Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně

Transkript

1 Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Variabilita lokusu CSN3 (kappa kasein) a mléčná užitkovost krav Diplomová práce Vedoucí práce: doc. Ing. Tomáš Urban, Ph.D. Vypracoval: Bc. Ondřej Martinec Brno 2008

2 Zadání diplomové práce

3 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Variabilita lokusu CSN3 (kappa kasein) a mléčná užitkovost krav vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům. V Brně, dne. Podpis diplomanta..

4 Poděkování Rád bych poděkoval panu doc. Ing. Tomáši Urbanovi, Ph.D. za pomoc při řešení této práce. Dále bych rád poděkoval moji mamince paní Ing. Stanislavě Martincové a bratrovi za podporu při studiu.

5 Abstrakt Genotypy genu CSN3 byly stanoveny u 388 krav, z toho 147 krav bylo plemene holštýn a 241 krav plemene české strakaté. Ke stanovení genotypů byly použity metody PCR, RFLP a elektroforéza na agarózovém gelu. Pro statistické analýzy byl použit smíšený lineární model (MLM), proc mixed metoda REML (Restricted Maximum Likelihood) programem SAS for Windows Byl sledován efekt genotypů CSN3 na dojivost (kg/den), procento tuku, procento proteinu, procento laktózy a počet somatických buněk (ml). Ve sledované populaci byla stanovena frekvence žádoucí alely genu CSN3 B 0,36 a genotyp BB 12,11 %. Populace obou plemen byly v H-W rovnováze. V této práci nebyl nalezen žádný statisticky významný vliv genotypu CSN3 na znaky mléčné produkce. Klíčová slova: CSN3, κ-kasein, znaky mléčné produkce, genotypy mléčných proteinů, odhad genetických asociací

6 Abstract The Genotypes of CSN3 were detected at 388 cows, from those 147 cows were of the Holstein breed and 241 cows the Czech Fleckviehs. For the determination of the genotypes were used the methods PCR, RFLP and the electrophoresis on agarose gel. For the statistical analysis waere used the mixed linear model (MLM), method REML (Restricted Maximum Likelihood) in program SAS for Windows The efects of the genotypes CSN3 were estimated for the milk yield (kg/day), fat content, protein content, lactose content and the number of somatic cell (ml). The allele frequencies CSN3 B 0,36 and the frequencies genotype BB 12,11 % were established in the observed population. The populations of both breeds were in H-W equilibrium. There was found no statistically significant influence of the genotypes CSN3 on the milk production parameters. Key words: CSN3, κ-casein, milk production traits, milk protein genotypes, genetic association estimates

7 OBSAH 1 ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED MLÉKO A JEHO SLOŽKY MLÉČNÉ PROTEINY Kaseiny αs1-kasein αs2-kasein β-kasein κ-kasein Syrovátkové proteiny SACHARIDY MLÉČNÝ TUK ENZYMY MINERÁLNÍ LÁTKY VITAMÍNY KVANTITATIVNĚ GENETICKÉ PARAMETRY MLÉKA GENETIKA Κ-KASEINU OZNAČOVÁNÍ GENU CSN3 VE VĚDECKÝCH ČLÁNCÍCH VÝZNAM KAPPA KASEINU PRO MLÉKÁRENSKÝ PRŮMYSL LOKALIZACE GENU CSN VARIABILITA GENU CSN FREKVENCE ALEL A GENOTYPŮ GENU CSN3 V POPULACI VLIV GENU CSN3 NA MLÉČNOU PRODUKCI KRAV MATERIÁL A METODIKA ÚDAJE O ZVÍŘATECH STANOVENÍ PARAMETRŮ MLÉČNÉ UŽITKOVOSTI STANOVENÍ GENOTYPŮ GENU CSN IZOLACE DNA Z MLÉKA AMPLIFIKACE SEKVENCE DNA METODOU POLYMERÁZOVÉ ŘETĚZOVÉ REAKCE (PCR) 34

8 4.3.3 IDENTIFIKACE ALEL GENU CSN3 METODOU RFLP PŘÍPRAVA GELU PRO GELOVOU ELEKTROFORÉZU MATEMATICKO-STATISTICKÉ VYHODNOCENÍ VÝSLEDKY A DISKUZE ANALÝZA GENU CSN3 DLE RŮZNÝCH KRITÉRIÍ TESTOVÁNÍ HARDY-WEINBERGOVY ROVNOVÁHY POMOCÍ TESTU DOBRÉ SHODY (Χ 2 TEST) Testování Hardy-Weinbergovy rovnováhy pomocí testu dobré shody (χ 2 test) u testované populace bez rozlišení plemen Testování Hardy-Weinbergovy rovnováhy pomocí testu dobré shody (χ 2 test) u plemene holštýn Testování Hardy-Weinbergovy rovnováhy pomocí testu dobré shody (χ 2 test) u českého strakatého plemene FREKVENCE GENOTYPŮ A ALEL GENU CSN3 VE VŠECH CHOVECH ZASTOUPENÍ GENOTYPŮ GENU CSN3 V JEDNOTLIVÝCH CHOVECH ZASTOUPENÍ GENOTYPŮ GENU CSN3 V JEDNOTLIVÝCH ODDÍLECH PLEMENNÉ KNIHY ZASTOUPENÍ GENOTYPŮ GENU CSN3 V JEDNOTLIVÝCH LAKTACÍCH ANALÝZA ASOCIACE GENOTYPŮ GENU CSN3 SE ZNAKY MLÉČNÉ PRODUKCE ODHAD ASOCIACE GENU CSN3 A DOJIVOSTI ODHAD ASOCIACE GENU CSN3 A PROCENTA TUČNOSTI V MLÉCE ODHAD ASOCIACE GENU CSN3 A PROCENTA PROTEINU V MLÉCE ODHAD ASOCIACE GENU CSN3 A PROCENTA LAKTÓZY V MLÉCE ODHAD ASOCIACE GENU CSN3 A POČTU SOMATICKÝCH BUNĚK V MLÉCE ZÁVĚR POUŽITÁ LITERATURA SEZNAM TABULEK SEZNAM ZKRATEK... 62

9 1 Úvod Zemědělství jako odvětví má řadu specifik, které jsou dány hlavně jeho vazbou s přírodou. Jeho klíčovým posláním je produkce kvalitních zemědělských produktů k zabezpečení výživy obyvatelstva. Podle statistických údajů se snížily počty skotu k meziročně o 1,6 % na 1367 tis. kusů. Počty krav celkem klesly o 1,5 % na 559 tis. kusů, z toho počty dojných krav se snížily o 2,4 % na 407 tis. kusů. V roce 2007 se zvýšila průměrná roční dojivost na dojnici meziročně o 2,8 % na 6548,3 litrů. Trend růstu cen zemědělských výrobců mléka, který nastal v druhé polovině roku 2007, pokračoval i v 1. čtvrtletí roku Průměrná cena zemědělských výrobců nejvyšší třídy jakosti Q se meziročně zvýšila o 28,9 %. Mléko se nakupovalo v 1. čtvrtletí roku 2008 za průměrnou cenu 10,06 Kč/l. oproti cenám od 2. čtvrtletí 2006 do 3. čtvrtletí 2007, kdy nepřesáhly hranici 8,0 Kč/l. V tomto roce však opět dochází ke snižování cen v měsíci únor na 9,98 Kč/l a v březnu již 9,70 Kč/l. Pokud tento trend bude pokračovat, stane se opět výroba mléka díky vysokým nákladům na výrobu nerentabilní. Vysoké výkupní ceny mléka, ale také zvýšení cen mléčných výrobků bylo způsobeno vyšší poptávkou po mléce z Číny a Indie, a také sucha v zemích s největší světovou produkcí mléka v Austrálii a na Novém Zélandu. Mléčné kvóty, které byly zaváděny v době nadprodukce, mají nyní na produkci mléka a mléčných výrobků negativní dopad. Došlo totiž v Evropě k razantní redukci zásob másla a sušeného odstředěného mléka. Poptávka hlavně po sýru a čerstvých mléčných výrobcích na vnitřním trhu přitom významně vzrostla. V současné době již v Evropské unii neexistují téměř žádné zásoby mléčných výrobků. Poptávka po nich narostla natolik, že jí produkce není schopna uspokojit. Podle prognóz by měla produkce mléka v EU mírně stoupat až do roku Výroba a spotřeba sýrů by také měla stoupat na rozdíl od másla a sušeného odstředěného mléka. Výroba mléka celkově by měla od roku 2011 dosáhnout hladiny 147,3 až 147,4 miliony tun. Počty dojnic by měly dále poklesnout, především díky poklesu stavů dojnic v zemích EU-12. Myslím si, že zemědělec v EU bude muset produkovat mléko s vyšším množstvím kvalitního mléčného proteinu - kaseinu. Podle predikcí by totiž měla 9

