PLAC Test for Lp-PLA2 Activity

Transkript

1 PLAC Test for Lp-PLA2 Activity Enzyme Assay for the Quantitative Determination of Lp-PLA2 Activity in Human Serum or Plasma EN ISO 13485:2012 CERTIFIED Diazyme Laboratories, Inc Gregg Court, Poway, CA USA Tel: MDSS Schiffgraben Hannover, Germany Symbol Key Calibrator Read

2 ZAMÝŠLENÉ POUŽITÍ Test PLAC aktivity Lp-PLA 2 je enzymový test pro kvantitativní stanovení aktivity Lp-PLA 2 (fosfolipázy A 2 asociované s lipoproteinem) v lidské plazmě a séru na automatizovaných klinických chemických analyzátorech, které mají být použity ve spojení s klinickým hodnocením a hodnocením rizika u pacienta jako indikátoru aterosklerotického kardiovaskulárního onemocnění. SHRNUTÍ A VYSVĚTLENÍ Lp-PLA 2 je serin lipáza nezávislá na vápníku, která je spojena s lipoproteinem s nízkou hustotou (LDL) a v menší míře s lipoproteinem s vysokou hustotou (HDL) v lidském séru a plazmě 1 a je odlišná od jiných fosfolipáz, jako je cpla 2 a spla 2. 2 Lp- PLA 2 je produkována makrofágy a jinými zánětlivými buňkami a je exprimována ve vyšších koncentracích u pokročilých aterosklerotických lézí, než jsou léze v počátečním stadiu. 3,4 Kritický krok ve vývoji a progresi aterosklerózy sehrává oxidace LDL. 5,6 Lp-PLA 2 se podílí na rozpadu oxidovaného LDL v cévní stěně hydrolýzou oxidovaného fosfolipidu, čímž vzniká lyzofosfatidylcholin a oxidované volné mastné kyseliny, které jsou silnými prozánětlivými produkty, jež přispívají k tvorbě aterosklerotických plaků. 7,8,9 Lp-PLA 2 prokázala nevelké intra- a interindividuální změny, které odpovídají ostatním kardiovaskulárním lipidovým markerům, a podstatně nižší variabilitu než vysoce citlivý C-reaktivní protein (hs-crp). Kromě toho není Lp-PLA 2 zvýšena v systémových zánětlivých stavech a může být specifičtějším markerem vaskulárního zánětu. Relativně malá biologická variace Lp-PLA 2 a její vaskulární specifičnost mají význam pro detekci a monitorování kardiovaskulárního rizika. 10,11 PRINCIP TESTU Test PLAC aktivity Lp-PLA 2 je enzymový test. Lp-PLA 2 v séru nebo plazmě hydrolyzuje polohu sn-2 substrátu, 1-myristoyl-2-(4- nitrofenylsukcinyl) fosfatidylcholinu, čímž vznikne barevný reakční produkt 4-nitrofenol. Rychlost tvorby 4-nitrofenolu je sledována spektrofotometricky a aktivita Lp-PLA 2 je vypočítána z rychlosti změny absorbance. Pro generování standardní křivky změny absorbance versus úrovně aktivity Lp-PLA 2 v nmol / min / ml, ze které je odvozena aktivita Lp-PLA 2, je použita sada pěti kalibrátorů Lp-PLA 2. ČINIDLA A MATERIÁLY Test PLAC aktivity Lp-PLA 2 je dodáván s R1 R2 AL CONTROL LOW C ONTROL HIGH Pufr Substrát Lp-PLA2, 1-myristoyl-2-(4-nitrofenylsukcinyl) fosfatidylcholin Kalibrátor Nízká kontrola Vysoká kontrola Certifikát analýzy rozsah kontroly Rozsahy kontrol pro šarži jsou uvedeny na certifikátu analýzy Ostatní potřebné, ale neposkytnuté materiály: Automatizovaný analyzátor pro klinickou chemii a návod k obsluze systému. Aplikační list analyzátoru specifický pro použitý analyzátor pro klinickou chemii je k dispozici samostatně. Obraťte se na zákaznický servis společnosti Diazyme. UPOZORNĚNÍ A BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ Ředění vzorků způsobí chybné výsledky. Vzorky nelze ředit při žádné úrovni aktivity Lp-PLA 2. Zvýšené hodnoty Lp-PLA 2 vzorků nad měřicím rozsahem by měly být uvedeny jako > 400 nmol / min / ml. Ve studii populace na více než 4500 subjektech bylo při testu PLAC aktivity Lp-PLA 2 6 z hlášených hodnot > 400 