, a další, 2007) Funkce štítné žlázy postupně klesá, klinické známky zánětu nejsou přítomny. (Zamrazil, a další, 2003) Další - speciální formy Jako další klinicky definované formy (speciální) zánětu je možno zmínit dětskou lymfocytární tyreoiditidu, asymptomatickou poporodní tyreoiditidu a poiradiačni zánět. (Vlček, 2010) Jedná se však o klinické stavy Hyperplazie Hyperplazie je nenádorové zmnožení buněk a tkání, u štítné žlázy je toto zvětšení nad 60g u dospělého jedince a je hodnoceno jako struma. (Povýšil, a další, 2007) Podle klasifikace WHO je struma štítná žláza, která je viditelná nebo hmatná. Nezvětšená žláza není běžným fyzickým vyšetřením na krku nijak prokazatelná. Strumu lze rozdělit podle několika hledisek. (Zamrazil, a další, 2003) Podle WHO se fyzický nález na krku dělí na tyto stupně: Úroveň Stupeň 0 Stupeň 1 Stupeň 2 Nález Žláza není viditelná ani hmatná Žláza je hmatná a viditelná při záklonu hlavy Žláza je hmatná a viditelná při normální poloze hlavy Tab. 1 Hyperplazie fyzický nález na krku dle WHO Rozdělení strumy dle struktury Dle struktury lze strumu rozdělit na uzlovitou a difúzní (Schéma 1). Pokud se ve štítné žláze nenachází žádný uzel, jedná se o difúzní formu, pokud tomu tak není a je přítomen jakýkoliv uzlovitý útvar jedná se o formu nodózní. U difúzní formy dochází k rovnoměrnému zvětšení obou laloků na základě zmnožení a zvětšení thyreocytů nebo na podkladě autoimunitního zánětu. (Límanová, 2002) U pokročilejšího stadia difúzní strumy může docházet k uzlové přestavbě. (Zamrazil, a další, 2003)

16 Dle struktury Uzlová Difúzní Nodózní Polynodózní Schéma 1 Rozdělení strumy dle struktury Uzlová ložiska se dále rozlišují podle počtu uzlů na formy uninodózní (přítomný jediný uzel) a polynodózní (přítomno více uzlů). Polynodózní forma je typická většími i menšími uzly, které vznikly jako důsledek přestavby a degeneracee thyreoidální tkáně. (Límanová, 2002) Uzly můžou mít výrazně rozdílnou stavbu a to solidní, cystickou a komplexní. (Brunová, a další, 2009) Rozdělení strumy dle patogeneze Dle patogeneze lze roztřídit strumuu na eufunkční, nádorovou, vyvolanou zánětem a strumuu z akumulace cizorodých hmot (Schéma 2). (Povýšil, a další, 2007) Dle patogeneze Eufunkční Nádorováá Vyvolaná zánětem Maligní Benigní Akumulace cizorodých hmot Schéma 2 Rozdělení strumy dle patogeneze U Eufunkční strumy dochází k nedostatečné syntéze hormonů na základě geneticky podmíněného nedostatku enzymů pro jejich syntézu. Přičemž bylo popsáno několik odchylek v syntéze. (Límanová, 2002) Porucha vychytávání jódu Porucha konverze anorganického jódu na organický deficit peroxidázy Defekt v syntéze thyreoglobulinu Defekty v syntéze jodtyroninů Defekty v dejódazách

17 U strumy z akumulace cizorodých hmot dochází k hromadění amyloidu. Rozdělení strumy dle výskytu Dle výskytu lze rozdělit strumu na endemickou a sporadickou (Schéma 3). Dle výskytu Endemická Sporadická Nedostatek jódu Pusobení sturminogenů Schéma 3 Rozdělení strumy dle výskytu Endemická struma nastává, když postihuje v určitém území více než 10 % populace. Endemickou strumu lze rozdělit podle příčiny jejího vzniku na strumu eufunkční (z nedostatku jódu v potravě) a strumu vyvolanou působením strumigenů. Přítomnostt struminogenů narušuje výstavbu thyroidealních hormonů, a tak snižuje její činnost. (Límanová, 2002) Rozdělení strumy dle poměru koloidu a parenchymu Strumu lze taktéž rozdělit na základě poměru mezi koloidem a parenchymem žlázy (Schéma 4). U parenchymatozní strumy je poměrově přítomno více tkáně než koloidu, u koloidní strumy je tomu naopak. (Povýšil, a další, 2007) Poměr parenchymu a koloidu Parenchymatózní Koloidní Schéma 4 Rozdělení strumy dle poměru parenchymu a koloidu Nádory štítné žlázy Nádorové bujení je označení stavu, při kterém dojde k nekontrolovanému růstu buněk z vnějších nebo vnitřních příčin. Nádory dělíme podle biologické povahy na nezhoubné (benigní) a zhoubné (maligní)

18 Benigní nádory Benigní nádory jsou nezhoubné pomalu rostoucí nádory s místní expanzí, při čemž expanze nepoškozuje významně okolní struktury. Tento typ nádoru je často vazivově opouzdřený. Pouzdro vzniká z vlastního stromatu nádoru, ale jeho část může vzniknout atrofií okolní tkáně z důsledku místní tlakové expanze. Tímto mechanizmem může vznikat pouzdro i u nádorů, které vlastní pouzdro běžně nemají. Jejich umístění nebo působení může způsobit negativní dopad na zdraví pacienta, avšak tyto nádory jsou zpravidla dobře odstranitelné. (Rejthar, a další, 2002) Maligní nádory Maligní nádory jsou zhoubné a agresivní nádory schopné neustálého růstu a šíření. Šíření tkáňovými štěrbinami se nazývá infiltrativní růst (nižší stupeň agresivity). V případě rozrušování okolních tkání vzniká růst invazivní (vyšší stupeň agresivity), který je často doprovázen poruchou funkce postižené tkáně a případným krvácením z narušených cév. Pro tento typ nádoru je dále charakteristické zakládání dceřiných nádorových ložisek tzv. metastáz. Dceřiná ložiska nemají morfologickou souvislost s primárním nádorem a jsou od něj vzdáleny. Transport metastatických buněk může být zprostředkovaný lymfatickými nebo krevními cestami, anebo je možný i růst po povrchu různých dutin (např. peritoneum, perikard). (Rejthar, a další, 2002) Podle WHO v rozvinutých zemích nádory štítné žlázy tvoří přibližně 1 % všech malignit. Benigní nádory štítné žlázy jsou běžné, zatímco karcinomy jsou vzácné, přesto představují nejběžnější malignity endokrinního systému. Onemocnění štítné žlázy tvoří kolem 90 % endokrinopatií, postihuje 5-7 % české populace. (Vlček, 2010). Rozdělení nádorů dle výskytu jednotlivých forem ukazuje Graf 1. Je vidět že největší poměrnou část zabírá papilární karcinom, dále je nejčastěji diagnostikovaný folikulární karcinom a poté pod hranicí 10% medulární karcinom a další. (Fölsch, a další, 2003)

19 16% 5% 1% 1% Papilární karcinom Folikulární karcinom Medulární karcinom 75% Nediferencované karcinomy Ostatní (např. teratom) Graf 1 Procentuální výskyt různých nádorů štítné žlázy dle (Fölsch, a další, 2003) Podle výchozí buňky a její diferenciace se dělí na vzniklé z folikulárních nebo parafolikulárních buněk. Mezi méně běžné typy nádorů vycházejícíchh z folikulárních buněk patří nízce diferencovaný a nediferencovaný karcinom. (McDougall, 2006) Na základě morfologického hlediska je lze řadit do hlavních skupin: Nádory Benigní Maligní Folikulární adenom Folikulární karcinom Papilární karcinom Medulární karcinom Nediferencova ný karcinom Nízce diferencovaný karcinom Onkocytární Toxický Schéma 5 rozdělení nádorů dle morfologického hlediska Folikulární adenom štítné žlázy Folikulární adenom je solitární, opouzdřená benigní neoplázie pocházející z folikulárních buněk štítné žlázy. Svou buněčností a vzhledem se odlišuje od okolního parenchymu tkáně.(mcdougall, 2006) Většinou je přítomno pouze jedno ložisko, více ložisek je méně časté. Vlivem expanzivního růstu dochází v okolním parenchymu k tlakové atrofii. (Povýšil, a další, 2007)

20 Tento nádor má kulovitý až vejčitý tvar o velikosti 1-3 cm. Může u něho docházet k regresivním změnám, v tomto případě nejčastěji ke krvácení, jizvení, kalcifikaci nebo osifikaci. (Čáp, a další, 2003) Dle histologického obrazu (morfologie), se folikulární adenom dělí na makrofolikulární formu, mikrofolikulární formu, trabekulární formu nebo solidní a normofolikulární typ. (McDougall, 2006) Klinicky může být adenom doprovázen syndromem hypertyreózy (toxický adenom). Zvláštní jednotku představuje onkocytární adenom, u něhož je přítomnost Hürtleho buněk. (Mačák, a další, 2004) Tyto buňky mají objemnou eozinofilní cytoplazmu (nakupení mitochondrii) a velké excentrické jádro s nápadným jadérkem. (Povýšil, a další, 2007) Tyto buňky se vyskytují jednotlivě nebo ve shlucích s ostrým ohraničením. Buňky onkocytárního adenomu reagují při barvení na Tg, ale barvení je méně intenzivní a difúznější než u folikulární neoplázie, barvení na TTF-1 je zpravidla negativní. (McDougall, 2006) Mezi další vzácné varianty folikulárního adenomu patří adenolipom a adenochondrom. Ty obsahují jako metaplastickou mesenchymální komponentu tukovou tkáň nebo chrupavku. (McDougall, 2006) Folikulární karcinom štítné žlázy Folikulární karcinom se vyskytuje ve zvýšené míře v oblastech s nedostatkem jódu, a to častěji u žen než u mužů v poměru 3:1. Podle průzkumu provedeném v USA tvoří 5-10 % malignit štítné žlázy. (McDougall, 2006) Může vznikat maligním zvratem folikulárního adenomu. (Povýšil, a další, 2007) Dobře diferencované folikulární karcinomy jsou z histologického hlediska podobné folikulárnímu adenomu (Obr. 5). Folikulární karcinom lze od folikulárního adenomu odlišit díky jeho invazivitě do cév, prorůstáním skrz vazivové pouzdro do okolního parenchymu a případným metastázam do lymfatických uzlin, kostí a jater. (Mačák, a další, 2004) V metastazujících ložiscích lze prokázat thyreoglobulin. Syndrom tyreotoxikózy je zde výjimečný. (Povýšil, a další, 2007)

