Posouzení výsledků stanovení fosfolipázy A 2 asociované s lipoproteiny v souvislosti s aterosklerózou

Transkript

1 Posouzení výsledků stanovení fosfolipázy A 2 asociované s lipoproteiny v souvislosti s aterosklerózou Beňovská M. 1,2, Babušíková L. 1, Pařenica J. 3, Tůmová J. 1 1 Oddělení klinické biochemie a hematologie, Fakultní nemocnice Brno 2 Katedra laboratorních metod MU, Brno 3 Interní kardiologická klinika, Fakultní nemocnice Brno SOUHRN Cíl práce: Představení nového biochemického parametru Lp-PLA 2 v souvislosti s aterosklerózou, infarktem myokardu a cévní ischemickou příhodou. Metoda stanovení: Ve FN Brno byla nainstalována a zavedena imunoturbidimetrická metoda ke stanovení fosfolipázy A 2 asociované s lipoproteiny ( Lp-PLA 2 ) od americké společnosti diadexus. Výsledky: Zúčastnili jsme se studie Enablement a porovnali tak přesnost a výtěžnost našich výsledků stanovení Lp-PLA 2 na mezinárodní úrovni. Dále byla změřena koncentrace Lp-PLA 2 u čtyřech souborů sestavených z 90-ti pacientů dle diagnózy. Současně byl u těchto pacientů stanoven Chol, TG, HDL, LDL, ApoB, Lp(a), CRP a NT-proBNP a vyčíslena shoda mezi Lp-PLA 2 a jednotlivými parametry. Závěr: Metoda stanovení Lp-PLA 2 byla zavedena a představena klinikům kardiologické a neurologické kliniky FN Brno. Do budoucna je cílem u pacientů se středním a vysokým kardiovaskulárním rizikem stanovovat Lp-PLA 2 opakovaně a ověřovat tak efektivitu léčby. Klíčová slova: fosfolipáza A 2 asociovaná s lipoproteiny, ateroskleróza, cévní mozková příhoda, infarkt myokardu SUMMARY Beňovská M., Babušíková L., Tůmová J.: Evaluation of the results of the determination of lipoprotein-associated phospholipase A 2 in relation to atherosclerosis Objective: The goal of this work is to introduce the new biochemical test parameter Lp-PLA 2 in relation to atherosclerosis. Method of determination: A turbidimetric immunoassay for the measurement of Lp-PLA 2 from the American company diadexus was installed and implemented at FN Brno. Results: We took part in the Enablement study to compare the precision and recovery factor of our results of Lp-PLA 2 measurements on an international scale. Further, the concentration of Lp-PLA 2 was measured for four selected groups of 90 patients that were put together based on their diagnosis. Simultaneously, the values of Chol, TG, HDL, LDL, ApoB, Lp(a), CRP and NT-proBNP were measured for these patients and the concordance between Lp-PLA 2 and individual parameters was quantified. Conclusion: The method of determination of Lp-PLA 2 has been established and presented to specialists at the cardiology and neurology clinics of FN Brno. The future goal is to measure Lp-PLA 2 repeatedly for patients with moderate or high cardiovascular risk to determine the treatment efficiency. Key words: lipoprotein-associated phospholipase A2, Lp-PLA 2, atherosclerosis, stroke, myocardial infarction Lp-PLA 2 a její význam Fosfolipáza A 2 asociovaná s lipoproteiny (Lp-PLA 2 ) patří mezi nové nadějné biochemické parametry. V České republice prozatím toto stanovení není rozšířeno. Fosfolipáza A 2 asociovaná s lipoproteiny je považována za cirkulující biomarker. Je navázána z 80% na LDL cholesterol, z 20% na HDL cholesterol a dále na Lp(a) a ostatní lipoproteiny. Lp-PLA 2 je jedním ze skupiny intracelulárních a sekrečních fosfolipidových enzymů, které hydrolyzují esterovou vazbu