Metodka sledování kontamnace ovzduší v okolí veřejných komunkací aromatckým polycyklckým uhlovodíky na základě jejch analýz na povrchu lstů dřevn Petr Maršík, Tomáš Vaněk, Pavel Knderman
. Úvod.. Prncp metody Polycyklcké aromatcké uhlovodíky (PAH) jsou sloučenny tvořené dvěma a více aromatckým kruhy které vznkají př spalování nejrůznějších materálů organckého původu. Jsou to polutanty s řadou pro žvočšné organsmy a člověka rzkových vlastností: patří mez ně potencální karcnogeny a mutageny a řada z nch je vysoce toxcká. Nejsledovanější a potencálně nejškodlvější skupnou PAH jsou látky s -6 kondenzovaným benzenovým jádry (obr. ). Některé z těchto PAH (chrysen, benzo(a)anthracen, benzo(b)fluoranthen, benzo(k)fluoranthen, benzo(a)pyren, ndeno(,,3-c,d)pyren, d-benzo(a,h)anthracen) jsou klasfkovány agenturou US EPA jako karcnogeny. Mez nejlépe prozkoumané karcnogenní PAH patří benzo(a)pyren, jehož koncentrace v potravnách upravuje nařízení Evropské komse č. 08/005 a který slouží jako marker pro určení nebezpečných koncentrací PAH. Na základě koncentrace benzo(a)pyrenu (BaP) je též českou legslatvou stanoven cílový msní lmt pro polycyklcké aromatcké uhlovodíky v ovzduší (nařízení vlády č. 597/006 Sb.), který je vyjádřen jako koncentrace BaP ve výš ng/m. V České republce jsou prováděna pravdelná měření průměrných ročních koncentrací PAH v ovzduší (vyjádřeno jako ekvvalent koncentrace BaP) sítí montorovacích stanc ČHMÚ (v roce 009 na 3 stancích). Obsah některých PAH v odpadních vodách a kalech (např. fluoranthenu) je regulován českou státní normou č. 75 7554/998. Významným zdrojem PAH jsou spalovací motory (především deselové) motorových vozdel (Lm a kol., 999). Z tohoto důvodu je významně zvýšená koncentrace PAH v ovzduší v městských aglomeracích především v okolí frekventovaných komunkací (hlavní slnce, křžovatky). PAH s menším počtem aromatckých jader (-4) jsou v ovzduší přítomny v plynné formě, zatímco vyšší (4 a více) se vyskytují především adsorbované na prachové částce (De Ncola a kol. 005). Protože značná část jak plynných tak prachových polutantů ze vzduchu je zachytávána vegetací, která díky svému olstění dsponuje velkou absorpční plochou, jsou obě zmíněné frakce PAH ve zvýšené míře zachytávány především na jejch povrchu. Tomu napomáhá lpoflní charakter povrchu lstů, které jsou kryty voskovou vrstvou (kutkulou) a ve které jsou lpoflní PAH dobře rozpustné (Howsam a kol., 00). Mnohé rostlny mají navíc povrch lstů pokrytý množstvím jemných chloupků (trchomů), které účnně zachycují polétavé prachové částce. Z tohoto důvodu je obsah PAH na povrchu lstů dobrým ukazatelem lokálního atmosférckého znečštění těmto látkam. Předkládaná metodka je zaměřena na montorování obsahu atmosférckých PAH v okolí komunkací č jných míst se zvýšenou koncentrací PAH v ovzduší, které jsou zachyceny okolní vegetací. Je založená na kvaltatvní kvanttatvní analýze frakce PAH zachycené na povrchu (kutkula) č ve vntřních pletvech lstu a na frakc obsažené v prachových částcích na lstech zachycených. Měla by sloužt především jako nástroj pro zjšťování stavu ovzduší v okolí komunkací především v dlouhodobém horzontu (v řádu měsíců) a vzájemnému porovnání úrovně znečštění na sledovaných lokaltách. Zároveň by výstupem provedených analýz měly být nformace o absorpční kapactě jednotlvých rostlnných druhů na témže stanovšt, což může být jedním z výběrových krtérí př volbě druhového složení vysazované zeleně na exponovaných místech.. Odborné termíny a jejch defnce Polycyklcké aromatcké uhlovodíky (PAH) - rámc této metodky se termínem polycyklcké aromatcké uhlovodíky (PAH - Polycyclc aromatc hydrocarbons) rozumí uhlovodíky tvořené až 6 kondenzovaným benzenovým jádry (naftalen až benzo(g,h,)perylen vz obr. ). PAH s vyšším počtem kondenzovaných jader nemohou být prostřednctvím této metodky dostatečně přesně dentfkovány an kvantfkovány.