nmol / min / ml. Hemolyzované vzorky interferují s testem a neměly by být testovány. Vzorky, které jsou viditelně hemolyzovány, by měly být přehodnoceny. Testování hemolyzovaných vzorků s hemoglobinem > 1,0 mg/ml může způsobit chybné výsledky. PLA 2, je použita sada pěti kalibrátorů Lp-PLA 2. Pro diagnostické použití in vitro. Všechny vzorky krve, kalibrátory a kontroly považujte za potenciálně biologicky nebezpečný materiál. Před analýzou vizuálně zkontrolujte, jestli vzorky nevykazují nadměrný zákal a sraženiny. Vzorky s nadměrným zákalem a sraženinami mohou mít dopad na výsledky a neměly by být používány. Činidla zlikvidujte způsobem, který je v souladu s příslušnými předpisy. Nepoužívejte činidla po uplynutí doby jejich použitelnosti. Nemíchejte činidla z různých souprav. PŘÍPRAVA A SKLADOVÁNÍ ČINIDEL Dodávaná činidla jsou připravena k použití. Odstraňte víčka činidel R1 a R2 a vložte je do přístroje. Činidla jsou v analyzátoru stabilní až 4 týdny. Po otevření: Činidla lze skladovat při 2 8 C po dobu až 4 týdnů Kalibrátory lze skladovat při 2 8 C po dobu až 3 měsíců Kontroly lze skladovat při 2 8 C po dobu až 3 měsíců

3 Podrobné informace týkající se analyzátoru naleznete v konkrétním aplikačním listu analyzátoru pro klinickou chemii. Laboratoře by měly ověřit stabilitu vloženého činidla na vlastních analyzátorech za typických laboratorních podmínek. SBĚR A SKLADOVÁNÍ VZORKŮ Ustálení není nutné. Veškerou krev zadržte pomocí venipunktury v: Zkumavkách pro sběr séra s nebo bez gelu. Zkumavkách na odběr plazmy K 2 nebo K 3 EDTA s nebo bez gelu. Krev zpracujte za použití standardních separačních postupů. Veškerá krev může být před separací udržována až 4 hodiny při pokojové teplotě (RT) nebo až 30 hodin při 2 8 C. Po centrifugaci prověřte hemolýzu. Je-li zjištěna, vyhoďte vzorky a přehodnoťte. Vzorky mohou být okamžitě testovány nebo před testováním skladovány za následujících podmínek: 8 hodin při pokojové teplotě Až 2 týdny při 2 8 C Až 18 měsíců při -20 C Do 2,5 roku při -70 C (probíhají rozsáhlé studie) Vzorky plazmy nebo séra lze po zmrazení na -20 C nebo -70 C zmrazit a rozmrazit až 5krát. Při přepravě vzorků odesílejte vzorky v chlazeném balení při 2 8 C nebo zmrazené na suchém ledu. Při manipulaci a likvidaci všech vzorků používejte univerzální zabezpečení pro biologicky nebezpečné látky. POSTUP ANALÝZY Kalibrace Analýza se kalibruje pomocí 5bodové kalibrační křivky. Standardní křivka se generuje pomocí vhodného modelu křivky, který je uveden v aplikačním listu analyzátoru. Podle požadavků laboratoře ověřte kalibraci nejméně dvěma úrovněmi kontroly. Rekalibrujte a proveďte kontroly pro každou soupravu z nové šarže a poté každé 4 týdny pro soupravy ze stejné šarže. V případě, že kontroly spadají mimo přijatelný rozsah laboratoře, provádějte podle potřeby rekalibrace až do data konce spotřeby otevřených činidel. Kontrola kvality Nejméně jednou denně za každý den použití zkoušejte nejméně dvě úrovně materiálu vhodného pro kontrolu kvality. Kromě toho provádějte kontroly po každém novém kalibračním cyklu. Doporučuje se, aby byly v každém běhu zahrnuty nízké a vysoké kontroly. Pokud kontrolní hodnoty nejsou v mezích přijatelnosti, analýzu opakujte. Dodatečné testy kontroly kvality mohou být nezbytné dle místních, státních nebo federálních předpisů nebo akreditačních požadavků. Příklad postupu analýzy Test PLAC aktivity Lp-PLA 2 by měl být proveden s použitím příslušných nastavení použitého analyzátoru. Podrobné pokyny a