21 Obr. 5 Folikulární varianta papilokarcinomu 40x HE Papilární karcinom štítné žlázy Papilární karcinom je nejčastějším maligním maligním nádorem ve štítné žláze (kolem 80 %)) v oblastech s dostatkem jódu v potravě. Nejčastěji se vyskytuje u žen středního věku a to až 3x častěji než u mužů.(mcdougall, mužů.(mcdougall, 2006) Nádory jsou různé velikosti od několika milimetrů milimetrů po cca 10 cm. Nádory N menší než 1 cm jsou považovány za mikrokarcinomy, které mohou metastazovat do lymfatických uzlin. (Povýšil, a další, 2007) Tyto to metastázy u mikrokarcinomů jsou obecně velice vzácné. vzá (McDougall, 2006) Tyto nádory bývají velice buněčné. Papilární struktury mohou mít vějířovité uspořádání s centrální cévou.(mcdougall, cévou.(mcdougall, 2006) Diagnostickým znakem pro tento typ nádoru je výskyt tzv. matnicových jader (Obr. Obr. 6 vpravo), vpravo) která jsou vetší než u ostatních thyreocytů. Mnoho buněk toho nádoru má oválné jádro s podélným zářezem nebo centrálním projasněním (pseudoinkuze). Taktéž (pseudoinkuze). aktéž je možno pozorovat překrývající překrývající se jádra a psamomatozní tělíska (Obr. Obr. 6 vlevo).. (Povýšil, a další, 2007) Poměrně často je tento typ ná nádoru doru bilatelární a multifokální. Lze ze se setkat s ložisky kalcifikace. (McDougall, 2006) Obr. 6 Psammomatozní tělísko (vlevo)[8] (vlevo) a matnicová jádra u papilárního karcinomu (vpravo)[9] (vpravo)

22 V 1/3 případů pacientů s papilárním karcinomem jsou přítomny protilátky proti Tg. (McDougall, 2006) U papilárního karcinomu se vyskytuje několik variantních forem (Schéma 6). Papilární karcinom Folikulární varianta Columnar cell varianta Solidní varianta Tall cell varianta Difúzně sklerotická (diffuse sclerosing) Insulární varianta Schéma 6 rozdělení variantních forem papilárního karcinomu Mezi nejčastější patří folikulární varianta. Tato variantaa je predominantně nebo výlučně složená z neoplastických buněk s rysy papilárního karcinomu s folikulárním uspořádáním. Velice často se u těchto buněk nalézá silně eozinofilní koloid, vzhled jádra je typický pro papilární karcinom, ale nemusí být přítomen u 1000 % případů. (McDougall, 2006) Difúzně sklerotizující varianta je více běžná u dětských a u dospívajících pacientů. Je nejvíce charakteristická rozsáhlým nahrazením jednoho či obou laloků hyalinizující fibrózní tkání a lymfoidními buňkami. Neoplastické buňky jsou uspořádány do malých ostrůvkůů s početnými psamomatozními tělísky a squamozní metaplázii. (McDougall, 2006) Tall cell varianta a columnar cell variantaa mají horší prognózu, taktéž oba typy mají velké vyjádření (větší než 5 cm). U Tall cell varianty jsou buňky dvakrát delší než širší a vyskytují se ve většině nádoru (viz Příloha II) ). Buňky mají jádro typického vzhledu pro papilární karcinom a bohatou eozinofilní cytoplazmu.(mcdougall, 2006)

23 Obr. 7 Collumnar cell varianta [10] Columnar cell varianta má buňky s jemně rozptýlenými a hyperchomatickými jádry (Obr. 7). Jádra jsou oválná s nedostatkem jaderných zářezů a intranukleárních inkluzí. Buňky tohoto typu mohou být rozmístěny okolo fibrovaskulárního jádra. Jejich vzhled se nejčastěji přirovnává k sekrečnímu endometriu se subnukleárními vakuolami. (McDougall, 2006) Další varianty tohoto nádoru jsou vzácné.(mcdougall, 2006) Medulární karcinom Medulární karcinom tvoří 5-10 % z karcinomů štítné žlázy. Medulární karcinom vychází z parafolikulárních buněk štítné žlázy (C-buňky). (Povýšil, a další, 2007) Vyskytuje se většinou ve formě sporadické (80 % případů), ale též jako familiární forma v rámci mnohotné endokrinní neoplázie typu II-MEN II. (Mačák, a další, 2004). U tohoto typu nádoru se nacházení malé polygonální nebo vřetenité buňky (Obr. 8). (Povýšil, a další, 2007) Buňky netvoří folikuly, ale jsou trsech (klastr) nebo shlucích. Jádro je hyperchromatické a různé velikosti. Některé buňky jsou dvoujaderné nebo vícejaderné s excentrickým uložením. Občas lze nalézt rudá granula a jaderné inkluze. (McDougall, 2006) Obr. 8 Medulární karcinom polygonální buňky [11] Stroma nádoru obsahuje amyloid hormonálního původu. (Povýšil, a další, 2007) Tento amyloid je přítomen u 50 % vzorků. Pro diagnostiku lze použít imunologické barvení na kalcitonin (diagnostický) a karcinoembryonální antigen (CEA). (McDougall, 2006) Tento typ nádoru produkuje hormony, které mají vliv na klinické symptomy a projevy nádoru. Mezi tyto symptomy patří např. hypokalcémie, průjmy a oběhové poruchy. Prognóza

24 sporadických forem je příznivá, metastazování nádoru se generalizace je výjimečná. (Povýšil, a další, 2007) nachází až u pozdějších stadií, Nediferencovaný karcinom Nediferencovaný karcinom taktéž zvaný anaplastický, patří k nejagresivnějším nádorům. Jeho výskyt je nejčastější mezi dekádou života pacienta. (Mačák, a další, 2004) Vykazuje rychlou invazi do okolí žlázy s devastací okolních struktur a metastázemi do regionálních i vzdálených orgánů. (Vlček, 2010) Tento typ nádoru je velmi buněčný se známkami nekrózy a krvácením. Buňky jsou obvykle pleomorfní různého tvaru a velikosti. U tohoto nádoru lze nalézt veliké osteoklastoidní buňky a mnohojaderné buňky (Obr. 9), (původ buněk může být značně různorodý např. lymfo-epiteloidní, chrupavčitý nebo kostní). V 50 % případů jsou buňky pozitivní při barvení na keratin, ale zbarvení není rovnoměrné. Nádor není imunoreaktivní na barvení Tg nebo TTF-1. (McDougall, 2006) Obr. 9 Nediferencovaný karcinom štítné žlázy [12] Lze ho rozčlenit do několika forem dle následujícího schématu: Nediferencovaný karcinom Malobuněčná forma Velkobuněčná forma Sarkomatoidní Metaplastická Schéma 7 Rozdělení forem nediferencovaného karcinomu

25 Nízce diferencovaný karcinom štítné žlázy Nízce diferencovaný karcinom leží na pomezí mezi dobře diferencovanými karcinomy (papilárním a folikulárním) a nediferencovaným karcinomem. Jako nízce diferencovaný karcinom lze označit nádor, který vychází z folikulárních buněk, při čemž má solidní, insulární nebo trabekulární uspořádání. Obr. 10 Nízce diferencovaný karcinom [13] Karcinom obsahuje nádorové buňky, které nevykazují znaky papilokarcinomu (s výjimkou případného přítomného rezidua diferencovaného papilokarcinomu, které může být někdy jeho součástí). Dále přítomnost nekrózy, modelovaných hyperchromních jader (Obr. 10) a více než 3 mitózy na 10 HPF (zobrazení 400x, 10 zorných polí). (Ryška, 2008) TNM klasifikace nádorů Pro určení stádia nádorů vznikla TNM klasifikace, která poskytuje informace o prognóze, výzkumu a hodnocení zhoubných nádorů. Toto hodnocení je založeno na anatomickém rozsahu nemoci a skládá se ze tří složek. (Novák, 2011) Rozsah primárního nádoru (T) Nepřítomnost či přítomnost a rozsah metastáz v regionálních mízních uzlinách (N) Nepřítomnost či přítomnost vzdálených metastáz (M) Pro tuto klasifikaci existuje mnoho podkladů a kritérií. Například anatomická lokalizace, histologický typ, diferenciace a rozsah onemocnění aj. (Novák, 2011) Přiřazením číslic k těmto písmenům vzniká různý rozsah (T 0-4, N0 3, M 0-1). Klasifikace byla ustanovena UICC (International Union Against Cancer) a je shodná s klasifikací AJCC (American Joint Committee on Cancer). (Novák, 2011)

