MYCOPLASMA DUO IDENTIFIKACE A DIFERENCIÁLNÍ TITRACE UROGENITÁLNÍCH MYKOPLASMAT

Transkript

1 MYCOPLASMA DUO IDENTIFIKACE A DIFERENCIÁLNÍ TITRACE UROGENITÁLNÍCH MYKOPLASMAT

2 1- POUŽITÍ Mykoplasmata jsou komenzální organizmy, které kolonizují sliznici urogenitálního traktu a za určitých podmínek se intenzivně množí, což způsobuje řadu onemocnění: Ureaplasma urealyticum (Uu) u mužů převážně způsobuje uretritidu (druhá nejčastější příčina negonokokové uretritidy); příležitostně je nalézána jako původce prostatitidy a epididymitidy (12). U těhotných žen může U. urealyticum vést k choreoamnionitidě (13) a k předčasnému protržení membrán, které je provázeno rizikem neonatální infekce. Je zodpovědná za výskyt reprodukčních poruch (3, 4, 5). Mycoplasma hominis (Mh) je udávána jako příčina endometritidy a salpingitidy (12) a je spojována s nespecifickými vaginitidami (8). Oba druhy mohou způsobovat: Neonatální infekce (meningitidy, infekce respiračního traktu, septikémie) (9) (10) (12) (13) Poporodní septikémie (6) (12). Artritidu. Jelikož oba druhy mohou být přítomny jako komenzální nebo patogenní organizmy, je nutné používat kvantitativní kritéria pro interpretaci kultur z urogenitálních vzorků dospělých osob (1, 2, 11). Rozhodnutí o léčbě záleží na titru mykoplasmat a na klinických projevech. Test MYCOPLASMA DUO umožňuje laboratořím: kultivovat, identifikovat a diferenciálně titrovat urogenitální mykoplazmata (UU a MH) připravit standardizované inokulum pro testování citlivosti k antibiotikům. 2- PRINCIP Selektivita jamky X na mikrotitrační destičce je zajištěna antimykotickou látkou a směsí antibiotik. Identifikace/titrace urogenitálních mykoplasmat je založena na následujících specifických metabolických vlastnostech jednotlivých organizmů: hydrolýza: - urey druhem Ureaplasma urealyticum (UU) - argininu druhem Mycoplasma hominis (MH) s uvolňováním amoniaku a následnou alkalizací média (bez zakalení média).

3 Reakce je vizualizována změnou barvy ph indikátoru ze žluté na červenou (fenolová červeň). Žluté zbarvení v jamce destičky: žádná mykoplasmata Červené zbarvení v jamce destičky: přítomnost mykoplasmat Titrace založená na principu ředění tekutého média: postupným ředěním suspenzního média v jamce D (ředění 10-1 ) av jamkách U 10 4 a H 10 4 (ředění 10-2 ) je možné stanovit titr daného kmene. Titr odpovídá počtu jamek, jejichž barva se změní na červenou během 24 až 48 hodin; každá červeně zbarvená jamka obsahuje minimálně jednu CCU (jednotku změny barvy) viz schéma vyhodnocení. Příprava testu na stanovení citlivosti k antibiotikům. Jamka X umožňuje pomocí selektivního obohacení vzorku přípravu standardizovaného inokula (10 3 až 10 5 CCU/ml) (jednotka změny barvy) pro testování citlivosti k antibiotikům po 24 hodinách inkubace. 3- SLOŽENÍ UCHOVÁVÁNÍ DOBA POUŽITELNOSTI Složení soupravy: Mycoplasma Duo, kód 62740: 20 mikrodestiček: na každé destičce je 6 jamek, které obsahují: - dehydrované substráty pro identifikaci - růstové faktory pro mykoplasmata - látky inhibující růst přidružené polymorfní flóry jamka U a U 10 4 : identifikace a titrace UU (obsahuje ureu) jamka H a H 10 4 : identifikace a titrace MH (obsahuje arginin) D: ředící jamka X: selektivní pomnožení mykoplasmat: příprava standardizovaného inokula pro testování citlivosti k antibiotikům. 20 lahviček obsahujících po 2 ml suspensního média (suspensní/transportní médium) 1 kapací lahvička obsahující 15 ml ředícího roztoku

