MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE Bakalářská práce Brno 2013 Monika Dúcka

2 MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE ODDĚLENÍ GENETIKY A MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE CYKLINY D V REGULACI A DYSREGULACI BUNĚČNÉHO CYKLU U MNOHOČETNÉHO MYELOMU Bakalářská práce Monika Dúcka Vedoucí práce: RNDr. Sabina Ševčíková, Ph.D Brno 2013

3 Bibliografický záznam Autor: Název práce: Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce: Monika Dúcka Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Cykliny D v regulaci a dysregulaci buněčného cyklu u mnohočetného myelomu Biologie Molekulární biologie a genetika RNDr. Sabina Ševčíková, Ph.D. Akademický rok: 2012/2013 Počet stran: 57 Klíčová slova: mnohočetný myelom; cykliny D; regulace buněčného cyklu; dysregulace buněčného cyklu

4 Bibliographic Entry Author: Title of Thesis: Degree programme: Field of Study: Supervisor: Monika Dúcka Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology Cyclins D in regulation and dysregulation of the cell cycle in multiple myeloma Biology Molecular Biology and Genetics RNDr. Sabina Ševčíková, Ph.D. Academic Year: 2012/2013 Number of Pages: 57 Keywords: multiple myeloma; cyclins D; regulation of the cell cyle; dysregulation of the cell cycle

5 Abstrakt V této bakalářské práci se věnuji úloze cyklinů D v regulaci a dysregulaci buněčného cyklu u mnohočetného myelomu. Cykliny D se podílejí na regulaci progrese buňky z fáze G1 do S a fungují také jako transkripční faktory některých genů. V rámci mnohočetného myelomu dochází k dysregulaci buněčného cyklu a k dysregulaci exprese všech tří cyklinů D. Cykliny D slouží také jako prognostický marker a ke klasifikaci podskupin MM. Abstract In this thesis, I focus on the role of cyclins D in regulation and dysregulation of the cell cycle in multiple myeloma. Cyclins D are involved in regulating progression of cells from G1 to S-phase and also act as transcription factors of some genes. In multiple myeloma, there is the dysregulation of the cell cycle and the expression of all three cyclins D is dysregulated. Cyclins D are also prognostic markers and classify subgroups of multiple myeloma.

6

7

8

9 Obsah 1 ÚVOD REGULACE BUNĚČNÉHO CYKLU Historie Obecná charakteristika regulace buněčného cyklu Regulace progrese z G 1 do S CYKLIN D Regulace exprese cyklinu D Dráha Ras-Raf-MEK-ERK Dráhy Ras-PI3K-Akt-mTOR-S6K1 a Ras-PI3K-Akt-GSK3β Transkripční faktory NF-κB Dráha Wnt/β-katenin Dysregulace exprese cyklinu D Dysregulace na molekulární úrovni Cytogenetické změny Nekatalytické funkce cyklinu D Aktivace jaderných receptorů Interakce cyklinu D1 s koaktivátory transkripce Úloha cyklinu D1 při opravě poškozené DNA Cyklin D1 a rezistence k apoptóze CYKLINY D2 A D Porovnání cyklinů D2 a D3 s cyklinem D Funkce cyklinu D3 nezávislá na Cdk MYŠÍ KNOCK-OUT MODELY A CYKLINY D Myši deficientní pro jeden z genů cyklinů D Myši deficientní pro dva geny cyklinů D Myši deficientní pro všechny tři geny cyklinů D MNOHOČETNÝ MYELOM Obecná charakteristika... 34

10 6.2 Incidence Klinické příznaky Molekulární podstata MM Změny ve struktuře chromozomů Translokace t(4;14)(p16;q32) Translokace t(14;16)(q32;q23) a t(14;20)(q32;q11) Translokace t(11;14)(q13;q32) a t(6;14)(p21;q32) Dysregulace cyklinů D a TC skupiny Další chromozomové aberace Aberace na chromozomu Mutace genů RAS ZÁVĚR LITERATURA... 42

11 Seznam použitých skratek AIB1 koaktivátory transkripce (amplified in breast cancer 1) AIF apoptózu indukující faktor Akt proteinkináza B AP1 rodina transkripčních faktorů (activator protein 1) AR androgenový receptor Bax protein patřící do rodiny proteinů BCL2 (BCL2-associated X protein) BRCA2 rodina proteinů (breast cancer type 2 susceptibility protein) CAK kináza aktivující cyklin dependentní kinázy (Cdk activating kinase) CCND1 gen pro cyklin D1 CCND2 gen pro cyklin D2 CCND3 gen pro cyklin D3 CCR1 chemokinový CC receptor 1 (chemokine C-C motif receptor 1) Cdk cyklin dependentní kináza (cyclin dependent kinase) CKI inhibitory cyklin dependentních kináz (cyclin dependent kinases inhibitors) CKS 1 B gen pro regulační podjednotku 1 cyklin dependentních kináz (cyclin-dependent kinases regulatory subunit 1) Cip/Kip rodina inhibitorů cyklin dependentních kináz CRABP2 protein vážoucí kyselinu retinovou (cellular retinoic acid-binding protein 2) Eα/Eμ zesilovače transkripce (enhancer) ER estrogenový receptor ERE elementy promotorů odpovídající na vazbu estrogenu (estrogen response elements) ERK kináza regulovaná mimobuněčným signálem (extracelular signal-regulated kinase) ETS rodina transkripčních faktorů (E-twenty six) E2F rodina transkripčních faktorů FGFR receptor fibroblastového růstového faktoru (fibroblast growth factor receptor) G 1 -pm G 1 -postmitotická fáze G 1 -ps G 1 -pre-s fáze G-CSF růstové faktory granulocytů (granulocyte colony-stimulating factor) GSK-3β glykogen syntáza kináza 3β HDAC histon deacetyláza

12 Hox rodina transkripčních faktorů Hsp70 protein teplotního šoku (heat shock protein) IgH těžký řetězec imunoglobulinů IgL lehký řetězec imunoglobulinů IκB inhibitor κb (inhibitor of κb) IMWG mezinárodní myelomová skupina (The international myeloma working group) INK4 rodina inhibitorů cyklin dependentních kináz LEF rodina transkripčních faktorů (lymphoid enhancer-binding factor 1) LRP protein příbuzný lipoproteinovému receptoru (low density lipoprotein receptorrelated protein) Maf transkripční faktor MEK proteinkináza aktivovaná mitogeny (mitogen-activated protein kinase) MIP-1α makrofágový zánětlivý protein 1α (macrophage inflammatory protein 1α) mirna mikrorna (microrna) MM mnohočetný myelom (multiple myeloma) MMSET SET doména u mnohočetného myelomu (multiple myeloma SET domain) mrna mediátorová RNA (messenger RNA) mtor cílová molekula pro rapamycin u savců (mammalian target of rapamycin) Myc rodina transkripčních faktorů NF-κB jaderný faktor κb (nuclear factor-κb) P/CAF koaktivátory transkripce PEST doména bohatá na prolin, kyselinu glutamovou, serin a treonin PI3K fosfatidylinositol 3-kináza (phosphatidilinositol 3-kinase) p300/cbp koaktivátory transkripce R restrikční bod (restriction point) RAD51 rodina proteinů Raf rodina proteinkináz RAR receptory kyseliny retinové (retinoic acid receptors) Ras skupina proteinů Rb protein retinoblastom (retinoblastoma protein) RTK tyrozinkinázový receptor (receptor tyrosine kinases) RT-PCR reverzně transkripční polymerázová řetězová reakce (reverse transcription polymerase chain reaction) RXR receptory X kyseliny retinové (retinoic X receptors)

13 SRC1 koaktivátor steroidního receptoru 1 (steroid receptor coactivator-1) S6K1 ribozomální protein S6 kináza 1 (ribosomal protein S6 kinase 1) TC označení podskupin mnohočetného myelomu podle výskytu specifických translokací a dysregulace cyklinů D (translokace/cyklin) TCF rodina transkripčních faktorů specifická pro T-lymfocyty (T cell-specific transcription factor) TGFβ transformující růstový faktor β (transforming growth factor β) UTR nepřekládaná oblast (untranslated region) VEGF vaskulární endoteliální růstový faktor (vascular endothelial growth factor) Wnt Wingless-typ

