Pořád je co se učit Mikrosatelity Markery Krevní markery

Transkript

1 62 Princip testování parentity ovcí a jeho průběh na SVÚ Jihlava Pilířem šlechtění hospodářských zvířat je správně prováděná selekce plemenných jedinců. K odhadům plemenné hodnoty slouží jednak data o vlastní užitkovosti jedince, jednak dostupná data o jeho příbuzných. Z toho vyplývá, že špatně deklarovaný původ potomka může zkreslit jeho plemennou hodnotu a brzdit tak celé šlechtitelské úsilí. Aby k takovým situacím nedocházelo, lze využít možnosti ověření příbuznosti potomka s jeho deklarovanými rodiči. Toto ověření původu, tzv. parentita, je v České republice prováděno u všech plemenných beranů již několik let. Účelem tohoto článku je přiblížit čtenářům principy, na nichž je založeno testování parentity u ovcí, a představit způsob stanovení parentity plemenných beranů v laboratoři Státního veterinárního ústavu Jihlava (SVÚ Jihlava). Markery Při ověřování příbuznosti vycházíme z předpokladu, že příbuzní jedinci by se měli sobě navzájem podobat více než jedincům nepříbuzným. Potřebujeme tedy nějaký znak, či spíše soubor znaků, jejichž hodnoty mezi jedinci porovnáme a podle míry shody posoudíme příbuznost. Těmto znakům říkáme markery. Dobrý marker pro testování parentity musí splňovat především následující požadavky: 1. Musí se předávat z generace na generaci v nezměněné podobě. 2. Jeho hodnota musí setrvat stejná po celý život jedince. 3. Musí být v populaci variabilní, a to čím více, tím lépe. Důležitost těchto tří kritérií je vcelku jasná. Pokud se hodnota markeru mění z generace na generaci nebo v průběhu života, nelze naměřené hodnoty mezi generacemi srovnávat. Proto nelze jako markery pro testování parentity dosti dobře využívat např. vnější tělesné znaky (výška, váha, atp.), jejichž dědičnost je velmi komplexní a jejichž hodnoty jsou navíc výrazně ovlivněny prostředím. Nevhodný je také marker s nízkou variabilitou. Představíme-li si extrémní situaci, kdy má marker nulovou variabilitu a u všech jedinců v populaci má tudíž stejnou hodnotu, není vlastně co srovnávat. Naopak, čím více různých hodnot markeru v populaci existuje, tím vyšší je pravděpodobnost, že např. správně vyloučíme nepravého rodiče (různé hodnoty markeru) a potvrdíme toho pravého (shodné hodnoty markeru). Krevní markery Kritéria č. 1 a 2 splňují pouze tzv. markery genetické, jejichž hodnoty jsou pevně zakódovány v DNA. Historicky prvním takovým markerem byl systém krevních skupin AB0 u lidí. S rozvojem sérologických a elektroforetických metod analýzy proteinů v první polovině 20. stol. bylo následně popsáno až několik desítek dalších tzv. krevních markerů u člověka i u zvířat. Jednalo se o různé krevní proteiny vyskytující se v populaci v různých variantách. Tyto varianty jsou jasně determinovány geneticky a na rozdíl od krevního markeru AB0 dosahují i dostatečně vysoké variability (až několik desítek variant). Krevní markery byly využívány pro testování parentity u zvířat zhruba od 40. let. Analýza mnohdy až desítek různých proteinů je však dosti pracný a finančně náročný proces, proto se testování parentity tímto způsobem omezovalo především na oblasti s vysokým ekonomickým významem. Zásadním milníkem byl přelom 90. let, kdy s rozvojem poznatků a metod molekulární biologie na scénu vstoupily tzv. DNA markery. Mikrosatelity DNA marker je jedno konkrétní místo v DNA, ve kterém existuje populační variabilita. DNA markerů existuje více typů, pro účely parentity se však v 90. letech jasnou volbou staly DNA markery zvané mikrosatelity. Mikrosatelit je místo v DNA, kde se