FluoroSpheres Kód K0110 6. vydání Kalibrační kuličky pro denní monitorování průtokového cytometru. Činidla obsažená v kitu lze použít pro 40 kalibrací. (108650-004) SSK0110CE_02/CZ/2015.12 p. 1/9
Obsah Strana Použití... 3 Souhrnné informace a vysvětlení... 3 Princip testu... 3 Činidla... 4 A. Poskytnuté materiály... 4 B. Potřebný materiál, který není součástí dodávky... 4 Upozornění... 4 Uchovávání... 4 Postup testu a sběr dat... 4 Analýza dat, kalibrační křivka... 5 A. Definice... 6 B. Manuální kalibrace. Pro přístroje vyjadřující MFI v lineárních hodnotách... 6 C. Manuální kalibrace. Pro přístroje vyjadřující MFI v počtech kanálů... 7 (108650-004) SSK0110CE_02/CZ/2015.12 p. 2/9
Použití In vitro diagnostikum. FluoroSpheres jsou určeny pro denní monitorování výkonu průtokového cytometru. Souhrnné informace a vysvětlení Kit poskytuje kuličky (kapičky) typu Blank Beads a Calibration Beads o velikosti 3,2 µm. Calibration Beads je směs pěti populací kuliček s různými intenzitami fluorescence a jedné nefluorescenční populace. Zachycení ve fluorescenčních kuličkách je kombinací jedinečných fluorochromů, což umožňuje vybuzení světlem libovolné vlnové délky v rozmezí od 365 do 650 nm. Jelikož se kuličkové fluorochromy liší od fluorochromů běžně používaných v průtokové cytometrii, liší se rovněž spektrální vlastnosti. Tyto kuličky proto nelze použít pro nastavení fluorescenční kompenzace. Spolu s přiřazenými hodnotami molekul ekvivalentního fluorochromu (MEF) pro populace fluorescenčních kapiček použití FluoroSpheres umožňuje transformaci libovolných jednotek průměrné intenzity fluorescence (MFI) na absolutní jednotky pro zabezpečení jakosti a předkládání dat průtokové cytometrie. Princip testu 1. Za prvé, Blank Beads jsou analyzovány za účelem stanovení optimálního nastavení přístroje pro všechny požadované kanály. 2. Za druhé, Calibration Beads jsou analyzovány. Data se používají ke konstrukci kalibrační křivky závislosti MFI vůči MEF. Kalibrační křivka a příslušné statistické parametry se používají k vyhodnocení linearity přístroje. Z kalibrační křivky lze navíc určit detekční prahovou hodnotu a dynamický rozsah přístroje. Při kalibraci pomocí FluoroSpheres se používají dva způsoby: Konstantní nastavení přístrojů. Při použití této metody je nastavení všech přístrojů neměnné. Monitorují se MFI pro různá maxima a výsledky se zobrazí ve formě data kalibrace versus MFI. Konstantní citlivost přístroje. Touto metodou se nastaví napětí PMT tak, aby se MFI jednoho z vysokých fluorescenčních maxim pokaždé objevovalo na stejném kanálu. Výsledky se poté zobrazí ve formě data kalibrace versus napětí PMT. (108650-004) SSK0110CE_02/CZ/2015.12 p. 3/9
Činidla A. Poskytnuté materiály Ampule 1 Ampule 2 1,7 ml V 0,02 % azidu sodném, 0,01% NP40 1,7 ml Obsahuje Blank Beads a 5 populací kuliček s různým množstvím fluorochromů vyjádřených v hodnotách MEF pro FITC, RPE, RPE-TxRed, Cy5, resp. APC. Ohledně specifických hodnot MEF týkajících se šarže nahlédněte do přiloženého formuláře analytických hodnot. V 0,02 % azidu sodném, 0,01% NP40. B. Potřebný materiál, který není součástí dodávky Základní laboratorní vybavení pro průtokovou cytometrii. Semilogaritmický papír a dvojitý logaritmický papír (pro 5 cyklů). Kalkulačka. Programy pro analýzu výsledků průtokové cytometrie. Tabulkové procesory pro zpracování tabulek, např. Microsoft Excel. Tyto programy jsou volitelné. Upozornění 1. Pouze pro profesionální uživatele. 