14 1 ÚVOD Mnohočetný myelom je druhé nejčastější hematologické maligní onemocnění charakterizováno klonální proliferací plazmatických buněk a produkcí monoklonálního imunoglobulinu. Donedávna bylo toto onemocnění považováno za nevyléčitelné, dnes se uvádí, že léčitelné je, ale jenom u malé skupiny pacientů. Co se týká molekulární podstaty, jedná se o heterogenní onemocnění, vyskytují se početné i strukturní abnormality chromozomů. Mnohé studie uvádějí, že dysregulace cyklinů D patří ke sjednocujícím událostem v rané patogenezi mnohočetného myelomu. Téměř u všech pacientů s tímto onemocněním byla pozorována zvýšená exprese alespoň jednoho z cyklinů D, ale v mnoha případech je mechanizmus jejich zvýšené exprese neznámý. Mezi cykliny D patří cyklin D1, D2 a D3. Jejich primární funkcí je regulace buněčného cyklu. Společně s cyklinem E se podílejí na postupné fosforylaci proteinu retinoblastomu, a tím regulují progresi buněk z fáze G 1 do S. V posledních letech se ukazuje, že kromě této role v regulaci buněčného cyklu mají cykliny D, především však cyklin D1, také mnohé jiné funkce, kterými mohou přispívat k progresi maligních onemocnění. Cyklin D1 interaguje s různými transkripčními faktory, aktivuje některé jaderné receptory a podílí se i na opravě poškozené DNA v procesu homologické rekombinace. Cílem této bakalářské práce je popsat význam cyklinů D u mnohočetného myelomu. V první kapitole se zabývám regulací progrese buněčného cyklu. Na začátku uvádím historický přehled vedoucí k popisu obecných principů regulace buněčného cyklu, následně se věnuji regulaci buněčného cyklu obecně a v závěru se zaměřuji na přechod z fáze G 1 do S. V následující kapitole popisuji cyklin D1, regulaci jeho exprese a možné způsoby dysregulace. Dále uvádím jeho funkce nezávislé od katalytické aktivity cyklin dependentních kináz. Další kapitola je věnována cyklinům D2 a D3, následuje kapitola zabývající se myšími modely, na kterých byly studovány funkce cyklinů D. V poslední kapitole se věnuji mnohočetnému myelomu, nejprve obecné charakteristice onemocnění, pak incidenci, klinickým příznakům a nakonec jeho molekulární podstatě. 13

15 2 REGULACE BUNĚČNÉHO CYKLU 2.1 Historie Buněčný cyklus je univerzální proces, při kterém se buňky dělí a přispívají k růstu a vývoji organismu (Nurse, 2000). Časově je vymezen obdobím mezi koncem předchozí mitózy a začátkem následující. Členění buněčného cyklu na několik základních fází podle biochemických a morfologických charakteristik bylo navrženo v roce 1953 Howardem a Pelcem a dnes je obecně přijato. Jejich autoradiografická studie eukaryotických buněk vedla k rozdělení buněčného cyklu na fázi S a fázi mitotickou, interval předcházející S fázi, který je označován jako G 1 a interval následující po S fázi pojmenován jako G 2 (Howard a Pelc, 1953; Nurse 2000). V průběhu následujících let se vědci zabývali otázkou regulace buněčného cyklu. Důležitým pokrokem byla myšlenka, že buněčný cyklus by měl být považován za časově organizovaný sled událostí, kdy pozdější události jsou závislé od úspěšného dokončení těch předchozích (Hartwell, 1974). Příkladem je jev, kdy pomocí sníženého přísunu deoxyribonukleotidů dochází k inhibici fáze S a zároveň je blokován nástup mitózy. Aby k tomu mohlo dojít, je vyžadován soubor proteinů působících v signální dráze, která zprostředkovává skutečnost, že fáze S je nekompletní k efektorům mitózy (Nurse, 2000). Tato myšlenka byla dále rozvinuta do konceptu kontroly buněčného cyklu pomocí kontrolních uzlů (z angl. checkpoint control ), které v různých bodech cyklu kontrolují, zda byla předchozí událost provedena úspěšně (Hartwell a Weinert, 1989). Dalším důležitým koncepčním pokrokem byl návrh, že určité kroky buněčného cyklu můžou být limitující pro jeho progresi (Nurse, 1975). Za významný faktor byl považován buněčný růst, ukázalo se však, že limitující kroky se mohou lišit za různých okolností (Kacser a Porteaous, 1987). Faktory, které podporují progresi buněčného cyklu, byly identifikovány při studiu vajíček mořských bezobratlých a dělících se kvasinek. Studium mořských bezobratlých vedlo k objevení nestálého proteinu, jehož množství v průběhu buněčného cyklu kolísalo a byl pojmenován cyklin (Evans et al., 1983). U kvasinek byla charakterizována síť proteinů regulující nástup mitózy. Jádrem této skupiny byla protein kináza Cdc2p aktivovaná protein fosfatázou Cdc25p a inhibována protein kinázou Wee1p (Nurse, 1990). Cykliny a cyklindependentní kinázy (Cdk) byly pak v průběhu krátkého období identifikovány od kvasinek až po savce (Lee a Nurse, 1987) jako univerzální regulátory buněčného cyklu. V roce

16 získali Leland H. Hartwell, Tim Hunt a Sir Paul M. Nurse Nobelovu cenu za fyziologii a medicínu za jejich objevy klíčových regulátorů buněčného cyklu. 2.2 Obecná charakteristika regulace buněčného cyklu Klíčovou roli při přechodu z jedné fáze do další hrají cyklin-dependentní kinázy (Cdk). Je to rodina serin/treoninových protein kináz, které jsou aktivovány v různých místech buněčného cyklu a po aktivaci fosforylují cílové buněčné proteiny (Morgan, 1995). K aktivaci Cdk dochází po navázání regulační podjednotky zvané cyklin. Množství Cdk zůstává v průběhu buněčného cyklu stabilní, na rozdíl od množství cyklinů, jejichž koncentrace v průběhu cyklu kolísá (Obr. 1), čímž dochází k periodické aktivaci Cdk (Evans et al., 1983). Výjimku tvoří cykliny D, jejichž syntéza je závislá od stimulace růstovými faktory (Weinberg, 2007). Odlišné typy cyklinů a Cdk jsou potřebné v odlišných fázích buněčného cyklu (van den Heuvel a Harlow, 1993). Obrázek 1: Exprese různých typů cyklinů v průběhu buněčného cyklu (Weinberg, 2007; upraveno) Další úrovní aktivace Cdk je jejich fosforylace nebo defosforylace na konzervovaných treoninových a tyrozinových zbytcích (např. fosforylace treoninu 172 u Cdk4) pomocí komplexu Cdk7-cyklin H, označovaného také jako CAK - cyklin aktivující komplex. Tato fosforylace indukuje konformační změny Cdk a zvyšuje jejich schopnost vázat cykliny (Vermeulen et al., 2003). Aktivita Cdk může být inhibována pomocí Cdk inhibitorů (CKI), které se vážou buď na samotné molekuly Cdk nebo na komplexy Cdk-cyklin. Existují dvě odlišné rodiny CKI, rodina INK4, která je aktivní v průběhu fáze G 1, a rodina Cip/Kip aktivní v průběhu celého buněčného cyklu. Do skupiny INK4 patří p15 (INK4b), p16 (INK4a), p18 15

17 (INK4c) a p19 (INK4d). Tyto CKI se specificky vážou na Cdk4 a Cdk6, zabraňují navázání cyklinů D a tím je inaktivují. Druhá rodina inhibitorů, rodina Cip/Kip, zahrnuje p21 (Waf1, Cip1), p27 (Cip2), p57 (Kip2) a inaktivuje komplexy cyklinů s příslušnými Cdk (Weinberg, 2007). Aktivita CKI je regulována intracelulárními a rovněž i extracelulárními signály. Např. exprese genu p21 je pod transkripční kontrolou genu pro nádorový supresor p53, který kontroluje integritu genomu, inhibuje přechod z G 1 do S, pokud došlo k poškození genetické informace. Na druhé straně, exprese a aktivace p15 a p27 vzrůstá v odpovědi na transformující růstový faktor β (TGF β) přispívající k zastavení buněčného cyklu (shrnuto v Vermeulen et al., 2003). 2.3 Regulace progrese z G 1 do S Část buněčného cyklu označována jako G 1 (z angl. growth ) je fází buněčného růstu charakterizovaná zvýšenou mírou proteosyntézy a metabolizmu. V průběhu této fáze buňka integruje mitogenní a růst inhibující signály a rozhoduje se, jestli bude v buněčném cyklu pokračovat. Bod, který reprezentuje nevratný závazek buňky přejít mitózou, se označuje jako restrikční bod (R). R rozděluje buněčný cyklus na část závislou na růstových faktorech a část na růstových faktorech nezávislou. Z tohoto důvodu byla také fáze G 1 rozdělena na dvě části, část G 1 -postmitotická (G 1 -pm) a část G 1 -pre-s (G 1 -ps), odděleny jsou právě restrikčním bodem (Zetterberg et al., 1995). Přítomnost růstových faktorů určuje, zda buňka v G 1 -pm přejde přes R a následně bude pokračovat eventuálně až do mitózy nebo z důvodu nedostatku růstových signálů buňka vystoupí z cyklu a vstoupí do klidového stádia označovaného jako G 0 (Ho a Dowdy, 2002). Následující fáze S (z angl. synthesis ) je doba, kdy dochází k replikaci buněčné DNA. Existují dvě hlavní třídy cyklinů řídících přechod buněk z fáze G 1 do S: cykliny D a cykliny E. Cykliny D interagují s Cdk4 a Cdk6, cykliny E tvoří komplexy s Cdk2. Aktivní komplexy cyklinů D a E s jejich příslušnými Cdk se podílejí na fosforylaci proteinu retinoblastomu (Rb). Nefosforylovaná a hypofosforylovaná forma Rb na sebe váže rodinu transkripčních faktorů E2F, které regulují transkripci genů kritických pro přechod do fáze S (Lundberg a Weinberg, 1998). V průběhu rané fáze G 1 určitý typ cyklinů D (D 1, D 2, D 3 ), v závislosti na typu tkáně, sestavuje holoenzym s jednou ze dvou katalytických podjednotek, buď s Cdk4 nebo s Cdk6. Jejich různou kombinací může vzniknout šest typů holoenzymů, které vykazují podobné 16

