Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat

Transkript

1 Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Genetické markery ve studiu genetické diverzity v populacích hospodářských zvířat Bakalářská práce Vedoucí práce: doc. Ing. Tomáš Urban, Ph.D. Vypracovala: Martina Kosťuková Brno 2009

2 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma "Genetické markery ve studiu genetické diverzity v populacích hospodářských zvířat" vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana AF MZLU v Brně. V Brně, dne Podpis

3 PODĚKOVÁNÍ Předem mé bakalářské práce bych chtěla poděkovat doc. Ing. Tomáši Urbanovi, Ph.D. za odborné vedení a všestrannou pomoc, kterou mi v průběhu zpracování této práce poskytoval. Dále mé poděkovaní patří rodičům za finanční a také morální pomoc při studiu a nemalé díky patří mému příteli.

4 Abstrakta Tato bakalářská práce se zabývá problematikou genetických markerů u hospodářských zvířat a jejich použitím ve výzkumu a plemenářství. Důraz je přitom kladen především na různé typy genetických markerů a jejich výhody či nevýhody pro výzkum daných vlastností zvířat. Každý z diskutovaných typů genetických markerů má své specifické vlastnosti, jež jej do jisté míry předurčují ke konkrétnímu využití. Dalším stěžejním bodem práce jsou genetické procesy, jež mohou sehrát významnou úlohu při utváření genetického fondu zkoumaných populacích zvířat a vše, co s nimi souvisí. Jedná se zejména o procesy ovlivňující selekci a frekvenci různých alel v populaci a o techniky, jimiž lze tyto procesy sledovat a na jejich základě poté určit další možný vývoj situace v populaci, nebo naopak pátrat, jaká byla situace před určitým počtem generací. V závěru práce je nabídnuto několik možností provedení analýzy genetické informace pomocí počítačového softwaru. V této kapitole je několik základních faktů o fylogenetickém programu Arlequin Klíčová slova: populace, polymorfismus, genetický marker, diverzita, DNA Abstract This work is focused on the topic of genetic markers in livestock and its use in research and breeding. There is an emphasis on describing various types on genetic markers and discussing their advantages and/or disadvantages for studying various livestock traits. Each of the mentioned types of genetic markers disposes with its specific attributes that make it more or less useful for a concrete usage. The next hinge of this work is represented by processes that can play a significant role in modifying genetic pool of a population and their eventual features. These are mainly factors which adjust selection and allele frequency in the population and the technics, by which these processes can be watched. This gives us an opportunity to estimate further development of a population or to explore how was the situation a certain number of populations before the current state. At the end of this work, there is a proposal of a few types of genetic information analysis performed with computer software. In this chapter, there are a few basic facts about the software Arlequin Key words: populations, polymorphism, genetic marker, diversity, DNA

5 Obsah: 1 Úvod Cíl práce Evoluce DNA Genetický drift Mutace Fixace genů Substituční rychlost Generační doba Molekulární fylogenetika Polymorfismy v evoluci Polymorfismus Genetické markery a metody jejich identifikace Zkoumání kvantitativních znaků vede k objevu tří typů genetických markerů Genetické markery 1. typu Genetické markery 2. typu Genetické markery 3. typu Molekulární metody vyhledávání genetických markerů Metody detekce molekulárních markerů založené na restrikčním štěpení a hybridizaci Metody detekce molekulárních markerů založené na metodě PCR Metody detekce molekulárních markerů založené na různých kombinacích restrikčního štěpení, hybridizace a amplifikace Genetická variabilita Míra genetické variace Typy polymorfismu Metody analýzy genetické variability Frekvence alely Hardy-Weinbergova rovnováha Heterozygotnost Wrightovy F statistiky Genový tok Efektivní počet alel Shannonův index PIC - polymorfní informační systém Genetické distance Výběr vhodné metody analýzy Software pro populační genovou analýzu Software pro analýzy nukleotidových sekvencí Software pro analýzy variability alel a genotypů Fylogenetický software PHYLIP Arlequin

6 8 Závěr Seznam literatury Seznam použitých zkratek... 56

7 1 ÚVOD Jednotlivá plemena hospodářských zvířat se vyvíjela po mnoho staletí pod vlivem přírodního a lidského výběru. Každý z druhů byl přizpůsobován tak, aby byl schopen přežívat v různých podmínkách a vyhovoval potřebám člověka. Z tohoto podnětu se začalo zjišťovat, jakým způsobem funguje genetický přenos informací z rodiče na potomka. V posledním desetiletí stoupá zájem o detekci genů a genomických regionů jak u člověka, tak i u jiných organismů. Hospodářská zvířata jsou předmětem studií díky existenci divokých předků a kříženců, na nichž lze sledovat značné rozdíly v morfologii, fyziologii a vlastnostech. Domestikované formy od sebe nebyly odděleny jen mnoha tisíci kilometry, ale také mnoha tisíci let soustavného šlechtění a tudíž začaly vznikat formy velmi rozdílné. Ani jejich předkové nepatří mezi vyhynulé živočišné druhy, ale naopak existují i v současnosti. Vzhledem k tomu se u těchto živočichů nabízí jedinečná příležitost studovat savčí evoluční historii a definovat selekční prvky vyplývající z domestikace a přírodního výběru. Pokud je populace geograficky rozšířena přes více ekosystémů nebo nik, je nucena se na jednotlivá prostředí adaptovat, což může vést k diferenciaci genů. Diferencovaná populace je značně dynamická může přežívat, vyhynout, fúzovat s rodičovskou populací, nebo se od ní čím dál více diferencovat do té míry, že se stane reprodukčně izolovanou jednotkou, která vytvoří nový druh. Jendá se o přirozenou selekci, v zootechnické praxi se setkáváme se selekcí umělou, kdy řídící jednotkou nejsou přírodní vlivy, nýbrž je hlavním iniciátorem člověk. Cíleným křížením může značně ovlivnit budoucí využití a znaky užitkovosti jednotlivých druhů hospodářských zvířat. 7

8 2 CÍL PRÁCE Cílem této bakalářské práce je studium proměnlivosti genetických markerů ve vztahu ke genetické diverzitě v populacích hospodářských zvířat. Dílčí cíle jsou: - studovat vlivy působící na průběh evoluce deoxirybonukleové kyseliny (DNA), - seznámit se s různými typy genetických markerů, metodami jejich identifikace a možnostmi jejich použití pro další výzkum, - popsat parametry genetické variability a diverzity a statistické metody jejich stanovení, - popsat využití a funkce softwarů pro genovou analýzu populací. 8