26 Klasifikace TNM pro štítnou žlázu: T Klasifikce TX T0 T1 T1a T1b T2 T3 T4a T4b Pozn. Primární nádor nelze hodnotit Bez známek primárního nádoru Nádor do 2 cm v největším rozměru, omezen na štítnou žlázu Nádor do 1 cm v největším rozměru, omezen na štítnou žlázu Nádor větší než 1 cm, ne však více než 2 cm v největším rozměru Nádor větší než 2 cm, ne však více než 4 cm v největším rozměru, omezen na štítnou žlázu Nádor větší než 4 cm v největším rozměru, omezen na štítnou žlázu nebo jakýkoliv nádor s minimálním šířením mimo štítnou žlázu (např. šíření do m. sternothyreoideusnebo měkkých tkání kolem štítné žlázy) Nádor se šíří za pouzdro štítné žlázy a postihuje jakoukoliv z následujících struktur: podkožní měkké tkáně, larynx, tracheu, jícen, n. laryngeus recurrens Nádor postihuje prevertebrální fascii, cévy medistina nebo obrůstá a.carotis Všechny anaplastické/ nediferencované karcinomy se považují za T4 Tab. 2 T klasifikace nádorů štítné žlázy (Novák, 2011) Pouze pro anaplastický karcinom platí: T4a T4b Nádor (jakékoliv velikosti) omezen na štítnou žlázu Nádor (jakékoliv velikosti) se šíří za pouzdro štítné žlázy Tab. 3 T klasifikace pro anaplastický karcinom (Novák, 2011) Multifokální nádory všech histologických typů by měly být označeny písmenem (m), např. T2(m). (Pro klasifikaci je určující nádor největšího rozměru (Novák, 2011) N Klasifikce NX N0 N1 N1a N1b Regionální mízní uzliny nelze hodnotit Regionální mízní uzliny bez metastáz Metastázy v regionálních mízních uzlinách Metastázy uzlin etáže VI (v klasifikaci dle Robbinse), v mízních uzlinách pretracheálních a paratracheálních, včetně prelaryngeálních a mízní uzlině delfské (Poirierově) Metastázy v jiných jednostranných, oboustranných nebo druhostranných krčních (etáže I, II, III, IV nebo V - klasifikace dle Robbinse) nebo horních mediastinálních mízních uzlinách Tab. 4 N klasifikace nádorů štítné žlázy (Novák, 2011)

27 M Klasifikce MX M0 M1 vzdálené metastázy nelze hodnotit bez vzdálených metastáz vzdálené metastázy Tab. 5 M klasifikace nádorů štítné žlázy (Novák, 2011) Thyreoideální syndromy Jedná se o funkční poruchy štítné žlázy, přičemž tato aktivita může být snížená (hypotyreóza), nebo zvýšená (hypertyreóza). K posouzení těchto stavů slouží stanovení volných frakcí T 3 at 4 a dále také hladina TSH. Pro doplnění diagnózy lze stanovovat i protilátky proti peroxidáze (anti-tpo) a proti thyreoglobulinu (anti-tg). (Vlček, 2010) Hypotyreóza Hypotyreóza se je stav nedostatku hormonů štítné žlázy a lze ji podle příčin rozdělit na primární a sekundární (centrální). Příčina primární hypotyreózy je přímo ve štítné žláze. Mezi příčiny lze zařadit Hashimotovu tyreoiditidu (viz str ), chirurgické odnětí nebo ozáření štítné žlázy. (Vlček, 2010) Sekundární hypotyreóza vzniká poruchou hypofýzy (neuvolňuje dostatek TSH) a bývá způsobena adenomem (ne však TSH produkujícím). Další možností je poškození hypothalamu, u kterého bývá nejčastějším důvodem zánět. Příčiny hypotyreózy mohou být vrozené nebo získané. Mezi projevy vrozené hypotyreózy patří kretenizmus, který se vyskytuje jako endemický (nedostatek jódu) nebo sporadický v případě individuálních faktorů (např. hypoplazie, aplazie aj.). (Povýšil, a další, 2007) Pokud není doplňována hladina jódu během normálního vývoje, dochází k zpomalení růstu a nanizmu (disproporciálnímu), deformitám kostí a duševním poruchám. (Mačák, a další, 2004) Mezi projevy získané hypotyreózy patří myxedém (suchá kůže s otokem způsobená hromaděním mukosubstancí v intersticiu). Hypotyreóza může být způsobená odstraněním štítné žlázy, nádorem nebo zánětem. Mezi další projevy získané hypotyreózy patří hypotermie a reverzibilní mentální retardace. (Mačák, a další, 2004) Myxedém je až desetkrát častější u žen než u mužů a může vyústit v myxedémové kóma. (Povýšil, a další, 2007) Hypertyreóza U hypertyreózy dochází k hypermetabolickému stavu v důsledku nadprodukce tyreoideálních hormonů nebo jejich vystupňovanému uvolňování do krevního oběhu. Lze ji rozdělit na primární a sekundární (centrální). U primární hypertyreózy je nejčastější příčinnou

28 působení autoprotilátek proti TSH receptoru při Graves-Basedowy nemoci, dále pak autonomní adenom, případné předávkování při nevhodné substituci hormonů štítné žlázy a subakutních zánětů. Centrální hypertyreóza vzniká u adenomu hypofýzy s nadprodukcí TSH či při nadprodukci TRH u mozkového nádoru (thyreotropní adenom hypofýzy). (Vlček, 2010) Thyreotoxikóza se projevuje nezávisle na příčině zvýšenou teplotou kůže, intolerancí tepla, hypertenzí, neklidem nebo svalovou slabostí. Thyreotoxikoza může vyústit v thyreotoxickou krizi s letálním selháním srdečního rytmu a selháním krevního oběhu.(povýšil, a další, 2007) Graves-Basedowa nemoc Jedná se difúzní toxickou hyperplázií, kterou jsou nejčastěji postiženy ženy v dekádě života. Štítná žláza je u tohoto stavu zvětšená až na trojnásobek své velikosti. Histologicky je přítomen vysoký folikulární epitel, který vytváří pravé i nepravé papilární formace.(povýšil, a další, 2007) 2 Speciální část 2.1 Imunohistochemie Imunohistochemické metody se používají k detekci různých antigenů. Tyto antigeny jsou endogenního (cytoskeletární antigeny) nebo exogenního původu (bakteriální antigeny). V případě přítomnosti daného antigenu dojde k vazbě protilátky. Tuto reakci lze detekovat různými způsoby a jsou založené na různých principech. Slouží jako doplňující vyšetření k rutinním metodám (HE) a k upřesnění diagnózy. (Lukáš, a další, 1997) Protilátky Protilátky jsou specifické bílkoviny (glykoproteiny) při elektroforetickém rozdělení spadající do γ-frakce krevních bílkovin, jsou také nazývány jako imunoglobuliny. Protilátky jsou produkovány B-lymfocyty v závislosti na antigenní stimulaci příslušným antigenem. Mají tvar písmene Y, a nacházejí se v krvi vyšších obratlovců v pěti různých třídách a to IgA, IgD, IgE, IgG a IgM (dělení podle typu těžkého řetězce). (Hořejší, a další, 2009) Imunoglobuliny jsou tvořeny dvěma lehkými (L - light chain) a dvěma těžkými řetězci (H - heavy chain), (Obr. 11). Těžké řetězce jsou mezi sebou spojeny disulfidickými (cystinovými) můstky. Ke každému těžkému řetězci je pomocí cystinových můstků navázán lehký řetězec. Oba řetězce tvoří smyčky polypeptidového řetězce stabilizované cystinovým můstkem domény. Těžký řetězec má čtyři domény (některé frakce i pět), zatímco lehký řetězec má

29 domény dvě. Tyto domény se dělí na variabilní (V) a konstantní (C). Variabilní domény jsou přítomny na N-konci těžkého i lehkého řetězce a značí se tedy V H a V L. Variabilní domény obou řetězců společně vytváří vazebné místo pro antigen a jejich struktura je závislá na individuální produkci různých imunoglobulinů. Zbylé domény jsou konstantní a shodné pro řetězce dané třídy imunoglobulinů. (Hořejší, a další, 2009) Molekulu imunoglobulinu lze proteolyticky rozštěpit (papain, pepsin) na charakteristické fragmenty F ab a F c. V případě rozložení imunoglobulinu papainem jsou vytvořeny dva monovalentní fragmenty F ab a jeden F c, zatímco v případě štěpení pepsinem vzniká jeden fragment bivalentní F a zbytek molekuly je rozložen na malé peptidy. Fragment F c (fragment readily crystalized) vzniká štěpením těžkých řetězců v kloubní oblasti imunoglobulinu a přispívá k imunitním reakcím (opsonizace, aktivace C1 složky komplementu). Kloubní oblast je značně flexibilní a může se měnit v závislosti na dostupnosti antigenu. (Lukáš, a další, 1997) U třídy IgA a IgM je přítomen polypeptidový J- řetězec (joining), který je spojuje do větších celků a to u IgA převážně do dimerů, v menší míře i do trimerů nebo tetramerů. Třída IgM se vyskytuje jako pentamer nebo monomer (součást povrchu B-lymfocytů). (Krejsek, a další, 2004) Na základě rozdílů ve struktuře těžkých řetězců lze rozlišit základních 5 typů řetězců a jsou to α, δ, ε, γ, µ. Pro řetězec α je to třída IgA, pro δ je to IgD, ε třída IgE, γ třída IgG a pro µ je to třída IgM. Lehké řetězce jsou dvojího typu a to κ a λ. Na molekule imunoglobulinu se mohou nacházet pouze lehké řetězce jednoho typu.(krejsek, a další, 2004)

