Hodnocení linearity kvantitativních metod Zdenek Kubíček IKEM Praha
Obsah přednášky proč studovat a ověřovat linearitu kvantitativních testů? definice linearity, typy nelinearity preciznost a linearita vzorky k ověření linearity a analytického měřícího rozsahu sekvenční a proporcionální ředění
Obsah přednášky-pokračování Metody hodnocení linearity Vizuální posouzení linearity Statistický test lack of fit EP6-A CLSI Kroll, Praestgaard, Michaliszyn Kroll korig. Hsieh Příklady hs Troponin-I (Abbott), Galectin3 (Abbott)
Proč studovat a ověřovat linearitu dat/ metody linearita je zásadní předpoklad one point kalibrace ISO 15189, 2013 : 5.5.1.2 Verifikace postupů laboratorních vyšetření Nezávislou verifikací musí laboratoř potvrdit, prostřednictvím získání objektivního důkazu (ve formě výkonnostních charakteristik), že požadavky na výkonnost u daného postupu laboratorního vyšetření byly splněny. Požadavky na výkonnost, které se potvrzují procesem verifikace, musí být takové, které odpovídají zamýšlenému použití výsledků laboratorního vyšetření.
Linearita kvalitativní analytická metoda je lineární, pokud existuje matematicky ověřená přímá úměrnost mezi pozorovanými hodnotami a pravými (true) hodnotami nebo aktivitami analytu Hodnocení linearity nevyžaduje nezbytně znalost absolutní hodnot pravých hodnot, mohou být nahrazeny relativními koncentracemi (1,2, 5..)
Kalibrace vs verifikace linearity Linearita (testování linearity) se vztahuje ke konečnému analytickému výsledku, nikoliv výstupnímu signálu přístroje.
Definice, typy nelinearity
Neprecisnost metody a linearita σ směrodatná odchylka regrese K posouzení preciznosti: σ c
Požadavky na vzorky počet měřených koncentrací ověření linearity metodou s polynomy (Kroll, EP6-A) min. 5 vzorků zjištění měřícího rozsahu 7, 9 nebo 11 vzorků matrix co nejvíce podobná klinickému použití pool biologického materiálu (sérum, moč, mok, plná krev) biologický materiál ředěný doporučený diluentem biologický materiál suplementovaný analytem (méně než 10 %) komerční referenční materiály biol. materiál ředěný fyziologickým roztokem koncentrované nebo předředěné komerční referenční materiály vodné roztoky analytu roztoky analytu v jiných rozpouštědlech
Příprava vzorků:ředění Sekvenční ředění doporučeno CLSI EP7 (interference) je přesnější! Proporcionální ředění doporučeno CLSI EP6-A. Ze vzorků pacientů si připravíme nízký a vysoký pool (L, H). Vhodná koncentrace H je těsně pod koncem kalibrační křivky. Z důkladně promíchaných L a H připravíme smícháním stejných objemů (např. 0,5 ml) precizně fungující pipetou vzorky M, ML,MH. M=(H+L)/2; LM= (M+L)/2; HM=(H+M)/2. Důkladně promícháme několikanásobným převrácení na Parafilmu. V testu linearity měříme každou hodnotu 2x. Vaks JE. Preparation of samples with equally spaced concentrations through mixing. Clin. Chem.1996;42(7):1074-8.