18 biochemické funkce (Sherr a McCormick, 2002). Exprese jednotlivých typů cyklinů D je regulována různými transkripčními faktory, což umožňuje různým typům extracelulárních signálů ovlivnit aktivitu Cdk4/6 (Weinberg, 2007). Po vazbě cyklinu D na Cdk4 anebo Cdk6 dochází k fosforylaci Rb a vzniká tzv. hypofosforylovaná forma Rb (Ho a Dowdy, 2002). Rb obsahuje 16 potenciálních míst pro fosforylaci, byla však identifikována tři místa, která jsou preferována komplexy cyklinů D s Cdk4/6, konkrétně Ser 780, Ser 795 a Thr 826 (shrnuto v Martinsson et al., 2005). Fosforylace proteinu Rb komplexem cyklin D-Cdk4/6 vede k disociaci histonových deacetyláz (HDAC), chromatin remodulujících enzymů, což vede k ukončení represe exprese genu pro cyklin E. Kromě toho, tato iniciální fosforylace Rb indukuje intramolekulární interakce mezi centrální doménou Rb a jejím C-koncem, což umožní komplexu cyklinu E s Cdk2 fosforylovat Ser 567, který je u nefosforylované Rb nepřístupný v její centrální doméně (Harbour et al., 1999). Komplex cyklinu E s Cdk2 je suprimován Cdk inhibitorem p27 Kip1 (Obr. 2). Bylo však zjištěno, že p27 Kip1 a rovněž i p21 Cip1 nepůsobí inhibičně na komplex cyklin D-Cdk4/6, ale že ho naopak aktivují (Cheng et al., 1999). Proto po tom, co vzroste koncentrace cyklinu D, je vyžadováno větší množství molekul p27 Kip1 k vytvoření aktivního komplexu cyklin D-Cdk4/6 a dochází k odloučení p27 Kip1 od komplexu cyklin E-Cdk2. Z tohoto důvodu se předpokládá, že vazba p27 Kip1 na cyklin D-Cdk4/6 přispívá k aktivaci komplexu cyklinu E s Cdk2 (Sherr a McCormick, 2002). Obrázek 2: Úloha molekul p21 Cip1 a p27 Kip1 při regulaci rozdílných komplexů cyklinů s Cdk. Komplexy cyklinů D s Cdk4/6 aktivují, ostatní komplexy, například cyklin E-Cdk2, inhibují (Weinberg, 2007; upraveno). 17

19 Aktivní komplex cyklin E-Cdk2 fosforyluje Rb a tvoří tím hyperfosforylovanou formu Rb, která uvolňuje rodinu transkripčních faktorů E2F, čímž se iniciuje transkripce genů potřebných pro přechod do fáze S, včetně genu pro cyklin E (Lundberg a Weinberg, 1998). Dalším substrátem komplexu cyklin E-Cdk2 je jeho inhibitor p27 Kip1. Fosforylací je p27 Kip1 označen pro ubikvitinaci a následnou degradaci proteasomem. Tvoří se tak pozitivní zpětná vazba, kdy komplex cyklin E-Cdk2 suprimuje protein Rb, uvolňují se transkripční faktory E2F, to vede ke zvýšené expresi cyklinu E, který pak v komplexu s Cdk2 může pokračovat v supresi Rb a fosforylaci p27 Kip1. Tento mechanizmus zajišťuje progresi přes poslední část fáze G 1 do S (Foster et al., 2011). Po zjištění, že fosforylace proteinu Rb komplexem cyklin D-Cdk4/6 je vyžadována pro následnou fosforylaci komplexem cyklin E-Cdk2 (Lundberg a Weinberg, 1998), se předpokládá, že Rb kontroluje progresi fází G 1 prostřednictvím své postupné fosforylace (Obr. 3) (Weinberg, 2007). Odnětí mitogenních signálů před restrikčním bodem má za následek zastavení buněčného cyklu a vstup buňky do klidové fáze G 0. Transkripce genu pro cyklin D je ukončena, dochází k rapidní degradaci holoenzymu cyklin D-Cdk4/6. Uvolněné molekuly p27 Kip1 inhibují aktivitu komplexů cyklin E-Cdk2 a umožňují tak opětovnou reakumulaci nefosforylovaných proteinů p27 Kip1. Inhibice G 1 cyklin dependentních kináz vrací Rb do nefosforylovaného (aktívního) stavu a buňka opouští cyklus (Sher a McCormick, 2002). Obrázek 3: Postupná fosforylace proteinu Rb zajišťující progresi přes fázi G 1. (Foster et al., 2011; upraveno). 18

20 3 CYKLIN D1 Cyklin D1 byl poprvé popsán v roce 1991 dvěma na sobě nezávislými skupinami. První skupina identifikovala cyklin D1 při hledání genů, jejichž exprese je indukována růstovými faktory (Matsushime et al., 1991), a druhá skupina identifikovala cyklin D1 díky jeho schopnosti nahradit funkci cyklinů působících ve fázi G 1 u kvasinek (Xiong et al., 1991). Tato počáteční zjištění naznačila, že cyklin D1 reguluje buněčný cyklus. Množství studií pak definovalo způsob, kterým cyklin D1 reguluje progresi buněčného cyklu a naznačilo způsob, kterým přispívá k maligní transformaci savčích buněk. Gen kódující cyklin D1 (CCND1) se nachází v lokusu 11q13. Skládá se z pěti exonů a jeho expresí vzniká 295 aminokyselin dlouhý produkt (Obr. 4). Existuje i druhá isoforma cyklinu D1, která vzniká alternativním sestřihem a označuje se cyklin D1b. Cyklin D1b je dlouhý 274 aminokyselin, s cyklinem D1 je identický na prvních 240 aminokyselinách a liší se svým C koncem, kde postrádá exon 5 nesoucí některé klíčové interakční motivy včetně aminokyselinového zbytku Thr286, jehož fosforylací je kontrolován export cyklinu D1 z jádra a stabilita tohoto proteinu (Knudsen et al., 2006). Ve srovnání s cyklinem D1 se poločas rozpadu cyklinu D1b neliší. Rozdílná je ale lokalizace cyklinu D1b, který je konstitutivně lokalizován v buněčném jádře (Lu et al., 2003; Solomon et al., 2003). Obrázek 4: Proteinová struktura cyklinu D1 (zeleně) v komplexu s Cdk4 (modře) ( upraveno) 19

21 3.1 Regulace exprese cyklinu D1 Exprese a akumulace cyklinu D1 je indukována růstovými faktory a je regulována na více úrovních zahrnujících zvýšenou míru transkripce a translace genu CCND1 a zvýšenou stabilitu vzniklého proteinu. Extracelulární signály v buňce spouštějí signální dráhy sbíhající se do vazebních míst na promotoru genu CCND1, promotor aktivují nebo inhibují, a tím regulují transkripci tohoto genu. Regulace transkripce je primárně zprostředkována signálními dráhami Ras (Obr. 5) (Winston et al., 1996). Obrázek 5: Regulace aktivity cyklinu D1 pomocí signální dráhy Ras. Šedě zvýrazněna signální dráha Ras aktivuje transkripční faktory (např. AP1), které zvyšují expresi genu pro cyklin D1. Vytvoření komplexu cyklin D1-Cdk4-Cip/Kip protein je řízenou tou samou signální dráhou (zvýrazněno oranžově). GSK-3β může spustit export cyklinu D1 z jádra a jeho následnou degradaci v proteasomu. Odlišná signální dráha Ras (zvýrazněna modře) negativně reguluje GSK-3β a zvyšuje tak stabilitu cyklinu D1 (Sherr a McCormick, 2002; upraveno) Dráha Ras-Raf-MEK-ERK Po stimulaci mitogeny aktivovaný tyrozinkinázový receptor (RTK) spouští signální kaskádu Ras-Raf-MEK-ERK, která způsobuje zvýšenou transkripci genu pro cyklin D1 (Marshall, 1999). Aktivace této dráhy vyžaduje vazebné místo pro transkripční faktory ETS v promotoru cyklinu D1 (Albanese et al., 1995). Další funkcí MEK je regulace sestavování 20