10 stoupat výroba a spotřeba sýrů a pokud by mléko obsahovalo vyšší množství mléčného proteinu kappa kaseinu, mlékárny by mohly takovéto mléko lépe zpeněžovat. I přes stanovené kvóty EU minimálně do roku 2013, musí být zemědělci připraveni na volný trh a být konkurence schopnými takovým výrobcům jako státy Latinské Ameriky (Argentina, Chille, Brazílie), USA, Nového Zélandu a v poslední době v tomto odvětví rozvíjející se Ruska. Zde by mohla najít mnohem větší uplatnění znalost genetických markerů (kappa kaseinu) a jejich asociací s mléčnou užitkovostí a jejich aplikace v konkurenčním prostředí trhu. 10

11 2 CÍL PRÁCE 1. Osvojení metodik izolace DNA, PCR, RFLP a elektroforézy na agarózovém gelu. 2. Stanovení polymorfismu v genu CSN3. 3. Analýza frekvencí jednotlivých genotypů a alel v daných populacích zvířat. 4. Na základě molekulárních dat analyzovat asociace genetického markeru CSN3 s mléčnou užitkovostí krav v několika chovech. 11

12 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Mléko a jeho složky Mléko je jediným a nezbytným zdrojem výživy novorozených mláďat savců a velice hodnotnou potravinou pro člověka, obsahující téměř kompletní soubor látek, nezbytných pro normální vývoj organismu. Biologická hodnota mléka je vysoká. Mléko obsahuje kolem 200 různých látek, z toho 60 mastných kyselin, 40 minerálních prvků, 20 aminokyselin, 17 vitamínů, řadu enzymů, hormonů a pigmentů. K základním složkám mléka patří bílkoviny, tuk, laktóza, minerální látky a voda. Jeden litr kravského mléka uhradí u člověka denní potřebu tuku, esenciálních aminokyselin, vápníku, fosforu, mikroelementů (s výjimkou železa a manganu), polovinu bílkovin, více než jednu třetinu vitamínu A, C, D a jednu čtvrtinu energie (Jelínek, Koudela, 2003). Zralé mléko můžeme rozdělit na albuminová a kaseinová. V tabulce 1 jsou uvedeny rozdíly ve složení mléka některých savců, kteří produkují kaseinové mléko. V tabulce 2 je uvedeno průměrné složení a variabilita kravského mléka ( Tab. 1 Složení mléka některých savců kaseinová mléka ( Složení (% hm) Mléko Voda/sušina Tuk Kasein Bílk. syrovátky Laktosa Popeloviny Kravské 87,3 / 12,7 3,9 2,6 0,6 0,7 4,8 0,7 Kozí 87,0 / 13,0 4,1 2,7 0,7 4,7 0,8 Ovčí 80,9 / 19,1 7,9 4,9 0,9 4,5 0,9 Buvolí 82,8 / 17,2 7,5 3,6 0,6 4,8 0,7 Zebu 86,7 / 13,3 4,7 2,6 0,6 4,7 0,7 Yaka 82,2 / 17,8 6,5 5,8 4,6 0,9 Velbloudí 87,9 / 12,1 3,3 2,9 0,4 4,8 0,7 Sobí 67,5 / 32,5 18,0 8,5 1,9 2,6 1,5 12

13 Tab. 2 Průměrné složení a variabilita kravského mléka ( Složka Průměrný obsah (%) Rozsah (%) Voda 87,3 85,5 88,7 Sušina 12,7 14,5 11,3 Tukuprostá sušina 8,8 7,9 10,0 Tuk 3,9 2,4 6,5 Bílkoviny 3,2 2,3 4,4 Kasein 2,6 1,7 3,5 Laktosa 4,8 3,8 5,3 Popeloviny 0,7 0,5 0,8 Org. kyseliny 0,18 0,13 0, Mléčné proteiny S rozvojem sofistikovaných analytických technik bylo během posledních let charakterizováno v mléce skotu více než 200 typů proteinů. Mléčný protein je velmi heterogenní skupina molekul a pro popis mohou být klasifikovány do pěti hlavních kategorií: kaseiny, syrovátkové proteiny, proteiny globulí mléčného tuku, enzymy a jiné miceliární minoritní proteiny. Heterogenita mléčných proteinů je také komplikována přítomností genetických variant, které byly identifikovány u hlavních druhů, zvláště u skotu. S vývojem molekulární biologie a zdokonalení technik pro klonování je možné také zvýšit heterogenitu mléčných proteinů řízenou mutagenezí kontrolující úroveň exprese proteinů původem mléčných, ale nové proteiny jsou mléčné žláze cizí (NG-KWAI-HANG, 2003). Základní charakteristiky hlavních proteinů kravského mléka je uvedeny v tabulce 3. 13

14 Tab. 3 Charakteristiky hlavních proteinů kravského mléka (NG-KWAI-HANG, 2003) Protein Mol. Počet AK zbytků Počet Konc. Detek. genet. hmot. Celkem Pro Cys PO4 (g/l) varianty αs1-kasein A,B,C,D,E,F, G,H αs2-kasein ,6 A,B,C,D β-kasein ,3 A1,A2,A3,B, C,D,E,F,G κ-kasein ,3 A,B,C,E,F1,F 2,G1,G2,H,I, J β-lg ,2 A,B,C,D,E,F, H,I,J α-la ,2 A,B,C Sér. albumin ,4 - Imunoglob ,4% 2,3% - 0,8 - Pozn. molekulová hmotnost je určena pro genetickou variantu zvýrazněnou tučně Chemické složení mléka ovlivňují genetické, fyziologické a technologické faktory i podmínky vnějšího prostředí (Jelínek, Koudela, 2003) Kaseiny Kaseiny v mléce krav byly původně definovány hlavně po sýru a čerstvých mléčných výrobcích Výborem americké mléčné asociace na nomenklaturu, klasifikaci a metodologii mléčných proteinů (American Dairy Association Committee on the Nomenclature, Classification, and Metodology of Milk Proteins) v roce 1956 Jennessem. Ten je definoval jako fosfoproteiny, které se srazí ze syrového mléka okyselením na ph 4,6 při 20 C. Kaseiny byly identifikovány podle homologie jejich primárních struktur (sekvence aminokyselin) (Farrell et al., 2004). Mléko skotu obsahuje čtyři typy kaseinů označovaných jako αs1-kasein, αs2-kasein, β-kasein a κ-kasein, všechny jsou produkovány speciálními geny (NG-KWAI-HANG, 2003). αs-, β-, κ- kaseiny jsou geneticky polymorfní a jsou 14

