PROTEOMIKA Proteomika membránových proteinů. Analýza proteinových komplexů

PROTEOMIKA 2018 Proteomika, proteiny, co a proč. Metody práce s bílkovinami (Petrák 15/10) Značení bílkovin, separační metody, 2-DE (Petrák 22/10) 2-DE záludnosti, digesce a identifikace bílkovin pomocí MS-úvod (Petrák 29/10) Principy hmotnostní spektrometrie (Man 5/11) Identifikace proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie (Man 12/11) Limity 2-DE, Shot-gun strategie (Petrák 19/11) Kvantitativní metody v shot-gun experimentech (Petrák 26/11) Proteomika membránových proteinů, proteinové komplexy (Petrák 3/12) Speciální metody, klinická proteomika, top-down..??? (Petrák 10/12)

PROTEOMIKA 2018 Proteomika membránových proteinů Analýza proteinových komplexů

INTEGRAL MEMBRANE PROTEINS ~ 21 000 human genes 5000-6000 IMPs 10 000 genes actively expressed by an average cell type 1500-3000 IMPs

INTEGRAL MEMBRANE PROTEINS alpha helix TM domain(s) (20-25 AA) + soluble domains

4500 Number of predicted TM segments in human integral membrane proteins 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 + Fagerberg et al. Proteomics 2011

INTEGRAL MEMBRANE PROTEINS alpha helix TM domain(s) (20-25 AA) + soluble domains low expression

Cellular abundance of transmembrane proteins is LOW (100-1000 copies/cell) Beck et al., Mol Syst Biol. 2011 Nov 8;7:549.

INTEGRAL MEMBRANE PROTEINS alpha helix TM domain(s) (20-25 AA) + soluble domains low expression hydrophobic/amphipathic nature

Hydrofobicita proteinu/peptidu Amino Acid Name One Letter Code Hydropathy Score Isoleucine I 4.5 Valine V 4.2 Leucine L 3.8 Phenylalanine F 2.8 Cysteine C 2.5 Methionine M 1.9 Alanine A 1.8 Glycine G -0.4 Threonine T -0.7 Tryptophan W -0.9 Serine S -0.8 Tyrosine Y -1.3 Proline P -1.6 Histidine H -3.2 Glutamic acid E -3.5 Glutamine Q -3.5 Aspartic acid D -3.5 Asparagine N -3.5 Lysine K -3.9 Arginine R -4.5 GRAVY SCORE Grand average hydropathy (součet hydrofobicity (-4.5 až 4.5) jednotlivých aminokyselin dělený počtem aminokyselin) Aminokyseliny typické pro a-helixy: FAMILY VW (+S)

Hydrofobicita proteinu GRAVY SCORE Grand average hydropathy (součet hydrofobicity (-4.6 až 4.6) jednotlivých aminokyselin dělený počtem aminokyselin) Spíš rozpustné Spíš transmembránové Kyte, J., and Doolittle, R.F. (1982) J.Mol.Biol. 157, 105-132

IMPs - molecules with split personalities hydrophilic hydrophobic

INTEGRAL MEMBRANE PROTEINS alpha helix TM domain(s) (20-25 AA) + soluble domains low expression hydrophobic/amphipathic nature no Arg, Lys in TM domains

Visualized by Protter Vít O., Petrak J., Journal of Proteomics 2017

INTEGRAL MEMBRANE PROTEINS alpha helix TM domain(s) (20-25 AA) + soluble domains low expression hydrophobic/amphipathic nature no Arg, Lys in TM domains detergents interfere with digestion and/or LC-MS UNDER-REPRESENTED IN PROTEOMIC ANALYSES

Nízký podíl identifikovaných transmembránových proteinů a peptidů v necílených proteomických analýzách Komerční (Pierce) trypsinový digest z lidských nádrových buněk proteinů peptidů 615/4537 (13,5%) 38/26263 (0,14%) Detergent +FASP trypsinový digest z lidských nádorových buněk proteinů peptidů 519/4748 (10,8%) 18/28269 (0,035 %)

Překonávání amfipatie a nízké abundance TM proteinů Izolace (obohacení) membrán centrifugace Obohacení/izolace TM proteinů carbonate stripping - uhličitan sodný, vysoké ph delipidace (MetOH/chloroform) fázová separace (Triton X 114) izolace povrchově značených (Ab, biotin, hydrazid, lektiny) Solubilizace TM chaotropy detergenty (nekompatibilita s LC a MS!) organická rozpouštědla

Obohacení membránových frakcí + majoritní cytosolické proteiny + cytoskelet + proteiny asociované s membránou

