Univerzita Karlva v Praze 1. lékařská fakulta Oddělení bichemie membránvých receptrů Dktrandská dizertační práce Mdulační vliv mnvalentních intů na δ-piidní receptry Ing. Mirslava Všahlíkvá Veducí dizertační práce: Dc. RNDr. Petr Svbda, DrSc.
Publikační pdklad pr přípravu dizertační práce frntální mzkvá kůra ptkana Publikace I Buřvá, L., Všahlíkvá, M., Kagan, D., Dluhá, K., Nvtný, J., Svbda, P. (2010). Lng-term adaptatin t high dses f mrphine causes desensitizatin f mu-or- and delta-orstimulated G-prtein respnse in frebrain crtex but des nt decrease the amunt f G- prtein alpha subunits. Med Sci Mnit, 16(8), BR260-BR270. Publikace II Ujčíkvá, H., Dluhá, K., Rubalvá, L., Všahlíkvá, M., Kagan, D., Svbda, P. (2011). Upregulatin f adenylylcyclases I and II induced by lng-term adaptatin f rats t mrphine fades away 20 days after mrphine withdrawal. Bichim Biphys Acta-Gen Subj, 1810(12), 1220-1229. buněčná linie exprimující fúzní prtein mezi δ-piidním receptrem a G i 1α prteinem Publikace III Všahlíkvá, M., Svbda, P. (2011). The influence f mnvalent catins n trimeric G prtein G i 1α activity in HEK293 cells stably expressing δ-or-g i 1α(Cys 351 -Ile 351 ) fusin prtein. Physil Res, 60(3), 541-547. Publikace IV Všahlíkvá, M., Jurkiewicz, P., Rubalvá, L., Hf, M., Svbda, P. (2014). High- and lwaffinity sites fr sdium in δ-or-g i 1α(Cys 351 -Ile 351 ) fusin prtein stably expressed in HEK293 cells; functinal significance and crrelatin with biphysical state f plasma membrane. Naunyn-Schmiedebergs Arch Pharmacl, 387(5), 487-502.
Opiidní receptry (OR) rhdpsinvá rdina receptrů spřažených s G prteiny (GPCRs) 4 typy OR μ-or, δ-or, κ-or, NOP klíčvý prvek vnímání blesti vlivňují afektivní chvání a neurendkrinní funkce, vládají autnmní funkce Struktura GPCR Granier S. et al., Nature, 2012 aktivují hetertrimerní G prteiny třídy G i /G inhibují adenylyl cyklázu (AC) pkles prdukce camp, inhibují Ca 2+ kanály, stimulují K + kanály McDnald J. a Lambert D.G., CAECCP, 2005
Knstitutivní aktivita, inverzní agnisté knstitutivní aktivita - schpnst receptru přejít d aktivní knfrmace (R*) i v nepřítmnsti agnisty plný inverzní agnista antagnista částečný inverzní částečný agnista agnista plný agnista neaktivní frma receptru aktivní frma receptru Seifert R. a Wenzel-Seifert K., NSAP, 2002 Na + půsbí jak allsterický inverzní agnista (allsterický stabilizátr neaktivníh stavu receptru) Asp 95 v TM2 δ-or kritická pr regulaci vazby agnisty Na +
Interakce mnvalentních intů s OR allsterická vazebná kapsa pr Na + interakce Na + s 5 kyslíkvými atmy (pstranní řetězce Asp 95, Ser 135, Asn 131 splu s 2 mlekulami vdy) 1.8 Å δ-piidní receptr adensinvý receptr A 2A identické pstranní řetězce a pdbné knfrmace v 15 pzicích kapsy Allsterická vazebná kapsa GPCRs vázající Na + a vdu Fenalti G. et al., Nature, 2014
Cíle dizertační práce frntální mzkvá kůra ptkana změny v signální dráze OR vyvlané dluhdbým půsbením mrfinu klíčvý fyzilgický mechanismus, kterým je snižvána knstitutivní aktivita - inhibiční půsbení sdných intů na vazebné míst δ-or buněčná linie δ-or-g i 1α (Cys 351 -Ile 351 )-HEK293 účinek různých mnvalentních intů na δ-or i na jeh funkční spřažení s trimerními G prteiny inhibičníh typu