15 kontrolovány autosomálními geny, které jsou děděny v souladu s Mendelovou dědičností (NG-Kwai-Hang et al., 1984). Identifikace hlavních kaseinů a syrovátkových proteinů bude stále založeno na jejich primární struktuře (Farrell et al., 2004). Kaseiny kravského mléka zahrnují 82 % všech proteinů. V kyselém prostředí se kaseiny, na rozdíl od syrovátkových proteinů, sráží. V mléce se kasein nachází ve formě micel o velikosti kolem 100 nm, spolu s vápníkem a fosforem (Jelínek, Koudela, 2003) αs1-kasein Primární struktura αs1-kaseinu obsahuje 199 aminokyselinových zbytků. Neobsahuje žádný cysteinový zbytek, obsahuje osm fosfátů připojených na serin. Menšinový αs1-kasein byl dříve označovaný jako αs0-kasein (NG-KWAI- HANG, 2003). αs1-kasein představuje přes 40 % kaseinových frakcí v kravském mléce. Referenční protein pro tuto skupinu je αs1-cn B-8P. Skládá se ze 199 aminokyselinových zbytků: Asp7, Asn8, Thr5, Ser8, Ser P8, Glu25, Gln14, Pro17, Gly9, Ala9, Val11, Met5, Ile11, Leu17,Tyr10, Phe8, Lys14, His5, Trp2 a Arg6. Vypočtená molekulová hmotnost je 23,615 Da (Farrell et al., 2004). Aktuálně je známo 8 genetických variant. Varianta A byla nalezena u Holštýnského, Red Holštýnského a Německého červeného skotu. B varianta je predominantní varianta u druhu Bos taurus, varianta C u Bos indicus a Bos grunniens, varianta D u různých plemen ve Francii a Itálii a také u plemene Jersey v Nizozemí, a varianta E u Bos grunniens. Varianta F byla objevena u Německého černobílého skotu, G varianta u Italského hnědého skotu a poslední objevená varianta je αs1-kasein H (Farrell et al., 2004) αs2-kasein αs2-kasein obsahuje 207 aminokyselin. Obsahuje 10 prolinů, více fosfoserinů a více lyzinů než jiné kaseiny a má dva cysteiny na pozici 36 a 40. Hlavní formy αs2-kaseinu jsou zjistitelné pomocí PAGE způsobené různým stupněm fosforylace která má rozmezí od 10 do 13 fosfátových skupin. Tyto 15

16 formy byly identifikovány jako αs2-, αs3-, αs4-, αs5- a αs6-kasein (αs5- je dimer αs3- a αs4-) (NG-KWAI-HANG, 2003). Referenční protein je αs2-cn A-11P. Obsahuje 207 aminokyselinových zbytků: Asp4, Asn14, Thr15, Ser6, Ser P11, Glu24, Gln16, Pro10, Gly2, Ala8, Cys2, Val14, Met4, Ile11, Leu13,Tyr12, Phe6, Lys24, His3, Trp2 a Arg6. Vypočtená molekulová hmotnost je 25,226 Da ( Farrell et al., 2004). αs2-kaseinová rodina představuje až 10% z kaseinové frakce v mléce skotu. Genetické varianty jsou αs2-kasein A, B, C, a D. Varianta A je nejčastěji pozorovaná u západních plemen, αs2-kasein D s pozorovanými četnostmi od 0.01 až 0.09 u plemene Vosgienne a Montbeliarde a u třech španělských plemen. B varianta byla pozorovaná s nízkými četnostmi u zebu v Jižní Africe a varianta C byla pozorovaná u yaka v údolí Nepálu a Mongolska ( Farrell et al., 2004) β-kasein β-kasein obsahuje sekvenci 209 aminokyselin. Je to nejhydrofobičtější kasein. Neobsahuje žádný cystein, ale má vysoký podíl prolinu (35 reziduí). Přirozená amfipatická molekula β-kaseinu je příčinou, proč tyto formy micel agregují v roztoku. γ-kaseiny, které byly dlouhou dobu známy, jsou hydrolytickými produkty β-kaseinu produkované činností plasminů. γ-kaseiny odpovídají reziduím , a β-kaseinu (Farrell et al., (2004) označoval tato frakce jako γ1-, γ2-, γ3-cn) a jsou přítomny ve sraženině během isoelektrického srážení celého kaseinu při ph 4,6. Jiné fragmenty β- kaseinu (zbytky 1-28, a 1-107) byly nalezeny v syrovátce a tvoří část frakcí dříve známé jako proteosový pepton (NG-KWAI-HANG, 2003). β-kaseinová rodina představuje až 45% z kaseinu bovinního mléka. Referenční protein pro tuto skupinu je β-cn A 2-5P, obsahující 209 zbytků. Skládá se z: Asp4, Asn5, Thr9, Ser11, Ser P5, Glu19, Gln20, Pro35, Gly5, Ala5, Val19, Met6, Ile10, Leu22,Tyr4, Phe9, Lys11, His5, Trp1 a Arg4. Vypočtená molekulová hmotnost je 23,983 Da ( Farrell et al., 2004). Bylo popsáno 13 genetických variant β-kaseinu. Patří sem A 1, A 2, A 3, B, C, D, E, F (dříve označován β-cn-x), G, H 1, H 2, I, J ( Farrell et al., 2004). 16

17 κ-kasein κ-kasein je nejvíce studovaný mléčný protein. Stabilizuje kaseinové micely proti srážení vápníkem. Chymozin odštěpuje od κ-kaseinu glykopeptid a zbylý parakasein vytváří s vápníkem nerozpustnou sraženinu parakaseinát vápenatý, který se zadrží ve slezu a je tráven pepsinem (Jelínek, Koudela, 2003). Ke štěpení κ-kaseinu dochází v místě Phe105-Met106. Para-κ-kasein je reziduum 1-105, kaseinomakropeptid je reziduum , které zůstává v roztoku (NG-KWAI-HANG, 2003). Problematika κ-kaseinu je rozvedena v samostatné kapitole 3.2 Genetika κ-kaseinu Syrovátkové proteiny Syrovátkové proteiny zahrnující 18 % všech proteinů. Mezi syrovátkové bílkoviny řadíme β-laktoglobulin (10 %), α-laktalbumin (3 %), imunoglobuliny (2 %), krevní (plazmatický) albumin (1 %) a albumózopeptonová frakce (2 %) (Jelínek, Koudela, 2003). Jsou také známy aminokyselinové sekvence β- laktoglobulinu, α-laktalbuminu a sérového albuminu s molekulovými hmotnostmi 18277, a Da v tomto pořadí. Na rozdíl od β- laktoglobulinu nejsou α-laktalbumin, sérový albumin a některé imunoglobuliny syntetizovány v mléčné žláze. Imunoglobuliny jsou extrémně heterogenní, jejich rozdělení je dáno dle jejich imunochemických vlastností. V mléce skotu bylo identifikováno pět tříd imunoglobulinů (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD) (NG-KWAI- HANG, 2003). Imunoglobuliny (IgG, IgM, IgA) se ve zvýšeném množství nacházejí v mlezivu a mají význam pro pasivní imunitu mláďat. Hladina imunoglobulinů ve zralém mléce je nízká. β-laktoglobulin se nachází pouze v mléce přežvýkavců. α-laktalbumin se účastní při syntéze laktózy jako součást enzymu laktózosyntetázy (Jelínek, Koudela, 2003). 17