nastavení pro každý analyzátor naleznete v aplikačním listu analyzátoru pro konkrétní analyzátor automatizované klinické chemie. Je popsáno obecné vysvětlení postupu analýzy pro analyzátor Beckman Coulter (Olympus) AU400. Nastavení pro klinický analyzátor Beckman Coulter (Olympus) AU400 Kód analýzy Rate Doba analýzy 8,5 min Cykly čtení 15 až 14 Objem vzorku 25 μl Objem činidla R1 100 μl činidla R1 (pozice R1) Objem činidla R2 25 μl činidla R2 (pozice R2) Vlnová délka nm, nm Kalibrační metoda Proložení 5 bodů Rozsah analýzy 1,4 až 400 nmol / min / ml POZNÁMKY K POSTUPU Doporučuje se, aby každá laboratoř určila vhodnou frekvenci kalibrací. Nová kalibrační křivka by měla být vygenerována minimálně se soupravou z nové dávky a poté každé čtyři týdny pro soupravy ze stejné šarže. Kalibraci proveďte tehdy, když budou kontroly spadat mimo přijatelný rozsah. Při uskladnění neprohazujte víčka na roztocích činidel, protože to může vést ke kontaminaci. Všechny vzorky by měly být před testováním dobře promíchány, zejména po rozmrazení uložených vzorků. Může být použit vírový mixér, nicméně je třeba se vyvarovat vzniku vzduchových bublin nebo pěnění vzorků. PŘÍKLAD KALIBRAČNÍ KŘIVKY: Aktivita Lp-PLA2 nmol / min / ml Absorbance OD/min

4 OMEZENÍ Spolehlivé, přesné a reprodukovatelné výsledky se získají, když se provádí postup analýzy s úplným pochopením pokynů v příbalovém letáku a s dodržováním správné laboratorní praxe. Stejně jako u jakékoli jiné analytické metody existuje možnost, že látky nebo faktory, které nebyly testovány (např. technické nebo procedurální), mohou rušit test a způsobovat falešné výsledky. Výsledky by měly být zvažovány ve spojení s dalšími klinickými a analytickými metodami. KLINICKÁ INTERPRETACE Aktivita Lp-PLA 2 by měla být interpretována ve spojení s klinickým hodnocením a hodnocením rizika pacienta jako indikátoru aterosklerotického kardiovaskulárního onemocnění. Tento test nenahrazuje testování lipidů v krvi nebo jiných tradičních rizikových faktorů zjištěných u kardiovaskulárních onemocnění. OČEKÁVANÉ HODNOTY Vzorky séra byly získány od klinicky relevantních mužů (N = 751) a žen (N = 785) ve věku 35 let a více (rozsah 35 až 98 let). Vzorky byly testovány pomocí testu PLAC aktivity Lp-PLA 2 podle doporučeného protokolu pro zpracování vzorku a byly vypočteny referenční rozsahy. Distribuce hodnot aktivity Lp-PLA 2 pro tuto populaci je uvedena v následující tabulce: Distribuce podle pohlaví Percentil Vše (N=1536) Lp-PLA (nmol/min/ml) Muži (N=751) Lp-PLA (nmol/min/ml) Ženy (N=785) Lp-PLA (nmol/min/ml) Min Max >400 >400 >400 Střední U jedinců s dvěma asijskými rodiči byla hlášena nízkofrekvenční homozygotní nulová (null) mutace (V279F), což vedlo k nízké hladině cirkulujícího Lp-PLA Tyto referenční rozsahy jsou pouze orientační a nejsou určeny k řešení kritických hodnot nebo lékařských rozhodovacích limitů. Výsledky ukazují, že každá klinická laboratoř může sledovat hodnoty aktivity, které jsou závislé na povaze populace pacientů, jež jsou testováni v dané laboratoři (např. pacienti, u kterých je obecně vyšší riziko kardiovaskulárních onemocnění oproti pacientům s obecně nižším rizikem). Každá laboratoř by si měla stanovit své vlastní referenční intervaly. Pokyny pro stanovení referenčních intervalů lze nalézt v normě CLSI EP28-A3c (Jak definovat a stanovit referenční intervaly v klinické laboratoři, schválené směrnice třetí vydání). Ve velkém počtu klinických epidemiologických studií projevily hodnoty aktivity Lp-PLA 2 nad mediánem prognostickou významnost. 