Standard strategy (targets intact proteins) Membrane fraction Solubilization Tryptic digestion Low purity of membrane fractions! Lack of trypsin clevage sites! Detergents may interfere with digestion Detergents interfere with LC and MS LC-MS/MS LOW ENRICHMENT (10-15%)

Odstranění detergentu Filter Assisted Sample Preparation - FASP Lys-C 30 o C Trypsin 37 o C nahrazení detergentu močovinou Volitený krok Štěpění Lys-C v močovině močovinou výměna pufru a štěpení trypsinem (odpaření) a LC-MS

Standard strategy (targets intact proteins) Membrane fraction Solubilization Tryptic digestion LC-MS/MS LOW ENRICHMENT (10-15%)

Standard strategy (targets intact proteins) Only the hydrophilic segments? Membrane fraction Solubilization Tryptic digestion LC-MS/MS LOW ENRICHMENT (10-15%)

Většina IMPs je N-glykosylována na Asn Asn Lektiny mají vysokou afinitu k cukerným zbytkům (Concavalin A, WGA, RCA 120)

N-GLYCOCAPTURE Capture of N-glycopeptides by immobilized LECTINS PNGase F Peptides released by PNGase F N-Glyco-FASP Zielinska et al. Cell, 2010

Glyco-FASP Trypsin 37 o C peptidy lektiny PNGAse F výměna pufru a štěpení trypsinem Záchyt glykopeptidů na lektinech a odsmytí neglykosylovaných Uvolnění glykopeptidů PNGázou F

Alternativa ke lektinům záchyt glykopeptidů z lyzátu immobilizovaným hydrazidem SPEG solid phase exctraction of glycopeptides

Cukry hydrazide Biotin Hydrazide bind to oxidized carbohydrates through the hydrazide group ( NH-NH 2 ), forming a hydrazone linkage. Oxidation of glycoproteins generates reactive aldehydes that react specifically with hydrazide groups.

Alternativa ke lektinům záchyt glykopeptidů z lyzátu immobilizovaným hydrazidem SPEG solid phase exctraction of glycopeptides SPEG vychytání oxidovaných glykoproteinů na kuličky s hydrazidem, odmytí neglykosylovaných proteinů, naštěpení trypsinem, odmytí a následná eluce PNGázou Zhang H, et al. Nat Biotechnol. 2003 Jun;21(6):660-6.

N-GLYCOCAPTURE Capture of N-glycopeptides by immobilized LECTINS Capture of N-glycopeptides using hydrazide chemistry Peptides released by PNGase (F) N-Glyco-FASP Peptides released by PNGase F SPEG Zielinska et al. Cell, 2010 Zhang et al. Nature Biotechnology, 2003

Classic strategy Only the hydrophilic segments (GLYCOCAPTURE) Membrane fraction Solubilization Tryptic digestion Solubilization Digestion Isolation of N-glycopeptides LC-MS/MS LC-MS/MS

Only the hydrophobic segments? Classic strategy Membrane fraction Solubilization Tryptic digestion Only the hydrophilic segments (GLYCOCAPTURE) Solubilization Digestion Isolation of N-glycopeptides LC-MS/MS LC-MS/MS

Only the hydrophobic segments High ph-trypsin-cnbr (HpTC) Classic strategy Membrane fraction Solubilization Tryptic digestion Only the hydrophilic segments (GLYCOCAPTURE) Solubilization Digestion Isolation of N-glycopeptides LC-MS/MS LC-MS/MS

Identification of IMPs via enrichment of membrane-embedded segments hptc method (High ph-trypsin-cnbr) Vit O, et al. J Proteomics. 2016, 21;149:15-22. Blackler AR, et al. J Proteome Res. 2008, 7(7):3028-34.

hptc method (high ph-trypsin-cnbr) Membrane-enriched fraction Vít O. et al., Journal of Proteomics 2016 Blackler A et al., J Proteome Res. 2008

ph 7.4

hptc method (high ph-trypsin-cnbr) Membrane-enriched fraction Disruption of vesicles Vít O. et al., Journal of Proteomics 2016 Blackler A et al., J Proteome Res. 2008

Na ledu Na 2 CO 3 ph 11

hptc method (high ph-trypsin-cnbr) Membrane-enriched fraction Disruption of vesicles Trypsin added Vít O. et al., Journal of Proteomics 2016 Blackler A et al., J Proteome Res. 2008