několikrát za sebou opakuje krátký motiv (tzv. repetice) většinou dvou až šesti nukleotidů. Nejčastěji v DNA různých organismů nalézáme mikrosatelity tvořené tzv. dinukleotidovými repeticemi, tedy opakováním sekvence dvou nukleotidů, např. CACACACACA nebo ATATATATAT. Mikrosatelit tvořený trinukleotidovými repeticemi bude tvořen opakováním tří nukleotidů, např. CATCATCATCATCAT, atp. Počet takových opakování může být různý, nejčastěji mezi pěti a padesáti. A právě v rozmanitém počtu opakování příslušné repetice spočívá variabilita mikrosatelitu. V populaci se tedy bude vyskytovat několik variant (alel) mikrosatelitu daných různým počtem repetic (obr. 1). Obr. 1 Čtyři alely mikrosatelitu tvořeného opakováním dinukleotidové repetice CA Dinukleotidu CA v jednom řetězci dvoušroubovice DNA odpovídá komplementární dinukleotid GT ve druhém řetězci. Tyto čtyři alely, popř. i další alely, existuje-li jich více, budou náhodně distribuovány mezi jedinci v populaci. I v ovčí DNA se nachází bezpočet různých mikrosatelitů. Jednotlivé alely se značí čísly, která jsou odvozena od jejich celkové délky. Např. v české ovčí populaci bylo na SVÚ Jihlava dodnes nalezeno celkem 9 různých alel markeru zvaného D5S2: 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198 a 200. Každý jedinec je nositelem dvou alel mikrosatelitu, jednu zdědil od otce a druhou od matky. Alelová skladba v daném mikrosatelitu, tedy jeho genotyp, je pak vyjádřena jako dvě čísla oddělená lomítkem, např. D5S2 184/188 nebo D5S2 192/192. Jelikož se alely DNA markerů předávají v nezměněné podobě z rodičů na potomka, lze porovnáním genotypu potomka s genotypem jeho rodičů vyhodnotit příbuznost (obr. 2). Obr. 2 Vyhodnocení parentity čtyř potomků porovnáním genotypů DNA markeru D5S2 Potomek vždy získává jednu alelu od otce a druhou od matky (znázorněno šipkami). Dle tohoto pravidla lze v uvedeném příkladu vyhodnotit parentitu následovně: Potomci 1 a 2 mohou být potomky uvedených rodičů.

2 Potomek 3 může být potomkem uvedené matky, ale nemůže být potomkem uvedeného otce. Potomek 4 nemůže být potomkem žádného z uvedených rodičů. Je jasné, že pouze DNA marker D5S2 se svými devíti alelami by pro spolehlivé testování parentity ovcí nestačil. Počet jedinců v české ovčí populaci je nesrovnatelně vyšší, než počet alel tohoto markeru, budou tudíž existovat zvířata nesoucí stejné alely, ačkoli zcela nepříbuzná. S tímto nedostatkem se vypořádáme tím, že analyzujeme a porovnáváme nikoli jeden, ale více různých mikrosatelitů. Soubor údajů o genotypu všech analyzovaných DNA markerů jedince se nazývá genetický profil. Porovnáním celých genetických profilů již lze parentitu u ovcí testovat s dostatečně vysokou spolehlivostí. Existují dva hlavní důvody, proč se mikrosatelity rychle ujaly jako DNA markery nejvhodnější pro testování parentity. Prvním je jejich vysoká variabilita ve srovnání s jinými typy DNA markerů (až desítky alel). Druhým je jejich relativně snadná analýza, urychlená navíc tím, že lze genotypovat více markerů najednou v rámci jednoho laboratorního procesu - tzv. multiplexování. Významnou organizací v oblasti testování parentity domácích zvířat je Mezinárodní společnost pro zvířecí genetiku (ISAG). Tato mezinárodní platforma laboratoří zabývajících se zvířecí genetikou mimo jiné vydává doporučení ohledně sestav markerů vhodných k testování parentity u různých druhů zvířat, sjednocuje nomenklaturu alel, což je nezbytné pro mezilaboratorní a mezinárodní srovnatelnost dat a výsledků, a pořádá mezilaboratorní porovnávací zkoušky. Parentita ovcí na SVÚ Jihlava Na SVÚ Jihlava je prováděno testování parentity plemenných beranů od roku Genetický profil ovcí stanovovaný na SVÚ Jihlava odpovídá sestavě dvanácti mikrosatelitních DNA markerů doporučených organizací ISAG. Jedná se o markery CSRD247, D5S2, INRA005, INRA006, INRA023, INRA063, INRA172, MAF065, MAF214, McM042, McM527 a OarFCB020. SVÚ Jihlava se také pravidelně účastní mezinárodních porovnávacích zkoušek pořádaných touto organizací, dosud vždy se 100% úspěšností. Odběr vzorků a žádanky Parentita ovcí na SVÚ Jihlava se odlišuje od ostatních běžných vyšetření tím, že se pro účel tohoto vyšetření neodebírají vzorky. Každému vyšetření parentity totiž musí předcházet jiné genetické vyšetření všech zúčastněných zvířat, a sice genotypizace (viz. Zpravodaj SCHOK 1/2016, str. 66), přičemž krve všech genotypovaných zvířat jsou poté na SVÚ Jihlava po několik let archivovány. Tyto krevní vzorky jsou následně dle potřeby využity pro účely parentity. S tím souvisí i další specifikum tohoto vyšetření, a sice že žádanky neposílají na SVÚ Jihlava sami chovatelé, ale přímo SCHOK. Výjimkou mohou být případy, kdy si chovatel přeje stanovit parentitu na svoje vlastní náklady. V těchto případech nemusí být na SVÚ Jihlava archivovány potřebné krve, které je pak třeba odebrat a doručit na SVÚ Jihlava i se žádankou od chovatele. Jelikož se tyto situace liší případ od případu, je doporučeno vždy předem kontaktovat laboratoř molekulární biologie SVÚ Jihlava a dohodnout konkrétní postup. Odběr krve je nutný také ve výjimečných případech, kdy krev nějakého ze zvířat není již na SVÚ Jihlava archivována, nebo je její kvalita natolik špatná, že ji nelze použít. V obou případech se jedná většinou o starší několikaleté vzorky rodičů. Absence krve v archivu SVÚ Jihlava, popř. její nedostatečná kvalita, je zjištěna až při samotném procesu vyšetřování parentity. Tyto situace tedy řeší SVÚ Jihlava dodatečně skrze SCHOK požadavkem na opakovaný odběr krve konkrétního zvířete. Extrakce DNA Prvním krokem každého molekulárně genetického vyšetření je extrakce DNA ze vzorku v dostatečném množství, maximální kvalitě a čistotě. Postup extrakce DNA z krevních vzorků ovcí pro účel stanovení parentity na SVÚ Jihlava je totožný jako pro účel genotypizace a čtenářům Zpravodaje byl představen již dříve (Zpravodaj SCHOK 1/2016, str. 66). Na konci tohoto procesu získáme čistý roztok celkové ovčí DNA připravený k analýze mikrosatelitů. Příprava DNA fragmentů - PCR Alely mikrosatelitů se od sebe odlišují svojí délkou, potřebujeme tedy nějaký způsob, jak jednotlivé mikrosatelity v celkové ovčí DNA vyhledat a jejich délku přesně určit. Toho docílíme tím, že z extrahované DNA připravíme krátké DNA fragmenty obsahující jednotlivé mikrosatelity a determinujeme pak délků těchto fragmentů. K jejich přípravě slouží tzv. polymerázová řetězová reakce (PCR). Metoda PCR je bezpochyby jednou z nejvýznamnějších technik používaných v molekulární diagnostice. Jedná se o biochemickou reakci, během níž dochází k opakovanému kopírování vybraného úseku DNA za vzniku až miliard identických DNA fragmentů - kopií. Konkrétní úsek DNA, který se má takto nakopírovat, je určen dvěma tzv. primery. Primer je krátký uměle nasyntetizovaný jednořetězcový fragment DNA (cca 20 nukleotidů), jehož sekvence je navržena tak, aby se vázal na jedno konkrétní místo v cílové DNA. Pro PCR potřebujeme vždy 2 různé primery, lze je nazvat levý a pravý, které nám svou vazbou na DNA ohraničí úsek, jenž má být kopírován. Kromě primerů a extrahované DNA jsou pro polymerázovou řetězovou reakci nezbytné ještě další komponenty, a