Transgeneze u ptáků: očekávání vs. realita

Transkript

1 Transgeneze u ptáků: očekávání vs. realita

2 Proč ptáci? Kuře - základní model v anatomii, embryologii, vývojové biologii množství získaného proteinu nižší riziko cross reaktivity s tím spojená možnost produkce toxických bílkovin (EPO)

3 Generační doba inkubace kuřete trvá 21 dní dosažení pohlavní dospělosti cca 26 týdnů jeden kohout za rok může teoreticky dát vzniknout až transgenních potomků

4 Kuře jako bioreaktor pro produkci terapeutických proteinů směrovaná produkce do vajec produkce regulována ovalbuminovým promotorem (54% bílkových proteinů) odhadovaný výtěžek až 100mg rekombinantního proteinu na vejce při roční produkci 300 vajec, výtežek až 30g terapeutického proteinu z jednoho zvířete (1mg rhscf = ~ Kč) produkce lidských rekombinantních protilátek do žloutku (ten přirozeně obsahuje až 400mg maternálních IgY)

5 Výhody produkce rekombinantních proteinů do vajec (oproti produkci do mléka) Krátká generační doba, velké výtěžky, nízké náklady Přirozeně sterilní prostředí ve vejci Přítomnost inhibitorů proteáz Snadná purifikace z méně složitého vaječného bílku Ověřené a uznané metody izolace vaječných proteinů (lysozym), vč. izolace vakcín pro lidské použití (chřipka) Podobný glykosylační vzorec jako lidé Následné obdobné terciální uspořádání rek. prot. (může být imunogenní)

6 Glykosylace jedna z postranslačních modifikací proteinů vazba sacharidů na proteiny probíhají zejm. v endoplasmatickém retikulu a Golgiho aparátu některé tyto vazby u kuřat jsou velice podobné vazbám u lidí (na rozdíl od ostatních savců) např. α1-3-galaktosa je přítomna u savců, kromě lidí a primátů (lidé tvoří i protilátky přispívají k odhojení xenotransplantátů), kuřata tento oligosacharid vůbec netvoří

7 Buňky vhodné pro genovou manipulaci Blastodermální buňky Primordiální gonocyty Spermatogoniální buňky

8 Blastodermální buňky buňky zárodečného terčíku čerstvě sneseného vejce ~ buněk pluripotentní, částečně diferencované vznikají chiméry (somatické, zárodečné) Ivarie 2003, tibtec.trends.com

9 Primordiální gonocyty prekurzory pohlavních buněk ~2-5 dní inkubované embryo mohou být dlouhodobě kultivovány bez ztráty zárodečných charakteristik řádově pouze stovky buněk vysoce odolné proti genové manipulaci

10 Spermatogoniální buňky recombinant retroviral vector (LGVSV-G) carrying enhanced green fluorescent protein (EGFP) marker gene Kalina et al. (2007) Retrovirus-mediated in vitro gene transfer into chicken male germ line cells. Reproduction

11 Metody tvorby transgenních kuřat přenos pomocí retrovirových vektorů DNA/retro transpozony (PiggyBAC) moderní nukleázové systémy (ZFN, TALEN, CRISPR/Cas)

12 Virové vektory LTR Gag,pol,env Retroviry Lentiviry

13 Virové vektory u kuřat zatím nejpoužívanější a nejúspěšnějsí systém omezená kapacita vektoru (~8kb) (semi)náhodná a vícečetná integrace do genomu (riziko onkogeneze) epigenetický silencing

14 Virové vektory Transgenní kuře rezistentní na ptačí chřipku (RNAi kazeta).lyall et al.(2011) Produkce lidských rekombinantních proteinů ve vejci (mir24, IFN-β-1a; µg/ml ). Lillico et al. (2007)

15 Transpozibilní elementy transpozony, sekvence DNA schopné měnit pozici v genomu piggybac (cabbage-looper) Tol2 (medaka fish) Park and Han, 2012

16 CRISPR/Cas clustered regularly interspaced short palindromic repeats prokaryotický imunitní systém lze jím přidat, změnit nebo vyřadit libovolný gen in vivo genomová editace, potenciál pro experimentální léčbu cystické fibrózy nebo srpkové anémie (bodové mutace) Park et al., J Stem Cell Res Ther 2014,

17 Závěr Transgenní ptáci (kuře) mají obrovský potenciál Přibývají nové publikace popisující nové metody přípravy transgenních kuřat a produkce rekombinantních proteinů Vzniklo několik společností, které se soustředí na produkci terapeutických proteinů v transgenních kuřatech Přesto stále není žádný významnější komerční výstup

18 Děkuji za pozornost