37 o C trypsin

CNBr cleaves at Met

HpTC method High ph-trypsin-cnbr Membrane-enriched fraction Disruption of vesicles Trypsin added Vít O. et al., Journal of Proteomics 2016 Blackler A et al., J Proteome Res. 2008

HpTC method High ph-trypsin-cnbr Membrane-enriched fraction Disruption of vesicles Trypsin added Solubilization and CNBr cleavage Delipidation Vít O. et al., Journal of Proteomics 2016 Blackler A et al., J Proteome Res. 2008 Rey M, et al. Anal Chem. 2010

hptc analýza lymfomových buněk Mino 1224 proteinů identifikováno 802 (65,5%) s jednou a více TM doménami 35% peptidů se překrývá s TM doménou > 150 TMP s neznámou funkcí 48 CD leukocytárních membránových markerů TMP z různých membránových kompartmentů Vít et al. J. Proteomics 2016

hptc Only the hydrophobic segments (hptc) GHITM_HUMAN 800-1000 IMPs in various tissues Visualization: Protter IMP Enrichment 40-60% Vít O. et al., Journal of Proteomics 2016

The Pitchfork strategy Only the hydrophobic segments (hptc) Only the hydrophilic segments (GLYCO-CAPTURE) Classic strategy LC-MS/MS C18, Easy Spray, Thermo Orbitrap Fusion Membrane proteome of human PHEO/PGL

PHEOCHROMOCYTOMA / PARAGANGLIOMA Rare neuro-endocrine tumors (0.8:100,000) From adrenal medulla (PHE) From sympathetic or parasympathetic ganglia (PGL) Up to 25 % are malignant, even benign disease has high mortality Often catecholamine-producing Therapy limited, patients only seldom cured NEW DRUG TARGETS ARE NEEDED!

PHEO/PGL Only the hydrophobic segments (hptc) Only the hydrophilic segments (GLYCO-CAPTURE) Classic strategy LC-MS/MS C18, Easy Spray, 180 min, Thermo Orbitrap Fusion Enrichment 45-60 % Enrichment 40-50% Enrichment 12-16%

The membrane proteome of PHEO/PGL Up to 1300 IMPs identified in each PHEO/PGL tumor sample

Relative occurrence 0.6 Number of transmembrane segments Human membrane proteome predicition 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 12+ Number of predicted transmembrane alpha helices membrane proteome prediction

Relative occurrence Number of transmembrane segments 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 12+ Number of predicted transmembrane alpha helices membrane proteome prediction trypsin SPEG gfasp hptc

VMAT2_HUMAN Synaptic vesicular amine transporter (SLC18A2) G GLYCOCAPTURE HpTC Visualization: Protter

G G G GLYCOCAPTURE CLASSIC STRATEGY hptc SCRB2_HUMAN Lysosome membrane protein 2 Visualization: Protter

2584 PHEO/PGL integral membrane protein (15 tumor samples analyzed) PHEOCHROMOCYTOMA 2197 IMPs PARAGANGLIOMA 1846 IMPs 738 1459 387

Missing human proteins no evidence of existence at protein level (PE2, PE3, PE4) 2186 missing proteins in human proteome (Ommen et al, JPR 2018) Low expression Low number of potential tryptic peptides Expression only in specific tissues only

Missing human proteins no evidence of existence at protein level (PE2, PE3, P 2186 missing proteins in human proteome (Ommen et al, JPR 2018) O00624 Sodium-dependent phosphate transport protein 3 hptc O14904 Protein Wnt-9a hptc O15342 V-type proton ATPase subunit e 1 hptc & glycofasp O60330 Protocadherin gamma-a12 SPEG P57773 Gap junction alpha-9 protein glycofasp Q15760 Probable G-protein coupled receptor 19 glycofasp Q5SWH9 Transmembrane protein 69 hptc & trypsin digest Q6IEE8 Schlafen family member 12-like trypsin digest Q6UY09 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 20 SPEG Q7Z4T8 Inactive polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase-like protein 5 hptc Q86VR8 Four-jointed box protein 1 hptc Q8IWD5 Major facilitator superfamily domain-containing protein 6-like trypsin digest Q8N1M1 Bestrophin-3 SPEG Q8NC01 C-type lectin domain family 1 member A SPEG Q92637 High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor IB glycofasp Q99928 Gamma-aminobutyric acid receptor subunit gamma-3 glycofasp Q9H2Y9 Solute carrier organic anion transporter family member 5A1 SPEG Q9UGF7 Olfactory receptor 12D3 SPEG Q9UKL2 Olfactory receptor 52A1 hptc Q9UPC5 Probable G-protein coupled receptor 34 SPEG