Obrázek : Strukturní vzorce vybraných polyaromatckých uhlovodíků sledovaných v rámc této metodky. naftalen acenaften acenaftylen fluoren fenanthren anthracen fluoranthen pyren benzo(a)anthracen chrysen benzo(b)fluoranthen benzo(a)pyren dbenzo(a,h)anthracen benzo(g,h,)perylen ndeno(,,3-cd)pyren Vysoce účnná kapalnová chromatografe (HPLC) separační metoda založená na průchodu směs látek v proudu kapalny (moblní fáze) kolonou naplněnou sorbentem (staconární fáze) zachycujícím s různou ntenztou jednotlvé látky směs. Ty 3
procházejí kolonou různou rychlostí a jsou tak navzájem oddělovány. HPLC bývá spojena s různým detekčním zařízením. Plynová chromatografe spojená s hmotnostní spektrometrí Chromatografcká separační metoda, př které se používá jako moblní fáze proud plynu, který prochází velm tenkou kolonou. Př průchodu směs látek dochází k jejch nterakcím s vntřním povrchem kolony a tak rozdílům v rychlost průchodu kolonou a následné separac. V hmotnostním spektrometru je pak analyzovaná látka onzovaná a profl vznklých ontů analyzován na základě jejch molekulární (ontové) hmotnost. Iontová spektra jsou často pro konkrétní chemcké sloučenny charakterstcká a lze podle nch s určtou mírou pravděpodobnost odhadnout strukturu měřených látek.. Vybavení Terénní odběr vzorků polyethylenové sáčky pracovní rukavce zahradncké nůžky samolepící štítky, popsovací fx fotoaparát Laboratorní zpracování vzorků skener rastrový skenovací program (např. LAM (Leaf Area Measurment, verson.3, Copyrght 003 The Unversty of Scheffeld, A.P. Askew)) ultračstá deonzovaná voda, dchlormethan, hexan, acetontrl M roztok KOH sušdlo (Na SO 4 ) pnzeta ultrazvuková lázeň laboratorní kádnka o objemu l slnostěnná odsávací baňka 500 ml fltrační zařízení s výměnným teflonovým fltračním membránam o porostě 0,45um Petrho msky různých velkostí fltrační papír skleněné 500 ml Erlenmeyerovy baňky se zábrusem vakuová rotační odparka odpařovací baňky o objemu 0 50 ml kádnky různých objemů Pasteurovy ppety skleněné, ppetovací nástavec pro Pasteurovy ppety 60 ml zábrusové zkumavky slnostěnné zkumavky se šroubovacím uzávěrem s teflonovým těsněním plynný dusík (6.0) skleněná kolona 400 x 0 mm slkagel Keselgel 60 Analýza vzorků HPLC systém s fluorescenční detekcí: vysokotlaková gradentová pumpa autosampler nebo vysokotlaký nástřkový ventl chromatografcká kolona Pnnacle II PAH 4um (50 x 4.6 mm) kolonový termostat průtokový fluorescenční detektor PDA nebo UV detektor moblní fáze: ultračstá deonzovaná voda, acetontrl (gradent grade) 4
nádoba na jímání odpadu ovládací a vyhodnocovací software GC/MS systém autosampler (AI 3000) splt/spltless njektor plynový chromatograf (Trace) kaplární kolona TR-5MS SQC (30m; 0,5mm; 0,5 µm) MS detektor (ITQ on trap) moblní fáze: Hélum 5.0 ovládací a vyhodnocovací software 3. Vzorkování 3. Výběr odběrových lokalt Montorovací odběrové lokalty jsou vybírány na základě blízkost a typu zdroje znečštění (křžovatka, frekventovaná komunkace, železnční trať). Důležtá je zejména exponovanost a geografcká poloha odběrového místa. Rozhodující úlohu př tom hraje především hustota provozu, výskyt a frekvence dopravních kongescí a sklon komunkace (na komunkacích s prudším sklonem jsou zpravdla koncentrace PAH vyšší). Významnou rol hraje též posce lokalty zda se jedná o místo v otevřené krajně se zvýšeným prouděním vzduchu, uzavřené údolí č zástavbu. Vzhledem ke sledování vztahu PAH v ovzduší a jejch sorbce na lsty je vhodné př výběru lokalty zohlednt také blízkost montorovacích stanc ČHMÚ, na kterých se provádí standardní měření koncentrací benzo(a)pyrenu v ovzduší (vz kap..). Pro odběr vzorků lstů je vhodné zvolt úsek podél komunkace ne delší než 50 m vzdálené -0 m od okraje komunkace (vzdálenost od okraje komunkace by měla být na stejné lokaltě vždy přblžně stejná). V otevřené krajně je vhodnější volt dřevny rostoucí blíže ke zdroj znečštění. 