L M H L=1 LM=2 M=3 MH=4 H=5
Metody hodnocení linearity Metoda Princip Literatura Vizuální posouzení linearity Lack of Fit (LoF ) Kroll et al.(2000) Korigovaný Kroll (2008) EP6-CLSI (2003) Generalized pivotal quantities GPQ, Hsieh et al. (2009) F-test porovnávající rozptyl pro pooled rozptyl mezi opakovanými měřeními a rozptyl průměrů od regresní linie. Kriterium ADL - průměrná odchylka od linearity ze všech měřících bodů mezi nejlépe odpovídajícím polynomem 2. nebo 3. řádu od přímky se srovnává s kritickou hodnotou, za předpokladu, že je dostatečná preciznosti opakovaných měření. Hsieh et. Al navrhují hodnotit kriterium ADL tak, aby hypotéza pro splnění linearity byla formulována jako alternativní. Odchylka od linearity ze všech měřících bodů mezi nejlépe odpovídajícím polynomem 2. nebo 3. řádu od přímky se srovnává s arbitrárně stanovenou hodnotou δ 0. Kriterium SSDL (součet čtverců odchylek od linearity) jako metrika pro posouzení. 1 2 3 4 5
Metody hodnocení linearity - pokračování Metoda Vizuální posouzení linearity Lack of Fit (LoF ) Kroll et al.(2000) Korigovaný Kroll (2008) EP6-CLSI (2003) Generalized pivotal quantities GPQ, Hsieh et al. (2009) Hodnocení Nezbytné jako první krok při testování i při exaktním statistickém postupu. Hlavní nehoda LoF: příliš přesné metody na analyzátorech způsobují statistickou významnost (zamítnutí H 0 :) tam, kde jsou odchylky od linearity laboratorrně nebo klinicky nevýznamné! Prakticky se v laboratorní medicíně nepoužívá. Oproti protokolu CLSI EP6-A navrhuje kriterium nelinearity ADL i jeho exaktní hodnocení. K výpočtu testovacího kriteria i kritických hodnot lze použít Excel nebo R-plus. Jiná formulace nulové a alternativní hypotézy pro kriterium ADL. Je konzervativnější než postup podle Krolla (2000). K výpočtu testovacího kriteria i kritických hodnot lze použít Excel nebo R-plus. Odchylka od linearity ze všech měřících bodů mezi nejlépe odpovídajícím polynomem 2. nebo 3. řádu od přímky se srovnává s arbitrárně stanovenou hodnotou δ 0. Jednoduché, prakticky snadno proveditelné. Chybí stanovené δ 0 na klinicko-laboratorní bázi. K výpočtům postačí Excel nebo R-plus. Kriterium SSDL (součet čtverců odchylek od linearity) jako metrika pro posouzení. Výpočetně obtížné.
Princip CLSI EP6-A CLSI EP6-A Hodnotí se velikost odchylky mezi predikcí průměru opakovaných měření i-tého bodů nejlépe vyhovujícím polynomem (2. nebo 3. řádu) a přímky. µ Pi µ Li y.quad 1 2 3 4 5 Linear Fit Quadratic-Best Fit δ 0 δ 0 Povolená odchylka Limit: δ 0 1 2 3 4 5 x
CLSI EP6-A Estimate Std. Error t value Pr(> t ) Sigma b0-24.795 2.51-9.879 0 b1 26.835 0.757 35.461 0 3.4 b0-13.17 2.175-6.054 0 b1 16.871 1.658 10.177 0 b2 1.661 0.271 6.127 0 1.4 b0-5.89 4.259-1.383 0.216 b1 6.644 5.567 1.194 0.278 b2 5.561 2.066 2.691 0.036 b3-0.433 0.228-1.9 0.106 1.2 Jak vybereme best fit polynom?
CLSI EP6-A x level Measured Mean Predict 1. Order Predict Polyn. Difference %Diff 1 6 2.04 5.361 3.841 188.304 2 25.7 28.875 27.214-2.701-9.353 3 53.1 55.71 52.389-3.321-5.962 4 81.45 82.545 80.884-0.621-0.752 5 112.3 109.38 112.701 2.801 2.561 Diference mezi µ Pi µ Li
EP6-A CLSI-přednosti velikost odchylky od linearity je vyjádřena u každé koncentrace kontrola neakceptovatelné precisnosti testovatelný statistický model snadno proveditelný (programovatelný) ve všech programových prostředích (Excel,R-plus)
