Kvantitativní proteomická analýza. Martin Hubálek

Transkript

1 Kvantitativní proteomická analýza Martin Hubálek

2 Kvantifikace proteinů Většinou pouze relativní srovnání odezvy mezi dvěma experimenty, případně mezi experimentem a standardem Množství proteinu bývá odvozeno z množství jednoho nebo více peptidů z proteinové sekvence Založené na porovnání výšky nebo plochy píku Peptidu(s) m/z (MS úroveň MS1) Fragmentu peptidu m/z (MS/MS úroveň MS2) Důležitý výběr peptidu Proteotypický peptid

3 Kvantifikace proteinů Bezznačková (Label-free) MS1 MS2 Stabilní Izotopové značení ( stable isotope labelling) 2-DE Cílená SRM Data Independent Analysis (DIA) SWATH LFQ Metabolické SILAC 14 N/ 15 N medium N-term MS1 mtraq Dimethyl MS2 itraq TMT Chemické C-term Esterifikace 16 O/ 18 O inkorporace Aminokyselina Lys (itraq) Cys (ICAT) Trp

4 Kvantifikační přístupy Mueller, Brusniak et al. 2008

5 Proteotypický peptid Peptidy, které je možné zaznamenat pomocí LC- MS Štěpitelné použitou proteázou (nejčastěji trypsin) Bez možných variabilních modifikaci (Met, Trp) Správná retence na C18 Ionizace v nanoesi + Peptidy, které jsou specifické pro stanovovaný protein ve směsi s ostatními proteiny Prohledání sekvence proti všem dostupným proteinovým sekvencím

6 PEPTIDERANK Predikce proteotypických peptidů MKSINILSFLLLSSTLSLVAFARSFTSENPIVLPTTCHDDDNLVLPEVYDQDGNPLRIGERY IINNPLLGAGAVYLYNIGNLQCPNAVLQHMSIPQFLGEGTPVVFVRKSESDYGDVVRVMTVV YIKFFVKTTKLCVDQTVWKVNDEQLVVTGGKVGNENDIFKIMKTDLVTPGGSKYVYKLLHCP SHLGCKNIGGNFKNGYPRLVTVDDDKDFIPFVFIKA

7 Bezznačkové metody

9 Selected Reaction Monitoring (SRM)

10 Selected Reaction Monitoring (SRM) Cílený přístup Výběr prekursoru (Peptide m/z) Q1 Fragmentace v kolizní cele Q2 Sken fragmentu (Peptide fragment m/z) Q3 Quantitation

11 % % MS APLDNDIGVSEATR (Beta-galaktosidáza) LV Bgal min Q (27.277) AM (Cen,4, 80.00, Ar,5000.0,0.00,1.00); Sm (SG, 8x3.00); Sm (SG, 8x3.00) e m/z MSMS y1 y3 y5 y6 y7 y8 y9 y10 y11 y12 y13 LV R Bgal TA min ES V G I D N D L P A b2 b4 b6 Q (27.077) Sm (SG, 8x3.00); Sm (SG, 8x3.00); Cm (194) Přechody: ID Q1 Q3 CE m/z APLDNDIGVSEATRy8 729,4 832,5 42 APLDNDIGVSEATRy12 729,4 1289,6 42 APLDNDIGVSEATRy11 729,4 1176,6 42

12 In te n s ity, c p s In te n s ity, c p s In te n s ity, c p s In te n s ity, c p s XIC of +MRM (80 pairs): 729,4/1176,6 Da ID: APLDNDIGVSEATR from Sample... Max. 1,8e5 cps. 1,8e5 17,14 1,6e5 1,4e5 729,4 832,5 1,2e5 1,0e5 8,0e4 6,0e4 4,0e4 2,0e4 XIC of +MRM (80 pairs): 729,4/1176,6 Da ID: APLDNDIGVSEATR from Sample... Max. 1,8e5 cps. 0, Time, min XIC of +MRM (80 pairs): 729,4/832,5 Da ID: APLDNDIGVSEATR from Sample... Max. 1,4e5 cps. 1,8e5 17,14 1,4e5 17,14 1,6e5 1,2e5 1,0e5 729,4 1176,6 1,4e5 8,0e4 1,2e5 6,0e4 4,0e4 1,0e5 2,0e4 8,0e4 0, Time, min 6,0e4 XIC of +MRM (80 pairs): 729,4/1289,6 Da ID: APLDNDIGVSEATR from Sample... 1,28e5 1,20e5 1,00e5 8,00e4 6,00e4 4,00e4 17,12 Max. 1,3e5 cps. 729,4 1289,6 4,0e4 2,0e4 0, Time, min 2,00e4 0, Time, min

13 Skyline sw pro tvorbu SRM přechodů i vyhodnocení výsledků Selekce nábojového stavu Selekce přechodů Optimalizace kolizní energie Finální metoda

14 Cycle Time Intensity (cps) Scheduled MRM maximalizace cyklu monitoruje každý MRM přechod jen očekávaném elučním čase redukuje počet překrývajících se přechodů zvyšuje čas měření pro každý přechod zlepšuje analytickou přesnost lepší LLOQ mnoho MRM málo MRM MRM XIC Time (mins)

15

16

17 AQUA Absolutní kvantifikace Stabilně izotopicky značený peptid o stejné sekvenci jakou kvantifikuji

18 Peak ratio - Light x Heavy PeptideSequence ProteinName ReplicateName Absolute spike RT RatioToStandard AGPESDGQFQFTGIK sp Q9JJW3 USMG5_RAT _RHD50G50 50 fmol THSDQFLVSFK tr Q6PCU0 Q6PCU0_RAT _RHD50G50 50 fmol Absolutní koncetrace proteinu USMG5: 50 * 4,0401 = 202 fmol Q6PCU0: 50* 4,0608 = 203 fmol

19 Full Dynamic Range Proteome Analysis of S. cerevisiae by Targeted Proteomics Figure 1 Cellular Concentrations of the Set of Measured Proteins Protein abundances are derived from Ghaemmaghami et al. (2003). Proteins detected by SRM assays are sorted by abundance to show the even distribution across the whole range of concentration (blue circles). Proteins for which the absolute abundance was measured using isotopically-labeled standards are indicated on top of the graph (open circles).

