Afinitní chromatografie

Transkript

1 Pražské analytické centrum inovací Projekt CZ / /0002 spolufinancovaný ESF a Státním rozpočtem ČR Afinitní chromatografie Tereza Vařilová, Věra Pacáková PřF UK Praha

2 Obsah přednášky 1. Úvod 2. Teoretický princip 3. Komerční stacionární fáze 4. Příprava vlastních stacionárních fází 4.1 Nosiče 4.2 Aktivace nosičů 4.3 Vazba ligandu 5. Aplikace 6. Závěr 2

3 Analýza biologicky aktivních látekl proteomika složité systémy vysoké požadavky na použité separační metody separační účinnost selektivita 3

4 Afinitní chromatografie princip metody Enzym Enzym Protilátka Hormon Substrát Inhibitor Antigen Receptor E + L E...L K = [ E... L] [ E] [ L] 4

5 Krok 1 Adsorpce vzorek nosič Krok 2 Promytí Krok 3 Desorpce kovalentně vázaný ligand Krok 4 Regenerace Vařilová T. et al.: Chem. Listy 99 (2005)

6 3 základní kroky analýzy * rovnováha ustálení startovacích podmínek * adsorpce nadávkování vzorku a promytí kolony * eluce vymytí zachycené molekuly z kolony ustálení promytí neadsor.látky desorpce sorb. látky 6

7 Eluce Nespecifická změna ph nebo iontové síly pi Specifická přídavek disociačních činidel Izokraticky jednoduché látky s afinitou k ligandu Gradientovou elucí vhodná strmost 7

8 Typy afinitních ligandů Ligandy pro mono-specifické separace strukt. a biol. příbuzné s cílovou molekulou specifický ligand pro každý jedn. případ pepsin + 3,5-dijodo-L-tyrosin Ligandy pro skupinově-specifické separace šiřší aplikovatelnost komerčně dostupnější glykoproteiny + Konkanavalin A 8

9 Skupinově selektivní ligandy Konkanavalin A Lysin Arginin Benzamidin Specifita Glukopyranosylmanopyranosylové skupiny Ribosomální RNA Serinové proteasy Serinové proteasy Heparin Lipoproteiny, hormony, steroidní receptory 9

10 Malé ligandy nebezpečí stérických interferencí mezi matricí a ligandem nebo nízká přístupnost pro ligand oddalovací raménko (spacer arm) 10

11 IMAC Immolized Metal Affinity Chromatography Afinitní chromatografie na vázaných v kovových iontech afinita někt. bílkovin k iontům TK, které jsou imobilozovány na pevném nosiči chelátovým komplexem Ni 2+, Cu 2+, Zn 2+, Co 2+ čištění rekombinantních proteinů 11

12 Komerční afinitní stacionárn rní fáze Tosoh Bioscience TSKgel ABA-5PW p-aminobenzamidin napodobuje inhibitor serinové proteasy Aplikace: trypsin, urokinasa, krevní koagulační faktory 0,5 M NaCl + 2 mm CaCl 2 v 50 mm Tris.HCl ph 8,0 Eluce změnou hodnoty ph pufru na 2,8. Izolace surového trypsinu 12

13 Amersham Bioscience Con A Sepharose 4B Concanavalin A váže sacharidové složky Aplikace: analýza glykoproteinů Eluce přídavkem α-methyl-manosidu. Přečištění lidského membránového glykoproteinu 13

14 Příprava afinitní stacionárn rní fáze Příprava vlastní stacionární fáze Nosič aktivace Nosič s aktiv. skupinami Imobilizace afinitního ligandu Blokace nezreg. funkč.skupin naplnění kolony Afinitní stacionární fáze 14

15 Nosiče e pro afinitní chromatografii minimální nespecifické interakce chemická stabilita mechanická stabilita ph stabilita teplotní stabilita 15

16 Silikagel nutná modifikace povrchu: volné silanolové Si-OH skupiny zavedení reaktivní funkční skupiny (epoxy) snese tlaky omezené ph: 2<pH<8 nespecifické interakce 16

17 Anorganické oxidy Al 2 O 3, TiO 2 a ZrO 2 mnoho amorfních a krystalických forem Al 2 O 3 se rozpouští při ph>12 a ph<3 TiO 2 a ZrO 2 snáší i extrémní podmínky ph 17

18 Agarosové nosiče e a jejich deriváty 2 polysacharidové jednotky, β-(1,4)-o Sepharosa ph 4-9, hydrofilní, nespecifické interakce nestabilní za tlaků OH O mikrobiální atak CH2 OH O O OH O CH 2 O OH O n Varilova T. et al.: Curr. Proteomics 3 (2006)

19 Polyakrylamidové gely syntetické kopolymery na bázi akrylamidu Bio-Gely ph 1-10 chemicky stabilní (sůl, močovina, Gdn.HCl) nízký stupeň porozity O H 2 C C H C NH 2 19

20 Hydroxyalkylmethakrylátov tové nosiče syntetické polymery HEMA hydroxyethylmethakrylát ph 2-12 Čoupek J., Vinš I.: J. Chromatogr. A 658 (1994) 391. Toyopearl ph 2-12, nižší nespec.interakce 20