sice speciální pufr zajištují v reakci správné chemické podmínky, dostatek volných nukleotidů jakožto stavebních kamenů pro syntézu nových DNA fragmentů a v neposlední řadě dostatek enzymu zvaného DNA polymeráza, který rozeznává primery navázané na DNA a s využitím dostupných nukleotidů provádí syntézu nových DNA fragmentů. Syntéza probíhá tak, že se jednotlivé nukleotidy jeden za druhým připojují k primerům, primery se tedy stávají součástí nově vzniklých DNA fragmentů. PCR je řetězová reakce, to znamená, že kopírování DNA probíhá v několika cyklech, přičemž fragmenty vzniklé v předchozím cyklu se stávají předlohou pro tvorbu nových identických fragmentů v dalším cyklu. Dochází tak k exponenciálnímu nárůstu počtu fragmentů až do řádově miliard kopií po cca 30 cyklech PCR. V praxi 63

3 se spíše nežli výraz kopírování DNA užívá pojem amplifikace DNA odkazující na to, že vybraný úsek DNA je při PCR mnohonásobně zmnožen. Zjednodušené schéma amplifikace DNA fragmentů během PCR ukazuje obr. 3. Obr. 3 Zjednodušené schéma amplifikace DNA fragmentů při PCR Amplifikovaný úsek DNA je při PCR vymezen dvěma primery. Primery se stávají součástí nově vznikajících DNA fragmentů (barevně zvýrazněno). Kopírování má exponenciální průběh - v každém cyklu vzniká dvojnásobek kopií oproti cyklu předchozímu až do cca kopií ve 30. cyklu. Při analýze mikrosatelitů jsou levý a pravý primer navrženy tak, aby svou vazbou na DNA ohraničovaly požadovaný mikrosatelit. K levému primeru je přitom uměle připojen tzv. fluorofor, což je molekula schopná vydávat světlo určité vlnové délky (tzv. fluorescence), které jsme schopni detekovat jako signál určité barvy. Přítomnost této signální molekuly je nezbytná pro detekci a rozlišení různých fragmentů v dalším kroku analýzy (viz dále). Každé zvíře nese vždy dvě alely mikrosatelitu. Jsou-li tyto alely shodné (zvíře je homozygot), vznikají amplifikací obou alel stejně dlouhé fragmenty značené stejným fluoroforem. Jsou-li alely rozdílné (zvíře je heterozygot), vznikají při PCR fragmenty značené stejným fluoroforem, ovšem dvou různých délek. Jak již bylo uvedeno, výhodou analýzy mikrosatelitů je tzv. multiplexování, tedy společná analýza více markerů najednou. Pro tento účel modifikujeme PCR tím, že do reakce přidáme několik dalších párů primerů pro amplifikaci dalších úseků DNA, v našem případě dalších mikrosatelitů. Takto modifikovaná PCR se nazývá multiplex-pcr. Použijeme přitom primery s rozdílnými fluorofory pro různé mikrosatelity. V jedné reakci se nám pak budou tvořit fragmenty DNA obsahující více různých mikrosatelitů vydávající signály různých barev. Obr. 4 ukazuje pro jednoduchost výsledek multiplex-pcr pouze dvou mikrosatelitů, běžně se však tímto způsobem v jedné reakci amplifikuje mikrosatelitů. Na SVÚ Jihlava jsou DNA fragmenty pro každý vzorek připravovány ve dvou multiplex-pcr (po devíti a šesti mikrosatelitech). Obr. 4 Výsledek multiplex-pcr dvou mikrosatelitů Testovaný jedinec v tomto příkladu je homozygot v jednom mikrosatelitu (alely jsou stejné - vlevo) a heterozygot ve druhém mikrosatelitu (alely jsou rozdílné - vpravo). Použijeme dva různé páry primerů, přičemž na levé primery jsou navázány různé fluorofory (modrý a zelený). Jelikož se primery stávají při PCR součástí nově vznikajících DNA fragmentů, získáme na konci multiplex-pcr fragmenty označené konkrétními barvami podle toho, k jakému mikrosatelitu náleží. Pro mikrosatelit v homozygotním stavu obdržíme pouze fragmenty identické délky, pro mikrosatelit v heterozygotním stavu budou vznikat fragmenty dvou různých délek. 64

