: nízkokroková nízkokroková ( a al a ýza analýza analýza komplexního komplexního vzorku proteinů protein /peptid

Transkript

1 přímá kvantitativní analýza v HPLC MS (bez izotopového otopoého značení) Jan Havliš Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta, Brno Ústav experimentální biologie : Oddělení funkční genomikya proteomiky : : Centrální laboratoř

2 : nízkokroková (shotgun shotgun)analýza komplexního vzorku proteinů/peptidů :relativní (rozdílové) stanovení buňka proteom vzorek proteom poteo (?) MS spektra proteiny pote y(?) data rekonstrukce k proteomu (?) : co : kolik : proč 3

3 náplň přednášky přímá kvantifikace? : kvantifikace ace vms aneb proč to dělat jednoduše, když to jde i složitě :: vliv ionizace použití hmotnostní značky :: je to opravdu tak výhodné? : přímá kvantifikace (bez izotopového značení) aneb cesta je to složitější, za to méně přesná :: ionizace problém stále zůstává :: neukončená snaha odejít spíše se štítem než na něm 4

4 kvantifikace pomocí MS intenzita signálu = f (koncentrace koncentrace) : hmotnostní spektrometrie složitý proces ionizace účinnost ionizace = f (koncentrace koncentrace, chemické struktury, pozadí) účinnost ionizace (ionisation efficiency) : počet vyprodukovaných iontů v závislosti na ionizační energii 5

5 dlouhá cesta od teorie k praxi klasické analytické stanovení v rámci proteomu (či jiné komplexní směsi) : obtížné referenční materiál a kalibrace pro každý analyt? analytické předpoklady v kvantitativní proteomice pomocí MS : 100% výtěžnost všech proteinů ů : lineární kalibrační závislosti : nulové výseky těchto závislostí na ordinátě : široký dynamický rozsah aejsou ale ve výsledku reálné? : takřka žádné absolutní hodnoty obsahu : mizerná přesnost, ale i správnost : těžko dosažitelné potřebné hodnoty mezí detekce a stanovitelnosti 6

6 nejběžnější řešení? :: použitím vnitřního standardu (s využitím hmotnostních značek) optimálně : standard i analyt ionizovány současně : standard i analyt mají stejnou chemickou strukturu : poměr analyt/standard jsou i jiná řešení? : bez derivatizace vzorku (hmotnostní značkou)? :: použitím využití intenzit nebo ploch píků :: použitím počítání spekter! nábližka : nejdelší vzdálenost mezi dvěma body 7

7 kontrola vzorek kontrola vzorek lehká značka těžká značka proteolytické štěpení proteolytické štěpení směs LC MS(/MS) LC MS(/MS) intenzity či plochy píků nebo počítání spekter poměry intenzit ve spektrech 8

8 krok první základní principiální kroky přímé kvantifikace : identifikace signálů, tedy peptidů, potažmo proteinů : hledáme unikátní peptidy :: redundance d databázová tbá á :: redundance fylogenetická krok druhý : převedení obsahu peptid na obsah proteinu (pars pro toto) :: různé ů nábojové stavy jednoho proteinu a jejich ji rovnováha :: různé proteiny sdílejí týž peptid (dekonvoluce signálu) základní obecný postup : odstranění šumu, vyhlazení : odečtení základní linie (jen pro využití intenzit) : normalizace signálu (jen pro využití intenzit) nebo dat (počítání spekter) : identifikace, roztřídění, vyhodnocení četnosti falešných nálezů (FDR, false discovery rate) : stanovení 9

9 využití intenzit nebo ploch píků : princip podobný stanovení molárního absorpčního koeficientu I A intenzita signálu analytu, u molární ionizační koeficient, c A koncentrace analytu, I B intenzita signálu pozadí experimentální získání u je nesnadné : pracné : závislost nebývá lineární ale : v relativní kvantifikaci nepotřebujeme u znát! jen je li I B1 a I B2 = 0 I A1 c A1 A1 intenzita signálu proteinu 1, I A2 intenzita signálu proteinu 2, A1 koncentrace proteinu 1, c A2 koncentrace proteinu 2 10

10 696 1x relativ vní intenzita [% %] relativní inte enzita [%] plocha píku [a.u.*min] retenční čas [min] t R [min] x plocha píku [a.u.*m min] retenční čas [min] t R [min] x 6x 6.3x 1.9x relativní inte enzita [%] plocha píku [a.u.*min] retenční čas [min] t R [min] 11

11 provedení iontočet iontočet (peptide ion intensity counting) : kvantitativní informace přímo v MS : intenzita či plocha monoizotopového píku : I B 0 RSD = < 40 % r 2 = 0.85 sumární iontočet (ion ion accounting) : signály tři nejintenzivnějších tryptických peptidů v MS 2 jsou mírou obsahu proteinu : součet intenzit či ploch monoizotopových píků RSD = % r 2 =

12 průměrná hodnota iontočtů iontočtů (spectral TIC method) : poměr průměrů signálů ze všech MS/MS patřících danému proteinu : průměr intenzit či ploch monoizotopových píků; robustnější parametr :: větší protein generuje více peptidů vyšší vzorkový práh RSD = ~ 20 % I A1 /I A2 A2 = 60 (SIL ~ 20) normalizovaný iontočet (PICA, (PICA, peptide ion current area) : poměr normalizovaných signálů z XIC MS peptidů patřících danému proteinu :: průměr intenzit či ploch prvních tří izotopových specií :: vyhlazení (substituce gaussovského profilu parabolou) :: statistický test, je li S/N daného signálu přijatelný RSD = ~ 10 % min 5 MS spekter na peptid 13

