Proteinové biočipy Nová a rychle se rozvíjející problematika Biočipy využívány převážně v oblasti genomiky a proteomiky, nově v oblasti mikrobiologie,

Podobné dokumenty
Doporučení ČSKB-Markery poškození myokardu Klin. Biochem. Metab., 16 (37), 2008, 1, Universal Definition of Myocardial Infarction

Současný stav rutinní analytiky některých biochemických markerů. J. Vávrová, B. Friedecký, M. Tichý Ústav klinické biochemie a diagnostiky LF UK

Nové trendy ve využití kardiálních markerů v laboratorní diagnostice poškození myokardu

DELFIA Dissociation-Enhanced Lanthanide Fluorescent ImmunoAssay

Princip a využití protilátkových mikročipů RNDr. Zuzana Zákostelská

Vývoj biomarkerů. Jindra Vrzalová, Ondrej Topolčan, Radka Fuchsová FN Plzeň, LF v Plzni UK

Validace stanovení volných monoklonálních lehkých řetězců v České republice

Multiplexové metody pro diagnostiku nádorových onemocnění a optimalizaci léčby. O. Topolčan, M.Karlíková FN Plzeň a LF UK Plzeň

Sandwichová metoda. x druhů mikrokuliček rozlišených různou kombinací barev (spektrální kód)

Využití proteinových biočipů v diagnostice ischemického poškození myokardu

laboratorní technologie

Biochemická laboratoř

Elecsys SCC první zkušenosti z rutinní praxe. Ing. Pavla Eliášová Oddělení klinické biochemie Masarykova nemocnice v Ústí nad Labem

Kardiospecifické markery v průběhu akutního infarktu myokardu zkušenosti s využitím proteinových biočipů

Hmotnostní spektrometrie v klinické laboratoři

Suchá chemie. Miroslava Beňovská (vychází z přednášky doc. Šterna)

Validace sérologických testů výrobcem. Vidia spol. s r.o. Ing. František Konečný IV/2012

Verifikace sérologických testů v imunologických laboratořích ISO Postupy vyšetření

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE

Hmotnostní spektrometrie

ve školní nebo zdravotnické laboratoři?

Ing. Martina Almáši, Ph.D. OKH-LEHABI FN Brno, Babákova myelomová skupina při Ústavu patologické fyziologie, LF MU, Brno

Imunochemické metody. na principu vazby antigenu a protilátky

Hmotnostní detekce v separačních metodách

Metody testování humorální imunity

Výzkumné centrum genomiky a proteomiky. Ústav experimentální medicíny AV ČR, v.v.i.

Proteinové znaky dětské leukémie identifikované pomocí genových expresních profilů

Protilátky proti štítné žláze ATG, ATPO laboratorní diagnostika v ČR

EUC Laboratoře s.r.o. EUC Laboratoře Praha Palackého 720/5, Nové Město, Praha 1

Pražské analytické centrum inovací Projekt CZ / /0002 spolufinancovaný ESF a Státním rozpočtem ČR

Současný stav stanovení vitaminu D v séru

IMALAB s.r.o. U Lomu 638, Zlín

Možná uplatnění proteomiky směrem do klinické praxe

DELFIA. RNDr. Alena Mikušková. FN Brno Pracoviště dětské medicíny, OKB

NAT testování dárců krve v ÚVN Praha

Veronika Janů Šárka Kopelentová Petr Kučera. Oddělení alergologie a klinické imunologie FNKV Praha

laboratorní technologie

K čemu slouží záznam provedených výkonů logbook?

