Standardizace v průtokové cytometrii Hana Glier, Martin Špryngar Konference Analytická cytometrie VII Mikulov, 2013
Osnova 1. Standardizace měření - co a proč standardizovat 2. Platforma BD CS&T modul 3. Platforma B.Coulter - FlowCheck+FlowSet 4. Standizace měření mezi cytometry / mezi laboratořemi EuroFlow přístup
1. Standardizace měření - co a proč standardizovat Zpracování vzorku Vzorek Měření Analýza dat Interpretace dat Závěr
Standardizace měření Cíl standartizace: mít porovnatelná data v dlouhodobém horizontu naměřená na jednom cytometru naměřená na různých cytometrech naměřená v různých laboratořích Reprodukovatelnost dat
Standardizace měření Výstupem měření není absolutní fyzikální veličina Získaná hodnota fluorescence je úměrná nastavení fotodetektorů 1. Definice Cílových hodnot MFI standard 2. Udržení cílových hodnot MFI změnou PMTV
Definice Cílových hodnot MFI Poznej svůj cytometr! (lasery, filtry, ) Optimalizace pro konkrétní aplikace Standard kuličky (CS&T, FlowSet, 8-peak Rainbow, ) Definice cílových hodnot MFI vlastní, standardní (EuroFlow) Konfigurace cytometru, baseline (charakterizace cytometru) Udržuj cytometr v optimální kondici
Definice Cílových hodnot MFI Standardní - externí Vlastní 35895 32941
Udržení cílových hodnot MFI Zajištění reprodukovatelnosti měřených dat změnou PMTV Automaticky - Platformy výrobců (CS&T, FlowCheck+FlowSet) Manuálně monitoring (EuroFlow) Data změřená dnes stejně jako za týden, měsíc, rok = porovnatelná data v dlouhodobém horizontu
Udržení cílových hodnot MFI 403V 403V 396 V Den 1 564 V 564 V 554V Den x Den x
2. BD CS&T modul v Diva6 CS&T beads
CS&T modul v Diva 6 + Application Settings 1. Baseline = charakterizace cytometru 2. Performance Check = Denní kontrola kvality PMTV nutná k zachování Cílových MFI 3. Application settings = Standardizace konkrétní aplikace PMTV (Instrument settings), při kterých jsou nastaveny požadované Cílové MFI, modifikace pro danou aplikaci Při každém změření CS&T Performance Check a použití Application settings je PMTV automaticky změněno tak, aby byly zachovány cílové hodnoty MFI
CS&T modul: Baseline = charakterizace cytometru Laser delay vzdálenost mezi lasery Area scaling factors 1/výška paprsku laseru Qr = účinnost detekce signálu, kolik fluorochromu je potřeba k vygenerování 1 fotoelektronu Br = optické pozadí množství světla bez fluorochromu rcv - pro všechny CS&T kuličky a všechny detektory Linearita signálu pro všechny detektory+elektroniku Elektronický šum pro všechny detektory+elektroniku PMTV pro optimální rozlišení signálu od šumu (10 x SD EN / 2.5 x SD EN )
CS&T modul: Baseline
CS&T modul: Baseline = min PMTV pro optimální rozlišení signálu od šumu 10 x SD EN / 2.5 x SD EN Baseline definuje okno pro optimalizaci PMTV pro konkrétní aplikaci (setup) šum
CS&T modul: Performance Check = Denní kontrola kvality Laser delay vzdálenost mezi lasery Area scaling factors 1/výška paprsku laseru Qr = účinnost detekce signálu, pro každý detektor Br = optické pozadí, pro každý detektor rcv - pro všechny CS&T kuličky a všechny detektory PMTV nutná k zachování cílových MFI Výraznější změny znamenají problém!