Frntální mzkvá kůra ptkana Aktivita G prteinů změny vyvlané půsbením mrfinu stanvení agnistu stimulvané vazby [ 35 S]GTPγS samci ptkanů kmene Wistar kntrlní ptkani (CTR, ) ptkani vystaveni půsbení 10-50 mg/kg mrfinu p dbu 10 dnů (MOR, ) Vazba [ 35 S]GTP S (pml mḡ 1 ) 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0 CTR MOR -OR -9-8 -7-6 -5-4 -3 lg [DADLE] (M) Vazba [ 35 S]GTP S (pml mḡ 1 ) 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0 CTR MOR -OR -8-7 -6-5 -4-3 lg [DAMGO] (M) pkles vazby [ 35 S]GTPγS stimulvané agnisty δ- a μ-or u ptkanů vlivněných mrfinem desenzitizace dpvědi δ- a μ-or nastává již na úrvni funkční aktivity G prteinů nárůst bsahu adenylyl cyklázy typu I a II Buřvá, L., Všahlíkvá, M., Kagan, D., Dluhá, K., Nvtný, J., Svbda, P. (2010). Lng-term adaptatin t high dses f mrphine causes desensitizatin f mu-or- and delta- OR-stimulated G-prtein respnse in frebrain crtex but des nt decrease the amunt f G-prtein alpha subunits. Med Sci Mnit, 16(8), BR260-BR270.
Frntální mzkvá kůra ptkana Inhibiční půsbení Na + na vazebné míst δ-or DADLE: δ-or, µ 1 -OR [D-Ala2,D-Leu5]enkefalin DPDPE: δ-or [D-Pen2,D-Pen5]enkefalin Vazba [ 3 H]DADLE (pml mg -1 ) 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 MOR MOR +100 mm NaCl CTR CTR +100 mm NaCl 0 5 10 15 20 25 30 35 Vazba [ 3 H]DPDPE (pml mg -1 ) 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 MOR MOR +100 mm NaCl CTR CTR +100 mm NaCl 0 10 20 30 40 50 60 [ 3 H]DADLE (nm) [ 3 H]DPDPE (nm) dluhdbé půsbení mrfinu nízká citlivst δ-or k inhibičnímu účinku sdných intů (narušení rvnváhy mezi aktivním a neaktivním stavem receptru) Ujčíkvá, H., Dluhá, K., Rubalvá, L., Všahlíkvá, M., Kagan, D., Svbda, P. (2011). Up-regulatin f adenylylcyclases I and II induced by lng-term adaptatin f rats t mrphine fades away 20 days after mrphine withdrawal. Bichim Biphys Acta-Gen Subj, 1810(12), 1220-1229.
δ-or-g i 1α (Cys 351 -Ile 351 )-HEK293 OR vytvářejí velmi slžitu signalizační síť GPCR-Gα fúzní prteiny pskytují mžnst napdbit fyzilgicky se vyskytující interakce užitečný mdel pr prvnání účinnsti vazby mezi definvaným typem receptru a definvaným typem G prteinu přesná a známá stechimetrie 1:1 mezi receptrem a G prteinem buněčná linie δ-or-g i 1α (Cys 351 -Ile 351 )-HEK293 exprimuje fúzní prtein mezi δ-or a G i 1α prteinem rezistentním vůči PTX (pertussis txin)
δ-or-g i 1α (Cys 351 -Ile 351 )-HEK293 Inhibice signalizace δ-or mnvalentními katinty Vazba [ 35 S]GTP S (pml mḡ 1 ) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0 - NaCl 100 mm NaCl -8-7 -6 lg[dadle] (M) vliv různých mnvalentních katintů na bazální a agnistu stimulvanu vazbu [ 35 S]GTPγS v jejich nepřítmnsti zjištěna vyská bazální aktivita G prteinů inhibice vyské bazální aktivity G prteinů vyvlání maximální dpvědi (B max ) Na + > Li + K + afinita agnisty DADLE (EC 50 ) Li + > K + > Na + EC 50 [M] +PTX -PTX 100 mm 200 mm 200 mm B max % bazální aktivity EC 50 [M] B max % bazální aktivity EC 50 [M] B max % bazální aktivity NaCl 1.0 10-8 335 5.1 10-8 350 6.5 10-8 327 KCl 0.6 10-8 162 9.6 10-8 216 2.0 10-8 237 LiCl 0.3 10-8 171 0.5 10-8 231 0.9 10-8 248 Všahlíkvá, M., Jurkiewicz, P., Rubalvá, L., Hf, M., Svbda, P. (2014). High- and lw-affinity sites fr sdium in δ-or-g i 1α(Cys 351 -Ile 351 ) fusin prtein stably expressed in HEK293 cells; functinal significance and crrelatin with biphysical state f plasma membrane. Naunyn-Schmiedebergs Arch Pharmacl, di:10.1007/s00210-014-0962-8.