18 3.1.2 Sacharidy Hlavním sacharidem mléka je laktóza. Kravské mléko obsahuje kolem 5 % laktózy. V mléce některých mořských savců (tuleň, mrož) laktóza chybí. Laktóza je zdrojem energie (30 % energetické hodnoty mléka), dodává mléku nasládlou chuť a při zkvašování mléka je substrátem pro tvorbu kyseliny mléčné. V tenkém střevě napomáhá resorpci vápníku, fosforu, hořčíku a využití vitamínu D (Jelínek, Koudela, 2003) Mléčný tuk Mléčný tuk obsahuje triacylglyceroly (85 %), diacylglyceroly a monoacylglyceroly, neesterifikované mastné kyseliny, fosfolipidy a cholesterol. Stabilitu tukových kuliček zajišťuje vrstvička fosfolipidů na jejich povrchu. Mléčný tuk obsahuje 60 mastných kyselin, jejich vzájemný poměr je druhově specifický. Kravské mléko obsahuje všechny základní nasycené mastné kyseliny se sudým počtem atomů uhlíku. Na rozdíl od ostatních tuků obsahuje mléčný tuk asi 9 % mastných kyselin s krátkým řetězcem (C4 až C10) kyselinu máselnou, kapronovou, kaprylovou, kaprinovou a laurovou. Nejvyšší zastoupení má kyselina olejová (30 %), palmitová (24 %), stearová (13 %) a myristová (9 %). Nízký obsah esenciálních mastných kyselin (4 %) spolu s vysokým obsahem cholesterolu snižuje biologickou hodnotu mléčného tuku, naproti tomu fosfolipidy a vitamíny rozpustné v tucích jeho biologickou hodnotu zvyšují (Jelínek, Koudela, 2003) Enzymy V kravském mléce bylo identifikováno více než 60 skupin enzymů. Uvádí se, že je jich méně než 1 % z celkového množství mléčných proteinů (NG-KWAI- HANG, 2003). Mléko obsahuje řadu enzymů lipázy, proteázy, oxidázy, laktoperocidázy, alkalickou fosfatázu, katalázu, alfa-amylázu, aldolázu a další. Stabilní součástí mléka jsou i bílkovinné a steroidní hormony (Jelínek, Koudela, 2003). 18

19 3.1.5 Minerální látky Minerální látky ovlivňují výživnou hodnotu a chuť mléka, fyzikální vlastnosti a stabilitu mléčných bílkovin. Mléko obsahuje Ca, P, K, Na, S, Mg, Fe, Cu, Zn a další minerální látky, buď ve formě anorganických solí nebo organických sloučenin (Jelínek, Koudela, 2003) Vitamíny Mléko je bohaté na vitamíny, zejména riboflavin, biotin, cholin, ale i ostatní vitamíny skupiny B. Obsah vitamínů rozpustných v tucích závisí na obsahu karotenu, tokoferolu a ergosterolu v krmivu a koreluje s obsahem mléčného tuku. Obsah vitamínů skupiny B je v úzkém vztahu především s aktivitou bachorové mikroflóry (Jelínek, Koudela, 2003). 3.2 Kvantitativně genetické parametry mléka Koeficient heritability (h 2 ) je jedna z nejdůležitějších vlastností kvantitativní genetiky. Důležitou funkcí heritability je její role predikce, vyjadřující spolehlivost fenotypové hodnoty jako vodítka k plemenné hodnotě. Pouze fenotypové hodnoty mohou být přímo změřeny, ale je to plemenná hodnota, která určuje jejich vliv na příští generaci. Heritabilita je definována jako poměr mezi aditivní genetickou variancí a fenotypovou variancí: 2 h = V V A P (Falconer, Mackay, 1996). V tabulce 4 jsou uvedeny koeficienty heritability u znaků mléčné produkce dle Hřebena a Bucka (2005), v tabulce 5 jsou uvedeny koeficienty heritability a směrodatné odchylky dle Hayese et al., (1984). Znaky, které mají vztah mezi množstvím mléka, tuku a proteinu na jednu stranu a procenta proteinu a tuku na druhou stranu je částečně charakterizována negativními genetickými korelačními koeficienty (Freyer et al., 1999). Existuje vysoká korelace mezi produkcí kaseinu a produkcí bílkovin 19

20 v kilogramech a o něco nižší korelace mezi obsahem bílkovin a obsahem kaseinu (tabulka 7) (Hřeben, Bucek, 2005). V tabulce 6 jsou popsány sledování genetických a fenotypových korelací mezi některými znaky mléčné produkce dle Hayese et al., (1984). V tabulce 7 uvádí Hřeben a Bucek (2005) hodnoty genetických korelací mezi kilogramy kaseinu a kilogramy mléka, kilogramy proteinu a procentem kaseinu, dále genetické korelace mezi procentem kaseinu a kilogramy mléka, kilogramy proteinu a procento proteinu. Tab. 4 Koeficienty heritability pro studované vlastnosti (Hřeben, Bucek, 2005). Sledovaný ukazatel Koeficient heritability mléko (kg) 0,31 produkce kaseinu (kg) 0,27 produkce bílkovin (kg) 0,30 obsah kaseinu (%) 0,22 obsah bílkovin (%) 0,23 Tab. 5 Koeficienty heritability a směrodatné odchylky pro množství kaseinu, procento kaseinu, kaseinové číslo a znaky produkce (Hayes et al., 1984). Vlastnost mléčné užitkovosti koeficient heritability směrodatná odchylka množství kaseinu 0,11 0,40 obsah kaseinu 0,26 0,07 kaseinové číslo 0,08 0,03 množství mléka 0,22 0,06 množství tuku 0,23 0,06 množství proteinu 0,12 0,04 obsah tuku 0,70 0,11 obsah proteinu 0,53 0,10 20

21 Tab. 6 Genetické a fenotypové korelace mezi každým z množství kaseinu, procenta kaseinu a kaseinovým číslem a množstvím mléka, množstvím tuku, množstvím proteinu, procento tuku a procento proteinu (Hayes et al., 1984). množství mléka množství tuku množství proteinu % tuku % proteinu r SE r SE r SE r SE r SE množství 0,80 0,08 0,61 0,13 0,95 0,02 0,34 0,15 0,17 0,12 kaseinu 0,87 0,82 0,91 0,03 0,00 procento -0,76 0,08-0,21 0,12-0,28 0,19 0,51 0,11 0,96 0,01 kaseinu -0,46-0,25-0,30 0,34 0,52 kaseinové -0,09 0,22-0,22 0,21-0,45 0,20 0,00 0,17 0,12 0,18 číslo -0,33-0,31-0,39 0,01-0,12 Pozn. horní číslo z každého páru je genetická korelace Tab. 7 Odhad genetických korelací mezi sledovanými vlastnostmi (Hřeben, Bucek, 2005). Genetická korelace Hodnota kg kaseinu kg mléka 0,956 kg kaseinu kg proteinu 0,992 kg kaseinu - % kaseinu -0,115 % kaseinu kg mléka -0,391 % kaseinu - kg proteinu -0,123 % kaseinu - % proteinu 0, Genetika κ-kaseinu Označování genu CSN3 ve vědeckých článcích Ve vědeckých pracích je gen CSN3 často označován různými zkratkami. Kučerová et al., (2004) používá označení CSN3. Gazdová et al., (2007) používá označení C-CSN, Freyer et al., (1999), Bobe et al., (1999) a Farrell et al., (2004) používají označení κ-cn a NG-Kwai-Hang et al., (1984) a Bovenhuis et al., (1992) používají označení κ-kasein. Soria et al., (2003) uvádí ještě dvě možné označení, κcn a CASK. 21

