MUTAGENEZE in vitro. postupy kterými se mění primární struktura DNA, především za účelem fenotypové změny

Transkript

1 MUTAGENEZE in vitro postupy kterými se mění primární struktura DNA, především za účelem fenotypové změny

2 Mutace gen transkripce translace mutace normalní protein normální fenotyp mutovaný gen abnormální protein částečně funkční nefunkční žádný změněný fenotyp

3 Typy mutací BODOVÉ DELECE INZERCE INVERZE TRANSLOKACE

4 Mutace na genové úrovni MUTACE BEZ PROJEVU (synonymní) 5 ATG GGA GCT CTA TTA ACC TAA 3 met gly ala leu leu thr stop 5 ATG GGA GCT CTA TTG ACC TAA 3 met gly ala leu leu thr stop ZMĚNA JEDNÉ AMINOKYSELINY (nesynonymní - missense) 5 ATG GGA GCT CTA TTA ACC TAA 3 met gly ala leu leu thr stop MUTACE SE ZTRÁTOU SMYSLU (nesynonymní nonsense) 5 ATG GGA GCT CTA TTA ACC TAA 3 met gly ala leu leu thr stop 5 ATG GGA GCT CTA TGA ACC TAA 3 met gly ala leu stop MUTACE S POSUNEM ORF 5 ATG GGA GCT CTA TTA ACC TAA 3 met gly ala leu leu thr stop 5 ATG GGA GCT CTA TTT ACC TAA 3 met gly ala leu phe thr stop 5 ATG GGG AGC TCT ATT AAC CTA A 3 met gly ser ser ile asn leu

5 PSEUDOGENY 1) Procesované (nebo retrotransposované) pseudogeny vznikly reverzní transkripcí z RNA a zabudováním do genomu 2) Neprocesované (nebo duplikované) pseudogeny vznikly duplikací a následnými spontánními mutacemi 3) Jedinečné pseudogeny jedinečné, důležité v evoluci. např. gulonolakton oxidasa pro biosyntézu vitamínu C nebo kaspasa12

6 REVERZE Proces kdy mutant získá zpět wild-typový fenotyp, dvě cesty: 1. zpětná mutace (přesná, málo častá) 2. supresorová mutace (mutace na jiném místě genu, která potlačuje (supresuje) původní mutaci. Mutant se nazývá REVERTANT. Je častá u mutací s posunem ORF.

7 Amesův Test test měří mutagenicitu různých látek jako zvýšenou frekvenci spontánní POUŽITÍ: testování nových látek na mutagenitu, potravinářská aditiva, pesticidy, kosmetika atd. reverze mutanta his- to his+ Test chemikálie + bakterie minimální medium bez histidinu 48 hrs histidin-vyžadující mutant (his-) Salmonella typhimurium Backgroundová spontánní REVERZE Chemicky indukovaná REVERZE

8 GENETICKÉ MAPOVÁNÍ často používaná metoda pro zjišťování funkce neznámých genů náhodná mutageneze semen Arabidopsis způsobující fenotypovou změnu mutagen ethylmethan sulfonát (EMS), záření rentgenové nebo gamma. cca semen se pěstuje a pozoruje fenotyp - M1 generace, mutace je heterozygotní. M1 generace se samo zkříží a semena se seberou. M2 semena se vysejí a mutanti s požadovaným fenotypem identifikují (ti co produkují pouze potomstvo s fenotypem jsou homozygotní na mutaci).

9 GENETICKÉ MAPOVÁNÍ I cm II 99.1 cm III cm IV 92.0 cm V cm nga 63 nga 126 nga 225 nga 8 nga 151 G4711 DET1 GAPB nga 280 GPA1 nga 168 NIT1 CH42 PRHA nga 139 DFR mutace a její pozice? nga 111 I-V cm mapa Arabidopsisových molekulárních markerů

10 GENETICKÉ MAPOVÁNÍ mutaci mapujeme pomocí molekulárních markerů u Arabidopsis thaliana ekotyp Columbia další rozšířený ekotyp Arabidopsis thaliana je Landsberg erecta pomocí DNA markerů můžeme rozlišit mezi těmito dvěmi ekotypy existuje na sekvenčních polymorfismů mezi ekotypy Landsberg erecta a Columbia a jejich pozice na chromozomech je přesně známa. tyto rozdíly se detekují především pomocí PCR variabilita v rámci inzertů a delecí způsobující rozdílnou délku amplifikovaných fragmentů, nebo vznikem nového restrikčního místa. příklad polymorfismu mezi Landsberg erecta a Columbia vznik nového restrikčního místa DraI v PCR produktu markeru

11 crossing over a rekombinace během meiozy při tvorbě gamet u heterozygotů (výměna části chromozomů) x Strain 1 Columbia mut (-/-) Strain 2 Landsberg mut (+/+) F1 rostliny mut (-/+) x BACK CROSSING markery ve vazbě mut { mut (-/-) mut (+/-) F2 semena