δ-or-g i 1α (Cys 351 -Ile 351 )-HEK293 Vliv mnvalentních katintů na vazbu agnisty a antagnisty Vazba [ 3 H]DADLE (pml mḡ 1 ) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 AGONISTA 0.4 KCl 0.2 LiCl 0.0 NaCl 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Kncentrace (mm) Vazba [ 3 H]naltrindlu (pml mg -1 ) 3.3 3.1 2.9 2.7 2.5 2.3 2.1 NaCl LiCl KCl ANTAGONISTA 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Kncentrace (mm) schpnst mnvalentních katintů měnit vazebná místa OR Vazba [ 3 H]DADLE (pml mḡ 1 ) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 AGONISTA NaCl r 2 = 0.99 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Kncentrace (mm) vyskafinní vazebné míst pr Na + 50 % inhibice vazby agnisty při 5.4 mm kncentraci NaCl interakce pzitivně nabitých Na + intů s negativně nabitu Asp 95 nízkafinní vazebné míst pr Na + 50 % inhibice vazby agnisty při 321 mm kncentraci NaCl vysvětlení existence nízkafinních vazebných míst pr Na + jsme se snažili hledat pmcí bifyzikálních studií se zaměřením na plazmaticku membránu Všahlíkvá, M., Jurkiewicz, P., Rubalvá, L., Hf, M., Svbda, P. (2014). High- and lw-affinity sites fr sdium in δ-or-g i 1α(Cys 351 -Ile 351 ) fusin prtein stably expressed in HEK293 cells; functinal significance and crrelatin with biphysical state f plasma membrane. Naunyn-Schmiedebergs Arch Pharmacl, di:10.1007/s00210-014-0962-8.
δ-or-g i 1α (Cys 351 -Ile 351 )-HEK293 Bifyzikální stav plazmatické membrány spjení GPCRs a G prteinů s plazmaticku membránu je činí citlivými k jejich lipidvému klí interakce s lipidy jsu důležité pr jejich funkci rle mnvalentních katintů při interakci s plárním rzhraním membrána-vda a hydrfóbním vnitřkem lipidvé dvjvrstvy Laurdan (2-dimethylamin-6-laurylnaftalen) pstihuje změny ve vlastnstech membrány díky své citlivsti k plaritě lipidvé dvjvrstvy a pskytuje infrmaci lipidvých karbnylech DPH 1,6-difenyl-1,3,5-hexatrien vykazuje silnu flurescenci, pkud je zanřen d lipidvé membrány Parasassi T. et al., J. Flur., 1998
δ-or-g i 1α (Cys 351 -Ile 351 )-HEK293 Excitační generalizvaná plarizace Laurdanu - GP ex GP ex (λ ex ) I I 440 440 I I 490 490 λ ex.excitační vlnvá délka I 440, I 490..intenzity flurescence změřené při emisních vlnvých délkách 440 a 490 nm GP ex plarita membrány a mbilita membránvých kmpnent v hydrfilní části lipidů (blast plárních hlaviček) GP ex Li + > Na + > K + > Cs + > médium bez intů HEK 293 POPC/POPS POPC/POPS/chlesterl POPC POPS 0.12 0.11 0.10 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04 0.03 LiCl NaCl KCl CsCl Bez intů 320 330 340 350 360 