22 holoenzymu cyklin D1-Cdk4 (Cheng et al., 1998). Vzniklý komplex se hromadí na membráně buněčného jádra, kde pro svoji aktivaci a přesun do jádra buňky potřebuje asociaci s molekulami p21 anebo p27 (LaBaer et al., 1997; Cheng et al., 1999). Zvýšená transkripce je doprovázená zvýšenou mírou translace a sníženou mírou proteolýzy, které jsou spouštěny odlišnou signální dráhou Ras, zahrnující PI3K (fosfatidylinositol-3-kináza) a Akt. Vzrůstající translace cyklinu D1 je zprostředkována signální kaskádou PI3K-Akt-mTOR-S6K1 (Weng et al., 1998), zatím co signální dráha způsobující sníženou degradaci cyklinu D1 zahrnuje PI3K-Akt-GSK3β (Diehl et al., 1998) Dráhy Ras-PI3K-Akt-mTOR-S6K1 a Ras-PI3K-Akt-GSK3β PI3K ovlivňuje translaci genu pro cyklin D1. Důležitou úlohu této signální dráhy má kináza mtor (z angl. mammalian target of rapamycin, cíl rapamycinu u savců), která fosforyluje S6K1 (Weng et al., 1998). Aktivovaná S6K1 fosforyluje 40S ribozomální podjednotku proteinu S6, který podporuje translaci proteinů obsahujících sekvenci několika pyrimidinů na 5 konci (Pullen a Thomas, 1997). Do translace cyklinu D1 je zapojen další cíl kinázy mtor, a to represor 4E-BP1. Tento protein se váže na protein eif-4e, brání tak vytvoření transkripčního iniciačního komplexu eif-4f. Fosforylace represoru 4E-BP1 zprostředkovaná kinázou mtor zabraňuje inhibici transkripce genu CCND1 (Richter a Sonenberg, 2005). Aktivace proteinkinázy B (Akt) prostřednictvím PI3K vede k akumulaci cyklinu D dalším post-transkripčním mechanizmem zahrnujícím GSK3β (glykogen syntáza kináza 3β). GSK-3β může fosforylovat cyklin D1 na Thr-286 a spustit tak jeho export z jádra a následnou ubikvitinaci a degradaci v proteasomu. Akt fosforyluje GSK3β a sníží tím jeho katalytickou aktivitu. Sníží se tak export cyklinu D1 z jádra a jeho cytoplazmatická degradace, což má za následek akumulaci cyklinu D1 v jádře (Diehl et al., 1998) Transkripční faktory NF-κB Do rodiny transkripčních faktorů NF-κB označované také jako Rel patří pět proteinů: RelA (p65), c-rel, RelB, p50 a p52. Tyto proteiny sdílejí Rel homologickou doménu na N konci, odpovědnou za vytváření homo- a heterodimerů a za vazbu na DNA. Transkripční aktivita je specifikována složením dimerů, závisí i na jejich buněčné lokalizaci a na asociaci s inhibičními proteiny IκB (Hayden a Ghosh, 2008). 21

23 Proteiny NF-κB se vyskytují v cytoplazmě všech eukaryotických buněk v neaktivním komplexu s inhibičními proteiny IκB (Baeuerle a Baltimore, 1996). Po stimulaci jsou proteiny IκB fosforylovány a degradovány proteazomem 26S, což vede k uvolnění transkripčního faktoru NF-κB (Obr. 6). Aktivní dimery pak vstupují do jádra, kde se vážou na vazebný element -κb a regulují transkripci genů, které obsahují tento element ve svém promotoru (Hayden a Ghosh, 2008). Obrázek 6: Signální dráha NF-κB. Po stimulaci dochází k fosforylaci proteinů IκB a následně k jejich degradaci v proteasomu. To umožňuje transkripčním faktorům NF-κB přechod do jádra a regulaci transkripce cílových genů ( upraveno). NF-κB reguluje transkripci genu pro cyklin D1 přímo navázáním na promotor tohoto genu. Bylo zjištěno, že RelA (p65) je potenciální aktivátor transkripce genu CCND1 (Guttridge et al., 1999). Na druhé straně, Rubio et al. (2012) zjistili, že cyklin D1 může inhibovat transkripční aktivitu NF-κB. Předpokládali, že tuto funkci vykonává zadržováním NF-κB v cytoplazmě buňky nebo blokováním vazby NF-κB na DNA cílových genů. Ukázalo se, že cyklin D1 se může vázat na IκB segmenty promotorů cílových genů, podporovat vazbu histonových deacetyláz a tím inhibovat funkci NF-κB. Byl navržen model, kdy aktivace NFκB indukuje expresi cyklinu D1 a progresi buněčného cyklu, ale v přítomnosti velkého množství cyklinu D1 se tento cyklin může vázat na svůj vlastní promotor, nabírat 22

24 korepresorové komplexy, které inhibují aktivitu NF-κB. Cyklin D1 tedy může inhibovat aktivitu NF-κB jako zpětnovazebný mechanizmus (Rubio et al., 2012) Dráha Wnt/β-katenin Wnt proteiny představují rodinu ligandů bohatých na cystein, které jsou esenciální pro široké spektrum fyziologických procesů (Logan a Nusse, 2004). Vážou se na koreceptory LRP-5 nebo -6 a Frizzled receptor a aktivují β-katenin dependentní Wnt dráhu (Obr. 7). Výsledkem aktivace této Wnt signální dráhy je akumulace β-kateninu v cytoplazmě a jeho následná translokace do buněčného jádra, kde plní svou funkci (van de Wetering et al., 1997). V nepřítomnosti Wnt proteinů je v cytoplazmě buňky udržována nízká hadina β- kateninu pomocí GSK3β, která ho fosforylací označí pro ubikvitinaci a následnou degradaci v proteasomu (Zeng et al., 1997). Po vazbě proteinů Wnt na příslušný komplex receptorů je funkce GSK3β blokována. Hypofosforylovaný β-katenin se akumuluje v cytoplazmě a je translokován do buněčného jádra, kde aktivuje transkripční faktory TCF (z angl. T cellspecific transcription factor) nebo LEF (z angl. lymphoid enhancer-binding factor 1), čímž reguluje expresi cílových genů včetně genu pro cyklin D1 (Molenaar et al., 1996; Tetsu a McCormick, 1999). Obrázek 7: Wnt signální dráha. A: neaktivní, β-katenin je degradován. B: aktivovaná, β-katenin se váže na transkripční faktory LEF nebo TCF a aktivuje transkripci cílových genů. ( upraveno) 23

25 3.2 Dysregulace exprese cyklinu D Dysregulace na molekulární úrovni Dysregulace exprese cyklinu D1 a poruchy regulace buněčného cyklu patří k hlavním znakům maligní transformace (Hanahan a Weinberg, 2011). Exprese cyklinu D1 je regulována na více stupních, přičemž v průběhu maligní transformace může být ovlivněn každý z nich (Obr. 8). Mutace způsobující aktivaci transkripčních faktorů nebo signálních drah, které je regulují, můžou způsobit konstitutivní expresi cyklinu D1 a přispět tak k progresi onemocnění (Klein a Assoian, 2008). Zvýšená transkripce genu CCND1 může být důsledkem dysregulace mitogenní signalizace a následní aktivace tyrozinkinázových receptorů. Buňky mohou také exprimovat zvýšené množství RTK a být tak citlivější na přítomnost mitogenů nebo může dojít ke konstitutivní aktivaci složek výše zmíněných signálních drah (Hanahan a Weinberg, 2011). Dalším mechanizmem zvýšené exprese cyklinu D1 je nepřítomnost microrna (mirna), jejichž cílem je CCND1 (Musgrove et al., 2011). mirna jsou krátké, jednořetezcové, nekódující molekuly RNA, působící jako negativní regulátoř genové exprese na posttranskripční úrovni. mirna rozeznávají 3 UTR (z angl. untranslated region) mrna, potlačují translaci příslušných mrna nebo snižují stabilitu transkriptů, v závislosti na stupni komplementarity mezi mirna a její cílovou mrna (shrnuto v Bartel, 2009). V souvislosti se zvýšenou expresí cyklinu D1 byla pozorována ztráta nebo snížená exprese mir-15a a mir-16 (Bonci et al., 2008; Bandi et al., 2009), mir-17 (Yu et al., 2008), let-7b (Schultz et al., 2008), mir-503 a mir-19a (Jiang et al., 2009). V současné době ještě není zcela jasné, jakou důležitou roli mají delece těchhle mirna při zvýšené expresi cyklinu D1. Vzhledem k tomu, že existují i další potenciální mirna, jejichž cílem je cyklin D1, je potřeba dalších prací, které by se věnovali téhle problematice (Jiang et al., 2009) Cytogenetické změny Translokace zahrnující oblast těžkého řetězce imunoglobulinu (IgH) na chromozomu 14q32 patří mezi významné cytogenetické změny v patogenezi různých hematologických maligních onemocnění včetně mnohočetného myelomu (MM). Výsledkem těchto translokací je zvýšena exprese genů translokovaných pod kontrolu zesilovačů transkripce IgH na 14q32 (Kuehl a Bergsagel, 2002). Molekulární analýzy ukázali, že stejné translokace u různých 24