4 Z uvedeného je zřejmé, že PCR, tím spíše pak multiplex- PCR, je reakce, které se účastní velké množství důležitých komponent. Ty se v reakci musí nacházet ve správných objemech a poměrech. Pro přesnou přípravu reakčních směsí multiplex-pcr je na SVÚ Jihlava využíván pipetovací automat epmotion 5075, představený čtenářům Zpravodaje již dříve (Zpravodaj SCHOK 1/2016, str. 67). Pro vlastní PCR se pak v molekulárně biologických laboratořích používají přístroje zvané termocyklery. Existuje spousta různých termocyklerů podle různých kritérií, jako je kapacita co do počtu vzorků, typ používaných zkumavek pro PCR, objem PCR reakcí a další. Multiplex-PCR na SVÚ Jihlava probíhá ve speciální obdélníkové plastové destičce, která obsahuje 96 jamek. V této destičce tedy může probíhat až 96 individuálních multiplex-pcr najednou. Termocyklerem používaným na SVÚ Jihlava pro multiplex-pcr v těchto destičkách je přístroj Veriti Thermal Cycler (obr. 5). Obr. 5 Termocykler Veriti a 96-jamková destička pro multiplex-pcr na SVÚ Jihlava Fragmentační analýza Na konci multiplex-pcr máme v každé jamce destičky směs různých DNA fragmentů značených různými fluorofory (barvami). Zbývá poslední krok, a sice určení příslušnosti fragmentů k jednotlivým markerům a přesné určení jejich délky v každém vzorku. Tento krok se nazývá fragmentační analýza. Podstatou fragmentační analýzy je metoda zvaná elektroforéza. Jedná se o další stěžejní metodu molekulární biologie, která je užívána k separaci biologických makromolekul, jako jsou proteiny, DNA a RNA. Při práci s biologickým materiálem totiž běžně získáváme komplexní roztoky představující směs molekul mnoha různých velikostí, tvarů, elektrických nábojů a dalších vlastností. Chceme-li takový roztok dále analyzovat, např. studovat jednu konkrétní makromolekulu, je nezbytné jednotlivé molekulární složky od sebe odseparovat. Jedním ze způsobů, jak to provést, je právě elektroforéza. V případě analýzy DNA pomocí elektroforézy využíváme toho, že páteř vlákna DNA je tvořena fosfátovými skupinami, které dávají DNA celkový záporný náboj. Pokud tedy roztok fragmentů DNA vložíme do elektrického pole, budou všechny fragmenty přitahovány ke kladně nabité elektrodě (anodě). Pokud jim navíc do cesty postavíme překážku v podobě nějakého porézního materiálu, budou se prodírat touto překážkou, přičemž kratší fragmenty budou migrovat rychleji (prodírají se snáze) a delší pomaleji. Dojde tak k separaci fragmentů DNA z původní směsi podle jejich celkové délky. Existuje více druhů a modifikací elektroforézy podle aplikovaných podmínek, typu separovaných molekul, použitého porézního materiálu a také podle technického provedení. Při analýze mikrosatelitů se jedná o tzv. kapilární elektroforézu. Zde dochází k separaci fragmentů DNA jejich migrací v tzv. kapiláře, což je úzká trubička (méně než půl milimetru v průměru, o délce řádově desítek cm) naplněná speciálním porézním materiálem, tzv. polymerem. Fragmentační analýza mikrosatelitů pak probíhá následovně. Na jeden konec kapiláry je aplikován vzorek (hotová multiplex-pcr, tedy směs fluorescenčně značených DNA fragmentů), na opačném konci kapiláry se nachází detektor fluorescenčního signálu a anodová elektroda. DNA fragmenty migrují polymerem celou délkou kapiláry směrem k anodě, přičemž se separují podle své délky. Separační proces je tak účinný, že dokáže odseparovat fragmenty lišící se délkou i o jediný nukleotid. Zaznamenaný fluorescenční signál z detektoru na konci kapiláry je vynášen do grafu. Průchod fragmentu detektorem je provázen chvilkovým zvýšením fluorescenčního