2. Tento výrobek obsahuje azid sodný (NaN 3 ), chemikálii, která je v čistém stavu vysoce toxická. V koncentracích, v nichž se azid sodný nachází v produktu, není klasifikován jako nebezpečný, může však reagovat s olověnými a měděnými armaturami a vytvářet vysoce výbušné koncentrace kovových azidů. Při likvidaci spláchněte velkým množstvím vody, abyste zabránili nahromadění kovových azidů v armaturách. Uchovávání Kit uchovávejte při teplotě 2-8 C. Nepoužívejte po uplynutí doby použitelnosti označené na ampulích. Jsou-li činidla uchovávána v jiných než uvedených podmínkách, musí být tyto ověřeny uživatelem. Pokud se objeví neočekávané výsledky, které nelze vysvětlit odchylkami v laboratorních postupech, a máte-li podezření na problém s kitem, kontaktujte naši Technickou službu. Postup testu a sběr dat 1. Kuličky intenzivně zamíchejte buď vortexovým mixérem nebo protřepáním. 2. Do každé ze dvou zkumavek přidejte 0,5 ml vhodného ředícího pufru, např. fosfátem pufrovaný fyziologický roztok, o ph 7,2. Do první zkumavky přidejte jednu kapku Blank Beads z ampule 1 a do druhé zkumavky jednu kapku Calibration Beads z ampule 2. Promíchejte vortexovým mixérem, aby byly kuličky součástí suspenze. 3. Před sběrem dat se zvolí logaritmická amplifikace pro příslušné fluorescenční detektory a fluorescenční kompenzace všech parametrů se vynuluje. 4. Zkumavku s Blank Beads vložte do průtokového cytometru. (108650-004) SSK0110CE_02/CZ/2015.12 p. 4/9
5. Nastavte napětí PMT tak, aby se maximum Blank Beads zobrazilo v první dekádě histogramu. 6. Použitím dopředního a stranového rozptylu nastavte vodivostní hradlo na kuličkových singletech (viz obr. 1). 7. Získejte minimálně 5 000 hradlovaných uzlů z Blank Beads. 8. Zkumavku s Calibration Beads vložte do průtokového cytometru a získejte data od nejméně 5 000 hradlovaných uzlů. 9. V příslušném fluorescenčním kanálu by se mělo zobrazit 6 různých maxim intenzity fluorescence (viz obr. 2). Analýza dat, kalibrační křivka Analýza výsledků je omezena na hradlované kuličkové singlety bez nečistot, jak je definováno na bodovém grafu dopředního versus stranového rozptylu (viz obr. 1). Individuální markery nebo oblasti se používají k definování každé ze 6 kuličkových populací Calibration Beads (viz obr. 2). Tyto oblasti se používají k určení MFI jednotlivé kuličkové populace. Obr. 1. Dopředný (FSC) versus stranový (SSC) rozptyl Blank Beads. Hradlo bylo nastaveno na sběr kuličkových singletů. (108650-004) SSK0110CE_02/CZ/2015.12 p. 5/9
855 R5 R6 R3 R4 641 R2 R1 Counts 427 213 0 100 101 102 103 104 FL1-H Obr. 2. Histogram populace kuliček FluoroSpheres. A. Definice Log offset Log offset představuje hodnotu fluorescence v kanálu 0. Kanál 0 je obvykle reprezentován programovým vybavením (SW) výrobce s libovolnými hodnotami, např. 1 pro většinu SW Becton Dickinson a 0,1 pro většinu SW Coulter. AvgRes% Průměrné zbytkové procento (AvgRes%) je neváhová míra odezvy linearity přístroje. Vypočítá se určením průměrného absolutního podílu v procentech, o které se regresní řady liší od skutečných bodů. r 2 Koeficient určení (r 2 ) je vážená míra linearity. Nejvíce se používá při analýze logaritmických údajů. Detekční prahová hodnota I když Blank Beads neobsahují zachycené fluorochromy, mohou vyvolat signál. Tento signál představuje hlukové pozadí a tudíž detekční hladinu přístroje. MEF Molekuly ekvivalentního fluorochromu představují množství fluorochromu na kuličku. Logaritmická dekáda