_(PSMM _ TIDE): 2010-04-06 Ivo Sedláček a Pavel Švec Česká sbírka mikroorganismů Přírodovědecká fakulta MU Tvrdého 14, 602 00 Brno Projekt FI-IM5/205
problematika taxonomie Polyfázová taxonomie - taxonomie založená na kombinaci údajů získaných rozmanitými technikami - obsahuje dostupné genotypové, fenotypové a fylogenetické informace - použití jen jedné metody je nedostatečné a je vyžadován mnohostranný přístup tzv. polyphasic approach Fylogenetická klasifikace fenotypové vlastnosti doplněné o výsledky metod molekulární biologie a o chemotaxonomické údaje popis mnoha nových taxonů X co identifikovat? identifikace taxonu X mobilní genetické elementy (bakteriofágy, ostrovy patogenity, chromozomové kazety, plazmidy), exoproteiny - genetický polymorfismus
problematika taxonomie DNA Celková DNA: % obsah G+C restriční profil (RFLP, PFGE) velikost genomu DNA reasociace RNA RNA sekvencování analýza nízkomolekulárních RNA Úseky DNA: PCR metody (rep-pcr, RAPD, AFLP) ribotypizace DNA sondy DNA sekvencování Polyfázová taxonomie, plazmidová DNA fylogenetická příbuznost Proteiny Chemotaxonomické znaky mastné kyseliny (FAME) mykolové kyseliny polární lipidy chinony elektroforetický profil celobuněčných peoteinů enzymový profil (MLEE) www.bacterio.cict.fr Fenotyp morfologie biochemie a fyziologie (API, Biolog) sérologie
Lactobacillus acidophilus Lactobacillus = 130 taxonů probiotická mikroflóra;?patogenita? ústa, trávicí trakt, vagina sensu stricto sensu lato (obligátně homofermentativní) velice rozsáhlá skupina bakterií: sensu stricto,, L. amylovorus, L. gallinarum,, L. johnsonii (Fujisava et al., 1992); (Gasser et al., 1970) fylogeneticky příbuzné x fenotypově podobné sensu lato - vaginální sliznice?!
Lactobacillus acidophilus externí zadavatel studie; v CCM pouze izolace a typizace cílená izolace ze stěrů z cervixu 34 zdravých žen = 100< izolátů G+ tyček (MRS, CO2/anaerobně, 36,5 C) presumptivní identifikace založena na: rep-pcr (GTG5) spolehlivá identifikace LAB
Lactobacillus acidophilus : rep-pcr Shluk I in house databáze > 1600 LAB Shluk II Neprůkazné pro Shluk IIIa
Lactobacillus acidophilus externí zadavatel studie; v CCM pouze izolace a typizace cílená izolace ze stěrů z cervixu 34 zdravých žen = 100< izolátů G+ tyček (MRS, CO2/anaerobně, 36,5 C) presumptivní identifikace založena na: rep-pcr (GTG5) 24 izolátů sensu lato (20 žen) biotypizace (API 50CH, apiweb; konvenčně) ribotypizace (RiboPrinter) MALDI-TOF MS
Lactobacillus acidophilus : biotypizace API Kmen 01A 03A 04A 06A 10A 10E/1 11A 11B 14C/2 15B 17A 18C 19A 19C 21A 22A 28A 29B 30B 30C 32A 33A 34A 35A API 50CH ID L. brevis Fenotypizace RiboPrinter MALDI-TOF MS výborná, dobrá ID: 10 nejistá, nepřijatelná ID: 14? růst při 45 C? variabilní bioprofil Finální ID
Lactobacillus acidophilus : rozšířená biotypizace Kmen 01A 03A 04A 06A 10A 10E/1 11A 11B 14C/2 15B 17A 18C 19A 19C 21A 22A 28A 29B 30B 30C 32A 33A 34A 35A API 50CH ID L. brevis Fenotypizace 4% NaCl RiboPrinter MALDI-TOF MS Finální ID
Lactobacillus acidophilus : dendrogram biotypizace 01A 06A 28A 04A 18C 32A 11B 21A 29B 35A 19A 10A 30B 17A 33A 03A 22A 14C/2 15B 11A 19C 34A 30C 10E/1 0% 10% 20% Linkage Distance 30%
Lactobacillus acidophilus : RiboPrinter profil 1. phes sekvencování (a) profil 2.a profil 2.b
Lactobacillus acidophilus : RiboPrinter Kmen 01A 03A 04A 06A 10A 10E/1 11A 11B 14C/2 15B 17A 18C 19A 19C 21A 22A 28A 29B 30B 30C 32A 33A 34A 35A API 50CH ID L. brevis Fenotypizace RiboPrinter MALDI-TOF MS Finální ID
Lactobacillus acidophilus externí zadavatel studie; v CCM pouze izolace a typizace cílená izolace ze stěrů z cervixu 34 zdravých žen = 100< izolátů G+ tyček (MRS, CO2/anaerobně, 36,5 C) presumptivní identifikace založena na: rep-pcr (GTG5) 24 izolátů sensu lato (20 žen) biotypizace (API 50CH, apiweb; konvenčně) ribotypizace (RiboPrinter) MALDI-TOF MS 7 izolátů sensu lato sekvencování phes genu
Lactobacillus acidophilus : ribotypizace phes sekvencování (a)
Lactobacillus acidophilus : MALDI-TOF MS
Lactobacillus mucosae: MALDI-TOF MS x104 4706 isolate 10E/1 ] u s.[a te In 1.0 0.8 0.6 4491 0.4 0.2 2352 2742 5135 3145 3421 0.0 x104 6312 5304 3996 6842 4706 7989 9403 7450 L. mucosae CCDM 690T ] u s.[a te In 1.5 1.0 0.5 2350 4492 3144 2739 5136 5304 3687 3994 6313 6844 7453 9406 7990 0.0 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 Fig. 2: Comparison between MALDI-TOF mass spectra of isolate 10E/1 identified as L. mucosae and the corresponding reference strain L. mucosae CCDM 690T. m/z
Lactobacillus acidophilus : MALDI-TOF MS Kmen 01A 03A 04A 06A 10A 10E/1 11A 11B 14C/2 15B 17A 18C 19A 19C 21A 22A 28A 29B 30B 30C 32A 33A 34A 35A API 50CH ID L. brevis Fenotypizace RiboPrinter (a) (a) (a) MALDI-TOF MS (a) L. mucosae (a) Finální ID (a) L. frumenti (a) (a) (a) profil podobný L. ultunensis
Lactobacillus acidophilus : finální identifikace Kmen 01A 03A 04A 06A 10A 10E/1 11A 11B 14C/2 15B 17A 18C 19A 19C 21A 22A 28A 29B 30B 30C 32A 33A 34A 35A API 50CH ID L. brevis Fenotypizace RiboPrinter (a) (a) (a) MALDI-TOF MS (a) L. mucosae (a) (a) (b) L. frumenti (a) (a) profil podobný L. ultunensis (a) Finální ID = fenotypizace + shluková analýza ribotypizace + MALDI-TOF MS Finální ID (b) L. mucosae (b) (b) (b) (b) L. vaginalis (b) sekvencování phes (b)
Lactobacillus acidophilus 24 studovaných izolátů z cervixu: (63%) (25%), L. mucosae, L. vaginalis sensu stricto MALDI-TOF MS ribotypizace biotypizace?databáze?
Děkuji za pozornost