3. Odběr vzorků lstů Lstí opadavých stromů je odebíráno zhruba od polovny dubna do konce růstové sezóny (říjen). Frekvenc odběrů je vhodné zvolt podle exponovanost komunkace, zpravdla až 4 odběry do měsíce. Odběry se provádějí za suchého počasí, nejlépe alespoň den po posledních dešťových srážkách z důvodu lepšího skladování a snadnější manpulace a podílu prachových částc, které mohou být prudkým deštěm smyty. Ncméně na obsah PAH na lstech má podle dostupných údajů rozhodující vlv především jejch koncentrace v ovzduší a nkolv množství a frekvence srážek, jak ukazují některé výzkumy (Howsam a kol. 00). Vzorky lstů jsou odebírány z okrajových částí koruny dřevn přblžně ve stejné part (zpravdla blíže ke komunkac) ve výšce - m nad úrovní okolního terénu. Odběr je prováděn v rukavcích co nejšetrněj, aby nedocházelo k otěru povrchové vrstvy. Jsou sbírány dospělé lsty přblžně stejného stáří (ve stejné vzdálenost od vrcholu větve). Odebrané lsty jsou uloženy v plastových sáčcích označených samolepícím popsným štítky. Odebrané vzorky jsou poté přímo dále zpracovávány nebo před zpracováním uskladněny v chladu př 4 C po dobu maxmálně 5 dnů. Př odběru je pořzována fotodokumentace jak celé odběrové lokalty, tak jednotlvých dřevn tak, aby byla zřejmá jejch posce v rámc dané lokalty. 4. Zpracování vzorku 4. Měření plochy lstů 5
Plocha lstů je měřena pomocí stolního skeneru a rastrového skenovacího software (např. volně dostupného Leaf Area Measurment, který přímo provádí přepočet na jednotku plochy - mm ). Použté rozlšení se lší podle velkost skenovaných lstů: velm malé lsty jsou skenovány př více než 600 dp (zpravdla 800), středně velké př 600 dp a velké př 400 dp. Pro další analýzu se zpracovává množství lstů o celkové ploše přblžně 0 dm (tj. 00 000 mm ). Přesná hodnota plochy dále zpracovávaných lstů je zaznamenána do protokolu. Na tuto hodnotu jsou pak vztahována všechna další naměřená data. Takto naměřená plocha se zpravdla násobí dvěma (sorpce na obou stranách lstu nutné zaznamenat do protokolu). Příklad výstupu změřené plochy ze skenovacího software je na obr.. Obrázek : Výstup měření lstové plochy (slvoň) pomocí software Leaf Area Measurment. 4. Přečštění extraktů Extrakce PAH z prachových částc Po změření povrchu je adsorbovaný prach z lstů opláchnut jejch ponořením na 0 vteřn do kádnky s ultračstou vodou (500 ml) umístěnou v ultrazvukové lázn. Suspenze je poté pod vakuem zfltrována přes na laboratorních vahách předem zvážený teflonový fltr (0.45µm), jehož přesná hmotnost je zaznamenána do protokolu. Fltr se zachyceným prachem je poté sušen př laboratorní teplotě ve tmě cca 5-7 dní. Suché fltry jsou zváženy na přesných laboratorních váhách a hmotnost je zaznamenána do protokolu. Odečtením hmotnost čstého fltru a fltru se zachyceným prachovým částcem získáme čstou hmotnost omyvatelných prachových částc, která bude dále použta př přepočtech PAH v prachové frakc. Poté jsou extrahovány den ve tmě hexanem (0 ml) ve skleněných zkumavkách s těsnícím šroubovacím uzávěrem. Pokud se jedná o vzorky, které budou měřeny pomocí GC/MS, přdá se v této fáz ke vzorku roztok směs deuterovaných PAH (00 ng každé látky) 6
jako vntřní standardy (vz kap. 4.3). V případě analýzy na HPLC je přdána směs halogendervátů PAH (500 ng každé látky) (vz kap. 4.3). Po extrakc jsou zkumavky mn ponořeny do ultrazvukové lázně a celá extrakce stejným objemem hexanu zopakována. Obě hexanové frakce se sljí a zakoncentrují se na vakuové odparce ve vodní lázn o teplotě 37 C. Po zahuštění je zbytek rozpouštědla opatrně odpařen proudem dusíku. Pro přípravu vzorků určených pro analýzu na GC/MS je třeba se pokud možno vyhnout kontaktu vzorků s předměty vyrobeným z plastů, neboť tím se dramatcky zvyšuje podíl kontamnujících organckých látek (změkčovadla) ve vzorku. Extrakce PAH z lstů Lsty jsou po oplachu prachových částc uskladněny ve chladu (4 C) - nejdéle však dny poté umístěny do zábrusové baňky se 00 ml dchlormethanu a mn extrahovány v ultrazvukové lázn. Po vyjmutí z lázně jsou př laboratorní teplotě ponechány ve tmě ještě x hod. Pokud se jedná o vzorky, které budou měřeny pomocí GC/MS, přdá se v této fáz ke vzorku vntřní standard (směs deuterovaných PAH ke vzorkům pro analýzu GC/MS, směs halogendervátů PAH pro analýzu HPLC) (vz kap. 4.3). Poté je dchlormetanový extrakt slt, přdáno sušdlo (Na SO 4 ) a po zfltrování vzorek zahuštěn na vakuové odparce a odpařen do sucha proudem dusíku. Takto zpracované vzorky jsou uskladněny ve tmě a chladu pro následnou purfkac. Př přípravě vzorků pro GC/MS analýzu je třeba se stejně jako př přípravě extraktů z prachových částc vyhýbat používání plastových pomůcek z důvodu kontamnace vzorku látkam z těchto předmětů. Přečštění extraktů Odparek je rozpuštěn ve 0 ml n-hexanu mn v ultrazvukové lázn a 60 ml skleněné zábrusové zkumavce extrahován vytřepáním do stejného množství acetontrlu, aby byl zbaven polárních příměsí. Svrchní hexanová vrstva