26 onemocnění mohou zahrnovat různé body zlomů v lokusu IgH a rovněž i v lokusu translokovaných onkogenů (Neri et al., 1988). Lokus IgH obsahuje minimálně tři různé zesilovače transkripce, jeden 5 intronový zesilovač (Eµ) a dva 3 zesilovače (Eα1 a Eα2) (Ong et al., 1998). Zlomy v lokusu IgH mají obyčejně za následek rozdělení zesilovačů transkripce na chromozomy zapojené do translokace, což může teoreticky vést k deregulaci genů na obou chromozomech. Výsledkem translokace t(11;14)(q13;32) u MM je přemístění genu CCND1 pod kontrolu zesilovačů 3 Eα a následné zvýšení exprese cyklinu D1 (Specht et al., 2004). Další cytogenetickou změnou, která je spájena se zvýšenou expresí cyklinu D1 je trizomie chromozomu 11. Mechanizmus účinku této abnormality zatím nebyl přesně objasněn. Výsledky studií sledujících vztah exprese cyklinu D1 a trizomie chromozomu 11 se liší. Zatím co imunohistochemické metody odhalili expresi cyklinu D1 jen u % případů s trizomii chromozomu 11 (Prunieri et al., 2000; Specht et al., 2004), při metodě realtime RT-PCR byla u většiny případů s touto aberací pozorována zvýšená exprese cyklinu D1 (Soverini et al., 2003; Specht et al., 2004). U některých pacientů se solidními nádory a zvýšenou expresí cyklinu D1 byla popsaná amplifikace lokusu 11q13 (Schuuring, 1995). Obrázek 8: Regulace a možnosti deregulace exprese cyklinu D1 (Musgrove et al., 2011; upraveno). 25

27 3.3 Nekatalytické funkce cyklinu D1 Mnohé studie naznačují, že ne všechny funkce cyklinů D závisí na fosforylaci substrátů. Hlavní nekatalytickou funkcí cyklinů D se zdá být regulace transkripce. Interakce cyklinů D s transkripčními faktory se vyskytují převážně v motivech, které nejsou mezi cykliny D1, D2 a D3 konzervovány, což značí o specificitě účinků jednotlivých cyklinů D na regulaci transkripce (Reutens et al., 2001). Cyklin D1 tvoří fyzickou asociaci s více než 30 transkripčními faktory nebo transkripčními koregulátory. Kromě toho váže regulátory histonové acetylace a metylace. Zdá se tedy, že jeho úlohou je spojovat transkripční faktory s chromatin modifikujícími enzymy a modulovat tak transkripční aktivitu promotorů různých genů (shrnuto v Musgrove et al., 2011). Další dobře popsanou nekatalytickou funkcí cyklinů D je vazba molekul p21 a p27 komplexem cyklin D-Cdk4/6, která vede k nepřímé aktivaci Cdk2 (Sherr a McCormick, 2002). Cyklin D1 kromě toho reguluje expresi genů zapojených v procesu replikace DNA a interaguje s mnoha proteiny zahrnutými do odpovědi na poškození DNA (Jirawatnotai et al., 2011; Li et al., 2010) Aktivace jaderných receptorů Jaderné receptory jsou skupinou transkripčních faktorů, které můžou být aktivovány vazbou ligandu. Mechanizmus aktivace jaderných receptorů a ovlivnění transkripce vyžadují přítomnost koregulátorů (koaktivátorů a korepresorů). V nepřítomnosti ligandu jaderné receptory inhibují transkripci díky dominantní asociaci s komplexy korepresorů, které aktivují histonové deacetylázy. Konformační změny indukovány vazbou ligandu uvolňují molekuly korepresorů a následně dochází k asociaci s molekulami koaktivátorů a k aktivaci histonových acetyláz. Zvýšená acetylace je spojována s aktivací genové transkripce, umožňuje rozvolnění struktury a remodelaci chromatinu, což má za následek zpřístupnění cílových promotorů (Strahl a Allis, 2000). Vazba cyklinu D1 na jaderný receptor byla poprvé popsána v případě estrogenového receptoru. Cyklin D1 je pozitivní regulátor transkripce řízené estrogenovým receptorem α (ERα). Cyklin D1 zvyšuje transkripci genů obsahujících elementy ERE (z angl. estrogen response elements) tím, že podporuje interakci ERα s koaktivátory SRC1 (z angl. steroid receptor coactivator-1) a AIB1 (z angl. amplified in breast cancer 1) (Zwijsen et al., 1997; 26

28 Neuman et al., 1997). V kontrastu k jeho funkci aktivace ERα signalizace, cyklin D1 inhibuje aktivitu androgenového receptoru (AR). Inhibice AR může být způsobená jednak kompeticí cyklinu D1 s koaktivátory AR, nebo tím, že cyklin D1 podporuje vazbu korepresorů na AR (Reutens et al., 2001) Interakce cyklinu D1 s koaktivátory transkripce Cyklin D1 interaguje s transkripčními koaktivátory p300/cbp a P/CAF, které patří ke komplexu mnoha proteinů podílejících se na aktivaci transkripce pomocí jejich histonacetylázové aktivity (McMahon et al., 1999; Reutens et al., 2001). Přítomnost cyklinu D1 tedy ovlivňuje lokální acetylaci histonů a metylaci specifických promotorů (Hulit et al., 2004). Také funkce proteinu Rb je kromě fosforylace regulována i acetylací, na které se podílejí p300 a P/CAF. Acetylace proteinu Rb brání efektivní fosforylaci Rb komplexem cyklin E-Cdk2, udržuje buňky ve stavu zpomaleného růstu a umožňuje jim odpovědět na signály indukující diferenciaci (Chan et al., 2001). K acetylaci proteinu Rb, a následné neschopnosti proteinu Rb interagovat s komplexy cyklinů a Cdk, dochází i při poškození DNA buňky (Markham et al., 2006). S ohledem na fyzickou asociaci cyklinu D1 s p300/cbp a P/CAF a na známou funkci cyklinu D1 při fosforylaci proteinu Rb a na fakt, že protein Rb může být acetylován, budou zajímavé další studie, které určí relativní roli cyklinu D1 v regulaci fosforylace vs. acetylace proteinu Rb Úloha cyklinu D1 při opravě poškozené DNA Jedním ze způsobů oprav poškozené DNA je proces homologní rekombinace, ve kterém hrají důležitou úlohu proteiny BRCA2 a RAD51. RAD51 je rekombináza řídící proces homologní rekombinace, BRCA2 interaguje s molekulami RAD51 a pomáhá jejich lokalizaci do míst dvojřetězcových zlomů. Nedávno bylo zjištěno, že BRCA2 podporuje vazbu cyklinu D1 do poškozených míst DNA, kde cyklin D1 přímou interakcí pomáhá vázat rekombinázu RAD51. Tento proces je indukován radiací. Snížení množství cyklinu D1 oslabuje vazbu RAD51 na poškozenou DNA, inhibuje proces homologické rekombinace a zvyšuje tím citlivost buněk k radiaci. Tento efekt byl pozorován u maligních buněk postrádajících protein Rb. Bylo tak zjištěno, že 27

29 zatím co je cyklin D1 postrádatelný pro proliferaci Rb-negativních buněk, hraje důležitou roli v opravě radiací poškozené DNA (Jirawatnotai et al., 2011). Tato neočekávaná funkce protoonkogenu cyklinu D1 naznačuje, že léčba cílená na cyklin D1 může být užitečná i pro Rb-negativní nádory, které se dosud zdály být neovlivněné inhibicí exprese cyklinu D1 (Jirawatnotai et al., 2011) Cyklin D1 a rezistence k apoptóze Malé množství cyklinu D1 přítomné konstitutivně v B-lymfocytech nemá vliv na buněčnou proliferaci, ale podílí se na rezistenci těchto buněk k různým apoptotickým stimulům. Proteomická analýza ukázala, že přítomnost cyklinu D1 vede k intracelulární akumulaci různých molekulárních chaperonů. Funkcí chaperonů je regulace sbalování proteinů, s proteiny interagují, stabilizují je, ale ve výsledné struktuře nejsou přítomny. Důležitým antiapoptotickým chaperonem, jehož exprese je aktivována cyklinem D1, je Hsp70 (z angl. heat shock protein ) (Rouré et al., 2008). Hsp70 se váže na proteiny Bax a AIF (apoptózu indukující faktor) a znemožňuje jejich funkci navodit apoptózu. Ovlivňuje také transkripční faktory NF-κB, které regulují jak proapoptotické, tak i anti-apoptotické geny. Pozorována byla vazba Hsp70 na proteiny IκB, která stabilizovala jejich fosforylovanou formu, což vedlo k ukončení represe dimeru p50/c-rel. Následně byly aktivovány některé z jejich cílových genů, které mají antiapoptotickou funkci (Rouré et al., 2008). Z této studie vyplývá, že molekulární chaperon Hsp70 může být mediátorem cytoprotektivního efektu cyklinu D1, bránícího navození apoptózy určitými léky (Rouré et al., 2008). Cytoprotektivní funkce chaperonu Hsp70 byla pozorována také u myelomových buněk (Liu et al., 2006). Hsp70 tedy může být atraktivním cílem léčby mnohočetného myelomu v případech exprimujících cyklin D1 (Rouré et al., 2008). 28