30 Obr. 11 Imunoglobulin [14] V imunohistochemii je nejpoužívanější třída IgG a IgM. Třída IgG je v krvi nejvíce zastoupený typ, který lze rozdělit do čtyř podtříd IgG 1 -IgG 4. Vzniká při sekundární imunitní odpovědi organizmu. Třída IgM vzniká hlavně při primární imunitní odpovědi a jak bylo již zmíněno výše, vyskytuje se jako pentamer nebo monomer. (Krejsek, a další, 2004) Specificita protilátky je dána prostorovou stavbou vazebného místa protilátky s epitopem (vazebné místo na antigenu). Taktéž se u této vazby uplatňuje elektrický náboj vazebných skupin a hydrofobní vazby. Většina antigenů má více epitopů s různou antigenní schopností. (Lukáš, a další, 1997) Podle způsobu výroby rozlišujeme polyklonální a monoklonální protilátky. Polyklonální protilátky Polyklonální protilátky vznikly antigenní stimulací více B-lymfocytů. Toho lze dosáhnout opakovanou stimulací pokusných zvířat. Takto získaná antiséra obsahují směs Ig různých tříd s odlišnou specificitou a afinitou k antigenu. Proto se tyto antiséra dále čistí (izolovaná vazba na antigen a její následné uvolnění). Takto čištěná antiséra se poté mohou používat pro imunohistochemickou detekci. Jejich výhodou a zároveň nevýhodou je reaktivita s různými epitopy antigenu. Tato skutečnost může způsobovat negativní reakce (zkřížená reakce s nepříbuzným antigenem). Rozeznáním různorodých epitopů vznikají menší nároky na zpracování histologických řezů (změněná antigenní struktura během zpracování). (Lukáš, a další, 1997) Monoklonální protilátky Monoklonální protilátky vznikají produkcí jediného klonu B-lymfocytu získaného od daného imunizovaného zvířete. B-lymfocyty zvířete v laboratorním prostředí fúzují spolu s myelomovými buňkami, které jim zajistí nesmrtelnost, zatímco B-lymfocyty zajistí produkci Ig. Po splynutí obou buněk vznikají hybridomy, které je potřeba selekčně oddělit od ostatních neprodukujících buněk či buněk, jenž produkují Ig jiné než žádané kvality. (Lukáš, a další, 1997) Po proběhlé selekci jsou výsledné protilátky identické (stejné třídy) a se stejnou specificitou a afinitou k danému antigenu. Nevýhodou může být nerozpoznání antigenu po

31 proběhlém laboratorním zpracování, šance zkřížené reaktivity je u těchto protilátek nižší, ale vyloučit ji nelze. (Lukáš, a další, 1997) Imunohistochemické metody Tyto metody lze podle principu rozlišit na přímé a nepřímé. Přímé metody využívají primární značené protilátky proti stanovanému antigenu. Pro imuhohistochemii se používají nejčastěji protilátky značené enzymy peroxidázou, alkalickou fosfatázou, glukozo-oxidázou nebo β-galaktozidázou. Je také možné protilátky označit fluorescenčním barvivem. (Lukáš, a další, 1997) Nepřímé metody jsou současně používanější než přímé metody. Tyto metody jsou citlivější než přímé metody a používají několik rozdílných principů a vrstev stanovovaných protilátek. (Lukáš, a další, 1997) V případě této práce byly výrobcem (Dako) doporučeny detekční systémy EnVision + System-HRP, systémy LSAB + a LSAB 2. Metody LSAB + a LSAB 2 jsou založené na principu reakce značené sekundární protilátky biotinem a peroxidázou značeného streptavidinu. Molekula streptavidinu váže vysoce specificky 4 molekuly biotinu, čímž dochází k výrazné amplifikaci výsledného signálu (Obr. 12). Molekula streptavidinu je poměrně elektroneutrální a eliminuje tím nespecifickou elektrostatickou vazbu ke tkáni. Metoda je 5 krát až 10krát citlivější než při užití avidinperoxidáza komplexu. [3] Obr. 12 Princip LSAB systému [15] Metody systému EnVision jsou založeny na aplikaci sekundární protilátky s navázaným dextranovým polymerem, který umožnuje navázání velkého množství křenové peroxidázy

32 (HRP). Navázáním velkého množství křenové peroxidázy na dextranovou páteř dochází k vysoké amplifikaci signálu. Výhodou je nízký vliv pozadí a snížení počtu kroků reakce. [3] Obr. 13 Princip EnVision [16] Markery imunohistochemické detekce štítné žlázy. Využití imunohistochemických metod je důležité pro rozlišení biologické povahy nádoru a případné další klasifikace. U těchto nádorových změn je diagnostika jediným markerem značně obtížná, kvůli různým diagnostickým kritériím a specifičností antigenů u jednotlivých typů. Proto se po výsledcích několika studií přistoupilo k diagnostice pomocí dvou nebo více markerů. Tento krok vede k zlepšení diferenciální diagnostiky a potvrzení diagnózy. (Paunovic, a další, 2012) Pro diagnostiku se zdá být vhodná kombinace molekulárních markerů galectin-3 (gal-3), mesotheliální antigen HBME-1 (Hector Battifora Mesothelial cell) a cytokeratin-19 (CK19). (Paunovic, a další, 2012) Tato trojkombinace markerů má své hlavní využití při diagnostice papilárních karcinomů včetně jejích folikulárních variant. Markery HBME-1 a gal-3 mají i význam v předpovědi malignicity štítné žlázy. Kombinace imunohistochemických markerů HBME-1, CK19 a Ret protoonkogenu napomáhá k diagnostice nejasných případů papilárních karcinomů. Ostatní nově navrhované markery jsou CITED1, S100A4, fibronectin-1, inis, p16, Aurora-A, ale jejich aplikace a výsledky nebyly konzistentně testovány. (Paunovic, a další, 2012) V této práci jsme se zaměřily na zmiňovanou kombinaci gal-3, HBME-1 a CK19. Marker Galectin-3 Galectin-3 je β-galaktosid vázající lectin. Má důležitou roli v mezibuněčných a cell-matrix interakcích. Je zapojený do řízení buněčného růstu, neoplastické transformace a tvorby metastáz. Ve většině odborných studií je hodnocený jako marker s vysokou senzitivitou a

33 specificitou k rozlišení maligních a benigních tyreoidálních onemocnění. (Paunovic, a další, 2012) Podle práce de Matose je normální štítná žláza negativní na gal-3, ačkoliv několik folikulárních buněk a makrofágů se zbarvilo. Tento marker by pozitivní u papilárního karcinomu v 72,6 % z toho bylo 73,8 % difúzně pozitivních. Folikulární karcinomy byly pozitivní jen v 21 %, při čemž byly vždy fokální. Galectin-3 měl nižší expresi u benigních lézí, při čemž byla vždy fokální a omezená na několik buněk. (de Matos, P.S, a další, 2005) Všechny medulární, nediferencované a hyalinizující trabekulární nádory byly na tento znak negativní. Pozitivita u klasického papilárního karcinomu byla zjištěna v 82 % případu, u folikulární varianty papilokarcinomu v 52 % případů, u všech tall cell buněk a v 75 % případů oxyfilních variant papilokarcinomu. Varianta s columnar cell byla negativní. (de Matos, P.S, a další, 2005) Tento marker pomáhá odlišit folikulární variantu papilárního karcinomu od případů folikulárního karcinomu, folikulárního adenomu a adenomatozních uzlů. U folikulární varianty papilokarcinomu je v 77 % difúzní zbarvení, zatímco u zmíněných onemocnění je zbarvení vždy fokální. (de Matos, P.S, a další, 2005) Marker Cytokeratin-19 Cytokeratin-19 je nejmenší z rodiny cytokeratinů, skupiny heterogenních středních (intermediálních) filament, jejichž biologická role zůstává nejasná. Několik studií prokázalo využitelnost exprese CK-19 při rozlišení folikulární varianty papilárního karcinomu od folikulárních benigních i maligních nádorů. Ačkoliv je exprese CK-19 spojena s nízkou fokální pozitivitou u některých folikulárních adenomů. (Paunovic, a další, 2012) Silná a difúzní exprese CK-19 byla přítomna u 80,9 % papilárních karcinomů. (Choi, a další, 2005) Podle práce de Matose, byl tento marker pozitivní v 72,6 % případů papilárního karcinomu, z toho se silně difúzně barvil u 65,6 % případů. U folikulikulárního karcinomu byl přítomen pouze v 21 % případů a s fokálním rozložením. Rozdíl mezi pozitivním a negativním výsledkem umožňuje u folikulárního karcinomu rozlišení folikulární varianty papilokarcinomu, u něhož je pozitivita difúzní. Díky tomuto rozdílu byla rozpoznána daná varianta v 77 % případů. Ve všech 10 případech tall cell varianty a varianty z oxyfilních buněk byla zjištěna pozitivita, zatímco varianta s columnar cell byla negativní. (de Matos, P.S, a další, 2005)

34 Marker HBME-1 HBME-1 je monoklonální protilátka proti povrchu mikroklků mesotheliálních buněk, která je následně používána u thyreoideálních malignit. Tato protilátka se nejvíce barví u papilárních a folikulárních karcinomu, zatímco adenomy jsou obvykle negativní. (Paunovic, a další, 2012) Podle práce Mokhtariho byl HBME-1 silně a difúzně pozitivní v 66,6 % případu folikulárního karcinomu (n=4/6), a většina benigních folikulárních adenomů byla negativních z 88,3 % (n=15/17). Výsledek byl dále negativní v 13 případech nodulární stumy, 4 případech Hashimotovy thyreoitidy a 4 případech adenomu z oxyfilních buněk.(mokhtari, a další, 2005) Ve své práci de Matos uvádí, že v normální tkáni se HBME-1 pozitivní nenacházel, u většiny případů Hashimothovy thyreoitidy byl pozitivní, ale v méně než 5 % buněk bylo imunoreaktivních. Pozitivita byla zjištěna u 94 % případů papilárního karcinomu, včetně klasické (97,4 %) i folikulární varianty papilokarcinomu (84 %). (de Matos, P.S, a další, 2005) Obě varianty měly pozitivitu difúzní, což zhoršuje jejich rozlišení pomocí tohoto markeru. Všechny případy papilokarcinomu byly pozitivní. Při diferenciální diagnostice mezi folikulárním adenomem a folikulárním karcinomem, bylo zjištěno, že se barví v přibližně stejnou měrou (55,6 % a 63 %), ale u folikulárního adenomu byla pozitivita převážně fokální (66,7 % případů), zatímco folikulární karcinom byl difúzní (50 %) nebo segmentální (33 %). Pozitivita HBME-1 byla přibližně stejná jak u minimálně (60 %) tak široce invazivní varianty (69,2 %) folikulárního karcinomu. U Hashimothovy thyreoitidy bylo 9 z 10 případů pozitivních, imunoreaktivita byla omezena na roztřoušené folikulární buňky a makrofágy. (de Matos, P.S, a další, 2005)