je po dokonalém oddělení obou fází odebrána a rezdua PAHů ze spodní acetontrlové vrstvy extrahována znovu 0 ml hexanu. Obě hexanové vrstvy jsou slty a zahuštěny na objem cca ml na vakuové odparce. V případě extraktů z pletv lstů bývá zpravdla přítomno značné množství lpdckých příměsí, které mohou být účnně odstraněny saponfkací. Ta se provede M roztokem KOH za občasného míchání př teplotě 40 C po hodny ve zkumavce se šroubovacím uzávěrem. Svrchní hexanová vrstva je poté odebrána a 3x vytřepávána se stejným množstvím vody. Poté je přdáno sušdlo (Na SO 4 ) a vzorek je dále čštěn stejně jako extrakt prachových částc. Zahuštěný hexanový extrakt je následně aplkován na skleněnou kolonu naplněnou aktvovaným slkagelem (4 g) pokrytým vrstvou sušdla (Na SO 4 ). Kolona je pak následně promyta 50 ml n-hexanu a poté 00 ml směs n-hexan-dchlormethan (:), aby se odstranly zbytky polárních kontamnací. Obě frakce jsou poté slty a zahuštěny na objem cca 00 µl. 4.3 Analýza PAH Vzorky byly analyzovány dvěma způsoby: pomocí kapalnové chromatografe s PDA a fluorescenční detekcí a GC/MS analýzou umožňující spolehlvější dentfkac detekovaných polycyklckých uhlovodíků. Obě metody se výhodným způsobem doplňují a umožňují přesné stanovení sledovaných látek v analyzovaném materálu. Pro měření koncentrace PAH v ovzduší se standardně používá postup podle techncké normy ISO 884:000 Stanovení sumy (plynná a pevná fáze) polycyklckých aromatckých uhlovodíků ve vnějším ovzduší Odběr na fltry a sorbent s analýzou metodou plynové chromatografe/hmotnostní spektrometre. Jelkož je popsaná metoda založená na zachycení prachových částc a PAH na sorbenty a fltry a obsahuje tudíž poměrně malé množství organckých kontamnantů, je ve stávající podobě pro analýzu PAH na povrchu lstů nevhodná (týká se to především extrakce a purfkace PAH). Z tohoto důvodu byla metodka měření modfkována, aby vyhovovala účelům analýzy rostlnného materálu. 7
Pro kvantfkac byly použty v závslost na způsobu analýzy dva typy vntřních standardů: pro GC/MS analýzu vybrané PAH značené deuterem a pro HPLC halogenované derváty PAH. Výhoda použtí deuterovaných dervátů spočívá v jejch praktcky dentckých vlastnostech, jako mají nedeuterované PAH vzorku, tudíž př přečštění vzorku dochází ke stejným ztrátám u obou skupn látek. Ze ztráty vntřních standardů př manpulac pak lze dopočítat ztráty u sledovaných látek. Navíc mají deuterované látky podobné retenční vlastnost (vzhledem k vyšší molekulové hmotnost zpravdla mírně zpožděnou retenc), jako látky sledované. Deuterované PAH mají molekulovou hmotnost (a tudíž hmotnost molekulového ontu) navýšenou oprot přrozeným PAH o příslušný počet jednotek odpovídající počtu deuterových jader nahrazujících v molekule vodíkové atomy, takže jsou v MS spektru snadno odlštelné a kvantfkovatelné. Vzhledem k rozdílným vlastnostem PAH o různém počtu kondenzovaných benzenových jader je vhodné zvolt výběr několka deuterovaných standardů tak, aby z tohoto hledska pokrývaly celou měřenou škálu PAH (např. acenafthen-d0, chrysen-d, benzo(a)pyren-d, naftalen-d8, anthracen-d0 jaké byly použty př vývoj této metodky). Jako vntřní standardy pro HPLC jsou vhodné halogenové (např. fluorované, bromované) derváty PAH. Vzhledem ke změnám fluorescenčních vlastností je však účelné provést kalbrac pomocí absorpce př UV vlnových délkách, což sce vyžaduje vyšší navážku vntřních standardů, ale umožňuje snímání sgnálu z UV spektrometru nezávsle na výstupu z fluorescenčního detektoru, takže se lze mnohdy vyhnout překrývání sgnálů látek o podobných retenčních časech. Analýza pomocí HPLC s fluorescenční detekcí Př použtí HPLC s fluormetrckou detekcí je nespornou výhodou nžší pozadí šumu a poměrně vysoká ctlvost metody. Detekční lmt se pohybuje od do 5 ng v závslost na konkrétní látce a na měřícím systému. PAH, které mají slabou fluorescenční odezvu (acenafthylen) jsou však touto metodou analyzovány obtížně. Identfkac lze provádět pouze na základě retenčních časů píků př charakterstckých exctačních a emsních vlnových délkách. Pouze př vyšších koncentracích PAH (řádově stovky ng v závslost na konkrétní látce) je možné dentfkovat dané látky pomocí UV-Vs absorbčních spekter. Pro separac na použté koloně (Pnnacle II PAH (Restek)) specalzované na separac PAH byl př vypracování dané metodky použt gradent voda:acetontrl (od 40% acetontrlu v čase 0, 00% ve 8 mn pokračujících až do 40 mn). V průběhu analýzy byla teplota kolony udržována na 35 C, průtok moblní fáze čnl ml/mn. Pro jednotlvé PAH jsou v tabulce uvedeny exctační a emsní vlnové délky a retenční časy, které byly za výše popsaných podmínek použty pro jejch detekc. Tabulka. Název Retenční čas [mn] λ exctační λ emsní naftalen 0,3 70 340 acenaftylen - - - acenaften 3,9 70 340 fluoren 4, 70 340 fenatren 5,7 54 375 antracen 7, 60 40 fluoranthen 8,8 60 40 pyren 0, 54 390 8