12 GENETICKÉ MAPOVÁNÍ homozygotní selektovaný mutant ekotypu Columbia homozygotní nemutovaný ekotypu Landsberg erecta heterozygot tzv. BACKCROSSING (zpětné křížení s mutantem) semena v F2 generaci poskytující mutantní fenotyp musí být homozygoti vzniklí crossing overem četný genotyp marker A není ve vazbě s mutaci vzácný genotyp marker B je ve slabé vazbě s mutaci velmi vzácný genotyp marker C je ve vazbě s mutaci četnost genotypu po crossing overu

13 analýza zpětně zkřížených mutantů frekvence rekombinace (RF) mezi mutovaným lokusem a různými markery RF [%] = # markeru Landsberg / # celkový počet markeru (lokusu) x 100 čím nižší procento, tím silnější vazba marker I ve vazbě 5 mutantů 1/10x100 = 10% marker II bez vazby na mutaci 6 mutantů 5/12x100 = 58% většinou se analyzuje až 1000 zpětně zkřížených mutantů, ten marker s nejmenší frekvencí na variantu pro druhý ekotyp má tento marker nejblíže mutaci určení dvou nejbližších markeru a následná sekvenace chromosomu mezi a nalezení hledané mutace resp. genu nesoucího tuto mutaci

14 GENETICKÉ MAPOVÁNÍ člověk shromážděno největší dostupné množství příslušníků rodin ve kterých se nachází znak (nemoc), kterou chceme mapovat určit gen, který nemoc způsobuje. Odebrány vzorky krve, izolována DNA a provedeno PCR na zhruba 200 genových markerů - polymorfismů (pokrývající celý genom cm od sebe) nalezen nejbližší marker tzn. jedna forma (alela) se nejčastěji vyskytuje u nemocného a u jeho zdravých sourozenců se nejčastěji vyskytuje druhá forma (marker ve vazbě k mapovanému genu nejmenší pravděpodobnost crossing overu) 2 kolo provedeno PCR na další nejbližší markery v nejbližším okolí markeru nalezeného v prvním kole testování. nakonec nalezeny dva nejbližší markery a DNA mezi nimi sekvencována u nemocného jedince a porovnána se zdravým.

15 GENETICKÉ MAPOVÁNÍ člověk - příklad Geny ve vazbě 2/13 transkripční faktor LMX1B

16 GENETICKÉ MAPOVÁNÍ myš Inbrední linie myší homozygotní téměř ve všech lokusech, vzniká křížením sourozenců minimálně po 20 generací

17 Kongenní myš vzniklá zpětným křížením potomstva dvou inbredních linií, z niž jedna nesla znak, který chceme alokovat, minimálně přes deset generací a selekcí na sledovaný znak Velikost diferenciálního segmentu v průběhu kongenizace Velikost diferenciálního segmentu v průběhu kongenizace lokace lokusů pomocí rozdílnosti mikrosatelitních markerů u jednotlivých inbredních myších linií Průměrná vzdálenost u myší 6.7 cm

18 MUTACE CÍLENÁ studuje efekt změny v genetickém materiálu - modifikace promotorové sekvence za účelem studia účinnosti transkripce - studium významu jednotlivých AK v proteinu zlepšování kvality např. expresního systému KOZAKOVÉ SEKVENCE je důležitá pro efektivitu translace (umožňuje pevnou vazbu malé ribozomální podjednotky na mrna) u eukaryot start codon Kozak seq. U A A A C A A U G G C U 60% 100% 70% AtCKX1 G U A G A A A U G G G A AtCKX2 A A A C A A A U G G C U HvCKX2 A G A G C C A U G A G G nebo proteinu, který exprimujeme změna jedné nebo i více aminokyselin může zlepšit kvalitu či aktivitu léčiva (enzymu)

19 mutace místně cílená (site-directed mutagenesis) gen, či sekvenci kterou budeme chtít mutovat, je třeba naklonovat do vhodného vektoru navržení dvou komplementárních primerů, v místě kde chceme mutovat, nesoucí tuto mutaci Stratagene M G A L L W L původní sekvence 5 ATG GGA GCT CTA TTA ACC TTA 3 forward primer 3 TAC CCT CGA GAT AAT TCG AAT 5 reverse primer 5 ATG GGA GCT CTA TTA AGC TTA 3 M G A L L S L PCR s těmito primery na templátový plasmid a s Pfu polymerasou vytváří se nové cirkulární DNA nesoucí mutaci, jsou k sobě komplementární a drží u sebe, mají přerušení v místě konce primerů (tzv. nick) ošetření restrikční endonukleasou DpnI (štěpí pouze methylovanou DNA, templátový plasmid) transformace do bakterie a namnožení mutovaného plasmidu

20 Gibson Assembly Site-Directed Mutagenesis

21 TRANSFORMACE baktérii a kvasinek přímý genetický přenos informace (DNA) z okolí do organismu buňka schopná přijmout DNA (plasmid) se nazývá KOMPETENTNÍ přirozeně kompetentní jsou některé kmeny Bacillus subtilis, Hemorheae influenze atd. všechny ostatní se mohou transformovat po uvedení do kompetentního stavu dvěma způsoby: A) ELEKTROPORACE B) CHEMICKÁ METODA buňky se pořádně promyjí dih 2 O smíchají s plasmidovou DNA rozpuštěnou také v dih 2 O a vloží do elektroporátoru buňky se ošetří roztokem rubidné a vápenaté soli, které způsobují větší permeabilitu membrány DNA se smísí s těmito buňkami a provede se tzv. HEAT SHOCK (45 sec. 42 C) EFEKTIVITA NÁROČNOST