35 3 Experimentální část 3.1 Principy zpracování tkáně Zpracování histologického materiálu je vícestupňový proces, který lze obecně rozdělit do několika fází (Schéma 8). Odběr Fixace Zalití do parafinu Krájení Barvení Uzavírání a pozorování Schéma 8 Proces zpracování histologického materiálu Odběr materiálu Získání materiálu na vyšetření štítné žlázy se získává pomocí tzv. tenkojehlové punkce nebo pomocí chirurgického zákroku. V případě punkčního odběru je nutné ihned zhotovitt z daného materiálu nátěr a poté ho cytologicky zpracovat Fixace tkáně Fixace tkání slouží k zachování buněk a tkání pomocí denaturace bílkovin, tak aby jejich vzhled a struktura byla co nejbližší jejímu původnímu stavu v organizmu. Fixace zabraňuje autolytickým procesům, osmotickým a morfologickým změnám, a uchování reaktivity pro histochemické reakce. Ideální fixační prostředek však neexistuje a proto je nutné počítat se jeho vlivy na vyšetřovaný vzorek. Mezi tyto vlivy patří fyzikální změny (permeabilitaa membrán, změna propustnosti polypeptidových řetězců) a změny chemickýchh vlastností (ovlivnění struktury proteinů, aktivita enzymů). Mezi nejběžněji používané chemické fixační prostředky patří formaldehyd (fyzikální fixace se v praxi příliš nepoužívá). (Lukáš, a další, 1997) Formaldehydd (formalín) patří mezi aldehydová fixativa. Formalín reaguje s nenabitýmii skupinami proteinů (aminy, guanidilové skupiny), nikoliv s nabitými skupinami (-NH + 3 ). Po reakci se vytváří methylenové můstky, které svazují polypeptidové řetězce. Vliv ph na reakci s formaldehydemm je značný. Při ph 4 jsou zmíněné skupiny převážně protonované a reagují tudíž pomalu. Proto se přistoupilo k používání neutrálního formalínu, u kterého je dosaženoo maximální fixace při ph 4,,5 5,5. Při vyšším ph míra fixace stejná, ale předpokládá se vlivv na konfiguraci proteinů. Formaldehydovou fixací dochází také ke ztrátě některých reakčních skupin, které mohou být součástí epitopů. (Lukáš, a další, 1997)

36 Fixace je několikahodinový proces (24 48h i déle), ke které se využívá obvykle 4 % roztoku formaldehydu (10 % formalín). Po fixacii se vzorek přenáší do 70 % etanolu nebo se 2-4 hodiny vypírá v pramenité vodě.(vacek, 1996) Většina dnešních metod je optimalizovánaa na neutrální formol Zalévání tkáně do parafinu Zalévání tkáně do parafinu je nutné pro další krok zpracování tkáně krájením. Tento proces se skládá ze čtyř navazujících kroků (Schéma 9) ). Proces začíná postupným zbavením tkáně vody, prosycením látkou rozpouštějícíí parafin, aby se mohl v tkáni navázat a nakonec mohla být tkáň kompletně zalita do parafinu a tvořila homogenní blok vhodný ke krájení. Podrobněji tento proces popisují následující odstavce. Odvodnění Prosycení tkáně látkou rozpouštěníjící parafin Prosycení tkáně parafinem Zalití do parafinu Schéma 9 Proces zalévání tkáně do parafinu Odvodnění tkáně Odvodnění jak již název napovídá, slouží k zbavení tkáně vody, protože parafin je ve vodě nerozpustná látka. Odvodnění tkáně se provádí pomocí roztoků etanolu o stoupajícíí koncentraci. Použití postupně se zvyšující řady zabraňuje přílišnému smrštění tkáně. V této práci proces odvodnění probíhal podle následujícího tabulky. Doba odvodnění závisí na velikosti a struktuře tkáně. Delší doba odvodňování má za následek přílišné tvrdnutí tkáně a potom její následné horší zpracování. (Vacek, 1996) Prosycení tkáně látkou rozpouštějící parafin Po procesu odvodnění je nutné tkáň prosytit látkou rozpouštějící parafin, pro jeho lepší pronikání parafinu do tkání. Z tohoto důvodu je nutné dokonale odstranit etanol, protože se v něm parafin nerozpouští. Je tedy nutné používat látky mísitelné s etanolem i parafinem. Pro tento účel se nejčastěji využívá xylenu. (Vacek, 1996) Prosycení tkáně parafinem Po prosycení tkáně látkou rozpouštějící parafin se přenáší přímo do parafinové lázně. Teplota parafinu závisí na jeho složení obvykle však o bodu tání C, ale není

37 vyloučeno použití parafinů s jiným bodem tání. Pokud jsou předchozí kroky nesprávně (odvodnění, prosycení), dochází ke tvrdnutí tkáně. (Vacek, 1996) provedeny Doba prosycování se odvíjí od velikosti a propustnosti tkáně. Při prosycování dochází k vyplnění mikroskopických štěrbin v tkáni, což umožňuje jejich krájení v tenkých řezech. Prosycení probíhá v několika lázních a trvá v rámci hodin. (Vacek, 1996) Zalití tkáně do parafinu Pro zalití zpracované tkáně se používá čištěný, zkvalitněný parafin nebo paraplast. K zalévání většího počtu vzorků se používají zalévací automaty, které dávkují teplý parafin (či zmíněný paraplast) do kovových formiček. V kovových formičkách je nutné tkáň zorientovat, pro následné krájení, dolít parafinem a přichytit na plastový nosič s identifikací vzorku. Plastový nosič je nutný pro uchycení bločku do svorky mikrotomu. V případě menšího vzorku nebo speciálních podmínek (parafiny s jiným bodem tání) se užívá kovovéhoo L-systému, který slouží místo formiček a je možné ho uzpůsobit velikosti tkáně. Ochlazování v obou případech by mělo být postupné a stejnoměrné pro optimální krájení Krájení tkáňových bločků Ke zpracování parafinových bloků na tenké řezy se používá mikrotomu. Síla řezů je důležitá kvůli přehlednosti a barvitelnosti, více antigenních míst může způsobit falešně pozitivní reakci. Po ukrojení jsou řezy přeneseny na vodní hladinu, ze které jsou následně sejmuty a napnuty na silanizované podložní sklo. V této práci byly použity skla typu SuperFrost plus. Tento typ sklíčka má na svém povrchu pozitivní náboj což umožnuje přilnutí řezu na jeho povrch bez použití různých lepících médii, které způsobují nežádoucí barevný nádech pozadí Barvení tkáňových řezů pomocí imunometod Samotné barvení je kombinovaný proces, který se skládá z několika dílčích kroků a principů (Schéma 10). Výsledkem jsou korektně obarvené tkáňové řezy, které jsou nakonec zamontovány do syntetické pryskyřice a hodnoceny příslušným pracovníkem. Odparafinování Blokace endogenní peroxidázové aktivity Odmaskování antigenů Aplikace primární protilátky Aplikace detekčního systému Vizualizace a dobarvení jader Odvodnění a projasnění Schéma 10 Proces zalévání tkáně do parafinu

38 Odparafinování tkáňových řezů Tkáně zalité do parafinu je nutné odparafinovat a zavodnit za účelem zpřístupnění tkáně pro další reakce a dodatečné barvení. U barvení typu HE (Hematoxylin-Eosin) se k tomu využívá několik lázní xylenu a sestupné řady alkoholů (rehydratace). V předchozích fázích bylo provedeno základní histologické zpracování tkání. V následujících kapitolách bude popsán postup potřebný pro imunohistochemickou detekci na úrovni antigen-protilátka. Tento proces vyžaduje zvláštní přístup k přípravě samotné tkáně, tak aby vše bylo navázáno s dostatečnou specificitou a aby nevznikalo příliš falešně pozitivních či negativních záchytů. Blokace endogenní peroxidázové aktivity Při stanovování pomocí enzymových metod je nutné endogenní enzymy blokovat, aby nevznikl falešně pozitivní výsledek nebo zabarvené pozadí. V této práci bylo využito reakce na bázi peroxidázy, která je blokována pomocí roztoku peroxidu vodíku. Odmaskování antigenů V průběhu fixace se vytvořily v tkáni methylenové můstky, které by mohly zablokovat hledaný antigen nebo epitop. K zpřístupnění těchto míst je nutné je odmaskovat. Toho lze dosáhnou pomocí tepelného působení nebo pomocí enzymového štěpení. Pro tepelné odmaskování se používají tlakové nádoby, vodní lázně nebo histoprocesory. Při tomto způsobu jsou řezy v prostředí s různým ph vystaveny vyšším teplotám. V případě enzymového působení se využívá proteolytických enzymů jako pepsin, trypsin nebo proteináza K. Aplikace primární protilátky a detekčního systému Před nanesením dané primární protilátky je vhodné z ekonomických i praktických důvodů (působení přímo na oblast řezu) ohraničit vyšetřovanou tkáň pomocí parafinové tužky. Ke každé nové šarži protilátky se stanovuje pozitivní kontrola, která je reprezentována pozitivní tkání. Pro gal-3 je doporučována jako pozitivní kontrolní materiál tkáň prostaty. Negativní kontrolní materiál výrobce doporučuje tkáň štítné žlázy. Často je však negativní kontrola zpravidla používána po pozitivní kontrole s negativním výsledkem. Tento postup se používá pro ověření funkčnosti protilátky