4 40 plastových mikropipet (2 jsou potřebné pro každý vzorek) 20 adhezívních fólií. Suspenzní médium MYCOPLASMA DUO (kód 62739) 40 lahviček obsahujících po 2 ml suspensního média (suspensní/transportní médium) Uchovávání: při +2-8 C. Exspirační doba : až do data exspirace vytištěného na soupravě. 4- VZOREK 1) Genitální vzorky: výtěry z uretry, endocervixu, vaginy (méně často nosní a nasofaryngeální výtěry a oční stěry u dětí): jelikož mykoplasmata adherují k buňkám, je nutné odebrat buňky stěrem mukózy. Tampony (cytobrush nebo Bactopick ) se poté louhují ve 2 ml média. 2) Biologické vzorky: moč*: - první část proudu : homogenizujte vzorek. - moč z dalšího močení: resuspendujte peletu vzniklou centrifugací v 0,2 ml fyziologického roztoku. sperma a méně často supernatanty krevních kultur, mozkomíšní mok, synoviální tekutina nebo bronchiální tekutina získaná aspirací u novorozenců. Inokulujte 0,2 ml vzorku do 2 ml suspensního média. * Jelikož mykoplasmata adherují k buňkám, jsou pro detekci mykoplasmat nejlepší takové urogenitální vzorky, které obsahují epiteliální buňky: tj. výtěry z uretry, endocervixu nebo vagíny, odebrané seškrábnutím sliznice včetně buněk. Podmínky pro uchovávání biologických vzorků jsou uvedeny v aktuálních doporučeních (14). 3) Přeprava: Vzorky mohou být přepravovány v suspensním médiu: po inokulaci do tohoto média mohou být vzorky uchovávány: 48 hodin při pokojové teplotě 72 hodin při +2-8 C 6 měsíců zmražené při -20 C. 5- PRACOVNÍ POSTUP A. POTŘEBNÝ MATERIÁL, KTERÝ NENÍ SOUČÁSTÍ DODÁVKY Inkubátor pro inkubaci při 37 C. Nádoba na kontaminovaný odpad

5 B. POSTUP Naočkování mikrotitrační destičky 1) Ředící roztok Pomocí kapací lahvičky nakapejte 4 kapky (200 µl) ředícího roztoku do každé ze tří jamek spodní řady destičky: U 10 4, D a H ) Vzorek Pomocí mikropipety přidejte suspenzní médium s inokulovaným vzorkem takto: 4 kapky (100 µl) do každé ze tří jamek horní řády destičky: U, X, H; jednu kapku (25 µl) do jamky D. 3) Ředění Pomocí nové pipety (je nezbytné použít pro ředění novou pipetu, protože mykoplasmata adherují k plastovým povrchům) důkladně homogenizujte obsah jamky D (třikrát nasajte obsah), poté nasajte suspenzi a přeneste jednu kapku (25 µl) do jamky U 10 4 a jednu kapku (25 µl) do jamky H Inkubace Překryjte destičku přilnavou fólií. Inkubujte destičku po dobu 24 h v inkubátoru při 37 C a poté v případě potřeby (viz kapitola 7) prodlužte inkubaci o dalších 24 hodin.

6

7 6- VYHODNOCENÍ - INTERPRETACE 1) Vyhodnocení Výsledky se hodnotí nejprve po 24 hodinách inkubace: toto hodnocení umožňuje stanovit definitivní výsledek vysokého titru vzorku ( 10 4 CCU/ml); Druhé vyhodnocení, provedené po 48 hodinách inkubace, je zapotřebí pro: - potvrzení negativních výsledků - detekci kmenů přítomných v nízkých titrech ( 10 3 CCU/ml) - detekci kmenů přítomných ve vysokých titrech ( 10 4 CCU/ml), ale charakteristických pomalým metabolismem. 2) Interpretace Změna barvy ze žluté na červenou u jamek obsahujících ureu nebo arginin bez zakalení média indikuje přítomnost mykoplasmat. Schéma vyhodnocení a interpretace je stejné pro oba druhy mykoplasmat: jamky U a U 10 4 soupravy DUO se hodnotí na přítomnost UU a jamky H a H 10 4 se hodnotí na přítomnost MH. Souprava MYCOPLASMA DUO umožňuje diferenciální titraci obou druhů mykoplasmat, které mohou být přítomny oba současně v jednom vzorku. Vzorky jsou klasifikovány takto: Negativní: žádná změna zbarvení UU pozitivní: změna barvy pouze v jamce (jamkách) U MH pozitivní: změna barvy pouze v jamce (jamkách) H UU a MH pozitivní: změna barvy pouze v jamkách U a H indikuje, že jsou ve vzorku přítomny oba druhy; vyhodnoťte titr pro každý druh zvlášť.