13 detekce peptidu základní kroky : MS data; odlišení od chemického šumu; určení náboje : lokalizace v rozměru retenčního času a rekonstrukce chromatografického profilu podle hodnoty m/z monoizotopického iontu peptidu : integrace celkového iontového proudu peptidu = kvantitativní informace ale : podobné m/z (přesnost) či podobný t R potřeba jednoznačné identifikace : identifikace ztráta času a materiálu na MS 2 kolokalizace srovnávaných peptidu : každý biologický vzorek se měří separátně (na rozdíl od měření se značkami) : podle koordinát (m/z m/z, t R ) se hledají srovnávané peptidy (přesnost) : normalizace t R (vnitřní standard d přidaný či skutečně č ě vnitřní) :: normalizovaný retenční čas (NET, normalised retention time) 14

14 výběr signifikantních peptidů : normalizace intenzit (odstranění artefaktů) informaticky :: hmotnostní značka správnosti (AMT, accurate mass tag) : výběr signifikantních peptidů p (statisticky statisticky) mezi skupinami vzorků : LTQ OT MS umožňuje paralelní MS 2 identifikaci a kvalitní kvantifikační MS data :: zvyšuje výpočetní nároky : 66% shoda mezi dvěma LC MS/MS běhy; 10 běhů max. počet unikátních peptidů unikátní peptidy m/z m/z normalizovaný retenční čas [min] 15

15 využití počítání MS/MS spekter : čím více je proteinu, tím více vytvoří tryptického peptidu : čím více tryptického peptidu, tím je pravděpodobnější, že bude podroben MS 2 pík (XIC) tryptického peptidu z proteinu o koncentraci c 1 : celkový počet unikátních peptidů na protein : celkový počet MS/MS spekter na protein r 2 = 0.99 linearita :dva řády spekter N S počet spekter n i obsah proteinu inten nzita intenzita retenční čas 8 MS 2 spekter pík (XIC) peptidu z proteinu o koncentraci c 2 kde 2*c 2 = c 1 4 MS 2 spektra počet retenční čas obsah proteinu [mol] 16

16 exponencializovaný index obsahu proteinu (empai empai, exponentially modified d protein ti abundance index) ) provedení index obsahu proteinu (protein abundance index) počet jedinečných: prekurzorových iontů sekvencí N i počet pozorovaných tryptických peptidů jednoho proteinu sekvencí bez překryvu N tot tot počet všech pozorovatelných tryptických peptidů jednoho proteinu n(hsa) [fmol] molární zlomek 17

17 absolutní exprese proteinu (APEX APEX, absolute protein expression) :normalizace počtu pozorovaných unikátních peptidů pomocí predikované pravděpodobnosti detekce/identifikace peptidu linearita :tři třiaž čtyři řády N S počet MS 2 spekter z jednoho proteinu, N PS počet predikovaných MS 2 spekter, c tot t celková koncentrace proteinu, n celkový počet identifikovaných proteinů, p pravděpodobnost detekce/identifikace peptidu 18

18 pokročilá normalizace dat normalizovaný faktor četnosti spekter (normalized spectral abundance factor) N S počet MS 2 spekter související s jedním proteinem, N AA počet aminokyselin tohoto proteinu, n celkový počet identifikovaných proteinů spektrální index (spectral index) x it č i intenzitasignálu, m počet MS 2 spekter, n počet unikátních peptidů proteinu, k počet unikátních proteinů, L délka proteinu 19

19 s volným přístupem p softvér MapQuant, MZmine, MsInspect,OpenMs OpenMs, MSight, SuperHirn, PEPPeR komerční Decyder MS (GE Healthcare) X Tracker (Cranfield Ca edu Uni) ProteinLynx (Waters Waters) Elucidator (Rosetta Rosetta) ProteoIQ (BioInquire BioInquire) SIEVE (Thermo Electron) G.I.G.O. : ze smetí nic než smetí neuděláš 20

20 srovnání srovnáníkvantifikačních postupů diferenční gelová el. proteiny identifikované a kvantifikované pomocí 1 peptidu sumární iontočet itraq proteiny identifikované a kvantifikované pomocí 2 peptidu sumární iontočet diferenční gelová el. itraq 21

21 shrnutí významu přímé kvantifikační metodologie + experimentální snadnost žel, jen na první pohled + neomezené množství paralelních analýz časové omezení + nízká cena provozní, ale ne pořizovací výsledky silně zatížené metodickými zjednodušeními vyšší dynamický rozsah, ale nízká přesnost a správnost žádné kalibrace, žádné standardy, ale také žádné řízení jakosti (QC) vyhodnocení speciální komplexní softvér vysoké instrumentální nároky vysoké rozlišení, vícerozměrná separace 22

22 prakticky, o fous lépe vychází počítání spekter, ale! neexistuje obecné řešení závěr jsem poněkud zmatená. tohle byl začátek něčeho, konec něčeho nebo to něco bylo už všechno? 23

23 děkuji za pozornost finanční č podpora GA ČR MŠMT GA /09 09/ MSM ,MSM MSM