39 Pro pozitivní kontrolu HBME-1 je vhodné použít např. normální pleurální a peritoneální mezoteliální buňky. Pro negativní kontrolu lze požít normální tkáně, které se nebarví např. játra, prostata, ledviny. Pro CK-19 může sloužit jako pozitivní kontrola např. bazální vrstva epidermis, epitel žlučníku. Za negativní kontrolu lze použít játra (hepatocyty neobsahují CK-19). Po aplikaci primární protilátky následuje aplikace detekčního systému. Vizualizace a dobarvení jader V případě použití metod založených na detekci peroxidázy (HRP) se využívá vizualizace pomocí substrátu DAB nebo AEC nebo jiných substrátů. V našem případě jsme využívaly standardní DAB, který se v pozitivním případě zbarvuje do hněda. V této práci bylo k dobarvení jader použito Gillova hematoxylinu, používaný je taktéž Mayerův hematoxylin. Odvodnění a projasnění Před montováním, aby bylo možné použít montovací média nemísitelná s vodou, musíme vzorky odvodnit a projasnit. Odvodnění se provádí pomocí vzestupné řady alkoholů a docílíme tak postupné odstranění vody v preparátu na minimální množství. Projasnění používáme několik lázní xylenu, dochází tak k optickému zvýraznění všech buněk a struktur v preparátu Uzavírání a pozorování Uzavíráme pomocí montovacích médií nerozpustných ve vodě k tvorbě trvalého preparátu. Jádra jsou po obarvení modrá, cytoplazma čirá v negativním případě, v pozitivním případě lze pozorovat hnědé zbarvení cytoplazmy u všech vyšetřovaných antigenů, membránové u HMBE-1 a gal-3. Dále u gal-3 je možná pozitivita jaderná a extracelulární. Tkáňové preparáty byly hodnoceny na mikroskopu OLYMPUS BX51 při zvětšení 40x a 400x

40 3.2 Praktická realizace experimentu Odběr a fixace V této práci jsme vyšetřovali pouze bioptické, chirurgicky odebrané vzorky štítné žlázy. Do zpracování byly zahrnuti pouze pacienti s podezřením na nádorové onemocnění štítné žlázy. Pro naše vyšetření se pro fixaci tkáně používal pufrovaný roztok formaldehydu, který je rutinně používaný Zalévání tkáně do parafinu Následující postup práce probíhal dle Schéma 9. Odvodnění, prosycení tkáně látkou rozpouštějící parafin, prosycení parafinem Proces přípravy tkáně, který je nutný před zalitím parafinem byl proveden standardně pomocí přístroje autotechnikon (karuselový odvodňovací a prosycovací automat) Shandon Citadel 2000 od výrobce Thermo EC, (Tab. 6, Tab. 7). Koncentrace etanolu objemový zlomek Doba odvodňování v minutách Lázeň xylenu Doba prosycování v minutách Lihobenzín 70 % 30 min Xylen I 30 min Lihobenzín 70 % 30 min Xylen II 60 min Lihobenzín I 96 % 60 min Xylen III 60 min Lihobenzín II 96 % 60 min Lihobenzín III 96 %. 90 min Lihobenzín IV 96 % 90 min Lihobenzín V 96 % 120 min Tab. 6 Odvodňovací proces Tab. 7 Proces prosycení tkáně látkou rozpouštějící parafin Zalití tkáně do parafinu a krájení Zalití tkáně do parafinových bloků probíhalo za pomocí dávkovacích automatů od firmy Leica parafinem o teplotě 55 C. Zalité bloky tkáně byly dále zpracovány procesem krájení na saňovém mikrotomu na řezy o síle 3-5 µm a přeneseny na silanizované podložní sklo. Po přenesení na podložní sklo je nutné nechat řez dokonale přilnout a uschnout v termostatu při 56 C po dobu nejméně jedné hodiny, tuto dobu lze i překročit

41 3.2.3 Barvení tkáňových řezů pomocí imunometod Proces zpracování vzorku probíhal podle postupu popsaného v kapitole 3.1.5, Schéma 10. Odparafinování tkáňových řezů Proces odparafinování probíhal v následujících časových rozestupech (Tab. 8) v histologických kyvetách. Použitý roztok Doba sklíčka v lázni Xylen I. 5 min Xylen II. 5 min Xylen III. 5 min Etanol I 96 % 5 min Etanol II 96 % 5 min Etanol III 96 % 5 min Tab. 8 Odparafinování proces Po odparafinování je nutné řezy opláchnout destilovanou vodou. Blokace endogenní peroxidázové aktivity Pro blokování endogenní aktivity peroxidázy byl použit roztok 3 % peroxidu vodíku v metanolu po dobu 10 minut. Lze případně použit 3 % vodného roztoku peroxidu vodíku, ale doba působení se prodlužuje na 30 minut. Odmaskování antigenů Odmaskování antigenů probíhalo pomocí tepelného odhalení u markerů HBME-1 a gal-3. Marker CK-19 byl odmaskován pomocí proteinového odhalení pomocí proteinázy K. Odmaskování antigenu HBME-1 probíhalo ve vodní lázni s citrátovým pufrem o ph 6, teplotě 98 C v které setrval 20 minut, a poté chladl pod tekoucí vodou. Odmaskování antigenu gal-3 probíhalo v tlakové nádobě s citrátovým pufrem o ph 6, při teplotě 120 C po dobu 4 minut. (CK-19) Odmaskování markeru CK-19 probíhalo pomocí dostatečného množství proteinázy K po dobu 5 minut. Po odmaskování se provádí praní ve 3 lázních PBS o ph 7,2-7,3, každá lázeň po dobu 5 minut. Pro protilátku HBME-1 není vhodné proteolytické odmaskování. Pro gal-3 a CK-19 je doporučené použití tepelného odmaskování

42 Aplikace primární protilátky a detekčního systému Před aplikací primární protilátky je nutné vložit sklíčka do vlhké komůrky a ohraničit parafinovou tužkou co nejmenší oblast v okolí řezu tak aby protilátka mohla působit na celou plochu tkáňového řezu. Vlhká komůrka zabraňuje odpařování aplikované primární protilátky. Podle velikosti vzorku se nanáší množství protilátky v rozmezí µl naředěné myší protilátky. Doporučené ředění od výrobce udává následující tabulka: Antigen Ředění Výrobce třída Ig CK-19 1:50-1:100 Dako IgG 1 kappa HBME-1 1:50 Dako IgM, kappa gal-3 1:100-1:400 Novacastra IgG 1 Tab. 9 Přehled použitých protilátek a jejich ředění Primární protilátka se inkubuje 1 hodinu při pokojové teplotě, při delší době aplikace vzniká nežádoucí zabarvené pozadí. Po aplikaci a inkubaci následuje praní ve 3 lázních PBS po 5 minutách, kvůli dosažení maximálního očištění od nenavázaných protilátek. V našem případě jsme využívaly detekčního sytému od firmy Dako EnVision+ System- HRP Labeled polymer. Protilátka v detekčním systému byla anti-myší. 1. Opatrné očištění sklíčka od PBS (omezení možnosti naředění systému) 2. Aplikace značeného polymeru po dobu 45minut (doporučeno 30 minut) 3. Promytí v 3 lázních PBS po 5 minutách a osušení sklíčka a následné dobarvení 4. Po aplikaci detekčního systému následuje praní ve 3 lázních PBS po 5 minutách Vizualizace Vizualizace probíhala v našem případě pomocí substrátu DAB, který byl připravován čerstvý. Navážka 13mg DAB 98 % čistoty, rozpustit v 50ml PBS pufru předehřátého na 37 C. Poté se přidá 25µl koncentrovaného 30 % H 2 O 2. Množství 50 ml odpovídá velikosti standardní histologické kyvety. Doba barvení řezu je 5 minut a následuje oplach pramenitou vodou a dobarvení jader

43 Dobarvení jader, odvodnění a projasnění K dobarvení jader bylo použito Gillova hematoxylinu po dobu 30s. Po dobarvení Gillovým hematoxylinem je nutné nechat vzorky 3-5 minut modrat za stálého proudu teplé (nikoliv vařící) pramenité vody. Dále bylo provedeno odvodnění preparátů pomocí vzestupné alkoholové řady a poté pomocí xylenových lázní dle (Tab. 10 a Tab. 11) optické projasnění. Postup odvodňovacího a prosjasňovacího procesu: Odvodnění Doba sklíčka v lázni Prosjasnění Doba sklíčka v lázni Etanol 70 % 5 min Xylen I. 5 min Etanol 85 % 5 min Xylen II. 5 min Etanol 96 % 5 min Xylen III. 5 min směs Aceton Xylen 1:1 směs Aceton Xylen 1:1 5 min 5 min Tab. 10 Proces odvodňování preparátů Tab. 11 Proces projasnění preparátů Montování a uzavírání V našem případě jsme využívaly syntetickou pryskyřici Entellan, po jejímž nanesení na podložní sklíčko jsme přiložili sklíčko krycí a vytvořily tak trvalý preparát. 3.3 Zpracování a porovnání získaných dat Data byla získána z ústavu patologie FN Brno Bohunice v rozsahu 20 vzorů suspektních na nádorové onemocnění štítné žlázy. Všechny nasbíraná data jsou umístěna v tabulce členěné dle získaných diagnóz a dále dle vyšetřovaných markerů (Příloha I). Každý pacient byl vyšetřen na 3 druhy markerů. Výsledky byly nasbírány za období 6 měsíců. Věk pacientů byl poměrně rozptýlený, nejmladší jedinec byl 17 let starý a nejstarší 76 let. Střední hodnota věku byla 48 let. Z těchto pacientů bylo 65 % žen a 35 % mužů. U získaných subjektů byly zjištěny celkem 4 druhy diagnóz: Papilární karcinom. Folikulární adenom. Adenomatoidní uzel. Folikulární karcinom