22 3.3.2 Význam kappa kaseinu pro mlékárenský průmysl Kasein je v poslední době velice sledovaná složka mléka v souvislosti s výtěžností při výrobě sýrů. Výtěžností rozumíme množství čerstvých nebo zralých sýrů vyrobených ze 100 litrů nebo ze 100 kg mléka. Výši spotřeby litrů mléka na 1 kg sýrů ovlivňuje řada faktorů, např. složení a jakost zpracovaného mléka, především jeho tučnost a obsah bílkovin v mléce o 0,1 % představuje zvýšení spotřeby mléka na výrobu 1 kg sýra v průměru o 0,3 0,5 litru. Čím vyšší je obsah bílkovin v mléce, speciálně obsah kaseinu, tím nižší je spotřeba litrů mléka na 1 kg sýra za jinak stejných výrobních podmínek (Mášová, Šustová, 2007). Jednou z nejdůležitějších technologických vlastností mléka je jeho sýřitelnost. Jedná se o schopnost mléka srážet se syřidlem a vytvořit sýřeninu požadovaných vlastností. Mléko s příznivými sýrařskými vlastnostmi dává předpoklad vyšší výtěžnosti sýrů s jejich požadovaným složením, než mléko s nevhodnými sýrařskými vlastnostmi. Sýřitelnost mléka je kombinací iniciační enzymatické hydrolýzy a následné enzymově nezávislé agregační reakce proteinů. Dobrá sýřitelnost mléka závisí na jeho neporušeném složení, na obsahu kaseinových bílkovin, jejich složení a genetickém typu, na obsahu minerálních látek a jejich rovnováze s bílkovinami atd. Sýřitelnost negativně ovlivňuje přítomnost mastitidního mléka (Čejna, Chládek, 2005). Kaseiny kravského mléka jsou velmi důležité pro svoje nutriční a funkční vlastnosti. S rostoucí produkcí sýrů se také zvyšuje tlak mlékárenských podniků k pravidelnému monitoringu obsahu kaseinu. To je též podpořeno zaváděním nových analytických metod pro jeho zjišťování. Vedle bazénových vzorků má stanovení kaseinu význam i v rámci kontroly užitkovosti, a to z hlediska šlechtění a monitoringu krmení. Nízký obsah kaseinu má negativní vliv na výtěžnost sýrů (Čejna, Chládek, 2007). V posledním období se naskytla možnost rutinního stanovení obsahu kaseinu v rámci kontroly užitkovosti a při zpeněžování a tím získat údaje o složce mléka. V současné době je tento ukazatel mlékárnami sledován, ale nedochází ke zpeněžování podle obsahu kaseinu v mléce. Nejvyšších hodnot dosahuje obsah kaseinu v listopadu, prosinci a lednu. Mezi dojenými plemeny skotu je vykazován nejvyšší obsah kaseinu u plemene jersey. Obsah kaseinu se 22

23 jeví na základě dostupných údajů z literatury jako uspokojivý ukazatel pro selekci. Tento ukazatel má význam zejména v sýrařských oblastech (například v Itálii u plemene brown swiss a ve Švýcarsku) (Hřeben, Bucek, 2005). Společný evropský trh s mléčnými výrobky včetně mléka postupně začíná klást stále větší nároky především na prvovýrobu. Obsah mléčných složek, především bílkoviny začíná významně ovlivňovat cenu nakupovaného mléka od chovatelů. Velmi důležitou složkou mléka je pro zpracovatele sýrů především zastoupení kaseinu v mléce (Hřeben, Bucek, 2005) Lokalizace genu CSN3 Gen pro mléčný protein kappa kasein (CSN3) je u skotu lokalizovaný na 6. chromozomu a kóduje informaci pro jeden z nejdůležitějších proteinů mléka, který je součástí tzv. kaseinového komplexu (Neubauerová, 2000). Na obrázku 1 je znázorněno umístění genu CSN3 na chromozomu 6 (BTA6) (Smith et al., 1997). Primární struktura bez karbohydrátové části proteinu obsahujícího 169 aminokyselin je ukázán na obrázku 2 (NG-KWAI-HANG, 2003). Obr. 1 Lokalizace genu CSN3 na 6. chromozomu u skotu (Smith et al., 1997). 23

24 Obr. 2 Primární struktura κ-kaseinu B (NG-KWAI-HANG, 2003). Referenční protein pro κ- kasein je κ-cn A-1P. Je složen ze 169 aminokyselinových zbytků následovně: Asp4, Asn8, Thr15, Ser12, Ser P1, Pyroglu1, Glu12, Gln14, Pro2O, Gly2, Ala14, Cys2, Val11, Met2, Ile12, Leu8,Tyr9, Phe4, Lys9, His3, Trp1 a Arg5. Vypočtená molekulová hmotnost je Da (Farrell et al., 2004) Variabilita genu CSN3 V genu CSN3 je známo 11 genetických variant. Nejběžnější alely jsou označovány písmenem A a B. Varianta B se od A odlišuje substitucí Ile za Thr na pozici 136 a Ala za Asp na pozici 148. A varianta je predominantní u mléčných plemen s výjimkou plemene Jersey. Další alela C se liší od alely A náhradou His 97 za Arg 97. Alela E se liší od alely A náhradou Gly 155 za Ser 155. PAGE analýzou byla alela D označena jako nová varianta, ale tato alela byla později zjištěna jako identická ke CSN3 C. Nesprávnou identifikací CSN3 D indikovalo potřebu pro sekvenační analýzy (PCR apod.) k potvrzení nových genetických variant pro všechny kaseiny. CSN3 F byl objeven pomocí PCR u Zebu a křížence černobílého skotu. Tato analýza odhalila dvounukleotidovou změnu mezi CSN3 A a CSN3 F: G za T na druhé pozici kódující Thr 145 (nezpůsobuje změnu proteinu) a T za G na druhé pozici Asp 148 (který poskytuje Val 148 v F 24

25 variantě). Tento druhý protein byl označen F 1. Druhá F varianta, která obsahuje substituce a která přinesla změnu z Arg 10 na His 10 (Arg10His) byla považována za F 2. Stejné výzkumy pojmenovaly následující variantu G. Tato nová alela byla popsána u Alpských plemen. G variantu způsobuje Arg 97 v CSN3 B, který je změněn na Cys 97. Opět tato varianta byla označena jako G 1. Jiná varianta CSN3 byla nalezena u yaka (Bos grunniens) a byla také označena jako CSN3 G. Ta se odlišuje od CSN3 A mutací Asp148Ala a kodony pro rezidua 167 a 168 jsou rozdílné, ale to nepřinese změnu fenotypu proteinu. Tato pozdější varianta (Asp148Ala) byla označena G 2. Další CSN3 H se odlišuje od A varianty změnou Ser104Ala. Varianta CSN3 I se liší od CSN3 A změnou Ser104Ala. Konečně CSN3 J byl objeven u Bos taurus na Pobřeží Slonoviny. Zdá se, že tato varianta vznikla z CSN3 B varianty mutací Ser155Arg. Rozdíly v pozicích a aminokyselinách jednotlivých variant jsou znázorněny v tabulce 8 (Farrell et al., 2004). Tab. 8 Pozice a aminokyselinové rozdíly v proteinu κ-kaseinu (Farrell et al., 2004). Varianta Pozice a aminokyselina v proteinu A Arg Arg Ser Thr Thr Asp Ser B Ile Ala C His E Gly F1 Val F2 His Ile Ala G1 Cys Ile Ala G2 Ala H Ile I Ala J Ile Ala Arg 25

26 3.3.5 Frekvence alel a genotypů genu CSN3 v populaci V ČR nebyly dosud chovatelé ani plemenářské organizace pod ekonomickým tlakem, který by nutil systematicky sledovat a publikovat zastoupení genotypů CSN3 alespoň u býků vybraných k opakovanému nasazení. Jsou však v posledních dvaceti letech období, kdy bylo genotypování prováděno často, především v 90. letech. V období let 1994 až 1998 se genotypování provádělo u všech býků vybraných k opakovanému nasazení v populacích plemene českého strakatého a holštýnského plemene. Po roce 1999 se touto problematikou zabývaly pouze některé plemenářské organizace. V grafech 1 a 2 jsou uvedeny výsledky rozborů laboratoře imunogenetiky Českomoravské společnosti chovatelů, a.s. na stanovení genotypů CSN3 u býků českého strakatého (192 případů) a holštýnského plemene (182 případů). Vedle hlavního informačního zdroje byly rovněž využity některé volně dostupné informace o sledovaných plemenících z materiálů společností Natural, s.r.o., CZ DELTA, s.r.o. a Plemo, a.s. Do sledování byly zařazeni býci ročníku narození 1985 až Z grafu 2 je patrný vyšší podíl genotypu AA u holštýnského plemene (63,2 %) v porovnání s českým strakatým plemenem (43,2 %). Výraznější rozdíl mezi oběma plemeny byl rovněž vykázán u genotypu AB (47,4 % u plemene českého strakatého a 30,2 % u plemene holštýnského) a u genotypu BB (7,3 % u plemene českého strakatého a 3,3 % u plemene holštýnského) (Hřeben, Bucek, 2005). Běžně se vyskytují pouze alely A a B, přičemž je zřejmá převažující tendence alely A a jednotlivá plemena se liší pouze výší frekvence výskytu. Frekvence alel C a E jsou velmi nízké (Neubauerová 2000). Gazdová et al., (2007) sledovali frekvence rozložení genotypů a alel genu CSN3 u českého strakatého a holštýnského plemene. Hlavní mléčná plemena, jako je holštýnské plemeno, má nižší frekvenci alely B, naopak plemena s kombinovanou užitkovostí, jako je české strakaté plemeno, má vyšší frekvenci alely B genu CSN3. Jejich výsledky jsou uvedeny v tabulce 9. 26