9 3 EVOLUCE DNA Většina biologicky důležitých informací (fenotyp) organismu je zapsána v genetické informaci jedince. Základem je nukleová kyselina, která kóduje sekvenci DNA. Vývoj fenotypu organismu je úzce spjat s evolučními změnami na nukleové kyselině. Každá změna na úrovni organismu tudíž souvisí se změnou nukleové kyseliny. Evoluce fenotypu a evoluce nukleové kyseliny probíhají souběžně a jsou na sobě závislé, avšak mechanismy, ke kterým v průběhu přeměny dochází, se liší. Dlouho byl všeobecně uznáván názor, že silami řídícími evoluci jsou zejména domestikace a přírodní výběr. Je faktem, že domestikovaná prasata se vyskytují v poměrně širokém rozpětí přírodních podmínek. Pro rozeznávání jednotlivých druhů prasat jsou používány zejména tyto znaky: morfologie lebky a zubů, vnější proporce těla, barva a vzory na srsti, biochemické a molekulární polymorfizmy, ekologie a chování, reprodukční izolace (CHEN et al., 2007). Evoluční historie zahrnuje následující dva procesy; transformaci a rozdělení jednotlivých vývojových linií, což je zárukou zvyšování diverzity v populacích a druzích. Mutace, migrace, selekce a drift mění kvantity jednotlivých alel jak u jedinců tak i v populacích, čímž zajišťují divergenci a formování jednotlivých druhů. Tento proces však nezávisí jen na změně frekventovaností alel, ale též na ekologické diverzitě Genetický drift Evoluce jak biologická tak evoluce DNA podléhá do jisté míry náhodě a její vliv a utváření nelze dopředu zcela odhadnout. Některé události však lze do jisté míry zjistit a dále popsat. Jedním z nejdůležitějších přírodních dějů je genetický drift. Základní principy působení genetického driftu popsal ve svém evolučním díle FISHER (1958) a o rozvoj této teorie se zasloužili vědci WRIGHT, KIMURA a OHTA. Genetickým driftem (nebo též genetickým posunem) jsou míněny náhodné posuny ve frekvenci jednotlivých alel v genofondu určité populace (FLEGR, 2005). Posuny alel v genofondu nejsou způsobeny rozdíly v selekčních hodnotách. Jejich existence je závislá na volné kombinaci různých alel v genotypu a zastoupení jedinců v generaci. Přechod a zastoupení jednotlivých alel z generace na generaci závisí na náhodě a na zastoupení alel v předchozí generaci. 9

10 3. 2 Mutace Prase je typickým příkladem domestikovaného zvířete, jehož mnoho poddruhů je od sebe evolucí přehledně odděleno. Souběžně s domestikovanými druhy prasat existují také zástupci volně žijící a z tohoto důvodu jsou prasata považována za jeden z nejvhodnějších živočišných druhů pro posuzování dědičných mutací a určování selektivních procesů. Dědičné mutace jsou důležité z několika důvodů: 1) pravděpodobnost dědičnosti alely je rovna frekvenci jejího výskytu, 2) pozitivní selekce má za následek regiony se sníženou heterozygotností a nadbytkem odvozených alel (CHEN et al., 2007). Při mutacích dochází ke změnám ve struktuře genetického materiálu; jsou tudíž jedním z mála zdrojů variability v populacích. Bez existence mutace by se biologická evoluce pravděpodobně zastavila. Stopnutí evolučních změn na organismu by mělo za následek vyhynutí neadaptibilních organismů (FLEGR, 2005). Nejsou-li brány v úvahu adaptivní mutace, lze všechny mutace klasifikovat buď jako spontánní, nebo indukované. Tyto kategorie do určité míry překrývají, spontánní mutace však nastávají přirozenou cestou a s jejich výskytem není spjat žádný konkrétní faktor. Jsou tedy považovány za náhodné změny nukleotidových sekvencí v genech. Většina takových mutací je spjata s běžnými chemickými procesy měnícími strukturu nebo sled dusíkatých bází, jež jsou součástí existujících genů. Spontánní mutace se často objevují při enzymatické replikaci DNA. Případná chyba ve genetickém kódu může mít vliv na aminokyselinové složení výsledného proteinu. Nachází-li si pozměněná aminokyselina v části proteinu odpovědné za jeho strukturu či biochemickou aktivitu, může být pozměněna i funkce proteinu. Mutace indukované naopak vznikají vlivem či přímo působením důležitého faktoru. Všeobecně uznávaným faktem je, že jakýkoliv přirozený fenomén, jenž zvýší biochemickou aktivitu organismu, je schopen vyvolat (indukovat) mutaci. Například radiace z kosmických a minerálních zdrojů a sluneční ultrafialové (UV) záření jsou energetickými zdroji, jimž jsou organismy běžně vystavovány a zároveň jsou to faktory, které jsou potenciálními původci mutací. Prvním důkazem indukované mutace byl objev, že rentgenové paprsky vyvolávají mutaci u Drosophily (HERMANN, 1972). Spolu s různými formami záření je známo také mnoho chemikálií, jež jsou považovány za mutagenní. 10

11 Mutace lze dělit nejen dle příčiny jejich vzniku, ale také na základě jejich fenotypových projevů. Problémem je však to, že jedna mutace může splňovat podstatu více kategorií. Nejsnáze pozorovatelnými mutacemi jsou takové, jež nějakým způsobem ovlivňují morfologii organismu; tedy mutace, jejichž odchylky jsou pozorovatelné na základě rozdílů oproti fenotypu divokého typu. Do této kategorie patří například Mendelova pozorování a také mnoho experimentů prováděných na Drosophilách, neboť obojí se zakládá na sledování morfologických změn. Další rozsáhlou skupinou mutací jsou takové, jež vykazují fenotypové změny výživy nebo biochemické aktivity. U bakterií a hub je typickou změnou výživy neschopnost syntetizovat některý protein nebo vitamin. U prasat jsou takovými mutacemi hemofilie a anémie. Tyto mutace sice nejsou na první pohled rozeznatelné a nemusí ovlivňovat morfologické znaky, ale často mají zásadní vliv na prosperitu a přežívání daného organismu. Třetí kategorie mutací zahrnuje ty, jež nějakým způsobem ovlivňují vzorce chování daného organismu (páření, cirkadiánní rytmy). Primární efekt těchto behaviorálních mutací je často obtížné rozpoznat. Další typ mutací může mít efekt na genovou regulaci. Příkladem je lac operon (regulační gen), jenž produkuje molekuly ovlivňující transkripci dalších genů. Regulační mutace mohou také narušit normální procesy tím, že permanentně aktivují či deaktivují jakýkoliv gen. Tento typ mutací však není doposud dostatečně prozkoumán (KLUG, CUMMINGS, 2003) Mutace dále dělíme podle biologické zdatnosti jejich nositele, toto rozdělení je však relativní, neboť v prostředí, kde je daná mutace za určité situace negativní, může být za podmínek jiných neutrální. Dle vlivu na fitness nositelského organismu rozlišujeme tyto druhy mutací: pozitivní, jež jsou výhodné a užitečné tím, že zvyšují biologickou zdatnost svého nositele, dále pak mutace negativní, které jsou pro organismus škodlivé a snižují jeho biologickou zdatnost, a do třetice mutace selekčně neutrální, jež na nositele nemají vliv. Nutno podotknout ještě jednu skupinu a to mutace mírně negativní. U tohoto druhu mutací je biologická zdatnost záporná, ale vliv na nositele je velmi slabý. Nejvíce se vyskytují mutace selekčně neutrální a mírně negativní; ty se žádným výrazným způsobem neprojevují na fenotypu organismu a tudíž neznevýhodňují jedince z hlediska přírodního výběru. Neutrální mutace vznikají v jednotlivých úsecích DNA opakovaně v důsledku mutačního tlaku. Postupně pak ale zanikají působením 11

12 genetického driftu. Negativních mutací se vyskytuje více, než mutací pozitivních, neboť během dlouhé biologické evoluce byla funkce pozitivních mutací postupně zlepšována působením přirozeného výběru. Je však všeobecným předpokladem, že funkce žádné molekuly není natolik optimalizovaná, aby se nedala mutací více vylepšit. Odhaduje se, že 30-70% všech savčích genů prochází sestřihem (MODREK, LEE, 2003). Původ těchto sestřihů bývá přisuzován evolučnímu získání či naopak ztrátě exonů z genomu (THANARAJ et al., 2003). Konkrétní podoba sestřihu obvykle závisí na vývojovém stádiu organismu, konkrétní tkáni, případně fázi nemoci (THANARAJ et al., 2004). O sestřihových mutacích se dlouho hovořilo jako o možných zdrojích mnoha lidských nemocí (KRAWCZAK et al., 1992). Později bylo na základě náchylnosti lidských genů k nemocem, délce jejich kódujících oblastí a počtu intronů odhadnuto, že zhruba 60% všech dědičných chorob způsobených mutací připadá právě na alternativní sestřih. Tento fakt činí ze sestřihu jednoznačně nejčastější příčinu dědičných nemocí (LOPEZ-BIGAS et al., 2005). Přestože důležitost sestřihu pro různé biologické procesy jako jsou určení pohlaví (LOPEZ, 1998) a apoptóza je známa již po mnoho let, teprve genomické metody odhalily také jeho nenahraditelnou roli v genové regulaci (MODREK, LEE, 2002). Sekvenování genomu pak umožnilo zkoumat evoluční dopady sestřihu (XING, LEE, 2006) Fixace genů V průběhu evoluce byly jednotlivé geny důkladně zkoušeny a při zjištění vhodnosti pro organismus následně fixovány. Přírodní výběr dává průchod takovým genům, které jsou pro organismus užitečné a geny s nevhodným uzpůsobením nechá zahynout. K fixaci vhodných genů může dojít rychlým evolučním tahem, ale i pomalým genetickým driftem. Neutrální mutace je možno fixovat evolučním svezením, neboť se v populacích rozšiřují jen díky tomu, že se nalézají v blízkosti mutací pozitivních. Tím dochází k fixaci na tento gen a následně i k předávání z generace na generaci. Toto funguje jen u organismů rozmnožujících se pohlavně. Účinnost genetického draftu je tudíž nepřímo úměrná pravděpodobnosti rekombinace v úseku mezi neutrální a pozitivní mutací, tedy přímo úměrná síle genové vazby mezi příslušnými lokusy. Rychlost fixací mutací v dané pozici úseku DNA se nazývá substituční rychlost. Vyjadřuje se jako počet fixovaných mutací v určité poloze za jeden rok. Závisí na mutační rychlosti v daném místě, na intenzitě a směru selekce. Nezávisí na velikosti 12

13 populace, neboť při zvětšování skupiny se zároveň zvětšuje počet mutací a tím se zvyšuje hodnota mutační rychlosti, zároveň s tím se však snižuje možnost fixace nově vzniklé mutace genetickým driftem. V případě neutrálních mutací se substituční rychlost rovná mutační rychlosti, v jiném případě tyto dvě hodnoty stejné nejsou. Mutační rychlost je popisována jako množství mutací vznikajících v dané pozici za časovou jednotku u všech členů populace a také závisí na přesnosti replikace, účinnosti reparačních procesů, intenzitě působení mutagenů a mutabilitě sekvenčního motivu a dané pozici sekvence DNA (FLEGR, 2005) Substituční rychlost Intenzita a charakter selekce v daném úseku genu výrazně ovlivňují substituční rychlost. Substituční rychlosti jednotlivých genů téhož organismu se výrazně liší a to dokonce v rozmezí několika řádů. Nejmarkantnější rozdíly v rychlosti lze nalézt u substitučních rychlostí nesynonymních mutací, naopak u synonymních mutací se substituční rychlostí liší méně. Tento jev se vyskytuje proto, že rychlost a pravděpodobnost fixace nesynonymní mutace tj. mutace, která vede ke změně primární struktury kódovaného proteinu, je určována intenzitou selekčních tlaků, hrajících roli v evoluci daného genu. Tyto selekční tlaky jsou pro různé geny výrazně odlišné ( FLEGR, 2005). Je-li jedinec vystaven selekčnímu tlaku, obvykle to vyústí ve změnu genetického základu populace (NIELSEN, 2005). Nositelé výhodnějšího genotypu budou postupně potlačovat ostatní členy populace, což povede k fixaci alel prospěšných a zároveň eliminaci těch škodlivých. K identifikaci genů a genových toků bývají používány zejména dva postupy; prvním je použití kandidátního genu, což lze označit za genovou selekci založenou na metodách srovnávání funkcí genu. Druhá metoda zkoumá celý genom a zjišťuje, které z jeho oblastí jsou selekčními faktory. Děje se tak za pomoci asociace genotypu s fenotypem, tj. promítnutí se konkrétního genu do konkrétní vlastnosti (CHEN et al., 2007). Rychlosti fixace nesynonymních a synonymních mutací vykazují silnou pozitivní korelaci. Jejím zdrojem je především genetický draft nebo též evoluční svezení se. Díky existenci tohoto procesu se mutace neutrální fixují v daném genu, nebo jsou naopak potlačeny spolu s mutacemi selekčně významnými (BRAVERMAN et al., 1995, CHARLE, GUTTMAN, 1996). Stane-li se gen předmětem selekce, ať už pozitivní (směr k evoluční změně, fixace nových mutací), nebo negativní (směrem k evoluční stálosti, eliminace většiny mutací), změní se u něj rychlost fixace selekčně 13