21 Dextranové gely glukosové jednotky α-1,6/ větvené 1,2/1,3/1,4 Sephadex, Superdex O CH 2 O nejsou mechanicky stálé O CH 2 OH OH glykosidické vazby O OH CH hydrolýza při ph 2 CHOH CH náchylné k bakteriálnímu útoku 2 O O OH O HO OH O O O CH 2 Varilova T. et al.: Curr. Proteomics 3 (2006)

22 Celulosa glukosové jednotky β-1,4 dostupná, levná využití v průmyslové oblasti vláknitá vazba pro DNA 22

23 Monolitické fáze kolona je zcela vyplněna polymerem o def. pórovitosti spotřeba vzorku a rozpouštědel rychlé separace, + pro labilní látky Monolitický disk (scanning electron mikroscopy) Tennikova T.B.: J. High Resol. Chromatogr. 23 (2000)

24 Vtištěné polymery (imprinted polymers) založené na molekulovém rozpoznávání in-situ polymerace v koloně v polymeru zůstanou obtisky po vtištěné molekule chirální separace 24

25 Aktivace nosičů Epoxy skupinami (bisoxiranem) Bromkyanová metoda (CNBr) Divinylsulfonem (DVS) Organickými sulfonylchloridy tosylchlorid p-toluensulfonylchlorid tresylchlorid 2,2,2-trifluoroethansulfonylclorid nosič aktivace vazba afinant OH + CNBr O-CN + H 2 N-ligand O-CNH-ligand OH + ClSO 2 CH 2 CF 3 SO 2 CH 2 CF 3 + H 2 N-ligand NH-ligand + HOSO 2 CH 2 CF 3 upraveno podle Štulík K. a kol.: Analytické separační metody, Karolinum, Praha

26 Imobilizace afinitního ligandu Aktivní skupina epoxy bromkyan divinylsulfon tresyl Reagující skupiny ligandu -NH 2 -OH -SH -COOH -NH 2 -NH 2 -OH -SH -NH 2 Reakční podmínky ph 5-12 doba 4-72 hod teplota 4-60 C ph 7-10, doba 1-12 hod, teplota 4-25 C ph 6-11, doba 2-24 hod teplota 4-25 C ph 7-9, doba 2-16 hod, teplota 4-25 C upraveno podle Turková J.: Bioaffinity Chromatography, 2.vydání, Elsevier, Amsterdam

27 Blokace nezreagovaných fukčních skupin vazba vhodné látky na zbytkové aktivní skupiny nosiče glycin, glycerol, ethanolamin hydrolýza zbytkových aktivních skupin v OH - prostředí 27

28 Imobilizace ligandu a blokace zbylých skupin Vařilová T. et al.: J. Sep. Sci 29 (2006)

29 Stanovení množstv ství imobilizovaného ligandu diferenční analýza m celk -m nezreag přímá spektroskopie kyselá/enzymová analýza hydrolýza vazby mezi nosičem a ligandem elementární analýza S, I, N, P Radioaktivita 3 H, 32 P, 57 Co 29

30 Příklady použit ití prekoncentrace čištění analytů v komplexních směsích analýza látek oblast ŽP (např. pesticidy a toxiny) aplikace v lékařství (enzymy, hormony, viry a jejich genetický fond, rakovinotvorné markery, protilátky, proteiny semenné plazmy, léky/drogy ) proteomika stanovení vazebných konstant kombinace s 2-DE 30

31 nosiče HEMA E HEMA VS Toyopearl E ligand 3,5-dijodo-L-tyrosin blokace nezreag.skupin glycin vzorek prasečí pepsin A lidský pepsin eluce vzorku změnou ph mob. f. Pepsin A 214 [ma] , t [min] Prasečí pepsin A na koloně HEMA VS-DIT. 3 5,6 5,2 4,8 4,4 4,0 ph Vařilová T. et al.: J. Chromatogr. A 1084 (2005)

32 Proteiny semenné plazmy nosič Toyopearl (komerční) ligand heparin vzorek proteiny semenné plazmy: kančí, býčí a lidské eluce vzorku změnou pi mob. fáze A 280 [ma] , t [min] Lidská semenná plazma. 1,5 1,0 c NaCl [M] 0,5 Vařilová T. et al.: J. Sep. Sci 29 (2006)

33 nosiče Toyopearl E Toyopearl T ligand konkanavalin A blokace nezreag.skupin glycin vzorek 4-nitroder. sacharidů glykoproteiny vybrané alergeny eluce vzorku přídavek manopyranosidu Glykoproteiny A 280 [ma] t [min] Pylový alergen Phleum pratense na koloně Toyopearl E-Con A. 2 33

34 Papain nosič skleněná vlákna ligand papain vzorek papainové inhibitory z bramborové šťávy eluce vzorku 6 M močovinou Membrána ze skleněných vláken s imobilizovaným papainem. Guo. W. and Ruckenstein E.: J. Membr. Sci. 215 (2003)

35 Závěr Afinitní chromatografie separace a izolace látek specifické interakce (molekulové rozpoznávání) nové stacionární fáze miniaturizace techniky (afinitní membrány) 35

36 Děkuji za pozornost! 36