MISSING proteins - missing no more TSN31_HUMAN Tetraspanin-31 VA0E1_HUMAN V-type proton ATPase subunit e 1

MISSING proteins - missing no more O15342 Q99680 Q12999 Visualization: Protter

PHEO/PGL membrane proteome 15 tumor samples analyzed to date 2584 integral membrane proteins (status 20.10.2018) Control tissue: human adrenal medulla P H E O 0 0 1 P H E 0 0 0 2 P H E O 0 0 3 P H E O 0 0 4 P H E O 0 0 5 P H E O 0 0 6 P H E O 0 0 7 P H E O 0 0 8 P G L 0 0 1 P G L 0 0 2 P G L 0 0 3 P G L 0 0 4 P G L 0 0 5 P G L 0 0 6 C T R L 0 0 1 C T R L 0 0 2 P24390 P24821 P26006 P26572 P27105 P27338 P27449 P27824 P28068 P28288 P28906 P29972 P30501 P30508 P30511 P30519 P30533 P30536 P32004 P32297 P32856 P33121 P33151 P33527 P33947 P34096

Can we make it quantitative? Occurence of SILAC-compatible aminoacids in peptides 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% K R L K+R K+L L+R K+R+L K R L K+R K+L L+R K+R+L

Vit O, Petrak J. Integral membrane proteins in proteomics. How to break open the black box? J Proteomics. 2017 Feb 5;153:8-20.

PROTEOMIKA 2018 Proteomika membránových proteinů Analýza proteinových komplexů

ANALÝZA PROTEINOVÝCH KOMPLEXŮ Afinitní purifikace komplexů s pomocí protilátky tagované proteiny QUICK- SILAC+RNAi knock-down Nativní vícerozměrné separace Blue native/2d elektroforéza Clear native/2d elektroforéza Nativní LC proteinů-nativní ELFO Proximity labeling

IMUNOAFINITNÍ IZOLACE PROTEINOVÝCH KOMPLEXŮ 1) matrix s protilátkou proti jedné složce komplexu 2) matrix s (rekombinantním) proteinem (návnadou, bait)

Pulldown izolace komplexu s protilátkou proti jedné složce komplexu

Analysis of the Human Endogenous Coregulator Complexome Malovannaya et al. Cell 2011 145, 787-799 1796 primary antibodies 3290 immunoprecipitation experiments 300,000 protein identifications label-free quantitation Filtering based on stoichiometric stability 100,000 specific interactions Involving 11,485 unique human gene products

IMUNOAFINITNÍ IZOLACE PROTEINOVÝCH KOMPLEXŮ 1) matrix s protilátkou proti jedné složce komplexu 2) matrix s rekombinantním proteinem (složkou komplexu) Navázání rekombinantního proteinu s tagem na matrix Eluce specifickou endopeptidázou (trombin) štěpící v tagu Tag (lalůček, přívěšek, značka) - AA sekvence vložená do rekombinantního proteinu sloužící k izolaci, detekci, zakotvení apod...

AFINITNÍ MATRIX Aktivované matrice: NHS Sepharose lze vázat za aminoskupinu (succinimid) CNBr Sepharose...lze vázat za aminoskupinu EAH Sepharose...lze vázat protein za karboxyl (karbodiimid) Thiol sepharose lze vázat za SH cysteinu Matrice s afinitou pro IgG (Fc fragment) Protein G Sepharose Protein A Sepharose Protein A, G magnetic beads Matrice s afinitou pro glykoproteiny ConA Sepharose Velké ligandy (DNA, protein) lze vázat přímo na matrix. Malé ligandy (nukleotid, NADP, hormon ) se váží přes inertní spacer arm.

Typy možných interakcí při imunoprecipitaci Cílový protein Křížově reagující protein ( a jeho partneři) Protein nespecificky vázaný na Ab ( a jeho partneři) Cílový protein + vazebný partner Nespecificky vázaný na matrici ( a jeho partneři)

TANDEMOVÁ AFFINITNÍ PURIFIKACE (TAP) Anne-Claude Gavin et. al., (2002) Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature 415, 142-147 CBP- calmodulin-binding protein TEV štěpné místo virové proteázy TEV 1739 ORF

TANDEMOVÁ AFFINITNÍ PURIFIKACE (TAP)

TANDEMOVÁ AFFINITNÍ PURIFIKACE (TAP) 4562 6466 2357 1993 547 491 Komplexy (v průměru 5-7 komponent) Gavin 2002 Nature Gavin 2006 Nature Krogan 2006 Nature

TANDEMOVÁ AFFINITNÍ PURIFIKACE (TAP)

QUBIC (Quantitative BAC-GFP interactomics) 1125 bait proteinů 1330 BAC-GFP HeLa cell lines 3990 LC-MS!!! Hein MY et al. Cell. 2015 Oct 22;163(3):712-23.