benzo(a)antracen 4,0 54 390 chrysen 4,8 54 390 bezo(b)fluoranthen 8, 60 40 benzo(a)pyren 3, 60 40 dbenzo(a,h)antracen 3,8 60 40 benzo(g,h,)perylen 34,8 60 40 ndeno(,,3-cd)pyren 35,4 93 498 Analýza pomocí GC-MS Plynová chromatografe s hmotnostní detekcí poskytuje za daných podmínek vysokou ctlvost na zhruba stejné úrovn jako předešlá metoda (detekční lmt - ng). Navíc lze využít poměrně spolehlvou kvantfkac pomocí deuterovaných vntřních standardů. Nespornou výhodou je jstější dentfkace založená na kombnac retenčních charakterstk a hmotnostních spekter (v případě PAH především molekulových hmotností), v případě přístrojového vybavení použtého př vypracování této metodky možností tandemové hmotnostní spektrometre (MS n ), kdy se rzko záměny s případnou nterferující látkou výrazně snžuje. Nevýhodou je vysoká ctlvost vůč kontamnac detektoru (vysoké pozadí) a tudíž vyšší nároky na přípravu a purfkac vzorků (vz kap. 4.). PAH mají vesměs typcká hmotnostní spektra, která díky svým charakterstkám usnadňují jejch rozpoznání kvantfkac. Ionty hmotnostního spektra jsou charakterzovány hodnotam m/z (molekulová hmotnost dělená počtem nábojů), kdy ve většně případů každý on nese náboj jedný a proto číselná hodnota odpovídá zpravdla molekulové hmotnost příslušného ontu. Hlavní on je zpravdla ontem molekulovým a má tudíž př použtí onzace EI - hodnotu m/z rovnou molekulové hmotnost (vz obr. 3). Další fragmenty se ve srovnání s hlavním molekulovým ontem vyskytují zpravdla v mnmálních množstvích. U vyšších PAH se mohou vyskytnout onty s polovční hodnotou m/z molekulového ontu, což je způsobeno tím, že určté procento molekul nese dvojí náboj. Obrázek 3: MS spektrum benzo(a)fluoranthenu. PAH_kal_00ng #600-607 RT: 40.0-40.30 AV: 8 SB: 9 40.05-40.6 NL:.43E5 T: + c Full ms [50.00-300.00] 00 5. 95 90 85 80 molekulový on 75 70 65 Relatve Abundance 60 55 50 45 40 35 30 5 0 5 dvakrát nabtý molekulový on 50. 0 5 0 5.03 48.0 6. 3.09 4.03 85.03 06.98 73.05 87.06 00.05 33.0 5.0 74.09 46.09 64.97 80.96 98.69 60 80 00 0 40 60 80 00 0 40 60 80 300 m/z Pro vypracování dané metodky byla použta následující nstrumentace: hmotnostní spektrometr ITQ Ion Trap (ontová past), plynový chromatograf TRACE opatřený autosamplerem AI 3000 a splt/spltless njektorem (Thermo Scentfc). Jako moblní fáze 9
bylo použto helum o průtoku ml/mn. Měření probíhalo ve spltless módu, nastřkováno bylo µl vzorku. Pro separac byla použta kolona THERMO TR-5ms SQC (délka 30 m, vntřní průměr 0,5 mm, tloušťka flmu 0,5 µm). Teplotní gradent pro separac sledovaných PAH začínal na 60 C a pokračoval do 300 C ve 48 mnutě. Jednotlvé látky byly kvantfkovány na základě odezvy př m/z uvedených v tabulce, které odpovídaly molekulovým hmotnostem příslušných PAH. Tabulka. Název Retenční čas [mn] m/z naftalen 9, 8 acenaftylen 5,7 5 acenaften 6,5 53 fluoren 8,8 66 fenatren 3, 78 antracen 3,4 78 fluoranthen 8,7 0 pyren 9,7 0 benzo(a)antracen 35,5 8 chrysen 36,7 8 bezo(b)fluoranthen 40,3 5 benzo(a)pyren 4,6 5 dbenzo(a,h)antracen 45,9 78 benzo(g,h,)perylen 45,7 76 ndeno(,,3-cd)pyren 46,7 76 Kalbrace a stanovení lmty detekce a lmty stanovtelnost Před každou měřenou sérí vzorků je nezbytné provádět kalbrac příslušného měřícího systému (HPLC GC/MS) s použtím kalbračních roztoků směs standardů PAH a používaných vntřních standardů, aby se omezly chyby vznklé změnou odezvy příslušného zařízení. Tato kalbrace se provádí prostřednctvím sestrojení kalbrační přímky, která je vypočítána na základě ředící řady směs standardů. Kromě toho se provádí po každých 3 analyzovaných vzorcích měření testovacího vzorku směs standardů a vntřních standardů pro korekc posunu retenčních časů a síly odezvy sgnálu. Je vhodné používat jeden a týž testovací vzorek pro celou sér měření, aby se v průběhu celé sére zajstly mnmální odchylky v koncentracích sledovaných látek v rámc testovacího vzorku. Koncentrace standardů testovacího vzorku by se měly pohybovat přblžně ve středu rozsahu kalbrační přímky. Zpravdla se volí 5-0 bodová kalbrace (N=5 až 0), kde každý bod odpovídá konkrétní známé koncentrac. Pro sestrojení kalbrační přímky se jako odezva sgnálu (závslá proměnná y kalbrační přímky) zpravdla používá plocha píku. Př kalbrac je nutné nejprve zvolt příslušný pracovní rozsah. Ten by měl pokrývat hodnoty koncentrací očekávaných v měřených vzorcích, hodnoty měřené odezvy by měly být v rámc tohoto 0