lipoproteinů obsaženou v buněčných membránách. Enzym je produkován makrofágy a pěnovými buňkami ve vaskulární intimě. Bylo prokázáno, že se Lp-PLA 2 podílí na kaskádě zánětu, který probíhá v aterosklerotickém plátu. Její unikátnost spočívá v tom, že na rozdíl od CRP zvýšená hladina je specifická pouze pro zánětlivé procesy aterosklerotického plátu. Při hydrolýze oxidovaných LDL částic tento enzym generuje prozánětlivý mediátor lyzofosfatidylcholin, který podporuje rupturu plátu a přispívá k ischemické nekróze. Můžeme konstatovat, že vysoká hladina Lp-PLA 2 ukazuje na nestabilní a naopak nízká hladina na stabilní aterosklerotický plát. Nízká hladina Lp-PLA 2 má tedy negativní prediktivní hodnotu [1,2]. U pacientů se zvýšenou hladinou Lp-PLA 2

2 dochází až k několikanásobně vyššímu riziku vzniku primární a sekundární kardiovaskulární příhody [3]. Velký význam Lp-PLA 2 je tedy v predikci infarktu myokardu a cévní mozkové příhody i v určení pravděpodobnosti jejich recidivy. V současnosti se popisuje, že při 76% náhlých kardiovaskulárních úmrtí dojde k ruptuře aterosklerotického plátu a asi 87% CMP má ischemický charakter. Léčba určovaná hladinou Lp-PLA 2 by proto měla vést k redukci vzniku koronárních onemocnění a CMP [4,5]. Byla provedena řada studií, ve kterých se srovnávala hodnota Lp-PLA 2 s dalšími parametry. Pokud je současně zvýšena hodnota Lp-PLA 2 i CRP, je pozorován synergický efekt a riziko IM i CMP je výrazně vyšší. Zvýšené hodnoty LDL cholesterolu naopak nepatří mezi rizikové faktory CMP [6]. Velmi nadějné jsou preklinické studie prováděné na zvířatech. Bylo zjištěno, že inhibice enzymu Lp-PLA 2 tlumí zánětlivý proces a zpomaluje progresi aterosklerotického onemocnění [1]. V dnešní době se k posouzení koronárního rizika v široké míře užívají hladiny cholesterolu a jiných lipidů. Pouze u 50% osob s koronárním onemocněním však byly zjištěny zvýšené hladiny cholesterolu [5]. Problematikou kardiovaskulárního onemocnění se zabývala americká společnost pro posouzení kardiovaskulárního rizika American Heart Association/ Centers for Disease Control (AHA/CDC). Z jednání této společnosti v červnu 2008 vyplynulo doporučení, že stanovení Lp-PLA 2 by mělo být používáno jako další rizikový parametr pro pacienty se středním nebo vysokým rizikem vzniku kardiovaskulárního onemocnění. Závěrem doporučení jsou následující hodnoty : Koncentrace Lp-PLA 2 menší než 200 ng/ml jsou považovány za nízké riziko Koncentrace Lp-PLA 2 v rozmezí ng/ml jsou považovány za hraniční riziko Koncentrace Lp-PLA 2 větší než 235 ng/ml jsou považovány za vysoké riziko [7] Dle doporučení AHA/CDC by byl pacient se dvěma rizikovými faktory klasifikovaný jako středně rizikový, v případě, že má současně hladinu Lp-PLA 2 větší než 200 ng/ml, reklasifikován do skupiny s vysokým kardiovaskulárním rizikem. Měla by u něj být nasazena agresivní léčba rizikových faktorů aterosklerózy a změněna cílová hodnota LDL cholesterolu z 3,4 mmo/l na 2,6 mmo/l. U pacientů po IM, kteří mají vysoké hodnoty Lp-PLA 2, je doporučena cílová hodnota LDL cholesterolu dokonce 1,8 mmo/l [3]. Assess Patients through traditional risk factors Test Measure Lp-PLA 2 levels in individuals assessed as moderate or high risk Treat To appropriate LDL-C Goal Fig. 1. Recommendation for use of Lp-PLA 2 [3]