22 využití mutageneze při studiu regulačních sekvencí genů vytvoření konstruktu studovaného promotoru a reportérového genu promotor reportérový gen vytvoření mutantů pro skenování promotorové aktivity DNA transformace každého konstruktu do buněk lýze buněk a měření aktivity reportérového genu

23 využití mutageneze při studiu regulačních sekvencí genů konstrukt aktivita reportérového genu reportérové geny: ß-galaktosidasa (kolorimetricky) CAT (chloramfenicolacetyl transferasa) (v savčích buňkách; radioaktivně, fluorescenčně) luciferasa (luminiscenčně) ß-glucuronidasa (v rostlinách)

24 CÍLENÁ MANIPULACE GENOMU - příprava knock-outovaných linií organismů HR homologní rekombinace NHEJ nehomologní lepení konců

25 ZINC FINGER NUCLEASES chimerické proteiny vytvořené spojením Fok I nukleasy a specifických sekvencí zvaných zinkové prsty

26 ZINC FINGER NUCLEASES

27 Testování specifity ZFN

28 Knock-out genu pomocí ZFN Shukla et al (2009): Precise genome modification in the crop species using ZFN. Nature 459

29 TALE nukleasy Transcription activator-like effector Původem z patogenních baktérií Xanthomonas a Ralstonia sekretované bakterií aktivující rostlinné promotory

30 GOLDEN GATE KLONOVÁNÍ rozpoznávací místo pro BsaI nebo BsmBI není palindromické a proto u něj záleží na orientaci

31

32 CRISPR-Cas9 system (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) Přirozeně obrana Streptococcus pyrogenes proti bakteriofágům či cizorodé plasmidové DNA

33 Spacer DNA (target) nekódující DNA ležící mezi geny cizorodého původu crrna obsahuje guidedrna, která je komplementarní ke CRISPR lokusu obsahující fragmenty (spacery) cizorodé (virální, plasmidové) DNA a části (palindromické repetice) homologní k tracer RNA Tracer tracrrna krátká RNA komplementární k palindromickým repeticím crrna, váže se na crrna a procesuje ji, štípe ji PROTOSPACER 20nt fragment spacer DNA (target) komplementární s cizorodou DNA PAM protospacer adjacent motif na cizorodé DNA důležitý pro rozpoznání aktivované Cas9 v jehož blízkosti dochází k dsdna zlomům Cas9 CRISPR asociovaný protein 9, RNA naváděná endonukleasa, katalyzující místně specifické štěpení DNA v blízkosti PAM

34 Tracr RNA a crrna mohou být spojeny do jedné molekuly (guidedrna), k úspěšnému knock-outu v jakemkoli organismu, pak potřebujeme pouze dvě komponenty fragment pro guidedrna a gen pro Cas9

35 DESIGN KONSTRUKTU PRO CRISPR CAS9

36 POUŽITÍ CRISPR CAS9 SYSTÉMU: 1) DELECE GENŮ frame-shift mutace v jakémkoli genu téměř jakéhokoli organismu, studium funkce k čemu gen je 2) MNOHONÁSOBNÁ DELECE GENŮ - multiple knock-out např. u polyploidních druhů (pšenice) 3) GENOVÝ KNOCK-IN 4) AKTIVACE NEFUNKČNÍHO GENU (důležité pro genové terapie) 5) AKTIVACE PROMOTORU

37 VÝHODY 1) Na rozdíl od TALEN a ZFG velmi jednoduchý design 2) Efektivně funguje ve většině organismů 3) Levný a rychlý (pravděpodobnost zacílení na obě alely zároveň netřeba selektovat homozygota) 4) Možné zacílit na několik genů současně více guided RNA 5) U knock-outu, možné odsegregovat rekombinantní DNA pryč s genomu, výsledný organismus není transgenní (GMO) NEVÝHODY 1) off-target efekt protospacer (20bp) může cílit i na jiná místa v genomu pleiotropní efekt 2) Cílová sekvence (protospacer) musí sousedit s PAM sekvencí

38 První genová terapie zaměřená na léčbu rakoviny 2018 Úprava buněk regulačních T-lymfocytů Extrakce T-lymfocytů z těla pacientů a ex-vivo terapie pomocí lentivirálního vektoru 1) KO PD1 receptoru down-reguluje imunitní systém tím, že potlačuje aktivaci zánětlivé reakce T-lymfocytů (neprodukují cytokiny a neaktivují makrofágy) 2) KO standardního receptoru rozpoznávajícího buňky v apoptóze a jeho nahrazení (knock-in) umělým receptorem který specificky rozpoznává nádorové buňky CAR (chimeric antigen receptor)