rozsahu lneárně korelované s koncentrací (vz dále) a rozptyl těchto hodnot by měl být nezávslý na koncentrac. Př sestrojování kalbrační křvky se zjšťují následující parametry: - homogenta rozptylů - lnearta kalbrace - odhad koefcentů vlastní kalbrační funkce - odhad konfdenčních ntervalů Pro ověření homogenty rozptylů je třeba provést n opakovaných měření (nejlépe 0) kalbračních roztoků př nejnžší a nejvyšší (-té) koncentrac pracovního rozsahu (ČSN ISO 8466-, 993). Oba tyto soubory koncentrací se použjí pro výpočet rozptylů s a s : n j= ( y, j y ) s = (4.3.) n kde n je počet opakování na dané koncentrační úrovn a y je příslušný průměr naměřených hodnot. Významnost rozdílů v mezních hodnotách pracovního rozsahu se rozptyly testují pomocí F-testu. Testovaná hodnota PG se vypočte následujícím způsobem: s PG = pro s s > s (4.3.) s PG = pro s s > s (4.3.3) a porovná se s tabelovaným hodnotam pro F-rozdělení. Pokud je hodnota PG F f;f;0,99, není rozdíl mez oběma rozptyly statstcky významný, pokud je PG > F f;f;0,99, je tento rozdíl významný a je nutné zúžt pracovní rozsah. Pro výpočet je účelné využít dostupný software (např. Mcrosoft Excel, SPSS, Statstca a pod.). Předběžný test lnearty lze provést grafckým vynesením kalbračních bodů spolu s vypočtenou regresní přímkou, ze kterého lze často případnou nelneartu odhalt pouhým pohledem. Statstcký test lnearty spočívá v testování vhodnost proložení naměřených kalbračních hodnot lneární a nelneární (zpravdla polynom -3 řádu) kalbrační funkcí. To se provede testem rezduálních směrodatných odchylek s y a s y obou funkcí. Hodnoty těchto odchylek jsou mírou rozptýlení naměřených hodnot kolem dané regresní funkce. Rozdíl hodnot rozptylů DS získáme výpočtem: DS = (4.3.4) ( N ) s y ( N 3) s y a tuto hodnotu a hodnotu rozptylu nelneární kalbrační funkce s y testujeme F-testem: Pokud je hodnota PG F, nevede použtí nelneární kalbrační funkce k těsnějšímu proložení hodnot a kalbrační funkce je lneární. Pokud je PG > F, je nutné opět zúžt pracovní rozsah tak, aby bylo lnearty dosaženo, nebo se pro výpočet použje nelneární kalbrace, což však celé hodnocení komplkuje. Vlastní kalbrační funkce se provádí pomocí lneární regresní analýzy N naměřených hodnot koncentrační řady kalbračních roztoků standardů. Pomocí regresní analýzy se získají koefcenty kalbrační funkce a a b, vyjádřené rovncí:
y = a + b (4.3.5) kde y je naměřená hodnota odezvy, x je koncentrace vzorku, průsečík s osou odezev a je vypočtená hodnota slepého stanovení (pozadí) a ctlvost měření b odpovídá směrnc kalbrační funkce. Tuto analýzu je účelné provádět pomocí některého z výše zmíněných software. Z kalbrační funkce se potom určí hodnota koncentrace v analyzovaném vzorku podle vzorce: y a x = (4.3.6) b Takto získaná kalbrační funkce je však pouze odhadem mírou shody tohoto odhadu s naměřeným kalbračním daty je rezduální směrodatná odchylka s y, která vyjadřuje rozptýlení hodnot kolem kalbrační přímky. Je dána následujícím vztahem: N N [ y ( a + bx )] ( y yˆ ) = = s y = = (4.3.7) N N kde yˆ je hodnota opakování naměřená se stejným vzorkem, x a y získané hodnoty použté pro výpočet kalbrační křvky, N počet koncentračních úrovní, a vypočtená hodnota slepého stanovení a b ctlvost metody (směrnce kalbrační přímky). Další zjšťovanou charakterstkou kalbrační funkce jsou konfdenční ntervaly (ntervaly spolehlvost). Je to rozmezí, ve kterém se na základě zákona o rozdělení chyb náhodných velčn může pro konkrétní zvolenou hladnu statstcké významnost α vyskytovat skutečná kalbrační funkce, jejíž vypočítaný průběh je vždy zatížen určtou chybou. Výpočet konfdenčního ntervalu (VB) pro konkrétní naměřenou hodnotu se určí ze vztahu: xˆ, ± ( xˆ ) = xˆ VB (4.3.8) xˆ, = yˆ a ± s b y t ( f, α ) ( yˆ y) + + N b N nˆ b ( x x) = (4.3.9) kde ṋ je počet opakovaných stanovení, yˆ je průměr naměřených hodnot z n opakování, ṋ je počet opakovaných stanovení, y průměr kalbračních hodnot y, x průměr kalbračních koncentrací x, s y hodnota rezduální směrodatné odchylky