3 Cut off hodnota pro Lp-PLA 2 je tedy u rizikových pacientů 200 ng/ml. Doporučená frekvence testování pacientů s kardiovaskulárními problémy a hodnotou Lp-PLA 2 nižší než 200 ng/ml je 1x ročně. Zdá se, že parametr Lp-PLA 2 na rozdíl od posuzování rizika kardiovaskulárního onemocnění dle Framinghama dobře hodnotí riziko všech etnických skupin [3]. V roce 2005 bylo stanovení Lp-PLA 2 schváleno komisí US Food and Drug Administration. Výsledky Lp-PLA 2 ukázaly systematické spojení s rizikem cévní mozkové příhody. To může mít obrovský význam, neboť CMP je druhou nejčastější příčinou smrti na světě, léčba je finančně velmi náročná a 15-30% pacientů má trvalé následky [4]. Z uvedených faktů vyplývá, že stanovení Lp-PLA 2 je doporučováno u pacientů s rizikovými faktory aterosklerózy a v rámci sekundární prevence u pacientů po IM a CMP. Metoda stanovení Lipoproteinová fosfolipáza A 2 v séru či plasmě byla stanovována pomocí soupravy PLAC test od firmy diadexus, kterou v ČR dodává firma Medista. Jedná se o imunoturbidimetrické stanovení založené na reakci Lp-PLA 2 s dvěma vysoce specifickými protilátkami navázanými na polymerní mikročástice. Metoda byla prováděna na analyzátoru Hitachi 917 (Roche Diagnoscics). Vyšetření Lp-PLA 2 má doporučené speciální podmínky pro měření vzorků. Vzorky je po odběru možno analyzovat nejdříve druhý den po zamražení na -20 o C (minimálně na 16 hod). Pro skladování delší než 3 dny je nezbytná teplota -70 o C. Studie Enablement a studie FN Brno Naše pracoviště bylo vybráno k účasti na mezinárodní studii Enablement zabývající se stanovením Lp-PLA 2, kterou organizovala firma diadexus. V rámci této studie se měřily parametry metody Lp-PLA 2 - opakovatelnost, reprodukovatelnost, výtěžnost kalibrátorů a výtěžnost souboru 30 dodaných pacientských sér (opakovaně). Studie přesně specifikovala, co má být který den provedeno. Ve spolupráci s kardiologickou a neurologickou klinikou FN Brno byla stanovena Lp- PLA 2 u čtyř souborů pacientů sestavených dle diagnózy. Do prvních dvou skupin byli zařazeni pacienti sledovaní a léčení v rámci sekundární prevence - po IM a po CMP. Třetí a čtvrtý soubor byl sestaven v rámci primární prevence - z pacientů s nestabilní anginou pectoris a pacientů s dyslipidémií. U těchto pacientů byly v rámci studie vyšetřeny parametry Lp-PLA 2, CHOL, TG, HDL, LDL, ApoB, Lp(a), CRP a NT- probnp. Poznámka: Koncentrace Lp-PLA 2 v prvních týdnech po IM nebo CMP není stabilní. Vzorky je z těchto důvodů nutno odebírat za 4-5 týdnů po příhodě.

4 Výsledky a diskuse a) Studie Enablement Precision Intra Assay Inter Assay QC 1 QC 2 QC 1 QC 2 mean ,4 146,2 362,3 sd 1,589 2,978 4,492 12,859 %cv 1,1 0,9 3,1 3,5 Table 1. Intra Assay and Inter Assay precision on quality kontrols for Lp-PLA 2 (intra assay: n=20, inter assay n= 10) Calibrator Value Ave. Recovered Recovered Recovered Recovered Ave. % Recovery ,7 97,30% ,7 95,70% ,7 106,70% ,3 100,30% Table 2. Linearity by Calibrator Lp-PLA 2 Recovery LP-PLA2 METHOD COMPARISON ng/ml 600,0 500,0 400,0 Lab 300,0 200,0 100,0 0,0 0,0 100,0 200,0 300,0 400,0 500,0 diadexus Fig. 2. Plot of Lp-PLA 2 in patient s samples value of diadexus versus OKBH FN Brno Vyhodnocení studie Enablement Opakovatelnost s variačním koeficientem do 1,1%, reprodukovatelnost s variačním koeficientem do 3,5%, výtěžnost % u kalibrátorů a % u vzorků pacientů nám přinesla velmi pozitivní hodnocení od firmy diadexus a doporučení zavést na našem pracovišti stanovení Lp-PLA 2 do rutinního provozu.

