Polychromatická cytometrie - setup experimentu

Polychromatická cytometrie - setup experimentu

Polychromatická cytometrie - setup experimentu Cíl: Najít nejlepší kompromis Hladina exprese Intenzita fluorochromu Četnost subsetu buněk Kvalitativní x kvantitativní Kompenzační spread Dostupnost reagencií

Polychromatická cytometrie - setup experimentu Kostra definující znaky, méně časté fluo, i custom konjugace vhodná vyplatí se investovat do optimalizace Další znaky alterace podle experimentu, obvyklejší fluo ROZMYSLET SI GATING!!

7 -KOMBI Citlivost fluo: Spillover fluo: Pacific Blue FITC PE PerCP PE- D747 APC A700 CD14 CD3 16/56 CD45 CD4 CD19 CD8

7 KOMBI gating 1 FS Lin: FS 30K 20K 10K 0 0 10K 20K 30K SS Lin: SS FL 6 Log: CD14-Pacific Blue 10000 1000 100 10 1 GRAN 20.8 14+ MONO 3.82 LYMFOcyty 39 1 10 100 1000 10000 <FL 4 Log>: CD45-Per-CP

7 KOMBI gating 2 FS Lin: FS 30K 20K 10K FL 6 Log: CD14-Pacific Blue 10000 1000 100 10 0 0 10K 20K 30K SS Lin: SS 1 1 10 100 1000 10000 <FL 4 Log>: CD45-Per-CP

7 KOMBI gating 3 Lymfo: Lymfo: CD3+: 10000 10000 10000 <FL 1 Log>: CD3-FITC 1000 100 10 3+ 55.5 19+ 2.45 <FL 1 Log>: CD3-FITC 1000 100 10 NK 17.3 <FL 5 Log>: CD4-PE-Dy747 1000 100 0 4+ 73.5 8+ 21.8 1 1 10 100 1000 10000 <FL 8 Log>: CD19-APC 1 1 10 100 1000 10000 <FL 2 Log>: CD16\CD56-PE 0 10 100 1000 10000 <FL 9 Log>: CD8-Alexa 700

FMO příklad Test 10000 FMO (minus Alexa700) 10000 10000 Gate podle FMO <FL 1 Log>: CD3-FITC 1000 100 0 18.3 <FL 1 Log>: CD3-FITC 1000 100 0 0.22 <FL 1 Log>: CD3-FITC 1000 100 0 18.3 9.25 0 10 100 1000 10000 <FL 9 Log>: CD8-Alexa 700 0 10 100 1000 10000 <FL 9 Log>: NIC-Alexa 700 0 10 100 1000 10000 <FL 9 Log>: CD8-Alexa 700

GRAN Multigraph 14+ MONO Overlay LYMFOcyty LYMFOcyty/3+ LYMFOcyty/3+/4+ LYMFOcyty/3+/4+8+ LYMFOcyty/3+/8+ LYMFOcyty/3+/DN LYMFOcyty/3+8+ LYMFOcyty/3-8+ LYMFOcyty/19+ LYMFOcyty/Boolean Gate LYMFOcyty/NK FS Lin: FS <FL 1 Log>: CD3-FITC <FL 8 Log>: CD19-APC SS Lin: SS <FL 2 Log>: CD16\CD56-PE <FL 2 Log>: CD16\CD56-PE <FL 5 Log>: CD4-PE-Dy747 <FL 4 Log>: CD45-Per-CP FL 6 Log: CD14-Pacific Blue <FL 9 Log>: CD8-Alexa 700 <FL 8 Log>: CD19-APC <FL 5 Log>: CD4-PE-Dy747

FMO kontroly Pacific Blue FITC PE PerCP PE- D747 APC A700 CD14 CD3 16/56 CD45 CD4 CD19 CD8 FMO 1 3 16/56 45 4 19 8 FMO 2 FMO 3 FMO 4 FMO 5 FMO 6 FMO 7 14 14 14 14 14 14 3 3 3 3 3 16/56 16/56 16/56 16/56 16/56 16/56 45 45 45 45 45 45 4 4 4 4 4 4 19 19 19 19 19 19 8 8 8 8 8

FMO kontroly 2 Pacific Blue FITC PE PerCP PE- D747 APC A700 B2 CD14 CD3 16/56 CD45 CD4 CD19 CD8 FMO 1 3 16/56 45 4 19 8 FMO 3 14 3 16/56 45 4 19 8 FMO 5 14 3 16/56 45 4 19 8 FMO 6 14 3 16/56 45 4 19 8 FMO 7 14 3 16/56 45 4 19