a t ( f, α ) tabelovaná (krtcká) hodnota Studentova t-rozdělení pro f = N stupně volnost a hladnu spolehlvost ( α ). Pro výpočet konfdenčních ntervalů je vhodné použít specalzovaný software. Pro vyjádření přesnost a ctlvost kalbrace je třeba stanovt základní lmtní hodnoty, kterým jsou především lmta detekce a lmta stanovtelnost. Lmta detekce Lmta detekce y d udává takovou úroveň měřeného sgnálu, kdy je ještě možné odlšt sgnál od šumu. Tomu odpovídající koncentrace x d je mnmální koncentrací, kterou je ještě možné na základě odezvy sgnálu odlšt od nulové koncentrace. V případě použtých metod (HPLC, GC-MS) lze pro výpočet lmty detekce použít velkost sgnálu slepého pokusu a směrnce kalbrační přímky. Pro toto stanovení je nutné
nejprve změřt chromatogram slepého pokusu (rozpouštědla). Z chromatogramu slepého pokusu se určí maxmální kolísání baselne (h max ) v oblast vymezené 0-t násobkem ½ šířky píku stanovované látky. Lmta detekce (odezva sgnálu) se pak určí ze vztahu: y d = 3 h max (4.3.0) a odpovídající lmtní koncentrace analytu x d ze vzorce: y d x d = (4.3.) bh kde b h je směrnce kalbrační přímky sestrojené nkolv na základě ploch píků, ale jejch výšky. Lmta stanovtelnost Lmta stanovtelnost y s je nejmenší hodnota sgnálu, pro kterou je relatvní směrodatná odchylka predkce z kalbračního modelu dostatečně malá a rovna nějakému zvolenému číslu C, zpravdla rovnému 0, (tj. 0%). Lmta stanovtelnost lze podobně jako lmta detekce pro použté separační metody určt z úrovně šumu chromatogramu slepého pokusu, kdy se opět určí maxmální kolísání baselne (h max ) v oblast 0-t násobku ½ šířky píku analytu, a lmta stanovtelnost se analogcky vypočte na základě vztahu: y s = 0 h max (4.3.) a lmtní koncentrace stanovované látky x s : y s x s = (4.3.3) bh kde b h je směrnce kalbrační přímky sestrojené nkolv na základě ploch píků, ale jejch výšky. 5. Interpretace výsledků Koncentrace a zastoupení PAH sorbovaných na povrch lstů v prachových částcích jsou vyhodnocovány odděleně. Celkové množství jednotlvých PAH zachycených jednotkou lstové plochy (zpravdla dm ) je pak vypočteno jako součet obou frakcí. Př hodnocení sorpční kapacty lstů je třeba brát v potaz vlastnost jejch povrchu jako je přítomnost trchomů (chlupů), síla kutkuly (povrchové voskové vrstvy), sezónní přítomnost lepkavých exudátů (např. u lípy v době květu) na povrchu lstů apod., které mohou ovlvnt především množství zachycených prachových částc a tím koncentrac PAH v příslušné frakc. Př fnálním hodnocení je třeba zahrnout řadu dalších doplňkových údajů jako jsou nformace o místě odběru (exponovanost, geografcké umístění vz kap. 3.), vzdálenost od okraje vozovky, povětrnostní podmínky v době odběru a v dané sezóně č kondce sledovaných dřevn. Tyto údaje umožní dokonalejší nterpretac výsledků v šrším kontextu. Do hodnocení je účelné též zahrnout výsledky dlouhodobého montorngu stavu ovzduší (koncentrace BaP) a modelové zpracování msních dat prováděné ČHMÚ a to především z lokalt v blízkost montorovacích stanc. 6. Odběrové a analytcké protokoly Vz přílohy č., a 3 3
7. Archvace Z odběrových míst je nutné archvovat spolu s orgnálním odběrovým protokoly též plánky lokalt a fotodokumentac pořízenou v rámc sezóny. Stejně tak je nezbytné archvovat (v elektroncké podobě) výstupy (naměřená surová data) z měřících systémů spolu s protokolem dokumentujícím dané podmínky měření a vyhodnocování a kalbračním soubory. Zpracované vzorky je vhodné archvovat po dobu dvou let od jejch zpracování a to v tmavých vzduchotěsných valkách nejlépe v mrazáku (-8 C). 8. Možné komplkace Na kvaltu naměřených dat mohou mít vlv následující faktory: Kontamnace rostlnným vosky. Jedná se především o látky pocházející především z povrchové voskové vrstvy lstů (kutkuly), nebo pryskyřčných kanálků. Může se vyskytnout př extrakc některých rostlnných materálů se slnou kutkulou nebo obsahem pryskyřc (jehlčnany). Takovéto vzorky je nutné před měřením pomocí GC/MS ještě důkladně přečstt sloupcovou chromatografí na slkagelu, popříp. na na koloně se sephadexovou náplní (molekulové síto). Př analýze pomocí HPLC běžných koncentrací vzorků neční tento typ kontamnací zpravdla větší potíže. Vegetační sezóna. Může mít vlv zejména př vzájemném porovnávání různých druhů dřevn. Je nutné zohlednt též dobu kvetení a s tím spojené vylučování lepkavých sekretů (lípa), které mohou výrazně ovlvnt zejména frakc PAH v prachových