signálu, který se v grafu projeví jako ostrý hrbol, tzv. pík. Kapilární elektroforézu můžeme ukončit v okamžiku, kdy detektorem projde nejdelší fragment přítomný ve vzorku. Pro celý proces kapilární elektroforézy jsou používány automatické přístroje zvané genetické analyzátory. Genetický analyzátor sám aplikuje vzorek do kapiláry, dle nastavených parametrů udržuje správnou teplotu a správné elektrické napětí v kapiláře, zaznamenává fluorescenční signál a data odesílá do připojeného počítače s příslušným softwarem. Po skončení elektroforézy jednoho vzorku stroj naplní kapiláru novým čistým polymerem ze zásobníku a pokračuje s dalším vzorkem. Vzorky (resp. hotové multiplex-pcr reakce) jsou do přístroje vloženy ve stejné plastové destičce, v jaké probíhala multiplex-pcr. Pro urychlení analýzy větších počtů vzorků jsou běžně používány analyzátory s více kapilárami. Existují např. stroje se 4, 8, 16, ale dokonce i s 96 kapilárami, kdy je vlastně analyzována celá destička (tedy 96 reakcí) najednou. Na SVÚ Jihlava slouží pro fragmentační analýzu dva genetické analyzátory: Genetický analyzátor 3130 se 4 kapilárami a Genetický analyzátor 3500 s 8 kapilárami (obr. 6). Obr. 6 Genetický analyzátor 3500 na SVÚ Jihlava 65

5 Vyhodnocení fragmentační analýzy Výstupem kapilární elektroforézy je tzv. elektroforeogram. Jedná se o graf fluorescenčních dat zaznamenaných detektorem genetického analyzátoru, kde osa X ukazuje uplynulý čas fragmentační analýzy a na ose Y je vynesena zaznamenaná fluorescence všech barev. Jak již bylo řečeno, průchod fragmentu detektorem se projeví jako pík určité barvy v elektroforeogramu. Pokud bychom např. provedli fragmentační analýzu jednoduché multiplex-pcr dvou mikrosatelitů z obr. 4, zaznamenali bychom jeden modrý pík (homozygot pro modře značený mikrosatelit) a dva zelené píky (heterozygot pro zeleně značený mikrosatelit). Podle barvy tedy poznáme konkrétní mikrosatelit a podle počtu píků (1 nebo 2) určíme homozygota nebo heterozygota. Krom toho ale potřebujeme také přesně určit, o jaké alely se jedná. K tomu potřebujeme znát přesnou délku detekovaných fragmentů. Proto před samotnou fragmentační analýzou přimícháme do hotové multiplex-pcr tzv. velikostní žebříček, což je komerční směs DNA fragmentů známých délek značených jedinečným fluoroforem. Podle rozmístění zaznamenaných píků tohoto žebříčku v elektroforeogramu pak můžeme dopočítat velikosti detekovaných fragmentů a tím jednotlivé alely mikrosatelitů identifikovat a pojmenovat. Všechny tyto úkony samozřejmě provádí speciální software. Obr. 7 (viz. barevná příloha) ukazuje celkový elektroforeogram multiplex-pcr se šesti mikrosatelity na SVÚ Jihlava. Pokud tento elektroforeogram rozložíme do jednotlivých barev, vidíme již vyhodnocené alely u všech markerů (obr. 8 viz. barevná příloha). Závěr vyšetření Vyhodnocením elektroforeogramů máme stanoveny genetické profily jednotlivých vzorků, resp. zvířat. Zbývá poslední krok, a sice jejich porovnání mezi potomky a rodiči. Pro tento účel importujeme hotové genetické profily v textově-číselné formě do laboratorního informačního systému SVÚ Jihlava. Zde máme připraveny porovnávací algoritmy, které nám vyhodnotí shodu, popř. neshodu vybraných genetických profilů mezi rodiči a potomky. Následuje už jen zaslání výsledků porovnání na SCHOK a vyřízení protokolu pro chovatele, příslušného veterináře a Krajskou veterinární správu. Slovník základních pojmů Alela: Jedna konkrétní forma (varianta) genu nebo DNA markeru. DNA (kyselina deoxyribonukleová): Organická makromolekula, která je nositelkou dědičné