Zkreslení

Zkreslení vlivem kompenzací Nekomp, gate CD3+ lymfo CD8 Správně komp, gate lymfo Nature Medicine: Objev nové populace lymfocytů!!!!!!!!!!!! Nekomp, gate lymfo, single stain CD8

Zkreslení vlivem kompenzací

Zkreslení vlivem kompenzací

Zkreslení vlivem kompenzací FITC Přesvit (spilover, spectral overlap) z PE do FITC je malý = malá kompenzace MALÉ ZKRESLENÍ z PE do PE-TxRed je velký = velká komp. VELKÉ ZKRESLENÍ PRO GATING - FMO KONTROLY PE PE-TxRed PE PE-TxRed PE = 65%

Zkreslení vlivem kompenzací Je třeba promyslet odkud se dívat Obvyklé problémy: PE vs PE-TxRed, PE-Cy5 vs APC Nelze použít vždy histogram Nelze vždy použít čtverce či kvadranty Je třeba promyslet jak postavit gate (kontroly FMO) V silně komp. kanálech je menší rozlišení a horší kvantifikace

Design experimentu Na interpretaci dat myslet PŘEDEM Bez správných kontrol někdy interpretovat nelze Jak naložit se zkreslením komp. dat? Sestavit design experimentu tak, aby se předešlo potížím při analýze

Jak naložit se zkreslením? PE PE-TxRed donor akceptor Na donor pozitivních buňkách se akceptor pozitivní znak nevyskytuje/nehodnotí CD8 PE-TxRed CD4 PE u CD4 PE pos. buněk CD8 PE-TxRed není

10000 <FL 9 Log>: CD8-Alexa 700 1000 100 10 0 0 10 100 1000 10000 <FL 8 Log>: CD19-APC

Jak naložit se zkreslením? PE PE-TxRed donor akceptor PE-TxRed CD3 PE znak s nízkou int. do PE Nižší intenzita donoru = nižší rozptyl akceptoru

10000 <FL 9 Log>: CD8-Alexa 700 1000 100 10 0 0 10 100 1000 10000 <FL 8 Log>: CD19-APC

Jak naložit se zkreslením? PE PE-TxRed donor akceptor CD3 PE-TxRed CD4 PE Jen kvalitativní znak do PE-TxRed

Vizualizace digitálních dat

Vizualizace digitálních dat Dva ploty z téhot hož vzorku, CD3+ gate na lymfocyty Najdi rozdíly

Kompenzace PMT a % kompenzace Median fluo intensity PMT 550 PMT 600 PMT 650 PMT 700 CD19 APC+ 4425 7536 15532 25479 CD19 neg 146 372 888 944 Ratio 30 20 17 27 Vzájemný poměr r PMT (zde APC vs APC-Cy7) Cy7) - změní % kompenzace - NEZLEPŠÍ rozlišen ení APC channel Compensation PMT 550 PMT 600 PMT 650 PMT 700 APCCy7 - APC 24 12 6,7 3,4 APC - APCCy7 8,1 15,6 28 52 APC spillover to APC-Cy7 APC-Cy7 spillover to APC

Herzenberg, L. A., J. Tung, et al. (2006). "Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed." Nat Immunol 7(7): 681-5. Vizualizace digitálních dat Další názvy: Log-lineární transformace Logicle display Biexponential (DiVa) VisiComp (Summit 4,3)

Post-akviziční (off-line) kompenzace Výhody: méně stresu, bez rizika neřešiteln itelné over-komp komp, umožní LOGICLE display (i na analogových systémech) Neýhody: Data nejsou kompenzovaná při i měřm ěření, nelze dobře e vizuáln lně kontrolovat Podmínky: Kompenzační kontroly Single stained tubes Vhodný analyzační software: DiVa,, Summit, FlowJo

Digital: FACS Aria, BD LSR2 FACS Canto Cyan ADP Změna kompenzace po akvizici Analog vs digital Analog vs digital Analog: FACS Sort FACS Calibur FACS Vantage Kompenzace je přišitá

Zpracování signálu je jiné Kompenzovaná data v analogových systémech nemají NULU ani záporné hodnoty digitálních systémech mohou jít i do záporných hodnot