14 významných i neutrálních mutací. Z tohoto důvodu se musíme při analýze genů zaměřit na takové, jež v minulosti neprodělaly změny selekčních tlaků a to i v případě, že pracujeme pouze se znaky selekčně neutrálními. Za povšimnutí stojí, že přesto, že mezi substituční rychlostí synonymních a nesynonymních mutací u jednotlivých genů existuje závislost, rychlost kumulace neutrálních mutací v genomu nemá přímý vliv na rychlost anagenetického vývoje druhu. K radikální změně substituční rychlosti může dojít, začne-li produkt některého genu plnit v organismu novou funkci, nebo dojde-li k duplikaci tohoto genu a organismus tak má v genomu dvě jeho kopie. V těchto případech může dojít k významné změně intenzity selekce, jíž je gen vystaven, což může vyústit ve změnu substituční rychlosti v daném úseku DNA. Studie provedené na pekařské kvasince Saccharomyces cerevisiae prokázala, že geny, jejichž absence má malý vliv na životaschopnost organismu, vykazují větší substituční rychlost (HIRSH, FRASER, 2001). Pro analýzu je všeobecně vhodné zvolit takový úsek genu, který u všech taxonů plní tutéž funkci a během evoluce byl podroben totožným selekčním tlakům. Z tohoto důvodu se hojně využívají geny pro proteiny replikačního, transkripčního nebo translačního aparátu. Vzhledem k tomu, že genetický draft je schopen ovlivnit v jednom místě chromozomu fixaci selekčně významných i neutrálních mutací v přilehlých oblastech, může mít změna funkce jednoho genu podstatný vliv na substituční rychlost v sousedních sekvencích DNA. Jedinou účinnou možností pro datování kladu genetických událostí je tedy použití většího počtu genů nezávislých jak funkčně tak i z hlediska genové vazby. Jedním z velmi důležitých genetických faktorů ovlivňujících substituční rychlost je intenzita genetických rekombinací. V úsecích genomu, kde dochází ke snížené četnosti rekombinace, je větší část geneticky neutrálních mutací eliminována společně s negativními mutacemi tzv. selekcí na pozadí, naopak menší část neutrálních mutací je fixována spolu s pozitivními mutacemi tzv. selekčním vymetením, které je součástí genetického draftu. Z toho vyplývá, že v oblastech genomu s nízkou frekvencí rekombinací je substituční rychlost zvýšená a vliv selekčního vymetení převažuje nad vlivem selekce na pozadí (AQUADRO, BEGUN, KINDAHL, 1994). 14

15 3. 5 Generační doba Převážná část mutací probíhá v průběhu buněčného dělení, délku generační doby však negativně ovlivňuje mutační rychlost. Z toho vyplývá, že u organismů s delší generační dobou dojde během života k přibližně stejnému počtu buněčných dělení jako u organismů s generační dobou o několik řádů kratší. Z tohoto důvodu by měl být počet fixovaných neutrálních mutací zhruba konstantní pouze tehdy, je-li počet generačních dob daného druhu podobný (OTHA, 1995). KIMURA (1993) však ve svém díle uvádí, že pro nesynonymní mutace se efekt generační doby uplatňuje mnohem méně a počty fixovaných mutací jsou spíše úměrné absolutnímu času. Je obtížné definovat přesný čas vzniku nového druhu. Druh je skupinou (potenciálně) vzájemně se křížících populací, jež jsou v přírodě reprodukčně izolovány od ostatních takových skupin. U sexuálně se reprodukujících organismů je ke vzniku nového druhu třeba, aby původní genový pool byl rozdělen na nejméně dva oddělené genové pooly. Dalšími projevy odlišení se druhu bývají morfologické a fyziologické změny a též adaptace, tyto jevy však nejsou podmínkou vzniku nového druhu. Protože je divergence druhů a populací provázena genetickou diferenciací, je možné použít k rekonstrukci evoluční historie genetické šablony. Na základě dat získaných výzkumem genetické struktury populací a jejich divergence je možné odpovědět na otázky položené prve ( KLUG, CUMINGS, 2003) 3. 6 Molekulární fylogenetika Fylogeneze se zabývá studiem vzniku a vývoje jednotlivých vývojových linií, snaží se rekonstruovat průběh kladogeneze a brát v úvahu anagenezi. Fylogenetika se tudíž zabývá historií evoluce života na Zemi. Pomocí fylogenetických studií lze rekonstruovat rodopisné vazby mezi jednotlivými druhy a také určit dobu, před níž organismy naposledy sdílely společného předka, tj. před níž došlo k divergenci. (CHEN et al., 2007) Molekulární fylogenetika zkoumá molekulární znaky molekulárně biologickými metodami a byla původně vyvinuta pro biologické obory jako je biochemie, fyziologie aj. Poznatky a data nasbíraná pomocí molekulárně fylogenetických metod je možné použít pro výzkum genetické struktury populace, její dynamiky a rozmnožovacího systému. 15

16 Při výzkumu molekulárně biologických znaků nejsme omezováni výběrem dat, neboť výběr úseku DNA není omezen. Limitováni jsme pouze množstvím finančních prostředků a také času, který může být do výzkumu investován. Neposkytne-li nám analýza dostatečné množství informací může být pokus opakován či porovnáván s daty nasbíranými s analýz jiných, ale vždy stejného úseku DNA. Fylogenezi lze porovnávat ze 2 hledisek; metodou klasickou a metodou molekulárně biologickou. Zatímco metody klasické se zabývají vnějšími člověku viditelnými znaky na organismu (utváření končetin různých druhů), molekulárně biologické metody se zabývají znaky na úrovni DNA a proto podávají komplexnější informace o daném problému. U metod klasických je třeba hovořit o porovnávání na základě subjektivního hodnocení, neboť je velmi často nesnadné rozhodnout např. o příbuznosti daných druhů. U molekulárně biologických metod je rozhodováno na základě dat získaných ze sekvenátorů či jiných přístrojů, které se využívají pro zjišťování genetických znaků. Tyto výsledky jsou vyhodnocovány pomocí matematického algoritmu, jedinou možností subjektivného ovlivnění výsledku je tedy výběr správného algoritmu pro daný případ. Molekulární znaky zjišťované na základě DNA mají kvalitativní charakter. Genetická informace je zapsaná v digitální formě. Může se jakkoli převádět do alfanumerických znaků, nedochází ke skreslení takto získané informace. Tyto informace pak lze porovnávat se zdánlivě nepříbuznými druhy a na základě provedeného srovnání je pak možno dospět k hledané odpovědi. SSR markery jsou užívány zejména pro fylogenetické studie a měření rozdílů v jednotlivých druzích. Pro své neutrální vlastnosti jsou však nevhodné pro objasňování změn fenotypu způsobených selekcí. Za tímto účelem jsou prováděny fylogenetické studie zaměřené na hodnocení genetické jedinečnosti. Fylogenetickou analýzou druhu lze určit původ a historii domestikovaných prasat. Domestikace prasat proběhla nezávisle na sobě u několika poddruhů eurasijských prasat, u nichž také mohlo v osmnáctém a devatenáctém dojít ke křížení (DARWIN, 1868, JONES, 1998). Při taxonomických studiích klasických znaků se vyskytuje zásadní problém; konvergentní a paralelní evoluce. Konvergentní znaky jsou takové, jež vznikly u nepříbuzných druhů pomocí selekčních tlaků a v průběhu času se vytvoří obdobné formy znaků. U paralelní evoluce se objevují dva druhy, jež si jsou na počátku podobné a sdílely velké množství původních tzv. pleziomorfních znaků. Působením podobných 16

