Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ

Transkript

1 Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ 4. Metody molekulární biologie I Izolace DNA a RNA Specifické postupy pro baktérie, kvasinky, rostlinné a živočišné tkáně U RNA nutno zabránit kontaminaci RNasami Rozbití buněk NaOH/SDS, detergenty, sonikace, kapalný dusík Odstranění proteinů srážení fenol/chloroform, proteinasa K, centrifugace a odstranění sraženiny Zakoncentrování DNA/RNA srážení etanolem, centrifugace a separace sraženiny Přečištění na afinitní kolonce Skladování -20/-80 o C Elektroforetická separace DNA Southern blot / Northern blot Hledání určité sekvence DNA/RNA pomocí sondy Fragmenty DNA/RNA separujeme v agarosovém gelu Převedení dsdna na ssdna - NaOH Neutralizace a přenos na membránu (nitrocelulosa, Immobilon P) Přenos pomocí kapilárních sil Inkubace se značenou oligonukleotidovou probou ethidium bromid Značení pomocí 32 P nebo chemiluminiscenčním markerem polyakrylamidový gel agarosový gel agarosový gel elektroforéza v pulsním poli Lokalizace hledaných fragmentů

2 Klonování Southern blot Klon: soubor molekul nebo buněk, které jsou všechny identické s původní (originální) molekulou nebo buňkou Klonování genu znamená vytvořit mnoho jeho kopií (např. v populaci baktérií, kvasinek, atd.). Gen může být přesná kopie původního genu Gen může být upravenou verzí původního genu Umožňuje to technologie rekombinantní DNA Restrikční endonukleasy Restrikční štěpení a ligace DNA Baktérie dokážou zabránit ("restrict ) možnosti útoku cizí DNA pomocí restrikčních enzymů Restrikční enzymy Typu II a III štěpí řetězce DNA na místech specifické sekvence Tyto enzymy rozpoznávají sekvence 4, 6 nebo více bazí a štěpí je. Názvy těchto enzymů používají 3-písmenný kód (psaný kurzívou): 1. písmeno označuje rod, 2. a 3. písmeno druh organismu Např. EcoRI je první restrikční enzym nalezený v kmeni R baktérie Escherichia coli.

3 Reakce DNA ligasy Plasmidy a klonovací vektory Plasmidy - přirozené extrachromosomální DNA Plasmidy jsou cirkulární dsdna Plasmidy mohou být štěpeny restrikčními enzymy za vzniku lepivých konců Umělé plasmidy mohou být konstruovány spojením fragmentů nové DNA s lepivými konci plasmidů Plasmidy lze modifikovat za vzniku nových genů Plasmidy použité jako klonovací vektory musí obsahovat: replikátor (počátek replikace) výběrový (selekční) marker (gen rezistentní na antibiotikum) klonovací místo (místo, kde vložení cizí DNA neporuší replikaci nebo nedeaktivuje důležité markery Chimerické plasmidy Klonování do plasmidu Pojmenovány podle mytologických zvířat s částmi těl z různých tvorů Po rozštěpení plasmidu restrikčním enzymem může být vložen cizí fragment Konce plasmidového fragmentu jsou uzavřeny za tvorby "rekombinantního plasmidu" Plasmid se může replikovat ve vhodném bakteriálním hostiteli

4 Typické klonovací plasmidy Klonování pomocí linkeru Řízené klonování Vložení cizí DNA v určitém směru pomocí dvou různých restrikčních endonukleas Genetická transformace baktérií/kvasinek Vnesení chimerického plasmidu Tepelný šok (42 o C), LiAc Elektroporace 1,5/1,8 kv, ~5 ms