informace všech živých organismů. Tato molekula se až na výjimky nachází ve všech buňkách organismu. Jednotlivé organismy, druhy i jedinci v rámci téhož druhu se od sebe odlišují právě proto, že se liší jejich DNA. DNA marker: Konkrétní místo v DNA, ve kterém existuje populační variabilita. Dva jedinci téhož druhu se tedy v tomto místě DNA mohou, ale také nemusí vzájemně lišit. Fluorofor: Molekula schopná fluorescence, tedy absorpce a emise světla určité vlnové délky. Fluorofory se v molekulární biologii užívají mimo jiné ke značení amplikonů v multiplex-pcr pro jejich následnou detekci při fragmentační analýze. Fragmentační analýza: Analýza fragmentů nukleových kyselin, jako je DNA. Slouží k určení, kolik různých fragmentů DNA se nachází v analyzované směsi včetně determinace jejich délky. Genetický profil: Sada údajů v podobě čísel, která představuje jedinečnou skladbu DNA daného jedince ve vybraných DNA markerech. S výjimkou jednovaječných dvojčat neexistují dva jedinci se shodným genetickým profilem (za předpokladu vhodně zvolené sestavy DNA markerů). Genetický profil je neměnný po celý život jedince. Genotyp: Genetická (lze říci též alelová) skladba jedince v konkrétním místě jeho DNA, např. v genu či v DNA markeru. ISAG: (International Society for Animal Genetics, Mezinárodní společnost pro zvířecí genetiku je organizace poskytující komunikační a informační základnu pro laboratoře zabývající se zvířecí genetikou. Vydává doporučení ke genetickému profilování zvířat a pořádá mezilaboratorní testy. Kapilární elektroforéza: Postup separace makromolekul ze směsi na principu jejich odlišné mobility v elektrickém poli za použití tenké kapiláry naplněné speciálním polymerem. Je podstatou fragmentační analýzy DNA. Mikrosatelit: DNA marker, jehož populační variabilita spočívá v různém počtu tandemových opakování krátkých sekvenčních motivů DNA, tzv. repetic (většinou 2 6 nukleotidů). Alely mikrosatelitu se pak od sebe odlišují svojí délkou ve šroubovici DNA. Multiplex-PCR: Modifikace PCR spočívající v tom, že není amplifikován pouze jeden, ale více vybraných úseků DNA v jedné reakci. Principielně toho docílíme přidáním dalších primerů do PCR reakce. Nukleotid: Základní stavební kámen nukleových kyselin, jako je DNA. DNA je tvořena čtyřmi různými nukleotidy: A (adenin), G (guanin), C (cytosin), T (tymin). Ověření příbuznosti: Úkon, kdy zjišťujeme, zda vybraní jedinci mohou, či nemohou být v předpokládaném příbuzenském poměru. Děje se tak porovnáním genetických profilů těchto jedinců. PCR: Polymerázová řetězová reakce (z anglického Polymerase Chain Reaction). Biochemická reakce, při níž dochází k mnohonásobnému (řádově až miliardovému) zmnožení neboli amplifikaci přesně specifikovaného úseku DNA. Amplifikovaný úsek je určen a vymezen dvěma tzv. primery. Primer: Krátký jednořetězec DNA o délce cca 20 nukleotidů, jehož sekvence je navržena k vazbě na jedno konkrétní místo v DNA. Dva primery určují a ohraničují amplifikovaný úsek DNA při PCR. Stanovení parentity: (z latinského parentēs = rodiče) Ověření příbuznosti jedince s oběma jeho předpokládanými rodiči. Stanovení paternity: (z latinského pater = otec) Ověření příbuznosti jedince s jeho předpokládaným otcem. Stanovení maternity: (z latinského mater = matka) Ověření příbuznosti jedince s jeho předpokládanou matkou. STR a SSR: (popř. STR marker a SSR marker) V genetice a molekulární biologii často používaná synonyma pro mikrosatelit (z anglického Short Tandem Repeat a Simple Sequence Repeat). text a foto: Mgr. Ondřej Štěpánek, Ph.D. Státní veterinární ústav Jihlava 66