8

9

10 Poznámka Opožděné hodnocení (např. po víkendu): všechny výsledky zůstávají nezměněny po 48 hodinách, což umožňuje provést opožděné hodnocení. Tuto identifikaci je možné potvrdit pozorováním kolonií izolovaných na agaru pro mykoplasmata. V případě zakalení média, což indikuje růst bakterií jiných než mykoplasmat (vzácný případ, protože selektivita média je zajištěna aditivy), proveďte subkultivaci na agaru ze suspenzního média nebo z jamky D (nakapejte na povrch média jednu až 3 kapky a poté inkubujte 48 hodin při 37 C v 10% CO2. Uvedená technika umožňuje titrovat koncentrace přibližně 10 3 a 10 4 /ml, které jsou akceptovány jako hraniční koncentrace patogenicity (7). 7- POUŽITÍ JAMKY X Jamka X se neinterpretuje, jelikož obsahuje obohacené selektivní médium pro mykoplasmata, které umožňuje přípravu standardizovaného inokula k testování citlivosti k antibiotikům (test SIR MYCOPLASMA, kód 62781): Nařeďte obsah jamky X v poměru 1/100: U9 bujónem (U9, kód 62762) pro UU argininovým bujónem (Arginine, kód 62763) pro MH. Přeneste 20 µl obsahu jamky X do 2 ml urea nebo argininového bujonu (podle testovaného druhu). Do každé jamky destičky SIR MYCOPLASMA inokulujte 100 µl tohoto 1/100 ředění. 8- ÚČINNOST/KONTROLA KVALITY TESTU Účinnost soupravy Mycoplasma Duo je kontrolována pomocí těchto kmenů: KMENY KONTROLA AKTIVITY Ureaplasma urealyticum ref UU 80 Mycoplasma hominis ref MH 31 Enterococcus faecalis CIP Proteus mirabilis ATCC Staphylococcus aureus CIP Uspokojivá identifikace, titrace a pomnožení KONTROLA INHIBICE MIKRODESTIČKY Inhibice Inhibice KONTROLA INHIBICE MÉDIA Inhibice

11 9- KONTROLA KVALITY PROVÁDĚNÁ VÝROBCEM Všechny vyráběné a komercionalizované reagencie jsou kontrolovány kompletním systémem kontroly kvality začínajícím od přijetí surovin až po komercionalizaci produktu. Každá šarže je podrobena kontrole kvality a je uvolněna na trh pouze tehdy, jestliže odpovídá stanoveným akceptačním kriteriím. Dokumentace týkající se výroby a kontroly každé jednotlivé šarže je uchovávána u výrobce. 10- OMEZENÍ TESTU Vzorky moči mohou dávat falešně negativní výsledky, protože neobsahují velký počet buněk, nebo falešně pozitivní výsledky v případě alkalického ph.

12 11- REFERENCES 1. EB F. and ORFILA J., Les Mycoplasmes génitaux: rôle pathogène et diagnostic, Méd. Mal. infect, 1985, 9bis, SCHIEFFER H.G., Urethral syndrome in women: etiologic, cytologic and clinical studies, (abstract) June 1988: 7 th Congress International Organization for Mycoplasmology - Vienna 3. QUINN P.A. and coll. Incidence of late loss and U. urealyticum in women with recurrent pregnancy loss, Abstract of the 1987 ICAAC 4. LAMONT R.F. TAYLOR ROBINSON D. and coll. The role of mycoplasmas, ureaplasmas and chlamydia in the genital tract of women presenting spontaneous early preterm labor., J. Med. Microbiol., 1987,- 24, WAITES K.B. and coll. Ureaplasma pneumonia and sepsis associated with persistent pulmonary hypertension in the newborn, (abstract) June 1988: 7 th Congress International Organization for Mycoplasmology - Vienna 6. PHILLIPS L.E. and coll., Post cesarean wound infection by Mycoplasma hominis in a patient with persistent post partum fever, Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 1987, 7, BEBEAR C. and RENAUDIN H., Les mycoplasmes génitaux : principe d isolement et d identification, Feuil. Biol., 1986, 27, MARDH P.A. and coll., Mycoplasma hominis in women with bacterial vaginosis and their consorts, (abstract) June 1988: 7 th Congress International Organization for Mycoplasmology - Vienna 9.WAITES K.B. and coll., Chronic Ureaplasma urealyticum and Mycoplasma hominis infections of central nervous system in preterm infants. Lancet, 1988, 2/9, MADOFF S. & HOOPER D.C., Non genitourinary infections caused by Mycoplasma hominis in Adults. Rev. Infect. Dis., 1988, 3, BONISSOL CH., Isolement et identification des mycoplasmes urogénitaux, Méd. Mal. infect., 1980, 10, COPIN E. and LEBRUN L., Infections à mycoplasmes urogénitaux, Feuil. Biol, 1991, 32, (181),

13 13.CASSELL G.H., WAITES K.B., WATSON H.L., CROUSE D.T. and HARASAWA R., Ureaplasma urealyticum intra-uterine infection: role in prematurity and disease in newborns, Clin. Microbiol, Rew., 1993, 6 (1), Basic Laboratory Procedures Clinical Bacteriology. World Health Organization. Geneva st edition. 24

14 98

15 99

16 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) /2003 Fax.: +33 (0) code: