Modulační vliv monovalentních iontů na δ-opioidní receptory

Transkript

1 Univerzita Karlva v Praze 1. lékařská fakulta Oddělení bichemie membránvých receptrů Dktrandská dizertační práce Mdulační vliv mnvalentních intů na δ-piidní receptry Ing. Mirslava Všahlíkvá Veducí dizertační práce: Dc. RNDr. Petr Svbda, DrSc.

2 Publikační pdklad pr přípravu dizertační práce frntální mzkvá kůra ptkana Publikace I Buřvá, L., Všahlíkvá, M., Kagan, D., Dluhá, K., Nvtný, J., Svbda, P. (2010). Lng-term adaptatin t high dses f mrphine causes desensitizatin f mu-or- and delta-orstimulated G-prtein respnse in frebrain crtex but des nt decrease the amunt f G- prtein alpha subunits. Med Sci Mnit, 16(8), BR260-BR270. Publikace II Ujčíkvá, H., Dluhá, K., Rubalvá, L., Všahlíkvá, M., Kagan, D., Svbda, P. (2011). Upregulatin f adenylylcyclases I and II induced by lng-term adaptatin f rats t mrphine fades away 20 days after mrphine withdrawal. Bichim Biphys Acta-Gen Subj, 1810(12), buněčná linie exprimující fúzní prtein mezi δ-piidním receptrem a G i 1α prteinem Publikace III Všahlíkvá, M., Svbda, P. (2011). The influence f mnvalent catins n trimeric G prtein G i 1α activity in HEK293 cells stably expressing δ-or-g i 1α(Cys 351 -Ile 351 ) fusin prtein. Physil Res, 60(3), Publikace IV Všahlíkvá, M., Jurkiewicz, P., Rubalvá, L., Hf, M., Svbda, P. (2014). High- and lwaffinity sites fr sdium in δ-or-g i 1α(Cys 351 -Ile 351 ) fusin prtein stably expressed in HEK293 cells; functinal significance and crrelatin with biphysical state f plasma membrane. Naunyn-Schmiedebergs Arch Pharmacl, 387(5),

3 Opiidní receptry (OR) rhdpsinvá rdina receptrů spřažených s G prteiny (GPCRs) 4 typy OR μ-or, δ-or, κ-or, NOP klíčvý prvek vnímání blesti vlivňují afektivní chvání a neurendkrinní funkce, vládají autnmní funkce Struktura GPCR Granier S. et al., Nature, 2012 aktivují hetertrimerní G prteiny třídy G i /G inhibují adenylyl cyklázu (AC) pkles prdukce camp, inhibují Ca 2+ kanály, stimulují K + kanály McDnald J. a Lambert D.G., CAECCP, 2005

4 Knstitutivní aktivita, inverzní agnisté knstitutivní aktivita - schpnst receptru přejít d aktivní knfrmace (R*) i v nepřítmnsti agnisty plný inverzní agnista antagnista částečný inverzní částečný agnista agnista plný agnista neaktivní frma receptru aktivní frma receptru Seifert R. a Wenzel-Seifert K., NSAP, 2002 Na + půsbí jak allsterický inverzní agnista (allsterický stabilizátr neaktivníh stavu receptru) Asp 95 v TM2 δ-or kritická pr regulaci vazby agnisty Na +

5 Interakce mnvalentních intů s OR allsterická vazebná kapsa pr Na + interakce Na + s 5 kyslíkvými atmy (pstranní řetězce Asp 95, Ser 135, Asn 131 splu s 2 mlekulami vdy) 1.8 Å δ-piidní receptr adensinvý receptr A 2A identické pstranní řetězce a pdbné knfrmace v 15 pzicích kapsy Allsterická vazebná kapsa GPCRs vázající Na + a vdu Fenalti G. et al., Nature, 2014

6 Cíle dizertační práce frntální mzkvá kůra ptkana změny v signální dráze OR vyvlané dluhdbým půsbením mrfinu klíčvý fyzilgický mechanismus, kterým je snižvána knstitutivní aktivita - inhibiční půsbení sdných intů na vazebné míst δ-or buněčná linie δ-or-g i 1α (Cys 351 -Ile 351 )-HEK293 účinek různých mnvalentních intů na δ-or i na jeh funkční spřažení s trimerními G prteiny inhibičníh typu

7 Frntální mzkvá kůra ptkana Aktivita G prteinů změny vyvlané půsbením mrfinu stanvení agnistu stimulvané vazby [ 35 S]GTPγS samci ptkanů kmene Wistar kntrlní ptkani (CTR, ) ptkani vystaveni půsbení mg/kg mrfinu p dbu 10 dnů (MOR, ) Vazba [ 35 S]GTP S (pml mḡ 1 ) CTR MOR -OR lg [DADLE] (M) Vazba [ 35 S]GTP S (pml mḡ 1 ) CTR MOR -OR lg [DAMGO] (M) pkles vazby [ 35 S]GTPγS stimulvané agnisty δ- a μ-or u ptkanů vlivněných mrfinem desenzitizace dpvědi δ- a μ-or nastává již na úrvni funkční aktivity G prteinů nárůst bsahu adenylyl cyklázy typu I a II Buřvá, L., Všahlíkvá, M., Kagan, D., Dluhá, K., Nvtný, J., Svbda, P. (2010). Lng-term adaptatin t high dses f mrphine causes desensitizatin f mu-or- and delta- OR-stimulated G-prtein respnse in frebrain crtex but des nt decrease the amunt f G-prtein alpha subunits. Med Sci Mnit, 16(8), BR260-BR270.

8 Frntální mzkvá kůra ptkana Inhibiční půsbení Na + na vazebné míst δ-or DADLE: δ-or, µ 1 -OR [D-Ala2,D-Leu5]enkefalin DPDPE: δ-or [D-Pen2,D-Pen5]enkefalin Vazba [ 3 H]DADLE (pml mg -1 ) MOR MOR +100 mm NaCl CTR CTR +100 mm NaCl Vazba [ 3 H]DPDPE (pml mg -1 ) MOR MOR +100 mm NaCl CTR CTR +100 mm NaCl [ 3 H]DADLE (nm) [ 3 H]DPDPE (nm) dluhdbé půsbení mrfinu nízká citlivst δ-or k inhibičnímu účinku sdných intů (narušení rvnváhy mezi aktivním a neaktivním stavem receptru) Ujčíkvá, H., Dluhá, K., Rubalvá, L., Všahlíkvá, M., Kagan, D., Svbda, P. (2011). Up-regulatin f adenylylcyclases I and II induced by lng-term adaptatin f rats t mrphine fades away 20 days after mrphine withdrawal. Bichim Biphys Acta-Gen Subj, 1810(12),

9 δ-or-g i 1α (Cys 351 -Ile 351 )-HEK293 OR vytvářejí velmi slžitu signalizační síť GPCR-Gα fúzní prteiny pskytují mžnst napdbit fyzilgicky se vyskytující interakce užitečný mdel pr prvnání účinnsti vazby mezi definvaným typem receptru a definvaným typem G prteinu přesná a známá stechimetrie 1:1 mezi receptrem a G prteinem buněčná linie δ-or-g i 1α (Cys 351 -Ile 351 )-HEK293 exprimuje fúzní prtein mezi δ-or a G i 1α prteinem rezistentním vůči PTX (pertussis txin)

10 δ-or-g i 1α (Cys 351 -Ile 351 )-HEK293 Inhibice signalizace δ-or mnvalentními katinty Vazba [ 35 S]GTP S (pml mḡ 1 ) NaCl 100 mm NaCl lg[dadle] (M) vliv různých mnvalentních katintů na bazální a agnistu stimulvanu vazbu [ 35 S]GTPγS v jejich nepřítmnsti zjištěna vyská bazální aktivita G prteinů inhibice vyské bazální aktivity G prteinů vyvlání maximální dpvědi (B max ) Na + > Li + K + afinita agnisty DADLE (EC 50 ) Li + > K + > Na + EC 50 [M] +PTX -PTX 100 mm 200 mm 200 mm B max % bazální aktivity EC 50 [M] B max % bazální aktivity EC 50 [M] B max % bazální aktivity NaCl KCl LiCl Všahlíkvá, M., Jurkiewicz, P., Rubalvá, L., Hf, M., Svbda, P. (2014). High- and lw-affinity sites fr sdium in δ-or-g i 1α(Cys 351 -Ile 351 ) fusin prtein stably expressed in HEK293 cells; functinal significance and crrelatin with biphysical state f plasma membrane. Naunyn-Schmiedebergs Arch Pharmacl, di: /s

11 δ-or-g i 1α (Cys 351 -Ile 351 )-HEK293 Vliv mnvalentních katintů na vazbu agnisty a antagnisty Vazba [ 3 H]DADLE (pml mḡ 1 ) AGONISTA 0.4 KCl 0.2 LiCl 0.0 NaCl Kncentrace (mm) Vazba [ 3 H]naltrindlu (pml mg -1 ) NaCl LiCl KCl ANTAGONISTA Kncentrace (mm) schpnst mnvalentních katintů měnit vazebná místa OR Vazba [ 3 H]DADLE (pml mḡ 1 ) AGONISTA NaCl r 2 = Kncentrace (mm) vyskafinní vazebné míst pr Na + 50 % inhibice vazby agnisty při 5.4 mm kncentraci NaCl interakce pzitivně nabitých Na + intů s negativně nabitu Asp 95 nízkafinní vazebné míst pr Na + 50 % inhibice vazby agnisty při 321 mm kncentraci NaCl vysvětlení existence nízkafinních vazebných míst pr Na + jsme se snažili hledat pmcí bifyzikálních studií se zaměřením na plazmaticku membránu Všahlíkvá, M., Jurkiewicz, P., Rubalvá, L., Hf, M., Svbda, P. (2014). High- and lw-affinity sites fr sdium in δ-or-g i 1α(Cys 351 -Ile 351 ) fusin prtein stably expressed in HEK293 cells; functinal significance and crrelatin with biphysical state f plasma membrane. Naunyn-Schmiedebergs Arch Pharmacl, di: /s