13 FUNKČNÍ CHARAKTERISTIKY Funkční charakteristiky byly stanoveny pomocí analyzátoru Beckman Coulter (Olympus) AU400. Informace o funkčních charakteristikách naleznete v konkrétním aplikačním listu analyzátoru klinické chemie. CITLIVOST Klinická citlivost (kvantifikační limit) analýzy je 10 nmol / min / ml. PŘESNOST ANALÝZY Variabilita intra-analýzy a inter-analýzy byla stanovena testováním čtyř vzorků lidského séra a dvěma kontrolami aktivity Lp- PLA 2 v rozmezí od 98 do 324 nmol / min / ml. Vzorky byly testovány duplicitně dvakrát denně po dobu 20 dnů a se třemi šaržemi činidel. Celková přesnost CV pro každou šarži činidla a vzorek byla < 3 %. Údaje pro jednu šarži činidel jsou shrnuty níže a slouží pro analýzu jako reprezentativní výkon: ) Sérum Střední koncentrace Lp-PLA2 (nmol/min/ml) Intra-analýza % CV n=40 Inter-analýza % CV n=40 Celkem % CV n=

5 LINEARITA Bylo připraveno několik sérií ředění ze vzorků séra se známými vysokými a nízkými hladinami aktivity Lp-PLA 2 a byly testovány se 3 šaržemi činidel. V dynamickém rozmezí od 1,0 do 400 nmol / min / ml vyústila lineární regrese hladin aktivity Lp-PLA 2 ve sklon v rozmezí od 0,98 do 1,03, což odpovídá rozmezí od -6,8 do 10,7 nmol / min / ml a R2 v rozmezí od 0,995 do 0,999. INTERFERUJÍCÍ LÁTKY Endogenní látky nacházející se v krvi a exogenní látky (běžné a léky na předpis) byly hodnoceny jako interference v testu. Vzorky byly ovlivněny dvěma úrovněmi potenciálního interferentu a byly testovány. Na ovlivněných testovaných úrovních nebyla pozorována výrazná interference pro následující látky. Potenciální interference Testovaná koncentrace nízká Testovaná koncentrace vysoká Albumin, g/l Triglycerides, mg/dl Bilirubin, mg/dl Cholesterol, mg/dl Hemoglobin, mg/ml Acetaminophen, µmol/l Aspirin, µmol/l Atorvastatin, µmol/l 20 Diphenhydramine, µmol/l 2 20 Fenofibrate, µmol/l Lisinopril, µmol/l Niacin, µmol/l Tolbutamide, µmol/l Warfarin, µmol/l Metformin, µmol/l Clopidogrel bisulfate, µmol/l Vitamin C, µmol/l ZOTAVENÍ Do bezenzymového ředidla byla přidána různá množství roztoku Lp-PLA 2 vysoké aktivitě, aby vzniklo sedm úrovní aktivity. Tyto ovlivněné roztoky byly analyzovány 3 šaržemi činidel a úrovně aktivity Lp-PLA 2 byly poté porovnány s očekávanými hodnotami, které vedly ke sklonu v rozsahu od 0,99 do 1,10, což odpovídá rozsahu od -2,9 do 4,2 nmol / min / ml a R2 v rozmezí od 0,997 do 1,000. KLINICKÉ STUDIE Existují silné a konzistentní důkazy z epidemiologických studií a klinických studií, které korelují zvýšenou výchozí hladinu Lp- PLA 2 se zvýšeným rizikem kardiovaskulárního onemocnění (CVD ) Korelační údaje byly shrnuty v metaanalýze publikované v The Lancet a zahrnovaly 32 prospektivních studií se pacienty, u kterých hladiny aktivity Lp-PLA 2 prokázaly kontinuální souvislost s rizikem koronárního srdečního onemocnění (CHD), mrtvice a mortality. 13 Zdá se, že Lp-PLA 2 je jednoznačně specifická pro vaskulární zánět. 3,4,11 V primární i sekundární preventivní studii populace byla Lp-PLA 2 spojena s vyšším kardiovaskulárním rizikem a prognóza rizika zůstává významná, pokud je upravena pro klasické rizikové faktory CVD. Hatoum a kolegové dospěli k závěru, že úrovně aktivity Lp-PLA 2 byly signifikantně spojeny s incidencí CHD u žen ve Studii zdravotních sester. 22 U mužů a žen s diabetem typu 2 byly úrovně aktivity Lp-PLA 2 významně asociovány s výskytem CHD, nezávisle na tradičních a zánětlivých rizikových faktorech. 