27 Tab. 9 Absolutní (n) a relativní (r) frekvence genotypů a relativní frekvence alel CSN3 (Gazdová et al., 2007). Plemeno n AA AB BB České strakaté 807 Holštýnské 488 n r n r n r 286 0, , ,14 A 0,61 0,39 AA AB BB n r n r n r 261 0, , ,08 A 0,73 0,27 B B Kučerová et al., (2004) sledovali plemeníky a zjistili 3 genotypy markeru CSN3. Genotypy AA s četností 38 %, AB s četností 48 % a BB 14 %. Alelická četnost alely A byla 0,62 a četnost alely B byla 0,38. Kučerová et al., (2006) ve sledované populaci pozorovali frekvence genotypu CSN3 AA 35,4 % a BB 13,0 %. Ve své práci nalezli jen nízké frekvence genotypů obsahující alelu E. Genotyp AE se vyskytl ve frekvenci 2,3 %, genotyp BE 2,5 %. Genotyp EE nebyl v celé pozorované populaci nalezen. Frekvence CSN3 genotypů podle Bovenhuise et al., (1992) je u genotypu AA 63,63 %, AB 32,62 % a genotypu BB je 3,75 %. Studii prováděl na holštýnském skotu. Tsiaras et al., (2005) sledovali frekvence genotypů genu CSN3 u 278 krav holštýnského plemene. Pozoroval pouze genotypy AA a AB s frekvencemi 0,89 a 0,11. Absence genotypu BB mohlo být podle autora připsáno náhodě, v kombinaci s nízkou frekvencí B varianty u holštýnského plemene. Odhad alelových frekvencí byl 0,94 a 0,06 pro A a B v tomto pořadí. NG-Kwai-Hang et al., (1984) prováděli studii na 2045 kravách holštýnského plemene. Frekvence alely A byla 0,744 a frekvence alely B 0,256. Holštýnské krávy měly asi 53 % homozygotů pro alelu A, 4 % pro alelu B a 43 % pro heterozygotní genotyp AB. Freyer et al., (1999) uvádí v tabulce 10 frekvence alely CSN3 B u některých plemen skotu spolu s autory, kteří tyto frekvence prezentovali. 27

28 Tab. 10 Alelové frekvence CSN3 B u mléčných plemen (Freyer et al., 1999). Plemeno Počet krav CSN3B Autor Holštýn ,13 Oloffs DSR 481 0,2 Panicke SMR 804 0,28 Panicke Montbiliarde 646 0,37 Grosclaude Jersey 437 0,56 Erhardt Braunvieh ,59 Ortner Pozn. DSR německý černobílý skot, SMR kříženec německého černobílého skotu, 25 % jersey a 50 % holštýn. Bobe et al., (1999) zjišťovali genotypy a frekvence genotypů pro CSN3 u 233 krav holštýnského plemene. Genotyp AA mělo 166 krav (68,3 %), BB 8 (3,4 %) a genotyp AB mělo 66 krav (28,3 %). Graf č. 1 Frekvence genotypů CSN3 u býků holštýnského a českého strakatého plemene (Hřeben, Bucek, 2005) ,6 5,3 1,1 1,0 7,3 1,0 2,2 3,3 1, , ,0 47, ,9 63, ,2 0 celkem české strakaté holštýnské AA AB AE BB BE 28

29 Graf č. 2 Celková frekvence genotypů CSN3 (Hřeben, Bucek, 2005). AE 2% BB 5% BE 1% AB 39% AA 53% Vliv genu CSN3 na mléčnou produkci krav CSN3 je používaný jako genový marker ve šlechtění skotu, protože byly nalezeny efekty na mléčnou produkci. Gen CSN3 a jeho varianta B částečně zvyšuje podíl kappa kaseinu v celkovém mléčném proteinu. Hlavně genotyp CSN3 BB je asociován s obsahem proteinu a tuku. Naopak genotyp CSN3 AA je vázán s vyšším výnosem mléka, proteinů a tuku (Gazdová et al., 2007). Dle Kučerové et al., (2004) je alela A podmiňující pro vyšší dojivost, ale nižší obsah bílkovin a tuku v mléce a horší kvalitu mléčné bílkoviny. Zatímco alela B, ovlivňuje vyšší obsah bílkovin a tuku a lepší kvalitu bílkoviny, ale na druhou stranu ovlivňuje také nižší nádoj. Dle Hřebena a Bucka (2005) mají menšinově se vyskytující genotypy AE a EE výrazně negativní vliv na kvalitu mléka. Gazdová et al., (2007) uvádí v tabulce 11 metodu nejmenších čtverců a standardní chyby pro selektované znaky genotypů genu CSN3, kde jsou statisticky významné rozdíly v obsahu mléčného proteinu mezi genotypy CSN3 (genotypy BB > AB > AA). Z toho vyplývá pozitivní efekt genotypu CSN3 BB na obsah proteinu. Velmi významné rozdíly zjistili mezi obsahem tuku a proteinu u českého strakatého a holštýnského skotu. V jejich studii české strakaté plemeno 29

30 mělo významně vyšší obsah proteinu a nižší tuk než plemeno holštýnské. Lokus CSN3 významně neovlivňoval obsah tuku a laktózy. Tab. 11 Metoda nejmenších čtverců a standardní chyby pro selektované znaky a genotypy CSN3 genu. Metoda nejmenších čtverců a standardní chyby pro rozdíly mezi českým strakatým a holštýnským plemenem (Gazdová et al., 2007). Mléčný protein Mléčný tuk CSN3 AA AB BB České strakaté Plemeno Holštýn 3,44 ± 0,03 A 3,44 ± 0,03 A 3,54 ± 0,04 B 3,53 ± 0,04 a 3,42 ± 0,04 b 4,23 ± ,22 ± ,04 ± 0,10 4,04 ± 0,09 A 4,39 ± 0,10 B Pozn. hodnoty s rozdílným horním indexem označují významné úrovně uvnitř řady: P 0,05 (a,b), P 0,01(A,B) V práci Kučerové et al., (2004) byly zjišťovány genotypy markeru CSN3 u 37 plemeníků českého strakatého skotu a u 5506 jejich dcer byly sledovány ukazatele mléčné užitkovosti za první normovanou laktaci. Dcery po otcích s genotypem AA nadojily na první normované laktaci o 157 kg a 289 kg více mléka oproti dcerám s genotypem AB a BB. Dcery po otcích AB a BB tak vyprodukovaly 97 % a 94% nádoje dcer po otcích AA. Rozdíl mezi skupinami AA a AB byl statisticky středně významný. Obdobné výsledky byly zjištěny u množství bílkovin a tuku v mléce. Dcery plemeníků s genotypem AA vyprodukovaly o 6 kg více bílkovin a o 9 kg více tuku v porovnání s dcerami plemeníků genotypu AB. Rovněž tento rozdíl byl statisticky středně významný. Byl zjištěn statisticky vysoce významný rozdíl v obsahu bílkovin v mléce a středně významný rozdíl v obsahu tuku v mléce mezi dcerami po plemenících s genotypem BB a dcerami po plemenících s genotypem AA a AB. Obsah bílkovin a tuku byl nejvyšší u genotypu BB oproti genotypům AA a AB, které činily pouze 96 % obsahu bílkovin genotypu BB. Kučerová et al., (2006) našli významné rozdíly mezi genotypy CSN3 lokusu pro procento proteinu a množství proteinu. Genotypy BB byly asociovány s vyšší plemennou hodnotou (PH) pro procento proteinu, ale nižší PH pro množství proteinu, zatímco genotyp BE souvisel s vyšší PH hodnotou 30