20 SRM (MRM) peptidů Vysoce selektivní Široký dynamický rozsah

21 Data Independent Analysis (DIA) MS/MS fragmentace iontů o určité m/z nezávisle na přítomnosti signálu v MS Širokopásmová (broadband) Příklad: MS E Cílená na úzká pásma m/z Příklad: SWATH

22 SWATH SWATH-MS: Sequential Windowed data independent Acquisition of the Total High-resolution Mass Spectra Selekční okno prekurzoru - kolem 25 mu (x 1mu v SRM) Fragmentace v kolizní cele MS/MS scan pro všechny prekurzory v cele fragmenty ze všech přítomných iontů

23 SWATH-MS Adapted from Gillet et. al., Molecular & Cellular Proteomics, 2012

24 Př.: 1 protein 10 peptidů 6 přechodů celkem 60 hodnot pro kvantifikaci a statistické hodnocení 24 měření ve dvou variantách vzorků

25 Stabilní izotopové značení Stabilní izotopy Těžké (heavy): 13 C, 15 N, 18 O, 2 H Lehké (light): 12 C, 14 N, 16 O, 1 H Zavedení jednoho atomu Trypsinové štěpení v H 2 18 O 15 N značené v buněčné kultuře Zavedení skupiny s několika těžkými izotopy Stable isotope labelling of amino acids in cell culture (SILAC) Isobaric tag for relative and absolute quantitation (itraq) Dimethyl labelling předpoklad Shodné chování v průběhu chromatografie a ionizace odpovídající H/L formy peptidu eluují ve stejný čas obě formy mají stejnou pravděpodobnost ionizace na pozadí danné matrice

27 Značení stabilními izotopy - SILAC o Stable Isotope Labeling with amino ACids in cell culture (SILAC) o Metoda relativní kvantifikace proteinů ve dvou paralelně kultivovaných buněčných kulturách v médiu s lehkými nebo těžkými AK. o V mediu s těžkými AK se používá např.: Arg, Lys 13 C, 15 N o Kvantifikace MS1, ověření identity v MS2 o Nutné dosáhnout vysoké úrovně inkorporace těžkých AK do buněk o Minimálně 5 buněčných cyklů MS spektrum 2x nabitých iontů při SILAC experimentu 37

28 SILAC Inkorporace Inkorporace těžkých AK ( 13 C 15 N Arg, Lys) do buněčné kultury H/L ratio = 35 i.e. incorporation level 97 %

29 SILAC výsledek

30 SILAC + - Vzorky jsou smíseny na počátku experimentu Vhodné pro složité postupy přípravy vzorku Je možné použít shotgun i cílený přístup Auxotrofie pro Lys, Arg Snadné pouze v buněčných kulturách Metabolická konverze Arg na Pro Limitovaná multiplicita drahé

32

33

34 Dimethyl Labeling Reakce N-termini a ε-amino skupiny Lys s formaldehydem následovanou redukcí kyanoborohydridem sodným Boersema, P. J., et al. Triplex protein quantification based on stable isotope labeling by peptide dimethylation applied to cell and tissue lysates. Proteomics. 8, 2008, pp

35 Dimethyl labelling + - Levné a snadno získatelné reagencie Reakce rychlá V roztoku po štěpení ostatní primarní aminy mohou reagovat s formaldehydem vynechat Tris, Am. Bic, použij TEAB Všechny kroky před smísením kriticky důležité pro kvantifikaci - optimalizace

36 Izobarická značka pro rel. a abs. kvantifikaci itraq Isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation (itraq) Současná (relativní) kvantifikace až 4 vzorků. Sada 4 izobarických činidel, která se váží na aminoskupinu peptidů (proteinů). V MS mají stejný poměr m/z, v MS/MS poskytují 4 různé ionty. MS/MS MS Isobarická značka 145 Da itraq značky Relativní kvantifikace podle intenzit iontů m/z 114, 115, 116, 117 Možný i oktaplex 39

37 itraq Poměry jsou odečteny po peptidové fragmentaci MS/MS (MS2): Reporterové ionty a jejich poměry určují rozdíly v kvantitě

38 TMT značky

39 MS2 značení + - Levnější než SILAC Reakce rychlá V roztoku po štěpení Stejné chování peptidu v průběhu analýzy až na rozdíl v MSMS spektru ostatní primarní aminy mohou reagovat s formaldehydem vynechat Tris, Am. Bic, použij TEAB Všechny kroky před smísením kriticky důležité pro kvantifikaci -optimalizace Skutečné rozdíly v kvantitě jsou větší než naměřené

40 Stabilní izotopové značení Metabolické Eg. SILAC Chemické Eg. Dimethyl labeling

41 naměřená změna log základ 2 Srovnání Label-free kvantifikace a kvantifikace pomocí TMT 10plex ug krysích peptidů v 25ul ,5 1,25 0,625 0,31 0,156 0,078 ug kvasinkových peptidů 25ul ředění porovnání metod log ředění o základu 2 realita Labellfree MS2 MS3

43 Druhá dimense Dvoudimensionální elektroforéza + 2DE princip metody První dimense pi pi 10 _ Polyakrylamidový gel

44 2DE relativní kvantifikace