370 380 390 400 ex (nm) 20 C 800 mm kncentrace 1,2-palmityl-leyl-sn-glycer-3-fsfchlin 1,2-palmityl-leyl-sn-glycer-3-fsfserin Plměry intů [Å] 1Å =10-10 m Přibližné plměry hydratvaných intů [Å] 1Å =10-10 m Li + 0.68 6 Na + 0.95 4 K + 1.33 3 Cs + 1.69 2.5 Lange et al., Příručka Chemie, 1979 mnvalentní katinty prnikají dvnitř lipidvé dvjvrstvy na úrveň glycerlu, kde interagují s kyslíkvými atmy karbnylů a nahrazují tak mlekuly vdy Jurkiewicz P. et al., BBA, 2012 Všahlíkvá, M., Jurkiewicz, P., Rubalvá, L., Hf, M., Svbda, P. (2014). High- and lw-affinity sites fr sdium in δ-or-g i 1α(Cys 351 -Ile 351 ) fusin prtein stably expressed in HEK293 cells; functinal significance and crrelatin with biphysical state f plasma membrane. Naunyn-Schmiedebergs Arch Pharmacl, di:10.1007/s00210-014-0962-8.
δ-or-g i 1α (Cys 351 -Ile 351 )-HEK293 Rvnvážná aniztrpie flurescence DPH - GP ex r DPH I I II II I 2I I II slžky světelné intenzity rvnběžné ke směru plarizace budícíh záření I...slžky světelné intenzity klmé ke směru plarizace budícíh záření rdph membránvá fluidita vliv mnvalentních katintů na vnitřní hydrfóbní část membrány r DPH ± SEM (25 C Ex365nm/Em425nm) 0 mm 100 mm 200 mm 800 mm 0.204 ± 0.003 LiCl 0.205 ± 0.004 NS 0.209 ± 0.004 NS 0.211 ± 0.005 NS NaCl 0.203 ± 0.004 NS 0.206 ± 0.004 NS 0.213 ± 0.005 NS KCl 0.205 ± 0.003 NS 0.208 ± 0.004 NS 0.213 ± 0.005 NS CsCl 0.208 ± 0.004 NS 0.206 ± 0.004 NS 0.214 ± 0.005 NS žádné změny hdnt r DPH vliv vyských kncentrací mnvalentních katintů nastává výlučně jak interakce s pvrchvým, plárním reginem lipidvé dvjvrstvy hydrfóbní vnitřek membrány se účinku mnvalentních katintů neúčastní Všahlíkvá, M., Jurkiewicz, P., Rubalvá, L., Hf, M., Svbda, P. (2014). High- and lw-affinity sites fr sdium in δ-or-g i 1α(Cys 351 -Ile 351 ) fusin prtein stably expressed in HEK293 cells; functinal significance and crrelatin with biphysical state f plasma membrane. Naunyn-Schmiedebergs Arch Pharmacl, di:10.1007/s00210-014-0962-8.
Závěr frntální mzkvá kůra ptkanů vystavených dluhdbému půsbení mrfinu mechanizmus závislsti na mrfinu je zalžen na desenzitizaci dpvědi δ- a μ-or, která nastává již na úrvni funkční aktivity G prteinů zvýšení pčtu δ-or a změna jejich citlivsti k sdným intům buněčná linie δ-or-g i 1α (Cys 351 -Ile 351 )-HEK293 rzlišení vysk- a nízkafinních míst pr Na + při inhibici vazby agnisty δ-or plární rzhraní membrána-vda jsme značily jak jedn z mžných míst, kde by mhl prbíhat nízkafinní typ inhibice vazby agnisty tat interakce by následně mhla vlivnit vazbu ligandu na receptr allstericku cestu
Děkuji za pzrnst