Hmotnostní spektrometrie v klinické laboratoři

HTML
DOWNLOAD

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Hmotnostní spektrometrie v klinické laboratoři"

Ján Čermák
před 6 lety
Počet zobrazení:

1 Hmotnostní spektrometrie v klinické laboratoři B.Friedecký Brno Pracovní den

2 Minulost MS Referenční metody měřm ěření nízkomolekulárních látek l biologických materiálů GC-MS LC-MS Základ metrologické návaznosti Pracovní nástroj referenčních laboratoří

3 Rozvoj MS a MS/MS v posledních letech Úspěšný v oblasti analýz nízkomolekuln zkomolekulárních látek Toxikologie Léky Vrozené vady Vitamin D Albumin v moči HbA1c MS/MS je zlatý standard vyšet etřování při novorozeneckém skríninku vrozených vývojových vad MS/MS v oblastech toxikologie a TDM můžm ůže e být nástrojem metabolomiky

4 Co očeko ekávají lékaři i v US od MS(2009) Endokrinologové a onkologové zvýšenou analytickou sensitivitu a lepší analytickou specifičnost ve srovnání s imunochemickými metodami Hodnota m/z je specifická pro analyt Dosažen ení meze detekce v řádu pmol/l Možnost multiplexních měření

5 Nejčast astější pojmy MS Separace - GC, LC, CE Ionizace EI, APCI (malé molekuly) ESI, MALDI,SELDI(velké mol.) Generování m/z TOF Trojice kvadrupolů při i MS/MS

6 LC-MS/MS MS/MS- módy SRM a MRM Systém m tři t kvadrupolů (separace,fragmentace,selektivní detekce) Klasická LC-MS/MS analýza jednoho nízkomolekulárního analytu Módy SRM a MRM jsou způsoby MS/MS,upravené pro multiplexní provedení Mód d SRM (selected( reaction monitoring) -profil jednoho analytu a jeho variant -isoforem Mód d MRM (multiple( reaction monitoring) - multiplexní analýza

7 Varianty PTH

8 MRM- výkonnost a přesnostp analytů při i jednom měřm ěření Přesnost CV%< 20 Potřebn ebná doba několika n málo m minut

9 Standardizace MS/MS Vnitřní standardy eliminují supresi ionizace, která se vyskytuje u vzorků některých pacientů a adjustují nastavení měřícího systému. Kvantifikace pomocí externího kalibrátoru se stejnými nároky n jako u klasických biochemických stanovení Materiál l NIST-SRM SRM 972 zajistil pravdivost měřm ěření 25-OH OH-vitaminu D

10 Proteomika, proteom Proteom se skládá z cca genomem exprimovaných proteinů a z další ších několika n milionů posttranslačně změněných ných proteinů Stanovuje se běžb ěžně jen cca 150 proteinů o koncentracích ch 0,06 mg/l Proteomika je analýza proteomu Souvislost s genomikou: : genotyp/fenotyp MS mám potenci stanovovat aža femtomolové (10-15 ) koncentrace proteinů (low abundant proteins)

11 MALDI-SELDI TOF MS Nakoncentrování vzorku na čipu, ipu,často na bázi b afinitní chromatografie(čip ip IMAC-immobilized metal affinity chromatoigraphy) Tryptická digesce Ionizace TOF(m/z na bázi b času průlet letů z ionizační komory na detektor) Srovnání s knihovnou spekter SELDI navázání studovaných proteinů na čip a ionizace laserem přímo p z jeho povrchu

12 MALDI TOF MS vyhodnocení profilu programem Mascott

13 Aplikace MALDI/SELDI TOF MS Proteinové profily Systematický výzkum proteomu HUPO Pokusy o nalezení diagnostických biomarkerů v podobě proteinových profilů(zejm (zejména v onkologické diagnostice) Rychlá diagnostická vyšet etření v mikrobiologii

14 2D ELFO a návaznost n s MALDI TOF MS

15 Intensita hledání onkologických biomarkerů

16 Proč je hledání proteomických biomarkerů málo úspěšné Obrovský počet posttranslačních proteinů Jejich závislost z na genetických a environmentáln lních faktorech Problémy s preanalytikou a databázemi biologických materiálů Problémy s kvantifikací-rozsah koncentrací přes 10 řádů