30 4 CYKLINY D2 A D3 4.1 Porovnání cyklinů D2 a D3 s cyklinem D1 Počáteční analýzy struktury všech tří cyklinů D naznačily jejich funkční redundanci a jejich různou expresi v odlišných typech tkání. Základní funkcí cyklinů D je fosforylace proteinu Rb (Ho a Dowdy, 2002). Exprese jednotlivých typů cyklinů D je tkáňově specifická, např. zdravé B-lymfocyty exprimují jen cykliny D2 a D3 a neexprimují cyklin D1. Každý z cyklinů D je kódován jiným genem. Gen pro cyklin D1 se nachází v lokusu 11q13, gen pro cyklin D2 v lokusu 12p13, a gen pro cyklin D3 v lokusu 6p21 (Xiong et al., 1992). Celkově jsou proteinové struktury cyklinu D2 a cyklinu D3 identické s cyklinem D1 z 62 %, respektive 51 %, a z 62 % jsou si identické navzájem (Obr. 9). Největší homologie mezi cykliny D (78 %) se vyskytuje v doméně označované jako cycling box, která zprostředkovává vazbu cyklinů s cyklin-dependentními kinázami a je nevyhnutná pro interakci s inhibitory cyklin-dependentních kináz p21, p27 a p57. Všechny tři cykliny D sdílejí LxCxE motiv na N konci, kterým se vážou na protein Rb. Na C konci mají doménu PEST bohatou na prolin, kyselinu glutamovou, serin a treonin, která je charakteristická pro rychle degradovatelné proteiny. Na C konci se nachází i specifický treoninový zbytek, fosforylací kterého je spouštěná jejich degradace v proteasomu (thr286 u cyklinu D1, thr280 u cyklinu D2 a thr283 u cyklinu D3). Úsek mezi doménou cycling box a C koncem obsahuje domény, které jsou mezi cykliny D jen slabě konzervovány a jsou odpovědné za interakci cyklinu D1 s transkripčními faktory (shrnuto v Musgrove et al., 2011). Obrázek 9: Srovnání proteinových struktur cyklinů D2 a D3 s cyklinem D1. Všechny cykliny D obsahují LxCxE motiv, kterým se vážou na protein Rb. Největší homologie se dále vyskytuje v doméně cycling box, která sprostředkovává jejich vazbu na Cdk. Na C konci mají doménu PEST, která je charakteristická pro rychle degradovatelné proteiny (Musgrove et al., upraveno). 29

31 4.2 Funkce cyklinu D3 nezávislá na Cdk Cyklin D3 hraje úlohu při regulaci transkripce zprostředkované kyselinou retinovou. Kyselina retinová zprostředkovává transkripci pomocí dvou typů jaderných receptorů, RAR (z angl. retinoic acid receptors ) a RXR (z angl. retinoic X receptors ), které se jako heterodimery vážou na promotory cílových genů. Jako koaktivátor jaderných retinových receptorů působí protein CRABP2 (z angl. cellular retinoic acid-binding protein 2). Cyklin D3 interaguje s proteinem CRABP2 a jeho receptorem RARα a je jediný z cyklinů D, u kterých byla pozorována tato interakce. Byl navržen model, kdy se CRABP2 po vazbě na svůj receptor RARα přesouvá do buněčného jádra, kde tvoří komplex s cyklinem D3. Úlohou cyklinu D3 je zvyšovat stabilitu komplexu CRABP2-RARα a zesilovat tak jejich funkci regulace transkripce (Despouy et al., 2003). Kyselina retinová řídí transkripci genů zahrnutých do kontroly buněčné proliferace, diferenciace a apoptózy a bylo zjištěno, že se podílí na specifickém zadržení myeloidních buněk ve fázi G1 buněčného cyklu (Dimberg et al., 2002). Zastavení buněčného cyklu zahrnuje regulaci exprese cyklinu D3 a inhibitorů Cdk (p18 a p21), ovlivňuje fosforylaci molekul Cdk a spouští defosforylaci proteinu Rb (Shimizu et al., 2000). Zvýšená exprese cyklinu D3 je v kontrastu se zastavením buněčného cyklu ve fázi G1. Cyklin D3 může být titrován komplexem CRABP2-RARα, což následně může vést k aktivaci transkripce genů působících v regulaci diferenciace (např. RAR, CRABP2, HOX, G-CSF) nebo genů pro p21 a p27, jejichž funkce je inhibice progrese buněčného cyklu (Despouy et al., 2003). 30

32 5 MYŠÍ KNOCK-OUT MODELY A CYKLINY D 5.1 Myši deficientní pro jeden z genů cyklinů D Pro vysvětlení, jestli mají jednotlivé cykliny D odlišné funkce při regulaci proliferace anebo diferenciace různých typů buněk, byly studovány myši deficientní pro gen jednoho typu cyklinu D (tzv. myší knock-out modely). Aby došlo k vypnutí exprese cílového genu, byla deletována část genu kódující doménu cycling box, což je úsek odpovědný za vazbu cyklinů na cyklin-dependetní kinázy, který je konzervován mezi cykliny všech eukaryot. Tato část byla nahrazena genem neo. Takto pozměněné embryonální kmenové buňky byly injikovány do myších blastocyst, čímž došlo k vytvoření chimérických myší heterozygotních pro jeden z cyklinů D. Po křížení těchto heterozygotů byly selektovány myši postrádající expresi genu pro cyklin D1/D2/D3 (Sicinski et al., 1995). Myši s deficitem cyklinu D1 byly životaschopné, vykazovaly však určité vývojové abnormality, omezené převážně na sítnici a na defekty v rozvoji prsní tkáně v průběhu těhotenství. Tyto myši byly celkově menší, vykazovaly křečovité sevření končetin (Obr. 10), a některé zahynuly předčasně v průběhu třech týdnů po narození, což bylo interpretováno jako důsledek vrozených abnormalit nervového systému (Sicinski et al., 1995). Myši neexprimující cyklin D2 byly také životaschopné. Samičky byly sterilní, samečci měli hypoplastické varlata, ale byli fertilní (Sicinski et al., 1996). Kromě toho byly u těchto myší pozorovány poruchy proliferace B-lymfocytů (Lam et al., 2000) a mírné abnormality postnatálního vývoje mozečku (Huard et al., 1999). Rovněž i myši neexprimující cyklin D3 byly životaschopné. Jejich tymus byl hypoplastický, poškozený byl vývoj T-lymfocytů závislý na pre-t receptoru (Sicinska et al., 2003). Podrobná analýza exprese cyklinů D u těchto myší vedla k závěru, že nejvíce postiženými tkáněmi myší deficientních na jeden z cyklinů D jsou tkáně, u nichž je za fyziologických podmínek exprimován především jeden cyklin D na úkor ostatních dvou. Například cyklin D1 je ve velké míře exprimován výhradně v prsní tkáni a v sítnici, ale společně s ostatními cykliny je detekován v mnohých jiných tkáních (Sherr a Roberts, 2004). 31

33 Obrázek 10: Zpomalený růst a abnormální sevření končetin po zdvihnutí za ocas u myší deficientních pro gen cyklinu D1 (vpravo). Na obrázku v porovnání se zdravou myší (vlevo), obě jsou 4 týdny staré (Sicinski et al., 1995). 5.2 Myši deficientní pro dva geny cyklinů D Jelikož analýza experimentů popsaných výše byla ztížená přítomností zbylých dvou cyklinů D, které mohly kompenzovat nepřítomnost daného cyklinu, byly vytvořeny kmeny exprimující jenom jeden typ cyklinu D. Vytvoření takových kmenů spočívalo v křížení myší deficientních pro jeden typ cyklinu D, které byly použity v předchozím studiu. Byl tak vytvořen kmen exprimující jenom cyklin D1, kmen exprimující cyklin D2 a další exprimující jen cyklin D3 (Ciemerych et al., 2002). Nejdříve byla pozorována embrya těchto myší v raném stadiu embryonálního vývoje. Embrya exprimující jenom jeden typ cyklinů D byla nerozeznatelná od kontroly. Proto byla u těchto sledovaných embryí analyzována exprese cyklinů D, která odhalila, že jejich tkáňově specifická exprese byla porušena a byla převážně nahrazena zvýšenou expresí přítomného cyklinu D. Tyto výsledky naznačily, že cykliny D mohou být aspoň v průběhu embryonálního vývoje zaměnitelné, nebo že vývoj určitých typů tkání může být nezávislý od přítomnosti cyklinů D (Ciemerych et al., 2002). V pozdějších stadiích těhotenství se objevily abnormality, které ohrozily životaschopnost těchto myší a vedly k jejich úmrtí ještě před narozením nebo těsně po něm. U tkání, které vykazovaly závažné abnormality, nebyla pozorována zvýšená exprese přítomného cyklinu D. Myši exprimující jen cyklin D1 zahynuly ke konci těhotenství, důvodem byla 32