44 3.3.1 Výsledky markerů u papilárního karcinomu Diagnóza papilární karcinom byla zjištěná u 10 z 20 pacientů (50 %). Všechny tumory byly dobře diferencované, ve 3 případech se jednalo o klasickou variantu, ve 2 případech o folikulární variantu, v 1 případě o enkapsulovanou (Příloha II) a v 1 případě o tall cell variantu. Jiné varianty papilárního karcinomu nebyly zjištěny z důvodu nízkého počtu získaných vzorků a jejich nízkého výskytu v populaci. Pro porovnání byly použity výsledky autora de Matose z roku 2005, který k diagnostice těchto druhů onemocnění využívá stejných markerů jako v použité pro tuto práci. Autor použil diagnostické sety od stejného výrobce, jako byly použity ve zvolené laboratoři (viz Tab. 9). Jak ukazuje Tab. 12, tak všech 10 vzorků papilárního karcinomu bylo HBME-1 pozitivních (100 %). Pro porovnání bylo v práci de Matose u této diagnózy pozitivních 79 z 84 výsledků (94 %). U zjištěné pozitivity se dodatečně uvádí její rozsáhlost (difúzní-masivní, fokálníložiskovitá). HBME-1 pozitivita byla u 8 z 10 papilárních karcinomů difúzně pozitiviních (80 %) a u 2 případů fokálně (20 %). Práce de Matose se uvádí, že difúzní pozitivita HBME-1 u papilárního karcinomu byla u 72 ze 79 případů (91 %), zatímco fokální pozitivita byla u zbylých 7 ze 79 případů papilárního karcinomu (9 %). Pozitivita gal-3 byla zjištěna u všech 10 vzorků papilárního karcinomu (100 %). V případě de Matose se pozitivně barvilo 61 z 84 vzorků papilárního karcinomu (72,6 %). U testovaných vzorků s diagnózou papilárního karcinomu byla difúzní pozitivita gal-3 u 8 z 10 papilárních karcinomů (80 %) a u 2 případů fokálně pozitivní (20 %). V práci de Matose byly výsledky obdobné jako u námi zjištěných hodnot, difúzně bylo pozitivních 45 z 61 vzorků (73,8 %), zatímco fokálně se barvilo jen zbylých 16 z 61 pozitivních vzorků (26,2 %). Pozitivita u CK-19 byla v našem případě zjištěna ve všech 10 případech papilárního karcinomu i s difúzní pozitivitou (100 %). V práci de Matose bylo pozitivních 61 z 84 případů (72,6 %) a to 40 případů difúzně (65,6 %) a 21 případů fokálně pozitivních (34,5 %)

45 Porovnání % pozitivních Naše vzorky [%] počet de Matos [%] Počet HBME % 10/10 94 % 79/84 Difúzních 80 % 8/10 91 % 72/79 Fokálních 20 % 2/10 9 % 7/79 gal % 10/10 72,6 % 61/84 Difúzních 80 % 8/10 73,8 % 45/61 Fokálních 20 % 2/10 26,2 % 16/61 CK % 10/10 72,6 % 61/84 Difúzních 100 % 10/10 65,6 % 40/61 Fokálních 0 % 0/10 34,5 % 21/61 Tab. 12 Výsledky markerů u vzorků papilárního karcinomu Výsledky markerů u folikulárního adenomu Diagnóza folikulární adenom byla zjištěná u 3 z 20 pacientů (15 %). U těchto vzorků bylo přítomny 2 varianty, klasická (2 případy) a Onkocytární (1 případ). Porovnání % pozitivních Naše vzorky [%] počet de Matos [%] počet HBME-1 0 % 0/3 55,6 % 10/18 Difúzních 0 % 0 10 % 1/10 Fokálních 0 % 0 90 % 9/10 gal-3 0 % 0/3 11 % 2/18 Difúzních 0 % 0 0 % 0/2 Fokálních 0 % % 2/2 CK % 2/3 33,3 % 6/18 Difúzních 0 % 0/2 0 % 0/6 Fokálních 100 % 2/2 100 % 6/6 Tab. 13 Výsledky markerů u vzorků folikulárního adenomu Jak ukazuje Tab. 13, tak všechny naše 3 vzorky byly HBME-1 a gal-3 negativní. Makrer CK-19 byl pozitivní u 2 vzorků ze 3 (66,6 %) z nichž byly všechny fokálně pozitivní (100 %). V práci de Matose byl marker HBME-1 u diagnozy folikulárního adenomu pozitivních 10 z 18 vzorků (55,6 %). Vzorky u této diagnózy se vyskytovaly převážně fokálně pozitivní v 9 z 10 případů (90 %) a 1 z 10 pozitivních případů difúzních (10 %)

46 Marker gal-3 byl pozitivní jen u 2 z 18 případů (11 %) a vždy fokálně pozitivní (100 %). Marker CK-19 byl u této diagnózy přítomen u 6 z 18 případů (33,3 %) a vždy fokálně pozitivní Výsledky markerů u adenomatoidního uzlu Diagnóza adenomatoidního uzlu byla zjištěná u 6 z 20 pacientů (30 %). Jak ukazuje (Tab. 14), tak všechny naše 3 vzorky byly HBME-1 a gal-3 negativní. V práci de Matose se uvádí, že u markeru HBME-1 byly pozitivní 4 z 12 vzorků (33 %)s fokální pozitivitou (100 %). Marker gal-3 se u toho onemocnění téměř nevyskytoval a byl pozitivní jen v 1 z 12 případů s fokální pozitivitou (100 %). U markeru CK-19 jsme zjistily pozitivitu u 3 z 6 stanovovaných vzorků (50 %) s fokální pozitivitou (100 %). V práci de Matose byl tento marker přítomen u 2 z 12 vzorků (16,7 %) a taktéž s fokální pozititvitou (100 %) Porovnání % pozitivních Naše vzorky [%] počet de Matos [%] počet HBME-1 0 % 0/6 33 % 4/12 Difúzních 0 % 0 0 % 0/4 Fokálních 0 % % 4/4 gal-3 0 % 0/6 8 % 1 /12 Difúzních 0 % 0 0 % 0/1 Fokálních 0 % % 1/1 CK % 3/6 16,7 % 2/12 Difúzních 0 % 0/2 0,0 % 0/2 Fokálních 100 % 3/3 100 % 2/2 Tab. 14 Výsledky markerů u vzorků adenomatoidního uzlu Výsledky tumorových markerů u folikulárního karcinom Folikulární karcinom byl nalezen v 1 z 20 studovaných vzorků. U této diagnózy byl pozitivní pouze marker CK-19 s difúzní pozitivitou. V práci de Matose byla zjištěna pozitivita HBME-1 u 24 z 38 vzorků. (63 %), při čemž 50 % bylo difúzních a 50 % fokálně pozitivních. U markeru gal-3 byla zjištěna pozitivita v 8 z 38 vzorků, tyto vzorky byly vždy fokálně pozitivní

47 U markeru CK-19 byla zjištěna pozitivita v 8 z 38 vzorků, tyto vzorky byly v 87,5 % fokálně pozitivní a 12,5 % difúzně pozitivních. Vzhledem k ojedinělému výskytu této diagnózy není možné zjistit chování detekce tumorových markerů a také provést porovnání se studií autora de Matose

48 4 Závěr Nádorové onemocnění štítné žlázy představuje přibližně 1 % ze všech malignit a 90 % všech endokrinopatií. Vzhledem k obecné náročnosti léčby nádorových onemocnění je důležité včas rozeznat povahu onemocnění. Přesná histologická klasifikace nádorů štítné žlázy je založena v první řadě na mikroskopickém obraze daného onemocnění. Nicméně ve sporných případech s hraničním morfologickým nálezem může být nezbytné využít ke stanovení diagnózy metody na bázi imunohistochemie. Tato práce komplexně mapuje problematiku onemocnění štítné žlázy s primárním zaměřením na nádorové onemocnění. V první části je popsána obecná struktura a funkce štítné žlázy, která je dále rozvedena o jednotlivé diagnózy. Tato onemocnění jsou popsána od běžných nenádorových nálezů po nálezy tumorového původu, přičemž jsou uvedeny i jejich vzácnější formy. Ve speciální části jsme se zabývali stavbou, funkcí a využitím protilátek. Dále pak principem imunohistochemických reakcí u sledovaných markerů a jejich aplikaci na diagnostikovanou tkáň. K získání přehledu o této tématice bylo nutné provést literární průzkum, jehož výsledkem bylo nalezení několika zajímavých studií. Nejvíce zmiňovanou prací jsou studie autora de Matose a Paunovice. Pro další porovnání výsledků jsme zvolili práci de Matose, vzhledem k použitým markerům, které jsou využívány i v našem případě. Výhodným faktorem je i skutečnost, že de Matos diagnostikoval stejné typy diagnóz jako my. V experimentální části jsme popsali v jednotlivých bodech postup potřebný pro celý diagnostický proces. Zejména se jednalo o histologické zpracování tkání počínaje odběrem materiálu, jeho fixaci, zalití do parafinu až po finální imunohistochemickou část. Takto zpracované vzorky byly následně mikroskopicky vyhodnoceny a překontrolovány. V této práci jsme se zaměřili na diagnostiku pomocí tří markerů (HBME-1, gal-3 a CK-19). V případě nejčastěji diagnostikovaného nádorového onemocnění papilárního karcinomu naše výsledky přibližně odpovídaly výsledkům de Matose. Je zřejmé, že na tento druh onemocnění reagují všechny 3 markery vysoce specificky se silnou difúzní reakcí. Na ostatní onemocnění tyto zvolené markery reagovaly negativně, až na marker CK-19, který není tak specifický a reaguje i u dalších typů diagnóz. Porovnáním s de Matosovou studií jsme ověřily funkčnost použitých markerů u diagnózy papilárního karcinomu a analytických postupů v našich podmínkách