Stanovení cytokinů v nitrooční tekutině pomocí multiplexové xmap analýzy

Zajištění správnosti výsledků analýzy kotininu a kreatininu

Externí kontrola kvality sekvenačních analýz

Stanovení asialotransferinu

Metody testování humorální imunity

Klinická a farmaceutická analýza. Petr Kozlík Katedra analytické chemie

VÝZNAM NĚKTERÝCH FAKTORŮ PREANALYTICKÉ FÁZE V MOLEKULÁRNÍ BIOLOGII

Imunofenotypizace leukemií z kostní dřeně, periferní krve, výpotku a mozkomíšního moku průtokovou cytometrií

Analytické znaky laboratorní metody Interní kontrola kvality Externí kontrola kvality

Precipitační a aglutinační reakce

laboratorní technologie

SYNTETICKÉ OLIGONUKLEOTIDY

Vzdělávání zdravotních laborantek v oblasti molekulární biologie

AUTOMATIZACE V KLINICKÉ

Nové metody v průtokové cytometrii. Vlas T., Holubová M., Lysák D., Panzner P.

Laboratorní automatizace proč a jak?

METODY STUDIA PROTEINŮ

Kortizol, ACTH. Olga Bálková Roche s.r.o., Diagnostics Division

Glukóza, glykovaný hemoglobin, glykované proteiny. Glykované proteiny mechanismus glykace, stanovení ve formě formazanů.

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MELAMINU A KYSELINY KYANUROVÉ METODOU LC-MS

Validační protokol LT CRP HS II (ADVIA 1800)

Protokol o srovnání POCT EUROLyser CRP s akreditovanou metodou stanovení CRP imunoturbidimetricky na analyzátoru Unicel DxC 800

IMUNOENZYMOVÉ METODY EIA

Stav harmonizace stanovení markerů chronické ledvinové choroby. B. Friedecký, J. Kratochvíla ÚKBD FN Hradec Králové SEKK Pardubice

40 NOVINKY. Product News. Stanovení imunosupresivních lékù soupravami Elecsys. Elecsys Tacrolimus Elecsys Cyclosporine. Nový panel metod.

Diagnostika bronchiálního. ho astmatu HPLC/MS analýzou. Kamila Syslová Ústav organické technologie

Diagnostika amyloidózy z pohledu patologa Látalová P., Flodr P., Tichý M.

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE - kvalitativní i kvantitativní detekce v GC a LC - pyrolýzní hmotnostní spektrometrie - analýza polutantů v životním

METODY VYŠETŘOVÁNÍ BUNĚČNÉ IMUNITY. Veřejné zdravotnictví

Tématické okruhy pro státní závěrečné zkoušky

HPLC/MS tělních tekutin nový rozměr v medicinální diagnostice

POSTUP PRO VALIDACI/VERIFIKACI METODY 1

Nová doporučení o interní kontrole kvality koagulačních vyšetření. RNDr. Ingrid V. Hrachovinová, Ph.D. Laboratoř pro poruchy hemostázy, ÚHKT Praha

Vlastní zkušenosti s využitím biochemických markerů v diagnostice kardiotoxicity hematoonkologické léčby

Stanovení hormonů. Miroslava Beňovská

Pracoviště (1) Oddělení mikrobiologie, Přírodovědecká fakulta Masarykovy, Brno, Česká republika (2)Oddělení funkční genomiky a proteomiky, Přírodověde

Diagnostika infekce Chlamydia trachomatis pomocí molekulárně genetické metody real time PCR nejen u pacientek z gynekologických zařízení

Předmět a organizace oboru klinická biochemie

K čemu slouží záznam provedených výkonů logbook?

MagPurix Viral Nucleic Acid Extraction Kit

hs metody stanovení troponinů: proč je potřebujeme? 04/10 M. Engliš

K čemu slouží záznam provedených výkonů logbook?

Mnohobarevná cytometrie v klinické diagnostice

Luminiscenční analýza Použití luminiscenční spektroskopie v analytické chemii

Kvalita rutinních vyšetření kardiálních biomarkerů

Analytická technika HPLC-MS/MS a možnosti jejího využití v hygieně

ÚSTAV CHEMIE A ANALÝZY POTRAVIN

Mikrobiologické diagnostické metody. MUDr. Pavel Čermák, CSc.

Obsah. Sarkosin Charakterizace slepičích protilátek proti sarkosinu. Dagmar Uhlířová

EUC Laboratoře s.r.o. EUC Laboratoře Praha Palackého 720/5, Praha 1

Nastavení metod pro imunofenotypizaci krevních. EXBIO Praha, a.s.