31 pro množství proteinu ale nižší hodnotou pro procento proteinu. To znamená, že alela E spolu s alelou B dávají efekt podobný genotypu AA. Nicméně v této studii genotyp AA byl asociován s nižší průměrnou PH pro množství mléka. Tab. 12 Vztah mezi genotypy genu CSN3 a parametry mléčné produkce (Kučerová et al., 2006) Genotyp CSN3 Počet zvířat Průměrné plemenné hodnoty pro Protein Protein (kg) (%) Tuk (kg) Tuk (%) Dojivost AA ,3-2,31 a 0,022-3,15 0,020 AB ,6-0,45 a 0,019 a -1,84 0,003 AE 10-92,0-1,62 0,010-3,56-0,008 BB ,1-2,22 0,038 a -3,67 0,007 BE 11 0,9 0,11 0,018-0,07-0,011 Pozn. a znamená významný rozdíl P<0,05 mezi dvěma označenými genotypy NG-Kwai-Hang et al., (1984) uvádí ve své práci, že zvířata s genotypem CSN3 BB produkovaly o 12 kg více proteinu než zvířata s CSN3 AA a AB. Protože dojivost nebyla ovlivněna variantami genu CSN3, rozdíly v produkci proteinu byly od CSN3 BB v obsahu o 0,13 % více proteinu než CSN3 AA. Výsledky Tsiarase et al., (2005) indikovaly, že CSN3 má významný vliv na výnos a obsah proteinu (genotyp AB > AA). Zvířata s genotypem AB produkovaly o 21 (± 9) kg více mléčného proteinu než zvířata s genotypem AA. Vyšší bylo i procento proteinu v mléce o 0,08 % (± 0,04). Na obsah tuku a množství laktózy neměl vliv. Nezjistil také žádné asociace mezi polymorfismy genu CSN3 a reprodukčními vlastnostmi. Bovenhuis et al., (1992) také uvádí významný vliv genotypů CSN3 na mléčnou produkci. V jeho práci uvádí, že CSN3 BB krávy produkovaly o 173 kg mléka méně než krávy s genotypem CSN3 AA. Nicméně CSN3 genotypy měly vysoce významný vliv na obsah proteinu. Zvířata s genotypem BB produkovaly o 0,08 % vyšší obsah proteinu než zvířata s genotypem AA. Efekt genotypů CSN3 na procento tuku nebyl významný. Nicméně významný efekt CSN3 genotypů byl zjištěn na kilogramy tuku. Zde B alela byla asociována s nižším výnosem tuku. Žádný významný efekt CSN3 genotypů na množství proteinu nebyl v této práci zjištěn. 31

32 4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 Údaje o zvířatech Ke stanovení genotypů genu CSN3 bylo použito 392 zvířat ze tří chovů v ČR. Byly zde zahrnuty zvířata na první až sedmé laktaci, počty zvířat v jednotlivých laktacích jsou uvedeny v tabulce 13. Jednalo se o plemena české strakaté a holštýnské, případně kříženky těchto plemen. Zastoupení v jednotlivých oddílech plemenné knihy (PK) je znázorněno v tabulce 14. Z této tabulky vyplývá, že nejvyšší zastoupení mělo plemeno české strakaté vedené v oddílu plemenné knihy CA (48,4 % zvířat) a dále plemeno holštýnské, vedené v oddílu plemenné knihy HA (29,5 %). Tab. 13 Zastoupení krav v jednotlivých laktacích Laktace Počet kusů Proc. zastoupení , , , , , , ,28 Součet Tab. 14 Zastoupení krav v oddílech plemenné knihy Chov Oddíl PK CA CB CC HA HB HC HD Součet 1 Počet kusů Proc. zastoupení 80,9 7,87 11,2 2 Počet kusů Proc. zastoupení 80,8 5,38 13,9 3 Počet kusů Proc. zastoupení 73,5 4,76 19,1 2,72 Počet kusů Součet Proc. zastoupení 48,4 3,83 7,65 29,5 1,91 7,65 1,

33 Pozn. Oddíl plemenné knihy HA 100% podíl krve plemene holštýn, HB podíl krve plemene holštýn 87,5 % a více, HC podíl krve plemene holštýn %, HD podíl krve plemene holštýn %. Oddíl plemenné knihy CA podíl krve plemene české strakaté 75 % a více, CB podíl krve plemene české strakaté %, CC podíl krve plemene české strakaté %. 4.2 Stanovení parametrů mléčné užitkovosti Všechny sledované parametry mléčné produkce (dojivost, procento tuku, procento proteinu, procento laktózy a počet somatických buněk) byly zjištěny v kontrole užitkovosti. Procento tuku, procento proteinu a procento laktózy byly stanoveny dle normy ČSN Stanovení složení mléka infračerveným absorpčním analyzátorem pomocí přístroje Bentley 2000 (Bentley Instruments). Počet somatických buněk byl stanoven fluoro-opto-elektronickým přístrojem Somacount 500 (Bentley Instruments). Všechny údaje o zvířatech pocházely z databáze Ústavu morfologie, fyziologie a genetiky zvířat na MZLU v Brně. 4.3 Stanovení genotypů genu CSN3 Pro izolaci DNA byl použit komerční set Jetquick blood and cell culture DNA spin kit 250. Z vyizolované DNA se namnoží cílový fragment DNA metodou PCR a následně se stanoví genotypy s využitím metody RFLP (polymorfismus délky restrikčních fragmentů) a gelové elektroforézy Izolace DNA z mléka Aby bylo možné pracovat s DNA je třeba ji nejdříve upravit tím, že se zbaví proteinů, které ji obalují. Tomuto procesu se říká izolace. K izolaci DNA byla vyvinuta řada metodik v různých modifikacích. Pro izolaci DNA byl v mém případě použit komerční set Jetquick blood and cell culture DNA spin kit 250 (firma Genomed GmbH). Jako zdroj DNA bylo použito mléko. Pracovní potřeby: Mikrozkumavky 2 ml, stojan, sterilní rukavice, proteáza, mikropipety a špičky k mikropipetám, termostat, centrifuga, pufry K1, KX, K2, eluační pufr, mléko. 33

34 Pracovní postup: 1. 1 ml mléka se odpipetuje do 1,5 ml zkumavky. Poté se zahřeje na 50 C, centrifuguje se 1 min. 3000x g. 2. Do čisté zkumavky se napipetuje 200 µl spodní frakce (bez mléčného tuku). 3. Přidá se 20 µl Protease K a promíchá se se vzorkem. 4. Pak se přidá 200 µl pufru K1 a důkladně se promíchá. 5. Následuje inkubace při 30 min./62 C. 6. Přidá se 200 µl ethanolu a důkladně a jemně se promíchá. 7. Přenese se na kolonku a centrifuguje 1 min x g. 8. Sběrná zkumavka se vylije, přidá se 500 µl KX a centrifuguje 1 min x g. 9. Sběrná zkumavka se opět vylije, přidá se 500 µl K2, centrifuguje 3 min x g. 10. Vylije se obsah sběrné zkumavky a centrifuguje se na sucho max. 1 min. 11. Kolonka se přenese na popsanou 1,5 ml Eppendorfovu zkumavku, přidá se 100 µl elučního pufru a nechá se 2 min. při pokojové teplotě. 12. Pak se centrifuguje 2 min x g a čirý roztok se přenese do sterilní zkumavky Amplifikace sekvence DNA metodou polymerázové řetězové reakce (PCR) Polymerázová řetězová reakce je metoda rychlého a snadného zmnožení stejného úseku DNA. PCR se sestává z několika kroků. Prvním krokem je denaturace, kdy dojde k rozrušení vodíkových můstků a rozvolnění dvoušroubovice. Výsledkem je jednovláknová DNA. Druhým krokem je nasedání primerů na specifická místa DNA. Na primery nasedá polymeráza. Posledním třetím krokem je prodlužovací fáze. Zde dochází k samotné syntéze DNA, ve směru od 5 ke 3 přirůstá vlákno komplementární k původní molekule DNA. Tyto tři kroky se cyklicky opakují 20 40krát. Metodika byla provedena dle Mitry et al., (1998). Velikost PCR produktu byla 379 bp. Pracovní potřeby: Termální cykler (PTC-200, MJ Research Inc.), centrifuga, PCR mikrozkumavky 0,2 ml, mikropipety a špičky k mikropipetám, 34