17 selekčních tlaků se u těchto dvou podobných druhů vytvoří stejné formy znaků, různé od pleziomorfních forem znaků. Vzhledem k přítomnosti stejných nezávisle vzniklých znaků konvergentní či paralelní evolucí může být taxon zařazen do chybné či jiné skupiny. Takto vzniklá skupina může být vytvořena uměle, neboť v ní mohou chybět plezimorfní formy znaků. V případě molekulárně biologických metod je možno tyto obavy z chybného zařazení taxonu vypustit. Molekulárně biologické metody využívají ke studiu selekčně neutrální mutace. Sdílení stejné životní strategie či životního prostředí se neprojeví na molekulární úrovni fixace stejných neutrálních mutací. Míra sdílení molekulárně biologických znaků u dvou druhů přímo odráží vzájemnou příbuznost daných druhů. Není však vyloučeno, že může dojít ke vzniku selekčně neutrálních znaků u dvou nepříbuzných druhů. Avšak při použití velkého množství dat, které molekulárně biologické metody využívají, se vliv této náhody eliminuje natolik, že v podstatě vylučuje jakékoli nesprávné zařazení. Aby bylo v budoucnu možno splňovat požadavky zemědělství a potravinářského průmyslu, je třeba konzervovat genetické zdroje. Za tímto účelem jsou prováděny fylogenetické studie zaměřené na hodnocení genetické jedinečnosti každého z druhů prasat. Ze získaných dat by měl být ustanoven plán pro zachování druhů prasat, který bude brát v potaz zejména následující kritéria: genetickou jedinečnost daného druhu a jeho stupeň ohrožení (RUANE, 1999). Fylogenetické studie používající genové markery nebo jednonukleodtidové polymorfismy (SNP) mající spojitost s konkrétními vlastnostmi jsou důležité pro zachování jednotlivých druhů prasat, eventuelně pro vytváření druhů nových, které budou splňovat požadavky trhu. Také mitochondriální DNA (mtdna), jež je děděna pouze z matky na potomka, může poskytovat užitečné informace o mateřských liniích v každé populaci. Naproti tomu variabilní sekvence na chromozomu Y umožňují zjistit historii druhu a jeho fylogenetický původ (BRUFORD et al., 2003). Získávání molekulárně biologických dat je náročnější na prostředky, na vybavení laboratoří, na provoz laboratoře. Pro některé typy analýz tyto metody nejsou zcela vhodné a biologové budou nuceni neustále využívat metod klasických. 17

18 3. 7 Polymorfismy v evoluci Jednotliví zástupci stejného druhu se vzájemně liší výskytem různých nukleotidů v mnoha pozicích svých genů, proto v genofondu všech druhů organismu existuje velké množství polymorfismů. Většina takovýchto polymorfismů se v genofondu populací vyskytuje jen proto, že jsou selekčně neutrální. Selekčně neutrální znaky mohou v populaci přetrvávat po velmi dlouhou dobu; za takovéto znaky považujeme mutace v těch částech genomu, které nekódují žádný protein, dále v intronech a synonymní mutace. Protože aminokyselina se může skládat z různých tripletů, nemusí nutně záměna jednoho nukleotidu vést k záměně celé aminokyseliny v kódovaném proteinu. Synonymní mutace tak nutně nemusí změnit aminokyselinu v sekvenci příslušného proteinu, ale může mít dopad na koncentraci v aminokyselin v genomu organismů. V malých populacích najdeme větší množství polymorfismů, než v populacích větších. Tato skutečnost je dána tím, že v malých populacích dojde ke stejnému počtu mutací jako u populací s větším výskytem jedinců, ale většina mutací se zařadí do kategorie selekčně neutrálních. U velkých populací naopak dojde k přechodu takovýchto mutací do mutací selekčně pozitivních nebo převážně negativních. Proto jsou obvykle velmi rychle eliminovány (NEVO et al., 1994, TAKAHATA, 1996). Závislost množství vnitropopulačních polymorfismů na velikosti populace je mnohem menší, než se předpokládá u genetického draftu. Největší množství neutrálních polymorfismů se v genomu nachází v oblastech s nejvyšší frekvencí genetické rekombinace (TAKAHATA, 1996). Vznik genetických rekombinací je provázen vznikem určitých typů mutací. Zvýšení mutační rychlosti nemá vliv na vznik daného jevu. Avšak v případě mezidruhové diverzity genetická rekombinace ovlivňována je, což je vždy důsledkem některého z typů genetického draftu, tedy buď selekce na pozadí, nebo selekčního vymetení. Pokud by se významná část genetických polymorfismů udržovala v populacích pouze selekcí ve prospěch heterozygotů, byla by biologická zdatnost homozygotů velmi nízká, nejspíše by jim dokonce nedovolovala se rozmnožovat (LEWONTIN, 1994). Z tohoto vyplývá, že reálnějším mechanismem udržujícím molekulární polymorfismus je selekce závislá na frekvenci alely. Pokud biologická zdatnost nositelů dané alely klesá s růstem jejich zastoupení v populaci, bude se tato alela dlouhodobě či trvale v populaci udržovat. Pokud však pomocí selekčního tlaku dojde k vychýlení této 18

19 rovnováhy, ta se časem vrátí do původních hodnot díky selekci závislé na frekvenci. Selekce závislá na frekvenci může dlouhodobě udržovat stabilní četnost alel v populaci, ale závisí také na vnějších podmínkách v místě výskytu dané populace. Molekulární polymorfismus je v přírodě udržován mutačním tlakem, ovšem velikost podílu selekce na udržení mutačního tlaku ve prospěch heterozygotů, případně velikost podílu selekce závislé na frekvenci zatím nejsou známy. V průběhu zkoumání tohoto jevu byly vysloveny dva názory; neutralistický a selekcionistický. Tyto dva směry nelze pojímat jako zcela rozdílné, spíše se jedná o dva hraniční body možností, jež jsou mezi nimi. Neutralisté nepovažují přírodní výběr za hlavní faktor evoluce; namísto toho poukazují na fakt, že genotypy některých organismů jsou neadaptivní, jejich výskyt kolísá a jejich genotypy tedy mohly být zafixovány genetickým driftem. Naopak selekcionisté nepopírají, že genetický drift je jedním z důležitých faktorů při kolísání frekvence výskytu jednotlivých alel. Je velmi obtížné hledat argumenty proti tezi, že některé genetické variace musejí být neutrální. Rozdíl v obou výše popsaných teorií je spíše v míře neutrality, kterou uznávají. 19