23 Maiolino a kol. zjistili, že vysoká aktivita Lp-PLA 2 zhoršuje prognózu CV u kavkazských pacientů (n = 712) pro koronární angiografii. 24 Údaje ze studií polymorfizmů genu Lp-PLA 2 (snížení úrovní Lp-PLA 2) jsou proměnlivé, ale u korejských mužů (kde je běžná ztráta funkční alely V279F) byly spojeny se signifikantním snížením rizika CVD u postižených jedinců. Velikost a směr tohoto genetického účinku byly plně v souladu s rozsáhlými epidemiologickými studiemi plazmatické aktivity Lp-PLA 2 a rizika onemocnění koronární arterie (CAD). Přirozený nedostatek aktivity Lp-PLA 2 v důsledku transportu alely PLA2G7 279F chrání korejské muže před CAD. Tyto výsledky poskytují důkazy o kauzálním vztahu mezi Lp-PLA 2 a CAD. 12 V post-hoc analýze studie LIPID snížil pravastatin ve 40 mg / den aktivitu Lp-PLA 2 v průměru o 16 %. U pacientů s vyššími výchozími úrovněmi Lp-PLA 2 byl vyšší přínos pravastatinu. Výchozí hladiny aktivity Lp-PLA 2 předpovídaly úmrtí na CHD po úplné úpravě pro všech 24 výchozích rizikových faktorů. Snížení aktivity Lp-PLA 2 pravastatinem během prvního roku bylo vysoce významným prediktorem výskytu CHD nezávisle na změnách LDL cholesterolu a může představovat více než polovinu výhod pravastatinu v lipidové studii. R3 6 Zabraňte kontaktu s očima S2 5 Zabraňte kontaktu s očima S2 6 S36/37/ 39 Při zasažení očí okamžitě důkladně vypláchněte velkým množstvím vody a vyhledejte lékařskou pomoc Používejte vhodný ochranný oděv, rukavice, ochranu očí/obličeje

6 Reference 1 1 Caslake, M. J. et al. Lipoprotein-associated phospholipase A(2), platelet-activating factor acetylhydrolase: a potential new risk factor for coronary artery disease. Atherosclerosis 150, (2000). 2 Kudo, I. & Murakami, M. Phospholipase A2 enzymes. Prostaglandins & other lipid mediators 68-69, 3-58 (2002). 3 Hakkinen, T. et al. Lipoprotein-associated phospholipase A(2), platelet-activating factor acetylhydrolase, is expressed by macrophages in human and rabbit atherosclerotic lesions. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology 19, (1999). 4 Kolodgie, F. D. et al. Lipoprotein-associated phospholipase A2 protein expression in the natural progression of human coronary atherosclerosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology 26, , doi: /01.atv bc (2006). 5 Chisolm, G. M. & Steinberg, D. The oxidative modification hypothesis of atherogenesis: an overview. Free radical biology & medicine 28, (2000). 6 Witztum, J. L. The oxidation hypothesis of atherosclerosis. Lancet 344, (1994). 7 Macphee, C. H. Lipoprotein-associated phospholipase A2: a potential new risk factor for coronary artery disease and a therapeutic target. Current opinion in pharmacology 1, (2001). 8 MacPhee, C. H. et al. Lipoprotein-associated phospholipase A2, platelet-activating factor acetylhydrolase, generates two bioactive products during the oxidation of low-density lipoprotein: use of a novel inhibitor. The Biochemical journal 338 ( Pt 2), (1999). 9 Suckling, K. E. & Macphee, C. H. Lipoprotein-associated phospholipase A2: a target directed at the atherosclerotic plaque. Expert opinion on therapeutic targets 6, , doi: / (2002). 10 Wolfert RL, K. N., Selby RG, Sarno MJ, Warnick RG, Sudhir K. Biological variability and specificity of lipoprotein-associated phospholipase A2 (Lp- PLA2), a novel marker of cardiovascular risk (abstract). Circulation 110, 309 (2004). 11 Lerman, A. & McConnell, J. P. Lipoprotein-associated phospholipase A2: a risk marker or a risk factor? The American journal of cardiology 101, 11F-22F, doi: /j.amjcard (2008). 