34 těžká anemie. Většina myší exprimujících jen cyklin D2 zahynula na konci prvního dne po narození, příčinou byla aspirace mekonia (Ciemerych et al., 2002). Mekonium je fyziologický obsah gastrointestinálního traktu plodu, který může být vyloučen do plodové vody a následně být vdechnutý do plic a působit tak problémy s dýcháním (Greenough, 1995). Malá část myší exprimujících cyklin D2 přežila do dvou měsíců. Tyto myši byly porovnatelně menší, ale téměř všechny typy tkání byly vyvinuty normálně - s výjimkou sítnice, která byla hypoplastická. Myši exprimující jen cyklin D3 byly životaschopné, ale zahynuly v průběhu prvních tří týdnů. Vykazovaly zpomalený růst a poškozenou koordinaci. Byl u nich inhibován postnatální vývoj mozečku a měly taky hypoplastickou sítnici (Ciemerych et al., 2002). 5.3 Myši deficientní pro všechny tři geny cyklinů D Na základě výsledků studií myších kmenů exprimujících jenom jeden typ cyklinu se předpokládalo, že pro proliferaci savčích buněk je potřebná přítomnost alespoň jednoho typu cyklinu D. Pro potvrzení této teorie byl křížením cyklin D-deficientních myší vytvořen kmen, který postrádal expresi všech tří cyklinů D (Kozar et al., 2004). Bylo zjištěno, že embrya deficientní pro všechny tři geny cyklinů D se můžou vyvíjet normálně až do embryonálního dne 13.5, což je stadium, kdy už je vyvinuta většina tkání a orgánů. Po 13. dni se u nich vyskytly poruchy ve vývoji srdce, které měly za následek vznik edémů. Podobně jako u kmenů deficientních pro cykliny D2 a D3 se u myší deficientních pro geny všech tři cyklinů D rozvinula těžká anemie, což společně s poruchami cirkulace vedlo k úmrtí do 16. dne embryonálního vývoje (Kozar et al., 2004). Další experimenty ukázaly, že ztráta exprese cyklinů D vedla k neschopnosti hematopoetických kmenových buněk vstoupit do buněčného cyklu. Vznikla tedy otázka, jestli jsou cykliny D potřebné i pro buněčný cyklus ostatních typů progenitorových buněk. Dále byla testovaná vnímavost buněk deficietních pro geny cyklinů D na stimulaci onkogeny Myc a Ras a dalšími. Buňky byly na tyto onkogeny méně vnímavé, bylo tedy zjištěno, že přítomnost cyklinů D je potřebná pro onkogenickou transformaci, alespoň v případě těchto analyzovaných onkogenů (Kozar et al., 2004). 33

35 6 MNOHOČETNÝ MYELOM 6.1 Obecná charakteristika Mnohočetný myelom (MM) je hematologické nádorové onemocnění charakterizované neoplastickou klonální proliferací plazmatických buněk a jejich akumulací v kostní dřeni, přítomností monoklonálního proteinu v séru a/nebo v moči a osteolytickými lézemi (Hájek et al., 2007). MM tvoří přibližně 10 % hematologických malignit (Kyle a Rajkumar, 2004). Za příznivých prognostických podmínek při stanovení diagnózy je MM vyléčitelný u asi 10 % nemocných (Hájek et al., 2012). 6.2 Incidence MM tvoří 1 % všech druhů malignit a asi 10 % hematologických malignit (Rajkumar, 2011). Světově tvoří 0,8 % případů nově diagnostikované rakoviny. Incidence je vyšší v Severní Americe, Austrálii, Novém Zélandu, severní a západní Evropě ve srovnání s asijskými zeměmi (Parkin et al., 2005). V Evropě je diagnostikováno více než nových případů ročně (Krejčí et al., 2008). Výskyt MM v České republice jsou 4 případy na obyvatel (Hájek et al., 2007). Medián věku v čase diagnózy je zhruba 65 let (Kyle et al., 2003). 6.3 Klinické příznaky MM se manifestuje únavovým syndromem s celkovou slabostí, poklesem hmotnosti, zejména ale bolestmi různých častí skeletu, projevy anémie, zhoršené funkce ledvin a opakovanými, různě závažnými infekcemi. Často se vyskytuje nová, neočekávaná a neustupující bolest zad a vznik patologické zlomeniny. Vzácnějšími úvodními příznaky jsou projevy hyperviskózního syndromu a poruchy koagulace (Adam et al., 2006; Lonial 2010; Hájek et al., 2012). Mezinárodní myelomová skupina (The International Myeloma Working Group, IMWG) shrnula nejčastější symptomy poškození orgánů a tkání myelomem do zkratky CRAB (Tab. 1): C - hyperkalcémie, R - selhání ledvin, A - anémie, B - kostní změny (The International Myeloma Working Group, 2003). 34

36 Kritérium dysfunkce orgánů C - Hyperkalcémie (Calcium) R - Selhání ledvin (Renal insufficiency) A - Anémie (Anaemia) B - Kostní změny (Bone lesions) Podrobnější definice symptomu Kalcium > 2,75 mmol/l, nebo o 0,25 nad horní hranici normálního rozmezí Kreatinin > 177 μmol/l Hemoglobin < 100 g/l, nebo 20 g/l pod dolní hranici normálního rozmezí Lytická kostní ložiska, nebo osteoporóza s kompresivními frakturami Tabulka 1: CRAB - Kritéria poškození orgánů či tkání myelomem (The International Myeloma Working Group, 2003; Hájek et al., 2012) 6.4 Molekulární podstata MM MM vzniká pravděpodobně z postgerminální plazmatické buňky, s plasmablasty a dlouhožijícími plazmatickými buňkami sdílí silnou závislost na mikroprostředí kostní dřeně pro přežívání (Bergsagel a Kuehl, 2005). Na rozdíl od normálních plazmatických buněk si však myelomové buňky ponechávají potenciál nízké míry proliferace (1 % - 3 % buněk; Kuehl a Bergsagel, 2002). Podobně jako u jiných nádorů se i u MM vyskytují početní a/nebo strukturní abnormality chromozomů (Kuehl a Bergsagel, 2002). Charakteristické abnormality u MM jsou monozomie chromozomů 13, 14, 16, 22 a trizomie chromozomů 3, 5, 7, 9, 15, 19 a 21 (Fonseca et al., 2002a). Nejčastější strukturní aberace jsou aberace chromozomu 1, zahrnují hlavně delece na krátkém raménku (1p) a amplifikace na raménku dlouhém (1q). Delece 1p jsou asociovány s horší prognózou (Chang et al., 2007). Dalším nepříznivým prognostickým faktorem je zisk 1q21 (Němec et al., 2010) Změny ve struktuře chromozomů Kromě změn v počtu chromozomů se často vyskytují i reciproké chromozomální translokace zahrnující IgH lokus, 14q32, (Bergasagel et al., 1996) a méně často i IgL lokusy κ (2p12) anebo λ (22q11) (Fonseca et al., 2003). Díky těmto translokacím jsou různé geny, včetně onkogenů, translokovány pod kontrolu Ig zesilovače transkripce, který dysreguluje expresi jejich mrna (Bergsagel a Kuehl, 2001). Translokace IgH zahrnují sedm opakujících se chromozomálních partnerů a onkogenů: 11q13 (CCND1) 15 %; 12p13 (CCND2) < 1 %; 6p21 (CCND3) 2 %; 16q23 (MAF) 5 %; 35