20 4 POLYMORFISMUS V přírodě se vyskytuje genetická variace, jež má mnoho aplikací. Genetická variace poskytuje řadu zabudovaných markerů pro genetické studium organismů. V každé populaci existuje větší či menší polymorfismus v řadě kvantitativních i kvalitativních znaků. Některé znaky polymorfismů jsou nedědičné povahy; tyto znaky vznikají jako odpověď jedince na vlivy prostředí, s nimiž se během vývoje a života setkal. Většina polymorfismů je v různé míře povahy dědičná, pro tento typ polymorfismu je však nutná přítomnost dvou či více alel jednotlivých genů. Údaje o polymorfismu genů jsou užitečné při studiu genetických vztahů mezi populacemi jednotlivých druhů. S nástupem molekulární biologie bylo možno zkoumat jednotlivé geny bez znalosti jejich fenotypového projevu. Monoformní jsou takové geny, které se vyskytují v populaci v jedné variantě a proto dříve nebyly zkoumány. V dnešní době bylo zjištěno, že monoformní geny neexistují v populaci skoro neexistují, protože téměř všechny geny se v populacích vyskytují v mnoha variantách, které se liší jednotlivými bodovými mutacemi. Reverzní genetika nám umožňuje určit biologickou funkci genu i když se nachází pouze v jedné variantě. Výzkum probíhá buď pomocí transgenního organismu, nebo metodou genového odstřelu. Studium fenotypu takto geneticky modifikovaných organismů pak pomůže zjistit jaké znaky ten který gen určuje. Většina takovýchto mutací je fenotypově a selekčně neutrálních, jejich výskyt nevede k záměně aminokyselin v proteinovém řetězci. Většinou tedy nedochází k biologické změně funkčnosti proteinů. Tyto polymorfismy jsou označovány jako tzv. pseudopolymorfismy (FLEGR, 2005). Pokud pomineme pseudopolymorfizmy, které nemají vliv na fenotyp organismů, zjistíme, že existují dvě formy polymorfních genů. U prvního typu polymorfizmů rozeznáváme alely, které se vyskytují většinou přechodně, nebo jsou udržovány v dynamické rovnováze pomocí mutačního tlaku či selekce. Celá existence tohoto typu polymorfizmů vyplývá z vlastností evolučních procesů. U druhého typu polymorfismů se nedá přesně určit, která alela je standardní a která mutovaná, neboť se většina v populaci vyskytují s vysokou frekvencí. Výskyt těchto alel je navíc značně nepředvídatelný za předpokladu, že všechny organismy jsou vystaveny působení přirozeného výběru. V takovém případě by mělo být pravděpodobnější, že v populaci 20

21 nebudou dlouhodobě přetrvávat alely stejného druhu; alely s nejvhodnější genetickou informací by měly vytlačit alely méně vhodné.v přírodě existuje několik mechanismů, jež dokáží zabránit vytlačení méně vhodných alel. Patří mezi ně spojení mutačního tlaku s recesivitou znaků, superdominance, selekce závislá na frekvenci, cyklická selekce a vliv epistatických interakcí. Mutační tlak vzniká v důsledku opakovaného vzniku stejné alely. Působením mutačního tlaku se v populaci navyšuje procento kopií mutované alely. Proti mutačnímu tlaku v populaci působí selekce, která má za úkol z populace odstranit mutace snižující biologickou zdatnost oragnismu. Pokud je selekce recesivních alel nízká, je nízká i účinnost selekce a tyto alely se mohou v populací trvale vyskytovat s vysokou frekvencí. Rovnovážné zastoupení recesivních alel v populaci závisí na síle s jakou vznikají během jedné generace mutací alely recesivní z alel dominantních a na síle selekčního tlaku, který působí proti homozygotním nositelům mutovaných alel. Recesivní mutace mohou přetrvávat v populaci ve stabilním rovnovážném stavu narozdíl od dominantních alel, které se buď fixují, nebo se v genofondu populace skoro nevyskytují. Veliký význam mají polymorfismy v evoluci populace. Přítomnost polymorfismů umožňuje schopnost reakce na krátkodobé tlaky prostředí, protože poskytuje genetický materiál k selekci. K přizpůsobení se prostředí nemusí selekce vyhledávat nové mutace, nýbrž vybírá z již vzniklých variací. Je výhodnější pro organismus vyhledávat z vlastních genetických zdrojů než vytvářet nové mutace, u kterých není zajištěn prospěšný výsledek. V případě cyklických změn v prostředí je tak zajištěno, že při návratu do původních podmínek se organismus snáze navrátí k původnímu genetickému stavu. Podle některých teorii má tato technika mikroevoluce za následek vyšší evoluční úspěch u pohlavně se rozmnožujících druhů (WILLIAMS, 1975). Nevýhodou u těchto druhů však je vznik malého množství nových alel a tím i omezení fixace. U geneticky polymorfního druhu tak může dojít k poměrně rychlému poklesu polymorfismu. 21

22 5 GENETICKÉ MARKERY A METODY JEJICH IDENTIFIKACE Existují dobře prozkoumané sekvence DNA, které jsou snadno a lehce identifikovatelné. Většina genetických markerů má známý způsob přenosu genetické informace a je zjistitelná v jakémkoli věku jedince jakéhokoli pohlaví. Tím, že jsou objasněny způsoby dědičnosti genetických markerů je možno sledovat dědičné choroby, případně hledat příčiny těchto nemocí. Také pro znaky produkce a kvality masa je možné hodnotit markery až po porážce zvířete, nebo u velmi mladých zvířat. Na základě znalosti genotypu rodičů mohou být produkována jatečná zvířata s výhodným genotypem. Úseky DNA, jež leží na chromozomu v těsné blízkosti se přenáší na potomstvo společně a z je z nich možno vysledovat informaci o genu, který nebyl ještě lokalizován. Jednotlivé varianty téhož markeru mezi sebou mají kodominantní vztah, tzn. mohou být určeny genotypy (i heterozygotní), které se ve fenotypu neprojeví (FLEGR, 2005) Důležitým předpokladem pro použití DNA markerů je nezávislost na podmínkách prostředí, čili jejich selektivní neutrálnost, což v některých případech nebývá splněno u isoenzymových markerů, na které může působit selekce přímo, nebo které bývají často ve vazbě se selekci vystavenými geny (BERGMANN, 1975). Odlišné úseky DNA jsou vystaveny různým selekčním tlakům. Většina sekvencí kódujících životně důležité proteiny podléhá silnému selekčnímu tlaku, a proto jsou nevariabilní a pro analýzy většinou nepoužitelné. Na druhou stranou v nekódujících oblastech (introny a mezigenové regiony), u kterých lze předpokládat selekční neutralitu, a jejichž míru polymorfismu může ovlivňovat pouze genetický drift, se snadno hromadí mutace a proto jsou tyto sekvence variabilní. 22