12 δ-or-g i 1α (Cys 351 -Ile 351 )-HEK293 Bifyzikální stav plazmatické membrány spjení GPCRs a G prteinů s plazmaticku membránu je činí citlivými k jejich lipidvému klí interakce s lipidy jsu důležité pr jejich funkci rle mnvalentních katintů při interakci s plárním rzhraním membrána-vda a hydrfóbním vnitřkem lipidvé dvjvrstvy Laurdan (2-dimethylamin-6-laurylnaftalen) pstihuje změny ve vlastnstech membrány díky své citlivsti k plaritě lipidvé dvjvrstvy a pskytuje infrmaci lipidvých karbnylech DPH 1,6-difenyl-1,3,5-hexatrien vykazuje silnu flurescenci, pkud je zanřen d lipidvé membrány Parasassi T. et al., J. Flur., 1998

13 δ-or-g i 1α (Cys 351 -Ile 351 )-HEK293 Excitační generalizvaná plarizace Laurdanu - GP ex GP ex (λ ex ) I I I I λ ex.excitační vlnvá délka I 440, I 490..intenzity flurescence změřené při emisních vlnvých délkách 440 a 490 nm GP ex plarita membrány a mbilita membránvých kmpnent v hydrfilní části lipidů (blast plárních hlaviček) GP ex Li + > Na + > K + > Cs + > médium bez intů HEK 293 POPC/POPS POPC/POPS/chlesterl POPC POPS LiCl NaCl KCl CsCl Bez intů ex (nm) 20 C 800 mm kncentrace 1,2-palmityl-leyl-sn-glycer-3-fsfchlin 1,2-palmityl-leyl-sn-glycer-3-fsfserin Plměry intů [Å] 1Å =10-10 m Přibližné plměry hydratvaných intů [Å] 1Å =10-10 m Li Na K Cs Lange et al., Příručka Chemie, 1979 mnvalentní katinty prnikají dvnitř lipidvé dvjvrstvy na úrveň glycerlu, kde interagují s kyslíkvými atmy karbnylů a nahrazují tak mlekuly vdy Jurkiewicz P. et al., BBA, 2012 Všahlíkvá, M., Jurkiewicz, P., Rubalvá, L., Hf, M., Svbda, P. (2014). High- and lw-affinity sites fr sdium in δ-or-g i 1α(Cys 351 -Ile 351 ) fusin prtein stably expressed in HEK293 cells; functinal significance and crrelatin with biphysical state f plasma membrane. Naunyn-Schmiedebergs Arch Pharmacl, di: /s

14 δ-or-g i 1α (Cys 351 -Ile 351 )-HEK293 Rvnvážná aniztrpie flurescence DPH - GP ex r DPH I I II II I 2I I II slžky světelné intenzity rvnběžné ke směru plarizace budícíh záření I...slžky světelné intenzity klmé ke směru plarizace budícíh záření rdph membránvá fluidita vliv mnvalentních katintů na vnitřní hydrfóbní část membrány r DPH ± SEM (25 C Ex365nm/Em425nm) 0 mm 100 mm 200 mm 800 mm ± LiCl ± NS ± NS ± NS NaCl ± NS ± NS ± NS KCl ± NS ± NS ± NS CsCl ± NS ± NS ± NS žádné změny hdnt r DPH vliv vyských kncentrací mnvalentních katintů nastává výlučně jak interakce s pvrchvým, plárním reginem lipidvé dvjvrstvy hydrfóbní vnitřek membrány se účinku mnvalentních katintů neúčastní Všahlíkvá, M., Jurkiewicz, P., Rubalvá, L., Hf, M., Svbda, P. (2014). High- and lw-affinity sites fr sdium in δ-or-g i 1α(Cys 351 -Ile 351 ) fusin prtein stably expressed in HEK293 cells; functinal significance and crrelatin with biphysical state f plasma membrane. Naunyn-Schmiedebergs Arch Pharmacl, di: /s

15 Závěr frntální mzkvá kůra ptkanů vystavených dluhdbému půsbení mrfinu mechanizmus závislsti na mrfinu je zalžen na desenzitizaci dpvědi δ- a μ-or, která nastává již na úrvni funkční aktivity G prteinů zvýšení pčtu δ-or a změna jejich citlivsti k sdným intům buněčná linie δ-or-g i 1α (Cys 351 -Ile 351 )-HEK293 rzlišení vysk- a nízkafinních míst pr Na + při inhibici vazby agnisty δ-or plární rzhraní membrána-vda jsme značily jak jedn z mžných míst, kde by mhl prbíhat nízkafinní typ inhibice vazby agnisty tat interakce by následně mhla vlivnit vazbu ligandu na receptr allstericku cestu

16 Děkuji za pzrnst