Písemná zpráva zadavatele

Program 14. ročníku Školy hmotnostní spektrometrie

Zavedení nového přístroje v hematologické laboratoři

Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii

Radioimunolýza (RIA)

Filozofie validace. Je validace potřebná? Mezinárodní doporučení pro provádění validací ve forenzně genetických laboratořích

Změny sazebníku výkonů pro mikrobiologické obory

Standardizace laboratorních parametrů u mnohočetného myelomu

Preanalytická a postanalytická fáze Petr Breinek BC_Pre a Postanalyticka faze_2009 1

Polychromatická cytometrie v hemato-onkologii

Nejistota měř. ěření, návaznost a kontrola kvality. Miroslav Janošík

Transkript:

Multiplexní analýza s využitím proteinových čipů Ulrychová M., Vávrová J., Tichý M., Friedecký B. ÚKBD FN a LF UK Hradec Králové Sjezd ČSKB, 22.9.2009, Praha

Proteinové biočipy Nová a rychle se rozvíjející problematika Biočipy využívány převážně v oblasti genomiky a proteomiky, nově v oblasti mikrobiologie, imunologie a biochemie rychlý vývoj v posledních letech 1994 - název proteomika 1847 jeden z prvních laboratorních testů na stanovení proteinu (Bence-Jonesova bílkovina) vyvinuty analytické testy pro stovky proteinů v biologických materiálech elektroforéza a chromatografie (i vícedimenzionální 1982) imunologické a serologické metody

Proteomika nové postupy analýza stovek proteinů, jejich identifikace, kvantifikace, odhalení strukturálních modifikací komplex proteinových směsí v biologickém materiálu odseparování jednotlivých složek- multidimenzionální chromatografie a elektroforéza, vychytání pomocí protilátek štěpení proteinů izolovaných ze směsi analýza peptidů MS MALDI-TOF MS (matrix assisted laser desorption/ionisation time-of-flight flight mass spectrometry) SELDI-TOF MS (surface-enhanced enhanced laser desorption/ionisation time-of-flight flight mass spectrometry) nové molekuly použitelné jako biomarkery, fragmenty a modifikace proteinů aplikace postupů p proteomiky do klinické praxe

Multiplexní analýza proteinovými čipy simultánní stanovení několika analytů založené na imunochemických metodách kvalitativní i kvantitativní malé množství vzorku malé množství reagencií rychlost (statimová vyšetření) automatizace

Výroba Microarray Printing Platform

Princip stanovení imunoanalýza kompetitivní nekompetitivní Detekce Fluorecscence Chemiluminiscence IČ fotometrie

Dostupnost První komerčně vyráběné kity Randox Laboratories www.randox.com Thermo Fisher Scientific, Aushon Biosystems www.aushon.com Meso Scale Discovery www.mesoscale.com

Evidence Evidence (Randox) Evidence Investigator poloautomatický analyzátor zpracování minimálně 9 vzorků v sérii manuální pipetování délka inkubace do 2 hod Evidence automatický analyzátor zpracování minimálně 9 vzorků v sérii délka inkubace do 2 hod

Analýza Měřené analyty Kalibrace dodávaná výrobcem, 9 kalibrátorů, data nahraná na kalibrační CD Free Thyroid Array Total Thyroid Array Fertility Array Kontrola kvality Tumour Monitoring Array tři úrovně koncentrací Tumour PSA Array Cell Adhesion Molecule Array Cytokines & Growth Factors Array Cardiac Array Drugs of Abuse Array I Drugs of Abuse Array II Cardiovascular disease DNA Array Colorectal cancer DNA array cdna Expression Arrays Materiál sérum

Evidence Multistat automatický analyzátor zpracování po jednom vzorku délka analýzy 20 minut