23 5.1 Zkoumání kvantitativních znaků vede k objevu tří typů genetických markerů Genetické markery 1. typu tzv. přímé markery. Nejčastěji se jedná o kódující (exprimované) strukturní geny s nízkým stupněm polymorfismu. Jsou méně vhodné pro studium diverzity druhu a populací, ale zároveň se využívají pro komparativní mapování. Podle typu polymorfismu dělíme genetické markery na : Funkční markery, což je vlastní příčinná mutace Přímé markery, což je polymorfismus DNA přímo v sekvenci genu Genetické markery 2. typu tzv. nepřímé markery, které nemají vliv na vlastní variabilitu znaku. Nejčastěji se vyskytují jako mini- nebo mikrosatelity. Genetické markery jsou ve vazbě s lokusy kvantitativních znaků (QTL), čehož se využívá při mapování QTL a určování parentity. Vyhledávání takovýchto markerů vyžaduje dobře naplánovaný experiment, neboť vazba určité alely markeru a QTL může být pozměněna působením rekombinace. Proto je důležité pro použití nepřímých markerů provést rodokmenovou analýzu a zjistit užitkové vlastnosti rodičů. Z hlediska využití můžeme rozdělit nepřímé markery na: LD markery, které jsou s QTL ve vazbové nerovnováze LE markery, které jsou s QTL v rovnováze Genetické markery 3. typu které vycházejí z nepřímých genetických markerů. Jedná se o SNP markery v kódujících i nekódujících sekvencích, v intronech genů, nebo mimo geny. V těchto genech byl objeven polymorfismus podmíněný záměnou jedné báze nukleotidu (bodovou mutaci) v DNA. Ta tvoří přibližně 98% všech polymorfismů v DNA. Tyto markery poskytují informace o produkčních vlastnostech rostlin a zvířat a tím umožňují sledovat variabilitu genů v populacích (DVOŘÁK, 2001). SNP- single nukleotid polymorfismus SNP se v hojném počtu vyskytují téměř ve všech částech genomu organismu (v kódujících i nekódujících regionech) a poměrně rychle se z nich stávají markery 23

24 používané v populační genomice, evolučních analýzách a konzervační genetice. Vlastnostmi, které je k tomu předurčují jsou zejména efektivní genotypování, kvalita získaných dat a v neposlední řadě též cena daných metod. U většiny známých druhů se SNP obvykle vyskytují po každých párů bází (MORIN et al., 2004); až 90% procent veškeré genové variability připadá na alelické varianty SNP, které se vyskytují s frekvencí větší než 1%. Nesynonymní SNP lokalizované uvnitř kódujících regionů lze považovat za kandidátní geny funkčních změn. Fenotypový efekt drtivé většiny SNP zatím není znám a může být odvozován pouze na základě evoluční dynamiky konkrétní alelové varianty nebo jejího vlivu na funkci daného proteinu. Poměr nesynonymních (d N ) a synonymních (d S ) SNP lze považovat za sílu selekce pro daný gen či celý genom. Je však pravdou, že i mezi produkty synonymních SNP mohou existovat mírné rozdíly. Jedna aminokyselina může být kódována více kodony, a přestože za předpokladu náhodné distribuce by se měly všechny takové varianty vyskytovat v přibližně stejném počtu, většinou tomu tak není. Z tohoto důvodu může mít SNP, který změní obvyklejší či preferovaný kodon za některou ze vzácnějších variant, vliv na syntézu či funkci výsledného proteinu a genovou expresi. Přestože většina SNP se objevuje v nekódujících částech genomu, některým je možno přiřadit zcela konkrétní funkci. Například substituce inzulínového růstového faktoru 2 (IGF2) a intronu má výrazný vliv na růst svaloviny prasat (VAN LAERE et al., 2003) a také ovlivňuje tloušťku hřbetního tuku u křížení druhů Meishan x Evropského bílého prasete (JUNGERIUS et al., 2004, DE KONING et al., 2000). Velké množství nekódujících oblastí genomu je u všech živočišných druhů konzervované, z čehož lze usuzovat, že selekce zasahuje do velké části genomu. SNP lze hodnotit s přihlédnutím k tomu, zda se nacházejí v konzervovaných či nekonzervovaných částech nekódujících oblastí genomu. Navíc byly pomocí srovnávacích a odhadových algoritmů vysvětleny regulační regiony genů (promotory, tlumiče, izolátory a místa vázající mitochondriální ribonukleová kyselina mtrna), což napomohlo určení regulačních nekódujících SNP. Například u SNP, jež se vyskytují na vazebných místech transkripčního faktoru určených pro navázání promotoru, existuje větší pravděpodobnost, že budou modifikovat funkci, než u SNP umístěných mimo regulační oblast genu (CLOP et al., 2006, HOUSTON et al., 2006). SNP mají dobrý předpoklad pro to, aby se staly mocným genetickým nástrojem, neboť na rozdíl od SSR a mtdna poskytují kvalitnější data, nejsou příliš finančně nákladné a jsou schopny podat reprezentativní zprávu o větší části genomu. 24

25 5. 2 Molekulární metody vyhledávání genetických markerů Pomocí DNA markerů lze detekovat rozdíly v genetické informaci mezi analyzovanými populacemi. DNA markery jsou založeny na polymorfismu sekvencí DNA a využívají se hlavně ke zjišťování otcovství, sledování genetické mapy, populační genetiky a při studiu evoluce na molekulární úrovni. Sledování molekulárních markerů je možné provádět u všech organismů, u kterých je známá technika izolace DNA. Molekulární markery jsou výhodné z fyzikálního hlediska, neboť molekula DNA je vysoce stabilní a proto je izolace DNA možná nejen z živých tkání (CANO et al.,1993), ale také in vitro. Na analýzu je třeba jen malé množství DNA, proto lze metodu použít u již velmi raných ontogenetických stádií, což znamená zefektivnění rychlosti práce především ve šlechtitelské oblasti. Princip molekulárních markerů je založený na: 1. specifickém restrikčním štěpení analyzované DNA a následné hybridizaci se značenou sondou 2. amplifikaci specifických fragmentů v in vitro podmínkách 3. na různých kombinacích restrikčního štěpení, hybridizace a amplifikace Metody detekce molekulárních markerů založené na restrikčním štěpení a hybridizaci RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism polymorfismus délky restrikčních fragmentů RFLP patří mezi historicky nejstarší DNA markery. Pro rozvoj této metody byl nutným předpokladem první objev restrikčních enzymů (SMITH, WILCOX, 1970) a druhý objev přenosu elektroforeticky separované DNA z gelu na membránu metoda Southern blot (SOUTHERN, 1975). Metoda RFLP využívá délkového polymorfismu restrikčních fragmentů analyzované DNA, který je po nitrocelulózovou membránu) detekován pomocí hybridizace s homologním fragmentem provedení elektroforetické separace a přenosu fragmentů z gelu na pevný nosič (nylonovou nebo DNA specifickou sondou. RFLP markery na jaderné DNA vykazují kodominanci a jsou využívány pro genetické analýzy určování otcovství tzv. fingerprinting a pro tvorbu genetických map 25