5 Klonování s využitím lacz genu Modré a bílé kolonie Knihovny DNA Sada fragmentů klonované DNA z určitého organismu Gen tvoří malou frakci DNA v dané buňce Nelze ho přímo izolovat V DNA knihovně je ale možné nalézt fragment DNA, který obsahuje hledaný gen Malá pravděpodobnost nutný velký počet klonů v knihovně Hledání 20 kbp fragmentu v lidské genomové knihovně (3.200 Mbp) nutno testovat 650 tis. klonů k dosažení 99% pravděpodobnosti nalezení správného klonu. P.pravděpodobnost, že je klon zastoupen (99% = 0.99) n.poměr průměrné velikosti klonovaného inzertu k velikosti genomu Genomové a cdna knihovny Chromosomal DNA na Petriho miskách vypěstovat pro následnou analýzu alespoň 6.5 x 10 5 kolonií, abychom s 99% pravděpodobnosti zaručili, že je analyzován celý genom

6 Příprava cdna Příprava knihovny za využití bakteriofága λ Hybridizace kolonií Způsob hledání DNA fragmentu Připraví se dostatečný počet agarových ploten obsahujích klony hostitelského organismu z dané DNA knihovny Plotny se otisknou na nitrocelulosovou membránu Alkalizací se lyzují buňky a převede dsdna na ssdna Membrány se inkubují s probou značenou ssdna (většinou 32 P) odpovídající hledanému fragmentu DNA Proba se váže hybridizací na hledaný fragment SCREENING cdna a GENOMOVÝCH KNIHOVEN otisk plaků na nitrocelulosovou membránu denaturace DNA na filtru inkubace s hybridizační sondou vyvolání otisku detekce plaku obsahují požadovaný gen vyříznutí a namnožení požadovaného klonu

7 Vektory YAC sekvencování lidského genomu Enzymová (dideoxy) metoda sekvenování DNA Sekvenování DNA Fluorescenční barviva pro sekvenování DNA

8 Automatický DNA sekvenátor Odvození sekvence proteinu z DNA Nové metody sekvenování genomu (High-throughput genome sequencing) Whole Genome Sequencing (WGS, FGS) komparativní sekvenování člověk 3 mld. bp de novo sekvenování - do 50 mil. bp mikrobiální genomy Amplicone Sequencing detekce mutací (SNP) Transcriptome Sequencing mrna/cdna, exprese genů Metagenomics studium genomů v komplexním vzorku Full Genome Sequencing Race Archon X Prize for Genomics - 10 mil. USD pro toho, kdo postaví přístroj, který bude schopen sekvenovat 100 lidských genomů za 10 dní s přesností 1/100 tis., pokrytím 98% a náklady do 10 tis. USD/genom Illumina, Knome, Sequenom, 454 Life Sciences, Pacific Biosciences, Complete Genomics, Intelligent Bio-Systems, Genome Corp., ION Torrent Systems, Helicos Biosciences, IBM 454 Life Sciences 50 tis. USD Illumina 19.5 tis. USD Pacific Biosciences, Complete Genomics 5 tis. USD?? Metodiky Sequencing by synthesis Nanopore technology DNA Transistor Fluorophore technology

9 Pyrosekvenování 454 Life Sciences Princip pyrosekvenování 1. DNA polymerasa po přidání datp, dctp, dgtp nebo dttp inkorporuje pouze komplementární nukleotid, uvolní se PPi. 2. ATP sulfurylasa s adenosin 5 -phosphosulfátem převede PPi na ATP. 3. Luciferasa s ATP - přeměna luciferinu na oxyluciferin a světelné kvantum. 4. Apyrasa degraduje nevyužité dntps a ATP. Solexa (Illumina) princip SMRT Technology (ZMW - zero-mode waveguide) Sekvenování pomocí značeného reversibilního terminátoru 1. Inkorporace jednoho 3 -fluorescenčně značeného nukleotidu 2. Detekce značení 3. Chemická hydrolýza/odstranění značení/terminátoru -1 molekula DNA polymerasy imobilizovaná v ZMW - 5 -značené nukleotidy (na fosfátu), každý specifickým fluoroforem - laserem ozářené dno ZMW excitace fluorescence poblíž polymerasy - reakce polymerasy - 10 ms fluorescence daného nukleotidu - difuse nukleotidů 1000x rychlejší, krátké signály/šum