IMPACT (Roche) ve vývoji - Immunological MultiParameter Chip Technology plně ě automatický ti systém, 20 ul sérum Kostní markery: osteokalcin PTH PINP β-crosslaps polystyren s vrstvou streptavidinu, naspotované biotinylované protilátky, pro každý marker 10-1212 spotů druhá monoklonální protilátka značená digoxinem detekce další protilátkou fluorescenčně značenou protilátkou proti digoxinu 6 standardů, 3 kontroly opakovatelnost 1,6-6,8 %, mezilehlá přesnost 2,7-9,2 % ve srovnání s Elecsysem lepší citlivost ( fmol/l ) Claudon, A. et all: New Automated Multiplex Assay for Bone Turnover Markers in Osteoporosis. Clin. Chem. 54,9, 2008.

NALIA Nanodot Array Luminometric Immunoassay

SearchLight Protein Array Technology (Thermo Fisher Scientific) Mikrotitrační destičky (96 a 384 jamek) Obdoba ELISA techniky max. 16 spotů v jamce 50 ul vzorku různé způsoby značení Detekce CCD systémy Fluorescence Chemiluminescence Aushon SearchLight Plus Imaging and Analysis System Infračervené záření Odyssey or Aerius Infrared Imaging System 300 cytokinů and biomarkerů testováno a validováno pro SearchLight Multiplex Platform Printing na zakázku Materiály: různé - S, P, BAL, CSF, tkáňové homogenáty, mikrodialyzáty atd.

Sector Imager (Meso Scale Discovery)

FlowCytomix Technology (Bender MedSystems) multiplexní analýza na principu sendvičové imunoanalýzy a průtokové cytometrie využití klasických průtokových cytometrů rychlá analýza bez nutnosti sběru série vzorků

Bio-barcode assay multiplexní různé sondy ultrasenzitivní detekce NK a proteinů imunochemická reakce s detekcí bar-code DNA pomocí PCR PSA (LOD = amol/l) 10 6 x vyšší citlivost proti ELISA metodě časově náročné

Separační čipové metody skleněné nebo polymerové čipy mikrofluidní technologie - sítě kanálků a jamek tlak nebo elektrokinetické síly, ženou tekutiny skrz kanálky umožňuje dávkování vzorku, míchání, ředění chromatografické nebo elektroforetické ti ké separace barvení, detekce na různých principech Výhody: jednoduchost použití, rychlost, malé obejmy vzorků, automatizace Nevýhody: nutná extrémní čistota chemikálií, prostředí, náchylnost k zanášení

CE a HPLC na čipu CE - Shimadzu systém MultiNA Agilent HPLC-Chip / MS System g p y v čipu separační kolona všechny konektory nanosprej interface

MALDI TOF bílkovin v moči s Bence Jonesovou bílkovinou 4700 Linear Spec #1 MC[BP = 11784.7, 1797] 100 11784 1797. 90 80 70 60 % Intensity 50 40 11688 30 8264 8569 11947 20 6884 7945 8444 10 6160 7268 10691 11038 0 1996.0 5610.4 9224.8 12839.2 16453.6 20068.0 Mass (m/z) Lineární hmotnostní spektrum měřené v pozitivním módu, rozsah m/z je od 2 000 do 20 000

PCR mikrofluidní čipy vyhřívané bloky pro jednotlivé fáze PCR Chunsun Zhang et al. Miniaturized PCR chips for nucleic acid amplification and analysis: latest advances and future trends. Nucleic Acids Research, 2007, Vol. 35, No. 13, 4223-42374237

Lab-on-a-Chip

Problémy imunochemických čipů Analytická optimalizace metod detekce, délka inkubace, promývání, jednotné ředění pro všechny analyty, Standardizace metod - srovnání s jinými imunochemickými technikami QC selhání u jednoho parametru, odmítnutí výsledků pro celý panel???