hs-troponin-i, Kroll et al. (2000) Estimate Std. Error t value Pr(> t ) sigma b0-11098.35 660.915-16.792 0 b1 11547.24 199.273 57.947 0 891.2 b0-10937.75 1443.177-7.579 0 b1 11409.583 1099.797 10.374 0 b2 22.943 179.836 0.128 0.902 951.6 b0-16458.23 2551.855-6.449 0.001 b1 19164.543 3335.661 5.745 0.001 b2-2934.457 1238.082-2.37 0.056 b3 328.6 136.7 2.404 0.053 733.6 x Level Measured Mean Predict 1. Ord. Predict Polyn. Difference %Diff 1 2.25 448.89 448.89-348.434-77.621 2 13154.65 11996.13 11996.13 765.697 6.383 3 22908.25 23543.37 23543.37-45.886-0.195 4 34671.85 35090.61 35090.61-811.583-2.313 5 46979.85 46637.85 46637.85 440.206 0.944
Galectin3, Kroll et al. (2000) Estimate Std. Error t value Pr(> t ) Sigma b0-24.795 2.51-9.879 0 b1 26.835 0.757 35.461 0 3.4 b0-13.17 2.175-6.054 0 b1 16.871 1.658 10.177 0 b2 1.661 0.271 6.127 0 1.4 b0-5.89 4.259-1.383 0.216 b1 6.644 5.567 1.194 0.278 b2 5.561 2.066 2.691 0.036 b3-0.433 0.228-1.9 0.106 1.2 x level Measured Mean Predict 1. Order Predict Polyn. Differenc e %Diff 1 6 2.04 5.361 3.841 188.304 2 25.7 28.875 27.214-2.701-9.353 3 53.1 55.71 52.389-3.321-5.962 4 81.45 82.545 80.884-0.621-0.752 5 112.3 109.38 112.701 2.801 2.561
Galektin3 -detail -
Souhrn vzorky pro měření připravujte s maximální pečlivostí sekvenční ředění je preciznější a pravdivější, než proporcionální ředění doporučované CLSI EP6-A pro vyhodnocení použijte protokol CLSI EP6-A, pokud máte k dispozici hodnotu δ 0 V případě, že chybí spolehlivý údaj δ 0, testujte velikost θ 0 (ADL) statisticky (Kroll, Hsieh).
Co prostudovat? 1. https://onlinecourses.science.psu.edu/stat501/node/41. Dostupné 2013/03/20. 2. Kroll MH, Praestgaard J, Michaliszyn E, Styer PE. Evaluation of the Extent of Nonlinearity in Reportable Range Studies. Arch Pathol Lab med. 2000; 124:1331-1338. 3. Hsieh E, Liu JP. On statistical evaluation of linearity in assay validation. J. Biopharm. Stat. 2008; 18:677-690. 4. CLSI. Evaluation of the Linearity of Quantitative Measurement Procedures: A Statistical Approach; Approved Guideline. CLSI document EP6-A (ISBN 1-56238-498-8). CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2003. 5. Hsieh E, Hsiao ChF,Liu JP.Statistical methods for evaluating the linearity in assay validation. J. Chemometrics 2009; 23:56-63. 6. Vaks JE. Preparation of samples with equally spaced concentrations through mixing. Clin. Chem.1996;42(7):1074-8.
Komerční set :Audit MicroControl Audit MicroCV Immunoassay linearity Set pro kontrolu linearity kortizolu, estradiolu, FSH, feritinu, folátu, ft4, hcg, LH, progesteronu, prolaktinu, TSH, T3, T4, testosteronu a VitB12 na Siemens Centaur. 5 koncentrací, 5x5 ml vyhodnocení programem AUDITOR QC online na www. auditmicro.com
Lack of fit, LoF termín znamená míru neshody empirického modelu s teoretickým, nedostatek souladu test je standardní součástí statistických balíků základ prvního protokolu CLSI EP6-P, 5 vzorků se 4 opakovanými měřeními F-test porovnávající rozptyl pro pooled rozptyl mezi opakovanými měřeními a rozptyl průměrů jednotlivých bodů od regresní linie
Lack of fit, LoF -pokračování H 0 :neexistuje lack of fit vs H A : existuje lack of fit hlavní nevýhoda LoF: příliš přesné metody na analyzátorech způsobují statistickou významnost (zamítnutí H 0 :) tam, kde jsou odchylky od linearity laboratorně nebo klinicky nevýznamné!
Kroll et al. (2000) θ = ADL = L i=1 2 (μ Pi - μ Li ) /L μ H 0 : θ θ 0 vs. H a : θ > θ 0 Kroll, 2000 H 0 : θ > θ 0 vs. H a : θ < θ 0 Hsieh, Liu, Kroll korig (2008) ADL průměrná odchylka od linearity, L počet koncentrací