5 b) Studie FN Brno Stroke MI 100 dyslipidemia UAP Fig. 4. Distribution of measured Lp-PLA 2 Fig. 4. Distribution of measured Lp-PLA 2 values for groups of patiens with values for groups of patiens with a history of stroke and myocardial infarction dyslipidemia and unstable angina pectoris Variable : Stroke Variable : dyslipidemia Sample size : 15 Sample size : 14 Lowest value : 123,0000 Lowest value : 146,0000 Highest value : 1464,0000 Highest value : 450,0000 Median : 227,0000 Median : 223, th percentile: 201, th percentile: 202, th percentile: 289, th percentile: 276,0000 Variable : MI Variable : UAP Sample size : 41 Sample size : 20 Lowest value : 111,0000 Lowest value : 107,0000 Highest value : 447,0000 Highest value : 471,0000 Median : 204,0000 Median : 219, th percentile: 177, th percentile: 155, th percentile: 264, th percentile: 255,0000 V souboru pacientů po CMP mělo 80% pacientů hodnotu Lp-PLA 2 vyšší než 200 ng/ml, z toho 27% hodnotu vyšší než 300 ng/ml po IM mělo 58% pacientů hodnotu Lp-PLA 2 vyšší než 200 ng/ml, z toho 15% hodnotu vyšší než 300 ng/ml s dyslipidémií mělo 79% pacientů hodnotu Lp-PLA 2 vyšší než 200 ng/ml, z toho 21% hodnotu vyšší než 300 ng/ml s nestabilní anginou pektoris mělo 55% pacientů hodnotu Lp-PLA 2 vyšší než 200 ng/ml, z toho 15% hodnotu vyšší než 300 ng/ml Pro posouzení korelací mezi hodnotou Lp-PLA 2 a ostatními parametry v hodnocených souborech byl zvolen výpočet procentuálního vyhodnocení shody (concordance). Za shodu bylo považováno, pokud hodnota Lp-PLA 2 i srovnáného parametru byla v referenčním rozmezí nebo hodnota Lp-PLA 2 a srovnáného parametru dosahovala zvýšených hodnot, tedy byla mimo referenční rozmezí. Výsledky shody ovlivňuje vždy nejistota měření. Pro výpočty byly však striktně hodnoceny hodnoty Lp-PLA 2 vyšší než 200 ng/ml jako zvýšené. Příklad

6 výpočtu shody mezi Lp-PLA 2 a cholesterolem je v tabulce č. 3. Shoda vypočítaná mezi Lp- PLA 2 ostatními parametry je uvedena v tabulce č.4. Lp-PLA 2 within ref. int. above ref. int. CHOL [mmo/l] do 200 >200 total within ref. int. 3,1-5, above ref. int. >5, total x= 62% Table 3. The concordance between Lp-PLA 2 and cholesterol was 62% Concordance [%] Lp-PLA 2 Concordance [%] Lp-PLA 2 CHOL [mmo/l] 62 ApoB [g/l] 53 TG [mmol/l] 46 Lp(a) [g/l] 37 HDL [mmol/l] 43 CRP [mg/l] 58 LDL [mmo/l] 57 NT- probnp [pg/ml] 48 Table 4. The concordance between Lp-PLA 2 and other parameters Hodnocení dosažených výsledků Z popisu souborů pacientů vyplývá, že významné procento má koncentraci Lp-PLA 2 vyšší, než je doporučeno, což ukazuje na potřebu intenzivnější léčby. Shoda mezi Lp-PLA 2 a jednotlivými parametry je 40-60%, což odpovídá údajům z odborné literatury a potvrzuje roli Lp-PLA 2 jako nezávislého parametru pro posouzení rizika aterosklerózy. Významné je porovnání Lp-PLA 2 s Lp(a) a HDL cholesterolem, což v dosud publikovaných pracích chybělo. V těchto případech bylo dosaženo nejnižší shody ze všech sledovaných parametrů (37% Lp(a), 43% HDL cholesterol). Při srovnání Lp-PLA 2 s dalšími parametry jsme vypozorovali zajímavou skutečnost: největší neshody způsobovala vždy skupina pacientů, u nichž byla hodnota Lp-PLA 2 zvýšená a ostatní parametry nabývaly hodnot v referenčním rozmezí. Důvodem může být to, že za zvýšené byly považovány všechny výsledky s hodnotou Lp-PLA 2 vyšší než 200 ng/ml, což je cut off navržený pro rizikové pacienty. Při srovnávání lipidů však byly využity běžné referenční meze, ne hodnoty doporučované společností AHA/CDC. Domníváme se, že u pacientů se zvýšenou hladinou Lp-PLA 2, kteří mají současně dva a více rizikových faktorů aterosklerózy, by měla být ordinována agresivnější léčba. S tím koresponduje doporučení kardiologické společnosti AHA/CDC snížit hladinu LDL cholesterolu v rámci sekundární prevence až na hodnotu 2,6 mmol/l, zatímco při výpočtu shody jsme počítali u LDL cholesterolu s referenčním rozmezím 3,6 mmol/l.