Standardizace metod Y = 2,0656 X + 0,0946 EL LECSYS_CKMB 160 140 120 100 80 60 40 EVIDENCE_CKMB (Randox) Lowest value = 0,42 ug/l Highest value = 66,73 ug/l Arithmetic mean = 9,67 ug/l Median = 2,60 ug/l Standard deviation = 14,28 ug/l 100 20 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 EVIDENCE_CKMB ELECSYS_ CKMB (Roche) 20 Lowest value = 1,19 ug/l 0 Highest value = 156,90 ug/l -20 Arithmetic mean = 20,63 ug/l Median = 5,24 ug/l -40 Standard deviation = 33,44 ug/l ELECSYS_CKM MB - EVIDENCE_C CKMB 80 60 40 +1.96 SD 49,7 Mean 11,0-1.96 SD -27,8 0 20 40 60 80 100 120 AVERAGE of ELECSYS_CKMB and EVIDENCE_CKMB

QC Ulrychova, M et al. Využití technologie proteinových biočipů pro stanovení kardiálních markerů u pacientů s akutním infarktem myokardu, KBM, 4, 2008, 248-251 251. Evidence Investigator Concentration ti (μg/l) Nepřesnost (CV) z 10 měření Vzorky: směsné kontroly panel Cardiac Array CV (%) Interassay CKMB MYO GPBB FABP CA3 CTNI 3.9 86.3 8.4 3.2 4.0 1.6 13.2 124.6 27.9 18.9 29.6 7.0 30.9 120.7 68.1 43.8 39.6 12.0 7.5 13.5 6.6 5.0 7.0 8.7 69 6.9 11.6 42 4.2 57 5.7 93 9.3 60 6.0 8.6 15.6 7.9 8.7 9.8 9.0 Di Serio et al. Proteomic approach to the diagnosis of acute coronary symdrome: Preliminary results. Clin. Chim. Acta, 357, 2005, 226-235. 235. Interassay CV (%) 91 9.1 18.7 23.7 84 8.4 18.2 78 7.8 7.3 16.8 30.8 5.9 19.0 6.9 9.7 16.4 34.0 6.3 17.1 6.3

QC Ellington, AA et al. Measurement and Quality Control Issues in Multiplex Protein Assays: A Case Study, Clin Chem.,55, 2009, 1092-99. 99. procentuální zastoupení vzorků s nepřesností (CV) větší než: Panel A 10% 20% 30% SearchLight Protein Array Technology Nepřesnost měření v dubletech Vzorky: směsné kontroly a plazma 2 panely cytokiny IL-6 33,1 12,8 6,0 IL-8 50,7 26,1 14,9 TNF-RI 40,6 17,3 7,9 TRAIL 78,6 60,9 46,3 P-selektin 23,1 8,1 3,8 RAGE 38,4 18,3 11,1 Panel B MCP-1 38,8 21,1 13,1 TNF-RII 29,1 14,6 9,8 MMP-1 45,8 28,0 20,9 MMP-2 31,0 14,7 10,2 TIMP-1 18,7 5,3 2,5 TIMP-2 20,7 9,4 6,5 RANTES 29,9 14,8 8,4 E-selektin 19,1 6,9 3,8 ICAM 28,0 13,3 8,0 Průměr 35,2 18,2 11,6

Aplikace v klinické biochemii Multianalytový přístup k diagnostice kardiologických onemocnění AIM vs. stabilní, nestabilní AP hypertrofická kardiomyopatie kardiotoxicita cytostatik radifrekvenční ablace hepatopatie CKMB MYO GPBB FABP CA III ctni ug/l ug/l ug/l ug/l ug/l ug/l při příjmu 17,66 363,77 46,71 76,56 95,69 3,23 po 24 hod 31,67 97,77 18,59 8,43 71,45 18,14 po 2-3 dnech 3,05 58,89 16,37 3,88 40,65 4,47 Referenční meze 3,9 59,0 7,3 4,5 55,0 0,4

Závěr přehled současných možností využití technologie proteinových biočipů metody používané zatím v oblasti výzkumu rychlý rozvoj i přes současné problémy velký potenciál do budoucna použitelnost v klinických laboratořích rozšíření spektra analytů zjednodušení laboratorních postupů zlepšení diagnostiky

Děkuji za pozornost