37 20q11 (MAFB) 2 %; 8q24.3 (MAFA) < 1 %; 4p16 (MMSET a obvykle FGFR3) 15 % (Chesi a Bergsagel, 2011). Společná prevalence těchto chromozomálních partnerů u MM je asi 40 % případů. Tyto většinou jednoduché reciproké translokace se zdají být primárními translokacemi způsobenými chybou při izotopovém přesmyku IgH, protože zlomy se vyskytují většinou v přesmykových regionech, příležitostně blízko VDJ sekvencí (Fonseca et al., 2002b; Chesi a Bergsagel, 2011) Translokace t(4;14)(p16;q32) Chromozom 4p16 nese lokusy pro geny FGFR3 a MMSET. FGFR3 kóduje receptor 3 fibroblastového růstového faktoru, MMSET (z ang. multiple myeloma SET domain) je gen pro histon metyl transferázu a nedávno byla odhalena i jeho další funkce, působí i jako chromatin-remodelující faktor (Pei et al., 2011). Po poškození DNA je MMSET fosforylován na Ser102, navazuje se do míst dvouřetězcových zlomů, kde na sebe váže p53-vážicí protein (53BP1). 53BP1 odpovídá za akumulaci proteinu p53, zastavení v kontrolním bodě G2/M a intra-s-fázové zastavení v odpovědi na ionizující záření (Chesi a Bergsagel, 2011). Bod zlomu lokusu 14q32 se nachází v přesmykovém regionu a disociuje intronový zesilovač (Eµ) od zesilovače 3 (3 Eα). Po disociaci má každý zesilovač potenciál dysregulovat expresi příslušných genů, konkrétně intronový zesilovač dysreguluje transkripci MMSET a 3 zesilovač dysreguluje transkripci FGFR3 (Bergsagel a Kuehl, 2001). I když k dysregulaci MMSET dochází v každém případě této translokace, téměř třetina pacientů s translokací t(4;14)(p16;q32) neexprimuje FGFR3. Ztráta exprese FGFR3 může být spojena hlavně se ztrátou chromozomu 14, ale v některých případech je chromozom 14 přítomen a na ztrátě exprese se pak podílí jiný mechanizmus (Santra et al., 2003). Rozdíly v expresi zmíněných genů naznačují, že důležitějším onkogenem dysregulovaným při této translokaci je MMSET. Bylo zjištěno, že ztrátou jeho exprese se mění schopnost adheze buněk, potlačuje se jejich růst a následně podléhají apoptóze, proto by mohl být dobrým terapeutickým cílem (Martinez-Garcia et al., 2011). Dysregulovaná exprese FGFR3 je rovněž jasně onkogenní. Na druhé straně, nedávno se ukázalo, že i normální exprese FGFR3 může přispět k maligní transformaci B buněk (Zingone et al., 2010). Translokace t(4;14)(p16;q32) je nepříznivým prognostickým faktorem pro pacienty bez ohledu na to, zda je u nich změněná exprese FGFR3 (Keats et al., 2003). U téměř všech pacientů je tato translokace asociovaná s aberacemi na 13. chromozomu (Fonseca et al., 2001) a se zvýšenou expresí cyklinu D2 (Bergsagel et al., 2005). 36

38 Translokace t(14;16)(q32;q23) a t(14;20)(q32;q11) Translokace t(14;16)(q32;q23) aktivuje proto-onkogen c-maf, transkripční faktor leucinového zipu (Chesi et al., 1998) a translokace t(14;20)(q32;q11) ovlivňuje protoonkogen MAFB (Zhan et al., 2006). Hurt et al. (2004) zjistili, že zvýšená exprese c-maf ovlivňuje expresi integrinu β7, cyklinu D2 a C-C chemokinového receptoru 1 (CCR1, receptor pro chemokin MIP-1α). Překvapivým zjištěním bylo, že exprese c-maf byla zvýšená zhruba v polovině sledovaných případů, zatím co translokace t(16q23) se vyskytla jenom u 5-10 % případů. c-maf zesiluje adhezi myelomových buněk na stromální buňky kostní dřeně prostřednictvím interakcí mezi integrinem β7 a E-cadherinem. Tyto interakce myelomových buněk se stromálními buňkami indukují sekreci vaskulárního endoteliálního růstového faktoru (VEGF), který pak autokrinním nebo parakrinním působením podporuje proliferaci a přežívaní myelomových buněk a může indukovat angiogenezi (Obr. 11). Promotor cyklinu D2 obsahuje vazebné místo pro c-maf, cyklin D2 je tedy přímým cílem transaktivace c-maf. Důsledkem zvýšené exprese cyklinu D2 je zvýšená proliferace myelomových buněk (Hurt et al., 2004). Obrázek 11: Model znázorňující úlohu zvýšené exprese c-maf v patogenezi MM (Hurt et al., 2004; upraveno) Translokace t(11;14)(q13;q32) a t(6;14)(p21;q32) Translokace t(11;14)(q13;q32) se vyskytuje u % myelomových pacientů a indukuje zvýšenou expresi cyklinu D1 (Gabrea et al., 1999). Zdravé B lymfocyty cyklin D1 neexprimují, exprimují pouze cykliny D2 a D3 (Furukawa et al., 2000). Vzhledem k úloze 37

39 cyklinů D při přechodu buněk z fáze G1 do S se očekávalo, že dysregulace exprese cyklinu D1 povede ke zvýšení proliferace. Sled reakcí vedoucí k tomuto přechodu je však regulován Cdk inhibitory (např. p18ink4c), proto ke zvýšené proliferaci myelomových buněk dochází až po pozdějších onkogenních událostech, které inaktivují protein Rb nebo Cdk inhibitory (Bergsagel a Kuehl, 2005). Bylo zjištěno, že zvýšená exprese cyklinu D1 prodlužuje trvání S- fáze (Kuroda et al., 2008). Pacienti s touto translokací vykazují delší přežívání a dobrou odpověď na léčbu (Fonseca et al., 2002b). Na druhou stranu, Kuroda et al. (2008) uvádí, že zvýšená exprese cyklinu D1 sice může být příznivým prognostickým faktorem u některých skupin pacientů, ale může také indukovat nestabilitu genů myelomových buněk. Indukce genové nestability se může objevit při translokaci t(11;14)(q13;q32) vzniklé společně s trizomií chromozomu 11 v rané patogenezi onemocnění. Translokace 6p21 do přesmykové γ sekvence IgH je asociovaná se šestinásobným zvýšením exprese cyklinu D3 (Shaughnessy et al., 2001) Dysregulace cyklinů D a TC skupiny Přes nízkou míru proliferace buněk MM je množství mrna cyklinů D1, D2 anebo D3 téměř vždy relativně zvýšené v porovnání s množstvím mrna cyklinu D2 exprimovaným u zdravých proliferujících plazmablastů a výrazně zvýšené než u zdravých plazmatických buněk. Přibližně u 25 % případů MM je tato dysregulace způsobená IgH translokací zasahující gen CCND1 (11q13), CCND3 (6p21) nebo gen MAF (c-maf, 16q23 nebo MAFB, 20q11) kódující transkripční faktor pro cyklin D2. Téměř 40 % případů MM nemá translokaci t(11;14), ale bialelicky exprimuje cyklin D1. Většina zbylých případů, včetně těch s translokací zasahující geny MMSET a FGFR3 (4;14), exprimuje zvýšené množství cyklinu D2 oproti zdravým plazmatickým buňkám (Bergsagel et al., 2005). Dysregulace cyklinů D, buď jako následek primární IgH translokace nebo v jiných případech způsobena dosud neznámým mechanizmem, se zdá být časnou a sjednocující událostí v patogenezi MM. Nízká proliferativní kapacita buněk MM je v souladu s tím, že zvýšené množství cyklinu D1 nevede ke zvýšené proliferaci nebo ke vzniku nádorů, pokud nedojde ke spolupráci s aktivovanými MYC nebo RAS mutacemi. Buňky s dysregulovanou expresí cyklinů D pak mohou být citlivější k stimulaci proliferace (Bergsagel a Kuehl, 2005). Na základě hypotézy, že při dysregulaci cyklinů D se jedná o velmi časnou, možná i iniciační událost, Bergsagel et al. (2005) rozdělili MM podle této dysregulace, opakujících se 38

40 translokací IgH a specifických trizomií do 8 TC (translokace/cyklin) skupin (Obr. 12). Čtyři skupiny jsou založeny na opakovaných translokacích: TC 11q13 (CCND1), TC 6p21 (CCND3), TC 4p16 (MMSET a obyčejně i FGFR3) a TC maf, 16q23 (c-maf) + 20q11 (MAFB). Další čtyři skupiny byly rozděleny podle exprese cyklinů D v nepřítomnosti translokací. Patří sem skupiny TC D1, TC D1+D2, TC D2 a skupina TC NONE, u které zvýšená exprese nebyla nalezena. Všechny vyjmenované skupiny mají odlišnou genovou expresi a klinický vývoj. Důležitým klinickým příznakem je výskyt osteolytických ložisek. S vysokou prevalencí (asi 90 %) jsou pozorovány u skupin TC 6p21, TC 11q13, TC D1 a TC D1+D2. S nižší prevalencí (asi 55 %) se vyskytují u skupin TC 4p16 a TC maf. Ukázalo se, že některé skupiny mají důležitý prognostický význam. S horší prognózou je spojena skupina TC 4p16 a TC maf, naopak lepší prognózu mají pacienti ze skupin TC 11q13, TC D1 a TC NONE. Tyto výsledky naznačují, že TC klasifikace může být užitečná pro klasifikaci pacientů s odlišnými podtypy MM (Bergsagel et al., 2005). Obrázek 12: Zastoupení TC skupin u pacientů s MM (Chesi a Bergsagel, 2013; upraveno) Další chromozomové aberace Aberace na chromozomu 1 Zisk dlouhého raménka (1q) a ztráta krátkého (1p) se u MM často vyskytují společně a jsou asociovány s delecí chromozomu 13 a se špatnou prognózou (Walker et al., 2010). U jedné třetiny až jedné poloviny myelomových případů byl identifikován zisk 1q21 (Chang et al., 2006; Hanamura et al., 2006; Němec et al., 2010). Zvýšená exprese genu CKS 1 B způsobená amplifikací 1q21 se spojuje s horší prognózou u myelomových pacientů (Zhan et al., 2007). Produkt tohoto genu se váže na 39