26 významných hospodářsky využitelných plodin. Širšímu využití RFLP na nukleární DNA ve fylogenetických studiích většinou brání pracnost, časová a finanční náročnost těchto metod (BACHMAN, 1992) Metody detekce molekulárních markerů založené na metodě PCR PCR Polymerase Chain Reaction polymerázová řetězová reakce PCR reakce byla vyvinuta v Cetus Corporation Emeryville v Kalifornii. Jde o enzymatickou amplifikaci DNA in vitro syntézou mnoha kopií vybrané sekvence DNA v cyklické reakci o třech teplotních fázích (SAIKI et al., 1985, SAIKI et al., 1988). PCR-SPLAT (PCR-STS) Specific Polymorphic Locus Amplification Test amplifikace specific. polymorfního lokusu (Single Tagged Site amplifikace jednoho cílového místa) Jde o standardní PCR, kdy pomocí dvojice specifických primerů je nareplikován určitý fragment lokus (URL 1). RT-PCR Reverse Transcription PCR reverzní (zpětná) polymerázová reakce Jde o modifikovaný postup PCR určený pro amplifikaci molekul RNA. V prvním kroku je molekula RNA přepsána reverzně transkribována pomocí reverzní transkriptázy na molekulu kompelmentární DNA (cdna). Molekula cdna je poté použita jako templát následné PCR (URL 1). Real Time PCR Amplifikace probíhá obvyklým způsobem jako standardní PCR, avšak reakční směs obsahuje kromě dvojice primerů ještě specifickou vnitřní sondu (TaqMan sonda), která je fluorescenčně značená na 3 konci tzv. zhášečem a na 5 konci tzv. reportérem. (OVESNÁ, DRAŠNAROVÁ, 2001). 26

27 RAPD Randomly Amplified Polymorphic DNA polymorfismus náhodně amplifikované DNA Časově a na vybavení laboratoře méně náročná metoda. Princip je založen na amplifikací fragmentů DNA za použití pouze jednoho oligonukleotidového primeru. Primery mají obvykle délku 10 bází (náhodně vybraných s ohledem na zastoupení jednotlivých bází vyrovnaný poměr C:G). Krátká délka motivu a výrazně nižší teplota annealingu (35-38 o C) zvyšují pravděpodobnost nasednutí primeru na mnoha místech molekuly DNA (primery jsou tzv. nespecifické). Produkty amplifikace mohou odpovídat oblastem geneticky aktivní templátové DNA, stejně tak mohou odpovídat opakujícím se motivům. Amplifikované produkty jsou většinou elektroforeticky separovány na agarózovém gelu. Vizualizace se provádí pomocí etidium bromidu, přičemž pruhy na gelu jsou chápány jako fenotypová data přítomen/nepřítomen (1/0) (EXCOFFIER et al., 1992) Metody detekce molekulárních markerů založené na různých kombinacích restrikčního štěpení, hybridizace a amplifikace I-PCR Inverse PCR inverzní PCR Tento postup je používán pro amplifikaci fragmentů DNA s neznámou sekvencí, která je ohraničena známými sekvencemi. Metoda je založena na restrikčním štěpení známé sekvence, které umožní tvorbu kohezních konců. Druhým krokem je vytvoření cirkulární molekuly. Amplifikace je zahájena protisměrným připojením primerů ke známé sekvenci v cirkulární molekule. Tímto způsobem je zajištěna amplifikace vnitřního úseku cirkulární molekuly. In situ PCR Amplifikace DNA probíhá přímo v buňkách nebo cytologických preparátech. Produkt amplifikace je následně detekován hybridizací se specifickou sondou nebo s využitím imunochemických metod. Oproti standardně používané hybridizaci in situ je tento 27

28 postup mnohonásobně citlivější. Na principu in situ-pcr jsou obvykle založeny tzv. bio-čipy (URL 1). CAPS (PCR-RFLP) Cleaved Amplified Polymorhic Sequence délkový polymorfismus restrikčně štěpené amplifikované DNA Metoda CAPS v sobě zahrnuje spojení dvou postupů: PCR a RFLP. Úvodním krokem je amplifikace PCR markeru. Po následném rozštěpení restrikční endonukleázou jsou fragmenty elektroforeticky separovány na gelu. Díky bodovým mutacím lze odlišit dominantní a recesivní alely studovaných genů/mezigenových regionů. VNTR Variable Number Tandem Repeats variabilita v počtu tandemových opakování Opakující se sekvence obvykle čítá párů bází a může se nacházet vně i uvnitř genů. Tyto motivy se velmi často objevují v nekódujících oblastech genomu v těsné vazbě se strukturními geny. Podle délky motivu a počtu opakování lze tyto oblasti rozdělit na: 1. satelity oblasti nukleotidů dlouhé, délka motivu 100 a více nukleotidů, 2. minisatelity dlouhé úseky, motiv sestávající z nukleotidů, 3. mikrosatelity délka do 10 2 nukleotidů, motiv 2-6 nukleotidů (CHAMBERS, MACAVOY, 2000) Microsatellites (SSRs nebo STRs) Simple Sequence Repeats = Short Tandem Repeats tandemová opakování krátkých motivů Mikrosatelity jsou sekvence DNA složené z mnohokrát se opakujících motivů. Délka motivu je 2-, 3-, 4- nebo 6-bazí (např. motivy (CA) n, (CAA) n ). Celková délka lokusu obvykle nepřesahuje 100 párů bází (bp). Mikrosatelitové lokusy patří mezi nejvariabilnější oblasti genomu; jejich polymorfismus je dán zejména rozdílem v počtu opakování základního motivu (n), což je patrně způsobeno zejména klouzáním DNA polymerázy během replikace (tzv. replication slippage) a také změnami sekvencí v okolí mikrosatelitového lokusu. Mikrosatelitové markery jsou kodominantní. Pokud známe sekvence primerů, jde o relativně levnou, časově a na laboratorní vybavení nenáročnou metodu. Bohužel, 28