částcích. Povětrnostní podmínky. Povětrnostní podmínky mohou ovlvnt především množství sorbovaných prachových částc (oplach deštěm, vítr) a tím množství PAH v této frakc. Je proto třeba, aby odběru předcházelo alespoň několk dní bez srážek. Obsah PAH na povrchu lstů není podle údajů v lteratuře povětrnostním podmínkam výrazněj ovlvňován. Skladování. Př skladování může docházet k přeměnám PAH vlvem světla. Proto je třeba jak nezpracovaný výchozí materál tak zpracovávané vzorky chránt před světlem. Čstota použtých chemkálí. Použtí kontamnovaných rozpouštědel může v některých případech zkreslt konečné koncentrace PAH ve vzorku. Purfkační kroky. Př čštění extraktů může docházet k určtým ztrátám PAH ze vzorku, proto je třeba dbát na pečlvé dodržování všech parametrů extrakce (objem, doba, koncentrace, ph roztoků, eluční objemy). 9. Bezpečnost práce Př odběru vzorků v bezprostřední blízkost veřejných komunkací je nutné dodržovat pravdla slnčního provozu a dbát zvýšené opatrnost. Řada PAH patří mez kancerogenní a vysoce toxcké látky, proto je třeba př prác s extrakty (zejména koncentrovaným) a používaným standardy dodržovat pravdla pro nakládání s jedovatým látkam (používat vždy vhodný pracovní oděv a ochranné rukavce, př prác nejíst, nepít, nekouřt). Protože se často jedná o látky těkavé, je nezbytné provádět veškerou manpulac v laboratorní dgestoř v dobře větrané místnost. Je též nezbytně nutné zajstt skladování vznklého odpadu ve specálních a zřetelně označených nádobách. Odpad musí být odborně lkvdován v souladu se zákonem o nebezpečných chemckých odpadech. Podobně používaná rozpouštědla (zejména chlorovaná) patří mez zdraví škodlvé až nebezpečné těkavé látky, proto pro manpulac s nm platí stejná pravdla jako pro nakládání s PAH. Navíc se jedná zpravdla o hořlavny. třídy, proto je nezbytné dodržovat pokyny pro prác s vysoce hořlavým látkam. 4
0. Závěr Předkládaná metodka je zaměřena na kvanttatvní analýzu a zastoupení nejvýznamnějších polyaromatckých uhlovodíků (PAH) z ovzduší sorbovaných na povrchu lstů. Metoda je založena na měření obsahu PAH dvěma nezávslým metodam - HPLC s fluorescenční detekcí a GC/MS. Umožňuje kvanttatvní porovnání adsorbce sledovaných PAH na lsty různých druhů dřevn. Výsledky mohou být následně využty orgány místní samosprávy a státní správy pro montorng znečštění ovzduší v obytných lokaltách. Kromě toho mohou zjštěné nformace o absorbční kapactě lstů různých druhů dřevn posloužt jako vodítko př výběru druhů pro výsadbu ochranné zeleně podél dopravně vytížených komunkací. Metodka může dále posloužt jako základ pro výzkum mechanzmů adsorpce PAH na povrch a do pletv lstů a fyzologckých procesů, které mohou být zvýšenou přítomností těchto látek ovlvňovány.. Použtá lteratura ČSN 75 7554 (998) Jakost vod - Stanovení vybraných polycyklckých aromatckých uhlovodíků (PAU) - Metoda HPLC s fluorescenčním, a metoda GC s hmotnostním detektorem. Český normalzační nsttut Nařízení Komse (ES) č. 08/005 ze dne 4. února 005, kterým se mění nařízení (ES) č. 466/00, pokud jde o polycyklcké aromatcké uhlovodíky Nařízení vlády č. 597/006 Sb. ze dne. prosnce 006, o sledování a vyhodnocování kvalty ovzduší, příloha, část C, odstavec ISO 884:000 (000) - Stanovení sumy (plynná a pevná fáze) polycyklckých aromatckých uhlovodíků ve vnějším ovzduší - Odběr na fltry a sorbent s analýzou metodou plynové chromatografe/hmotnostní spektrometre. Drectve 004/07/EC of the European Parlament and of the Councl of 5 December 004 relatng to arsenc, cadmum, mercury, nckel and polycyclc aromatc hydrocarbons n ambent ar. (6..005) Offcal Journal of the European Unon, L 3/3 Lm L. H., Harrson R. M., Harrad S. (999) The contrbuton of traffc to atmospherc concentratons of polycyclc aromatc hydrocarbons. ENVIRONMENTAL SCIENCE & TECHNOLOGY, 33 (0): 3538-354 De Ncola F., Masto G., Prat M. V., Alfan A. (005) Temporal varatons n PAH concentratons n Quercus lex L. (holm oak) leaves n an urban area. CHEMOSPHERE 6 (3): 43 440 Howsam M., Jones K. C., Ineson P. (00) PAHs assocated wth the leaves of three decduous tree speces. II: uptake durng a growng season. CHEMOSPHERE 44 (): 55-64 Meloun M., Mltký J. (004) Statstcká analýza expermentálních dat. Academa, Praha ČSN ISO 8466- (993) Česká státní norma, Jakost vod, Kalbrace a hodnocení analytckých metod a určení jejch charakterstk. Část : Statstcké hodnocení lneární kalbrační funkce. Český normalzační nsttut 5