7 Závěr Byla zavedena a s úspěchem používána metoda na stanovení fosfolipázy A 2 asociované s lipoproteiny. Výsledky změřených souborů pacientů zaujaly klinické lékaře ve FN Brno. Bylo dohodnuto, že zvýšené koncentrace Lp-PLA 2 budou využívány při léčbě pacientů. V současné době neexistuje terapie přímo ke snížení Lp-PLA 2, ale léčba statiny její hodnotu ovlivňuje. Budeme hledat cestu pro pokračování celého projektu tak, aby mohlo být u rizikových pacientů prováděno opakované měření hladin Lp-PLA 2 a sledován vývoj této koncentrace v závislosti na léčbě. Dojde-li ke snížení koncentrace Lp-PLA 2, lze očekávat, že se zvýší stabilita aterosklerotického plátu pacienta. Výsledky léčebné strategie s využitím monitorování Lp-PLA 2 budou vyžadovat delší sledování. Příslibem do budoucnosti v této problematice se jeví studie zabývající se použitím inhibitoru enzymu Lp-PLA 2, jak je uvedeno v první části této práce. To by mohlo velmi výrazně ovlivnit léčbu koronárního a ischemického onemocnění. Literatura 1. Anderson, J.L. Lipoproteid - Associated Phospholipase A 2 : An Independent Predictor of Coronary Artery Disease Events in Primary and Secondary Prevention. Am. J.Cardiol 2008, 101, p Lerman, A., McConnell, J.P. Lipoproteid - Associated Phospholipase A 2 : A Risk Marker or Risk Factor? Am. J.Cardiol. 2008, 101, p Davidson, M.H., Corson, M.A., Alberts, M.J., Anderson, J.L., Gorelick, P.B., Jones, P.H., Lerman, A., McConnell, J.P., Weintraub, H.S. Consensus Panel Recommendation for Incorporating Lipoprotein Associated Phospholipase A 2 Testing into Cardiovascular Disease Risk Assesment Guidelines. Am. J.Cardiol. 2008, 101, p Gorelick, P.B. Lipoproteid Associated Phospholipase A 2 and Risk of Stroke. Am. J.Cardiol. 2008, 101, p Weintraub, H.S. Identifying the Vulnerable Patient with Rupture - Prone Plaque. Am. J.Cardiol. 2008, 101, p Ballantyne, C.M., Hoogeveen, R.C., Bang, H., Coresh, J., Folsom, A.R., Chambless, L.E. et al. Lipoproteid - associated phospholipase A 2, high sensitivity C- reactive protein, and risk for incident ischemic stroke in modele - aged men and women in the Atherosclerosis Risk in Communities (ARIC) study. Arch Intern Med. 2005, 165. p Corson, M.A., Jones, P.H., Davidson, M.H. Review of the Evidence for the Clinical Utility of Lipoprotein - Associated Phospholipase A 2 as a Cardiovascular Risk Marker. Am. J.Cardiol. 2008, 101, p Adresa pro koresponcenci: RNDr. Miroslava Beňovská OKBH FN Brno Jihlavská Brno mbenov@fnbrno.cz