35 mrazící box, stojan, sterilní rukavice, destilovaná voda, směs nukleotidů, pufr pro PCR, roztok primerů A a B, Taq DNA polymeráza, roztok vyizolované DNA. Použité primery: přímý: 5 CACGTCACCCACACCCACATTTATC 3, zpětný: 5 TAATTAGCCCATTTCGCCTTCTCTGT 3 Pracovní postup: 1. Do zkumavky se napipetuje 13,8 µl destilované vody. 2. Odebere se 2,5 µl pufru a přidá se do zkumavky. 3. Poté se přidá 1,5 µl MgCl2, 1 µl směsi nukleotidů, 0,5 µl primeru A a 0,5 µl primeru B. 4. Nyní se přidá 0,2 µl polmerázy. 5. Přidá se 5,0 µl vlastní DNA a vše se řádně promíchá. 6. Zkumavka se vloží do centrifugy a krátce se stočí. 7. Nyní se zkumavka vloží do termálního cykleru předem vyhřátého na 95 C a spustí se reakce. Tab. 15 Složení reakční směsi pro PCR Chemikálie množství (µl) dh2o 13,8 10*PCR 2,5 MgCl2 1,5 dntp 1,0 Primer A 0,5 Primer B 0,5 Taq Polymeraza 0,2 DNA 5,0 Tab. 16 Podmínky PCR reakce Denaturace proteinazy 94 C 5 min. Vlastní PCR Denaturace 94 C 0,30 s. Annealing 60 C 0,30 s. Elongace 72 C 0,30 s. Závěrečná elongace 72 C 2 min. Po provedené PCR reakci byla provedena kontrola PCR produktu pomocí gelové elektroforézy. 35

36 4.3.3 Identifikace alel genu CSN3 metodou RFLP Pomocí polymorfizmu délky restrikčních fragmentů (RFLP) se identifikují alely na základě přítomnosti nebo absence specifického restrikčního místa. Namnožená genomová DNA (PCR produkt) je štěpena příslušnou restrikční endonukleázou a separována pomocí elektroforézy na agarózovém gelu. Vizualizace DNA se provádí pomocí ethidiumbromidu. Pracovní potřeby: Centrifuga, Eppendorfovy zkumavky 0,5 ml, mikropipety a špičky k mikropipetám, sterilní rukavice, termostat, vana na elektroforézu, TBE pufr, 3% agarózový gel s ethidiumbromidem, elektroforetický zdroj, transiluminátor, destilovaná voda, pufr pro restrikční enzym, restrikční enzym HinfI, nanášecí pufr na elektroforézu (směs sacharózy s bromfenolovou modří), vzorek PCR produktu, hmotnostní marker (vzorek fragmentů DNA o daných velikostech). Tab. 17 Složení reakční směsi pro RFLP Chemikálie množství (µl) dh2o 2,6 Pufr 2,0 HinfI 0,4 PCR produkt 5,0 Enzym HinfI štěpí PCR produkt (velikost 379 bp): - alela A - 3 fragmenty o velikostech 156 bp, 132 bp a 91 bp. - alela B - 2 fragmenty o velikostech 288 bp a 91 bp. Pracovní postup: 1. Odebere se 10 µl PCR produktu a přenese se do zkumavky. 2. Přidá se 3 µl destilované vody, 1,5 µl pufru pro restrikční enzym a 0,5 µl restrikčního enzymu HinfI. 3. Zkumavka se vloží na 3 hodiny do termostatu předehřátého na 37 C. 4. Pak se na plato s jamkami přidá kapka nanášecího pufru, k ní se přidá 5 µl štěpeného PCR produktu a důkladně se promíchá. 5. Směs se pak nanáší do příslušných jamek agarózového gelu. 6. Poté se zapojí elektrický zdroj. 36

37 7. Na zdroji se nastaví napětí 80V na 15 min a spustí se. 8. Po uplynutí 15 minut se vypne zdroj a za použití rukavic se vyjme gel z vany a vložíme pod UV zářič. 9. Z ozářeného gelu se pak odečte genotyp daného jedince Příprava gelu pro gelovou elektroforézu Gelová elektroforéza je fyzikálně-chemická metoda pro dělení látek v elektrickém poli. Zařízení se skládá z elektroforetické vany s anodou, katodou a pufrem, vlastního držáku gelu, ve kterém bude k separaci docházet, a externího zdroje stejnosměrného napětí. DNA migruje směrem od katody (- pól) k anodě (+ pólu). Rychlost pohybu studované DNA závisí jednak na jejích vlastnostech (molekulová hmotnost - velikost, elektrický náboj, prostorové uspořádání), na vlastnostech nosiče (gelu), prostředí (pufru) a na přivedeném napětí. Pro separaci molekul o určité velikosti je třeba volit správnou koncentraci gelu a délku separace. Pracovní potřeby: TBE pufr, ethidiumbromid, agaróza, elektroforetická vana (s anodou, katodou, pufrem a vaničkou), externí zdroj stejnosměrného napětí, izolepa, hřebínek, varné sklo, mikrovlnná trouba, rukavice Pracovní postup: 1. Vanička se oblepí izolepou, čímž se zajistí zatuhnutí gelu ve vaničce. 2. Připraví se 3% roztok agarózy a TBE pufru. 3. Následně se roztok vloží do mikrovlnné trouby a nechá se opakovaně procházet varem do doby, než bude roztok čirý. 4. Poté se přidá 3 µl ethidiumbromidu a důkladně se roztok promíchá. 5. Roztok se pak přelije do přichystané vaničky, nasadí se hřebínek a nechá se ztuhnout. 37

38 4.4 Matematicko-statistické vyhodnocení Pro statistické analýzy byl použit smíšený lineární model (MLM), proc mixed metoda REML (Restricted Maximum Likelihood) programem SAS for Windows Model pro stanovení asociací genotypů genu CSN3 s mléčnou užitkovostí pro plemeno: ijklmn i j k l m n ( ijklmn x) eijklmn y = µ + Gen + Chov + Gen Chov + Plem + Lakt + Otec + b x + y ijklmn = užitkový znak µ = průměrná hodnota sledované vlastnosti Gen i = vliv genotypů genu CSN3, pevný efekt, i = AA, AB, BB Chov j = vliv chovu, pevný efekt, j = 1, 2, 3 Gen * Chov k = vliv interakce genotypů genu CSN3 a chovu, pevný efekt, k = 1,, 9 Plem l = vliv plemene, pevný efekt, l = CA, CB, CC, HA, HB, HC, HD Lakt m = vliv pořadí laktace, pevný efekt, m = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 Otec n = vliv otce, náhodný efekt, n =1,..., 76 ( x x) b ijk = regrese na den laktace, pevný efekt e ijklmn = reziduum Model pro stanovení asociací genotypů genu CSN3 s mléčnou užitkovostí u plemene holštýn: ijkl i j k l ( xijkl x) eijkl y = µ + Gen + Lakt + Otec + Plem + b + y ijkl = užitkový znak µ = průměrná hodnota sledované vlastnosti Gen i = vliv genotypů genu CSN3, pevný efekt, i = AA, AB, BB Lakt j = vliv pořadí laktace, pevný efekt, j = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 Otec k = vliv otce, náhodný efekt Plem l = vliv plemene, pevný efekt, l = CA, CB, CC, HA, HB, HC, HD ( x x) b ijkl = regrese na den laktace, pevný efekt e ijkl = reziduum 38