17 Problémy preanalytiky v proteomice Obecné preanalytické problémy Odběrov rové nádobky, proteolýza, antiproteolytika Špatný stav materiálů v biobankách Řada nadějných profilů a biomarkerů nemohla být verifikována na jiných pracovištích ch z důvodd vodů preanalytických chyb

18 Pokus o proteinový profil k diagnostice PCa V roce 2008 ztroskotala na preanalytických problémech validace tohoto profilu,prováděná šesti špičkovými ústavy USA(John Hopkins, San Antonio,Pittsburg Pittsburg...) Používaly vzorků ze čtyř různých bank biologického materiálu

19 FDA clearance Provedena modelově ve spolupráci proteomiků,, pracovníků FDA a výrobců na dvou hypotetických systémech. Edukační pokus. 1.Systém m MS/MS MRM,pracující s 10 peptidy, obohacenými pomocí příslušných antipeptidových protilátek tek 2.Proteinový čip se 120 jamkami a 10 analyty Skutečnou clearanci FDA zatím žádný systém m tandemové MS ani proteinových čipů nemá udělenu

20 Dva metodické přístupy MS v proteomice První metodický přístupp stup-profil profil části proteomu.typickým nástrojem n je MALDI-TOF MS Druhý metodický přístupp stup-kvantifikace cílových proteinů (targeted proteins).typickým přístupem p je SID MRM (SID= Stable Isotope Dilution ke kalibraci)

21 Kvantifikace cílových( c lových(targeted) proteinů Cílový protein stanoven vhodnými peptidy po jeho proteolytické digesci. Peptidy musí odpovídat dat cílovc lovému proteinu.obsah peptidů se obohatí pomocí antipeptidových protilátek tek (immunoafinity enrichment) Možnost výběru různých r (surrogate( surrogate) peptidů=mo =možnost multiplexních stanovení variant nebo isoforem cílového proteinu (pepsin/pepsinogen pepsinogen ctni/il 33) Kvantifikace obohacených peptidů kalibrací MS/MS MRM stabilní isotopovou dilucí (SID) SISCAPA-stable isotope standard capture with antipeptide antibodies

22 Zjednodušen ení proteinových vzorků u metod MS/MS.

23 Kvantitativní proteomika cílových (targeted)) proteinů Analýza malých molekul metodou MS/MS je dobře e zvládnut dnutá včetně multiplexních postupů (MRM). Ke kvantifikaci cílových c proteinů se nadějn jně jeví SID MRM s imunoafinitním obohacením m peptidů( ( SISCAPA). Možnost validovat dostatečně rychle,zda cílový protein lze považovat ovat za biomarker Možnost rychlých multiplexních analýz Možná náhrada imunochemických metod

24 SID MRM kvantifikace(psa)

25 Validace potenciáln lních biomarkerů Metoda LC-MS/MS v módu m SID-MRM s imunoafinitním obohacením peptidů(siscapa),ekvivalentn (SISCAPA),ekvivalentních hledanému proteinovému biomarkeru je velkou nadějí proteomiky CV%(mezilehlá precisnost)6-14% Recovery -15 aža 5,9%

26 Výhody MS Analytická sensitivita(lod v pmol a fmol/l) MULTIPLEXNÍ ANALYTIKA Analytická specifičnost(m/z charakterizuje analyt jednoznačně) Malé provozní náklady

27 MS a investice do zdravotní péče D.Callahan Callahan:Taming the Beloved Beast, Princeton University Press 2010(krocení drahé bestie) Finanční náročnost nových technologií může e zničit it zdravotnictví Velmi často je positivní efekt pro pacienty malý,ale positivní efekt pro firmy obrovský I z tohoto hlediska je nutné omické metody posuzovat a určit regulovaně počet zařízen zení a pracovišť podle potřeb péče e o pacienty

Podobné dokumenty

Vývoj biomarkerů. Jindra Vrzalová, Ondrej Topolčan, Radka Fuchsová FN Plzeň, LF v Plzni UK

Vývoj biomarkerů. Jindra Vrzalová, Ondrej Topolčan, Radka Fuchsová FN Plzeň, LF v Plzni UK Vývoj biomarkerů Jindra Vrzalová, Ondrej Topolčan, Radka Fuchsová FN Plzeň, LF v Plzni UK Proč potřebujeme laboratoř? Proč potřebujeme biomarkery? Časná diagnostika Správná diagnostika a stratifikace pacientů