49 Nelze s jistotou říci, jestli námi sledovaný proces detekce je korektní u ostatních typů diagnóz než u papilárního karcinomu. Počet ostatních získaných diagnóz byl příliš nízký na to, aby bylo možné vyjádřit korektní úsudek. S nízkým výskytem těchto typů rakovin na jejich celkový počet a s nízký procentuelním zastoupením jednotlivých variant bylo obtížné získat více pozorování. Celý proces sběru dat limitoval i fakt, že stanovení imunohistochemických markerů je obecně finančně nákladné a je třeba se tak přizpůsobit chodu laboratoře. Jako další možnost pokračování této práce by bylo vhodné zvýšit počet vzorků a zaměřit se na vzácnější formy. Tímto způsobem by bylo možné získat přesnější úsudek o expresi vyšetřovaných markerů a vyloučit tak že se jedná pouze o náhodu. Jako další rozšíření této práce by bylo možné vyzkoušet odlišný způsob zpracování tkáně a zjistit jakým způsobem budou imunohistochemické výsledky ovlivněny

50 5 Literatura Bartůňková, Jiřina a Paulík, Milan Vyšetřovací metody v imunologii. Praha : Grada Publishing a.s., Brunová, Jana a Bruna, Josef Klinická endokrinologie a zobrazovací diagnostika endokrinopatií. místo neznámé : Maxdorf, Čáp, Jan a Ryška, Aleš Aspirační cytologie štítné žlázy. Hradec Králové : Nucleus HK, de Matos, P.S, a další Usefulness of HBME-1, cytokeratin 19 and galectin-3 immunostaining in the diagnosis of thyroid malignancy. Histopathology. říjen 2005, Sv. 47, 4, stránky Fölsch, Ulrich Robert, Kochsiek, Kurt a Schmidt, Robert F Patologická fyziologie. [překl.] Rokyta Richard a Mareš Jan. Praha : GRADA, české vydání x. Hořejší, Václav a Bartůňková, Jiřina Základy imunologie. 4. Praha : Triton, Choi, Yoon-La, a další Immunoexpression of HBME-1, High Molecular Weight Cytokeratin, Cytokeratin 19, Thyroid Transcription Factor-1, and E-cadherin in Thyroid Carcinomas. Journal of Korean Medical Science. říjen 2005, Sv. 20, 5. Klika, Eduard, a další Histologie pro stomatology. 1. Praha : Avicenum, Krejsek, Jan a Kopecký, Otakar Klinická imunologie. Hradec Králové : Nucleus Hk, X. Límanová, Zdeňka Štítná žláza. [autor knihy] Josef Marek a Marie Brodanová. Endokrinologie, poruchy metabolismu a výživy. Vnitřní lékařství. Praha : Galén - Karolinum, 2002, Sv. VI. Lukáš, Zdeněk, a další Imunohistochemické metody v biologii a v bioptické diagnostice. Brno : Acta Facultatis Medicae Universitatis Masarykianae Brunensis, X. Mačák, Jirka a Mačáková, Jana Patologie. Praha : Grada Publishing, a.s., McDougall, I. Ross Management of thyroid cancer and related nodular disease. London : Springer, Mokhtari, M., Sadeghi, M. a Talebi, A MONOCLONAL ANTIBODY HBME-1 USEFULNESS IN DIFFERENTIATION OF BENIGN NEOPLASM AND DIFFERENTIATED THYROID CARCINOMA. Acta Medica Iranica. 2005, Sv. 43, 2, stránky Novák, J, [překl.] TNM Klasifikace zhoubných novotvarů. 7. místo neznámé : John Wiley & Sons, Ltd., česká verze Paunovic, Ivan, a další Combined immunohistochemistry for thyroid peroxidase, galectin-3, CK19 and HBME-1 in differential diagnosis of thyroid tumors.. APMIS : acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica. Květen 2012, stránky

51 Povýšil, Ctibor a Šteiner, Ivo Speciální patologie. 2. Praha : Galén, Karolinum, Rejthar, Aleš a Vojtěšek, Bořivoj Obecná patologie nádorového růstu. Praha : Grada,Avicenum, X. Ryška, A Co je nového v patologii štítné žlázy. Československá patologie. 2008, 4., stránky Vacek, Zdeněk Histologie a histologická technika - Histoogická technika II. část. Brno : Institut pro další vzdělávání pracovníků ve zdravotnictví, str Vlček, Petr Moderní endokrinologická diagnostika poruch štítné žlázy. klinická biochemie a metabolizmus. 2010, 3, stránky Zamrazil, V, Holub, V a Kasalický, P Endokrinologie. Praha : Triton, Elektronické zdroje [1] DORION, Dominique. Thyroid Anatomy. Medscape Reference: Drugs, Diseases & Procedures [online] [cit ]. Dostupné z: [2] Tropic hormones. Wdict: Pure wikipedia knowledge based dictionary [online] [cit ]. Dostupné z: [3] Introduction to Immunohistochemistry - IHC Methods:. IHCWORLD Life Science Products & Services. [Online] IHC WORLD, LLC, 23. Březen [Citace: 20. Duben 2013.] [4] YILDIZ, Levent, Mehmet KEFELI, Behiye KOSE a Sancar BARIS. Amyloid goiter: two cases and a review of the literature. In: Annals of saudi medicine [online] [cit ]. Dostupné z: [5] Subacute granulomatous thyroiditis. Pathology student: Making pathology easy and fun [online] [cit ]. Dostupné z: [6] Štítná žláza: Hashimotova thyreoiditis - přehled. CBO - ODDĚLENÍ HISTOLOGIE A EMBRYOLOGIE 3. LÉKAŘSKÉ FAKULTY V PRAZE. Histopatologický atlas [online] [cit ]. Dostupné z: [7] Štítná žláza: Hashimotova thyreoiditis - detail. CBO - ODDĚLENÍ HISTOLOGIE A EMBRYOLOGIE 3. LÉKAŘSKÉ FAKULTY V PRAZE. Histopatologický atlas [online] [cit ]. Dostupné z: [8] Psammoma bodies. Pathology student: Making pathology easy and fun [online] [cit ]. Dostupné z: -

52 [9] Štítná žláza: Papilární karcinom - detail. CBO - ODDĚLENÍ HISTOLOGIE A EMBRYOLOGIE 3. LÉKAŘSKÉ FAKULTY V PRAZE. Histopatologický atlas [online] [cit ]. Dostupné z: [10] Columnar cell variant of papillary carcinoma (columnar cell carcinoma) of thyroid. CHENG Z., Liu a Kar-Ming FUNG. DEPARTMENT OF PATHOLOGY, University of Oklahoma Health Sciences Center. A 55 year-old Man with a Rapidly Enlarging Thyroid Mass [online] [cit ]. Dostupné z: [11] My approach to oncocytic tumours of the thyroid. In: ASA, S L. My approach to oncocytic tumours of the thyroid [online] [cit ]. DOI: /jcp Dostupné z: [12] Anaplastic Carcinoma of the Thyroid. Surgical Pathology atlas: Image database [online] [cit ]. Dostupné z: [13] Case 16 Histology - Poorly differentiated (insular) thyroid carcinoma. BC CANCER AGENCY. BC Cancer Agency: Care + research [online] [cit ]. Dostupné z: m [14] Soubor:Imunoglobulin.png. MIROSLAVGENSKY. WikiSkripta [online] [cit ]. Dostupné z: [15] Avidin-Biotin Complex for IHC Detection. THERMO SCIENTIFIC. Pierce Protein: Biology Products [online] [cit ]. Dostupné z: C9816CF9F7DC#labmethod [16] WENTGES AUS BONN, Marek. Isolierung, Kultivierung und magnetische Separation von Vorläuferzellen aus humanem respiratorischem Epithel. Berlin, Dostupné z: 13/HTML/chapter2.html#_Ref Dizertační práce. Universitätsmedizin Berlin

53 Příloha I Tabulka výsledků diagnostiky tumorových markerů Věk Pohl. Diagnóza Varianta HMBE-1 Pozitivita HBME-1 Gal-3 Pozitivita gal-3 CK-19 Pozitivita CK-19 Komentář 57 m papilární karcinom folikulární + difúzní + difúzní + difúzní multicentrický, mikrokarcinom 44 ž papilární karcinom tall cell + difúzní + difúzní + difúzní bez metastáz 48 ž papilární karcinom folikulární + difúzní + difúzní + difúzní 33 ž papilární karcinom dobře diferencovaný + fokální + difúzní + difúzní Hashimotova thyreoitida, matnicová jádra 69 m papilární karcinom dobře diferencovaný + difúzní + difúzní + difúzní 38 ž papilární karcinom + fokální + fokální + difúzní 68 ž papilární karcinom + difúzní + difúzní + difúzní mikrokarcinom, nodozní koloidní struma, multicentrický 34 m papilární karcinom dobře diferencovaný + difúzní + difúzní + difúzní matnicová jádra, psamomatozní tělíska 17 ž papilární karcinom + difúzní + fokální + difúzní 42 ž papilární karcinom enkapsulovaná + difúzní + difúzní + difúzní mikrokarcinom, incidentalní, Hashimotova thyreoitida, výrazná nenádorová pozitivita Hashimotova thyreoitida, adematoidní uzel, mikrokarcinom, výrazná nenádorová pozitivita 64 m folikulární adenom smíšená mikro a makrofolikulární, bez malignit 48 ž folikulární adenom fokální polynodozní stuma 76 ž folikulární adenom onkocytární adenom fokální nodozní koloidní struma 72 ž adenomatoidní uzel toxická koloidní, normo až makrofolikulární 48 ž adenomatoidní uzel hyperplastická m adenomatoidní uzel onkocytární fokální 38 ž adenomatoidní uzel fokální 44 ž adenomatoidní uzel fokální drobné kalcifikace, mikro až makrofolikulární 58 m adenomatoidní uzel nodozní, mikrofolikulární stavby 39 m folikulární karcinom dobře diferencovaný difúzní minimálně invazivní, angioinvazivita

54 Příloha II Doplňující fotografie Papilární karcinom - enkapsulovaná varianta, 40x, HBME-1 Tall cell varianta HE, 400x

55 Tall cell varianta, CK-19, difúzní Tall cell varianta, 400x, gal-3, difúzní