QUICK SILAC+RNAi knock-down Typy možných interakcí při imunoprecipitaci Cílový protein Křížově reagující protein ( a jeho partneři) Protein nespecificky vázaný na Ab ( a jeho partneři) Cílový protein + vazebný partner Nespecificky vázaný na matrici ( a jeho partneři)

QUICK SILAC+RNAi knock-down 4 classes of proteins are present in an immunoprecipitate: target proteins specific interaction partners nonspecific binders cross-reactive proteins After knocking down expression of the protein of interest, only contaminants remain. Matthias Selbach & Matthias Mann Nature Methods, 2006

BLUE NATIVE ELECTROPHORESIS

BLUE NATIVE ELECTROPHORESIS Coomassie G250 serves as substitute for detergents binds on the surface of all membrane and some soluble proteins negative charge shift. Schägger, H. & von Jagow, G. (1991). Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anal Biochem 199, 223-231.

2D (BN-SDS) PAGE sample : added Coomassie brilliant blue G-250 in aminocaproic acid (0.5 M). cathode buffer: Tricine (50 mm), BisTris (15 mm), and Coomassie brilliant blue G-250 (0.02% w/v). anode buffer : BisTris (50 mm).

Arabidopsis thaliana mitochondrial proteome by Blue-native 2-DE

BLUE NATIVE ELECTROPHORESIS Interferuje s fluorescenční detekcí a enzymatickými esejemi!!!

High-resolution CLEAR NATIVE ELECTROPHORESIS CBB je nahrazena anionickýcm detergentem (např. deoxycholát) Detekce Cy3 2D CN-SDS PAGE Wittig et al. Mol Cell Proteomics 6, 7: 1215-1225 (2007)

ANALÝZA PROTEINOVÝCH KOMPLEXŮ Nativní vícerozměrné separace 2-DE blue native elecktroforéza Clear native elektroforéza Nativní LC proteinů-nativní ELFO

NATIVNÍ CHROMATOGRAFIE - NATIVNÍ ELEKTROFORÉZA- LC/MS-MS Analýza železo (hem)-vážících proteinových komplexů v erytroidních buňkách Metabolic labeling of MEL cells by 59 Fe-hemin Anion exchange liquid chromatography Native electrophoresis in presence of Triton X100 MS analysis (Ion trap - LC-MS/MS) Babusiak et al Proteomics. 5(2):340-50.

Native electrophoretic separation of radioactive fractions 18-25. A total 13 protein complexes (bands A-M) were analyzed 33 individual proteins were identified.

Radioaktivní frakce z chromatografie děleny ELFO a jednotlivé bandy naštěpeny a analyzovány MS Hb hemoglobin (α, β1, β2, δ chains) Prx I peroxiredoxin I Prx II peroxiredoxin II PPI - peptidylprolyl isomerase B IAP integtrin-associated protein Complex 1

Ft ferritin Prx I peroxiredoxin I Prx II peroxiredoxin II Hox heme-oxygenase Complex 2 ATPs ATP synthase

Hb hemoglobin (α, β1, β2, δ chains) Prx I peroxiredoxin I Prx II peroxiredoxin II CA II carbonic anhydrase II MD cyt. malate dehydrogenase AAT aspartate amino transferase Complex 3 NDK nucleoside diphosphate kinase

Prx II peroxiredoxin II Prx IV peroxiredoxin IV NAC Nascent polypeptideassociated complex HSP 2 heat shock protein 2 HSP 110 heat shock protein 110 PDI protein disulfide isomerase ALAD delta aminolevulinic acid dehydratase ATPs ATP synthase Complex 4

Proximity labeling (BioID) Protein zájmu je exprimován jako fuzní protein s biotin ligázou která v přítomnosti biotinu označí proteiny v nejbližším okolí. Označené proteiny se izolují streptavidinem. Roux KJ et al. J Cell Biol. 2012 Mar 19;196(6):801-10.

Proximity labeling (k určení lokalizace proteinů) (APEX) Peroxidáza je cílena pomocí signální sekvence do cílového kompartmentu (MT) kde v přítomnosti biotinfenolu označí proteiny v okolí. Označené proteiny se izolují streptavidinem. Rhee HW et al.,science. 2013 Mar 15;339(6125):1328-31.