CS&T modul + Application Settings = Setup experimentu a instrument settings pro konkrétní klinickou aplikaci PMTV (Instrument settings), při kterých jsou nastaveny požadované Cílové MFI, uložit jako Application settings Při každém změření CS&T Performance Check je PMTV automaticky změněno = drží cílové hodnoty MFI Použití templátu s aplikačními settings korigovanými dle CS&T Zajištění standardizace měření v čase
2. B.Coulter FlowCheck + FlowSet není analogické k CS&T modulu Baseline = charakterizace cytometru pouze servis Denní kontrola kvality = Flow-Check Pro Fluorospheres (BC) = monitoring cytometru Kontrola optického alignmentu a fluidiky cytometru Zaznamenává HPCV (CV), x-mean (MFI) Levey-Jennings graf v SW Navios: Mean ± 2SD Standardizace = Flow-Set Pro Fluorospheres (BC)
B.Coulter: Denní kontrola kvality Flow-Check Pro Mean ±2SD
B.Coulter Standardizace Flow-Set Pro Fluorospheres Nastavení: FSC/SSC, MFI (FL intenzita) Nastavení cílových hodnot MFI + tolerance pro každé instrument settings (Levey-Jennings graf) Automaticky nastaví PMTV, větší variabilita než CS&T Po změření ručně uložit nové settings (přepsat předchozí) Flow-Set settings nalinkovat k experimentu jako Cytosettings
4. Stand. měření mezi cytometry / mezi laboratořemi EuroFlow přístup Definice Cílových hodnot MFI Standard 8-peak Rainbow beads Udržení cílových hodnot MFI Manuálně Tolerance Cílové hodnoty MFI ± 15%, 8-peak Rainbow pokud MFI v rozmezí, PMTV se nemění = monitoring
EuroFlow Cílové hodnoty MFI (pro BD cytometry) SPHERO Rainbow Calibration Particles (8 Peaks), 2 µm (Spherotech) www.euroflow.org
EuroFlow Cílové hodnoty MFI - 7th peak Rainbow beads
Reprodukovatelnost dat a rozlišení Udržení cílových hodnot MFI Medián bright bead populace byl umístěn do stejného FL kanálu = Cílová hodnota MFI Pokles sensitivity na suboptimálně nastavených cytometrech ovlivní více Low Intensity rozlišení
Standardizace dat měřených na různých cytometrech Synchronizace cytometrů = cytometry měří stejně = Definice Cílových hodnot MFI vlastní, standardní Reprodukovatelnost měřených dat = Udržení cílových hodnot MFI změnou PMTV Manuálně - EuroFlow Automaticky - CS&T + Application settings (BD) - FlowSet (BC)
BD FACS Canto Synchronizace cytometrů B. Coulter Navios 488 nm solid state 20mW 633 nm HeNe 17mW 530/30 FITC 585/42 PE 670LP PerCP-Cy5.5 870/60 PE-Cy7 660/20 APC 780/60 APC-Cy7 488 nm solid state 22mW 638 nm solid state 25mW 405 nm solid state 40mW 525/40 FITC 575/30 PE 620/30 ECD 695/30 PE-Cy5.5 755 LP PE-Cy7 660/20 APC 725/20 Alexa Fluor 700 755LP APC-Cy7/APCA750/APC-H7 450/50 PacBlue 550/40 PacOrange 18 bit (2 18 kanálů), fcs 20 bit (2 20 kanálů), LMD
CD4 PE CD4 PE Jak udělat, aby cytometry měřily stejně? CANTO NAVIOS CD3 FITC CD3 FITC
Definice cílových hodnot MFI 35895 32941 Cílové hodnoty MFI dle EuroFlow pro BD cytometry a po optimalizaci pro Navios
Synchronizace os
Synchronizace cytometrů dle EuroFlow = porovnatelná data z Canto a Navios FITC PE PerCP-Cy5.5 PE-Cy7 APC APC-Cy7 CANTO NAVIOS
CD4 PE Cytometry měří stejně CANTO NAVIOS CANTO + NAVIOS CD3 FITC CD3 FITC CD3 FITC
120723 120727 120801 120806 120810 120815 120820 120824 120829 120903 120907 120912 120917 120921 120926 121003 121009 121011 121017 120723 120727 120801 120806 120810 120815 120820 120824 120829 120903 120907 120912 120917 120921 120926 121003 121009 121011 121017 120723 120727 120801 120806 120810 120815 120820 120824 120829 120903 120907 120912 120917 120921 120926 121003 121009 121011 121017 Monitoring cílových MFI 8-peak Rainbow (Navios) EuroFlow : odchylka ± 15% od Cílových hodnot MFI pokud MFI v rozmezí, PMTV se nemění = monitoring 2 PE (FL2) 2 PacBlue (FL9) PB (FL9) MFI x 1000000 RB/7 peak 1 PE (FL2) MFI x 100000 RB/7 peak PE (FL2) HPCV RB/7 peak 1 PB (FL9) HPCV RB/7peak 0 0 2 1 APC (FL6) APC (FL6) MFI x 1000000 RB/7 peak APC (FL6) HPCV RB/7 peak Stabilita PE, APC, PacBlue 3 měsíce 0 SPHERO Rainbow Calibration Particles (8 Peaks), 2 µm (Spherotech)
Standardizace CANTO vs. NAVIOS v praxi
Standardizace schéma testování Kdy provést? Po instalaci cytometru Změna optiky Servis, alignment Měsíčně Změna reagencií (tandemy) Denně Baseline x x (X) Denní kontrola cytometru X X X x Kompenzace X X x x x Kontrola gates (FMO) x x x x x
Kompenzace Stejné MFI = stejná pozice = stejná kompenzace Den 1 Instrument Setup + kompenzace Den x Změna PMTV (stejné MFI) + stejné kompenzace PE single pozitivní PE single pozitivní double pozitivní double pozitivní = double negativní single pozitivní double negativní single pozitivní FITC FITC Kompenzační matice se nemění, dokud se nezmění fluorochrom (tandemy!) nebo cytometr (filtry)
Děkuji za pozornost