Logaritmická dekáda je kalibrovaný plný rozsah stupnice nebo dynamický rozsah kalibrovaného fluorescenčního parametru. Obecně, průtokové cytometry opatřeny amplifikátory s dynamickým rozsahem 3,5 nebo 4 logaritmických dekád (v závislosti na výrobci). Snížená účinnost průtokového cytometru ovlivní logaritmickou dekádu. B. Manuální kalibrace. Pro přístroje vyjadřující MFI v lineárních hodnotách Konstrukce kalibrační křivky: 1. Stanovte MFI pro každou ze šesti populací kalibračních kuliček FluoroSpheres Calibration Beads. (108650-004) SSK0110CE_02/CZ/2015.12 p. 6/9
2. Vyneste logaritmus MFI proti příslušnému logaritmu MEF pro různá maxima. Podle následujícího vzorce vypočítejte "nejvhodnější" přímku: log (MEF) = a x log (MFI) + b kde a je sklon a b je úsek na přímce osy y rovněž zvaný log offset neboli také nulová hodnota kanálu. 3. Vypočítejte příslušné statistické parametry kalibrační křivky AvgRes% a r 2. 4. Dynamický rozsah amplifikátoru je vyjádřen v logaritmických dekádách. Logaritmické dekády lze vypočítat z regresní řady odečtením log (MEF min ) od log (MEF max ). Log (MEF min ) a log (MEF max ) jsou odvozeny od nejnižších, resp. nejvyšších hodnot MFI. V konkrétním případě se hodnota MFI pro MEF min a MEF max rovná 10 0, resp. 10 4. MEF (logaritmické měřítko) Detekční prahová hodnota (MEF (MEF kuličky 1) 1) 1 (blank) log offset (nulová hodnota kanálu) MFI (lineární hodnoty) Obr. 3. Kalibrační křivka (regresní řada) na základě FluoroSpheres. Příklad výpočtu: logaritmické dekády = log (MEF max ) - log (MEF min ) logaritmické dekády = log (188 735) - log (30,8) logaritmické dekády = 5,28 1,49 logaritmické dekády = 3,79 Počet kanálů na dekádu: Jelikož je počet kanálů 1024, počet kanálů na dekádu bude: 1024/3,79 = 270 C. Manuální kalibrace. Pro přístroje vyjadřující MFI v počtech kanálů Konstrukce kalibrační křivky: 1. Stanovte MFI pro každou ze šesti populací kalibračních kuliček FluoroSpheres Calibration Beads. 2. Podle následujícího vzorce vyneste MFI vůči log (MEF) a vypočítejte "nejvhodnější" přímku: log (MEF) = a x MFI + b kde a je sklon a b je úsek na přímce osy y. 3. Vypočítejte příslušné statistické parametry kalibrační křivky AvgRes% a r 2. (108650-004) SSK0110CE_02/CZ/2015.12 p. 7/9
4. Dynamický rozsah amplifikátoru je vyjádřen v logaritmických dekádách. Logaritmické dekády lze vypočítat z regresní řady odečtením log (MEF min ) od log (MEF max ). Log (MEF min ) a log (MEF max ) jsou odvozeny od nejnižších, resp. nejvyšších hodnot MFI. V konkrétním případě se hodnota MFI pro MEF min a MEF max rovná 0, resp. 1023. MEF (logaritmické měřítko) Detekční prahová hodnota (MEF kuličky 1) 1) 1 (blank) log offset (nulová hodnota kanálu) MFI MFI (číslo (číslo kanálu) kanálu) Obr. 4. Kalibrační křivka (regresní řada) na základě FluoroSpheres. Příklad výpočtu: logaritmické dekády = log (MEF max ) - log (MEF min ) logaritmické dekády = log (188 735) - log (30,8) logaritmické dekády = 5,28 1,49 logaritmické dekády = 3,79 Počet kanálů na dekádu: Jelikož je počet kanálů 1024, počet kanálů na dekádu bude: 1024/3,79 = 270 (108650-004) SSK0110CE_02/CZ/2015.12 p. 8/9
Vysvětlení symbolů Katalogové číslo Teplotní rozmezí od do Použitelné do In Vitro diagnostický zdravotnický prostředek Viz návod k použití Lze použít pro <n> testů Číslo šarže Výrobce Výrobce: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Denmark Tel. +45 44 85 95 00 Fax +45 44 85 95 95 (108650-004) SSK0110CE_02/CZ/2015.12 p. 9/9