12 Jang, Y. et al. Carriage of the V279F null allele within the gene encoding Lp-PLA(2) is protective from coronary artery disease in South Korean males. PloS one 6, e18208, doi: /journal.pone (2011). 13 Thompson, A. et al. Lipoprotein-associated phospholipase A(2) and risk of coronary disease, stroke, and mortality: collaborative analysis of 32 prospective studies. Lancet 375, , doi: /s (10) (2010). 14 Kiechl, S. et al. Oxidized phospholipids, lipoprotein(a), lipoprotein-associated phospholipase A2 activity, and 10-year cardiovascular outcomes: prospective results from the Bruneck study. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology 27, , doi: /atvbaha (2007). 15 Winkler, K. et al. Lipoprotein-associated phospholipase A2 predicts 5-year cardiac mortality independently of established risk factors and adds prognostic information in patients with low and medium high-sensitivity C-reactive protein (the Ludwigshafen risk and cardiovascular health study). Clinical chemistry 53, , doi: /clinchem (2007). 16 Robins, S. J., Collins, D., Nelson, J. J., Bloomfield, H. E. & Asztalos, B. F. Cardiovascular events with increased lipoprotein-associated phospholipase A(2) and low high-density lipoprotein-cholesterol: the Veterans Affairs HDL Intervention Trial. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology 28, , doi: /atvbaha (2008). 17 Elkind, M. S., Tai, W., Coates, K., Paik, M. C. & Sacco, R. L. Lipoprotein-associated phospholipase A2 activity and risk of recurrent stroke. Cerebrovascular diseases 27, 42-50, doi: / (2009). 18 Cucchiara, B. L. et al. Lipoprotein-associated phospholipase A2 and C-reactive protein for risk-stratification of patients with TIA. Stroke; a journal of cerebral circulation 40, , doi: /strokeaha (2009). 19 Caslake, M. J. et al. Lipoprotein-associated phospholipase A(2), inflammatory biomarkers, and risk of cardiovascular disease in the Prospective Study of Pravastatin in the Elderly at Risk (PROSPER). Atherosclerosis 210, 28-34, doi: /j.atherosclerosis (2010). 20 Kinney, G. L. et al. Lipoprotein-associated phospholipase A(2) activity predicts progression of subclinical coronary atherosclerosis. Diabetes technology & therapeutics 13, , doi: /dia (2011). 21 Massot, A. et al. Lipoprotein-associated phospholipase A2 testing usefulness among patients with symptomatic intracranial atherosclerotic disease. Atherosclerosis 218, , doi: /j.atherosclerosis (2011). 22 Hatoum, I. J., Cook, N. R., Nelson, J. J., Rexrode, K. M. & Rimm, E. B. Lipoprotein- associated phospholipase A2 activity improves risk discrimination of incident coronary heart disease among women. American heart journal 161, , doi: /j.ahj (2011). 23 Hatoum, I. J., Hu, F. B., Nelson, J. J. & Rimm, E. B. Lipoprotein-associated phospholipase A2 activity and incident coronary heart disease among men and women with type 2 diabetes. Diabetes 59, , doi: /db (2010). 24 Maiolino, G. et al. Lipoprotein-associated phospholipase A2 activity predicts cardiovascular events in high risk coronary artery disease patients. PloS one 7, e48171, doi: /journal.pone (2012). 25 White, H. D. et al. Changes in Lipoprotein-Associated Phospholipase A2 Activity Predict Coronary Events and Partly Account for the Treatment Effect of Pravastatin: Results From the Long-term Intervention with Pravastatin in Ischemic Disease Study. Journal of the American Heart Association 2, e000360, doi: /jaha (2013).