Petr Müller Masarykův onkologický ústav. Genová terapie

Transkript

1 Genová terapie Petr Müller Masarykův onkologický ústav

2 Genová terapie =terapie využívající vpravení exogenní DNA do buněk či tkání organismu za účelem opravy fenotypu (deficience či mutace genu, vrozené či získané choroby) klonování expresní systémy transfekce eukaryotických buněk genová terapie v praxi V běžné laboratoři se používá řada užitečných technik a postupů, které byli vyvinuty pro zdokonalení genové terapie

3 Klonování = vytváření identické kopie

4 Klonování v biologii Klonování DNA (genů)=molecular cloning Klonování buněk selekce mutantů-klonovací kroužky selekce hybridomů klonování kmenových buněk Klonování organismů vegetativní rozmnožování- řízkování partenogeneze klonování zárodečných buněk somatické klonování

5 DNA / RNA šum Molecular cloning Selekce RT-PCR PCR Hybridizace Modifikace Transformace Ligace Rekombinace Bakterie Kvasinka..

6 Výběr plasmidu expresní organismus bakterie virus eukaryota Selekce bakterie: Ampicilin, Kanamycin,Spectinomycin, Chloramphenicol, Doxyciclin, Rifampicin eukaryota: Geneticin, Blasticidin, Zeocin, Puromycin Promotor virový, inducibilní, tkáňově specifický Struktura genu, mrna

7 Vektory pro genovou terapii DNA lineární DNA plasmidová DNA Viry Adenovirus Adeno associated virus Retroviry=MMLV, HIV=Lentivirus Herpesvirus

8 Genová terapie náhrada původního genu 20kb 1.6kb

9 polya signal 3 UTR mirna intron Exon 5 UTR Enhancer Bazální promotor Promotor mrna Snaha o uvedení genové terapie v praxi probíhá paralelně s výzkumem regulace genové exprese

10 Požadavky na dobrý vektor: Správné začlenění do genomu Dlouhodobá exprese Tkáňově specifická exprese Optimální dávka Export mrna z jádra do cytoplasmy Poločas rozpadu mrna Úspěšné zahájení translace 5 Regulace genové exprese Transcription AAAA Pre-mRNA processing 5' cap addition Splicing Editing Polyadenylation 5 AAAA mrna degradation translation Protein

11 RNA pol II regulated micro RNAi 5 RISC Target mrna 5 AAAAAAA Drosha 21-mer antisense AAAAAAA mirna flanking sequence Recognized by Drosha RISC Nuclear export 21-mer antisense Dicer

12 In vivo versus ex vivo + Vysoká okamžitá exprese Distribuce ve všech tkáních In vivo vektor je vpravován přímo do těla většinou jsou využívány viry - Imunitní odpověď Náhodné začlenění + Cílená tkáň Optimální exprese Ex vivo vektor je transfekován do buněk selekce klonu buněk s optimální - expresí většinou plasmidy Omezená distribuce buněk

13 Nahrazení chybějícího či mutovaného genu Choroby potenciálně léčitelné genovou terapií Chybějící sérové proteiny Hemofilie-faktor VIII, IX Wilsonova choroba- Ceruloplasmin Metabolické choroby Deficience ornitin dekarboxylázy Svalové dystrofie Poruchy imunitního systému SCID-ADA deficience, X=linked Další choroby s Mendelovskou dědičností Cystická fibróza Malignity Solidní nádory Leukemie, Lymfomy Neurodegenerativní choroby Alzheimer- agregace Tau Huntingtonova choroba Parkinsonova choroba Multifaktoriální choroby Kardiovaskulární choroby Oční choroby Zabití buněk Odstranění agregovaného proteinu Kompenzace poruchy, regulace

14 Virové vektory: většinou neschopné replikace (crippled) Vysoká schopnost vniknout do buněk Možnost zacílení prostřednictvím povrchových receptorů Schopnost aktivně se začlenit do genomu Imunitní odpověď Náhodné začlenění do genomu (mutagen) Velikost je limitem průniku do některých tkání (CNS)

15 Lentivirus (HIV) Plasmid s cílovou sekvencí Geny pro kapsidu Reverzní transkriptáza Tranzientní transfekce (lipofekce, elektroporace) Kapsida virová RNA Produkční buněčná linie

16 VSV-virus vesikulární stomatitidy VSV-G Neurony infikované rekombinantním VSV nesoucím gen pro GFP

17 WPRE I I HpaI San DI ClaI Nde I Sna BI Spe I AleI 2000 CMV promoter Bsp EI I Pas Eco NI MfeI 1000 HI...nt Intron gene 3000 Chloramp...ce Z17I Bst I Srf KasI NarI SfoI BbeI ccd...ne 4000 I Sal Bsp MI BI Mlu Bst RSV R...r Pfo I 9000 PciI puc origin Blas...ene SV4...er 5000 Pml I Sex AI Bcl I AhdI 8000 Ampicillin de...tr 6000 I Blp Cytomegalovirus Woodchuck hepatitis virus Bakteriofág M13 SV40 HIV plenti bp Bcg I Bcg I' 7000 Alo I Dra III I Sfi

18

19 Transfekce samotné DNA Lipofekce Elektroporace Dendrimery Polymery (PEG) Gene gun

20 Elektroporace

21

22 Lipofekce

23 Dendrimery PAMAM (polyamidoamine)

24 Protilátka Ligand receptoru Komplex DNA-dendrimer

25 Gene gun

26 Etické aspekty Klonování zárodečných kmenových buněk a jejich použití pro genovou terapii Definice nemoci, normality Zneužití, doping