Kušnierová, P., Zeman D., ÚLD, OKB

Kušnierová, P., Zeman D., ÚLD, OKB Průkaz intratekální syntézy volných lehkých řetězců: porovnání různých kvantitativních metod s detekcí oligoklonálních flc metodou izoelektrické fokusace a afinitního imunoblotingu

Volné lehké řetězce (flc) v likvoru (CSF) 1974 Iwashita et al. předpokládá přítomnost flc kappa v CSF u pacientů s roztroušenou sklerózou (RS) metodika: double ring na dvojité radiální imunodifuzi 2008 Presslauer et al. 2012 Villar et al. 2013 Duranti et al. 2014 Hassan-Smith et al. 2014 Pieri et al. 2014 Senel et al. 2014 Presslauer et al. 2015 Presslauer et al.

Volné lehké řetězce 80. až 90. léta min. století: kvalitativní metody detekce flc (Bracco et al, 1987,.. Gallo et al, 1989; Krakauer et al, 1998;. Lamers et al, 1995,. Rudick et al, 1985,. Sindic a Laterre, 1991, Vakaet a Thompson, 1985) kvantitativní metody stanovení flc (DeCarli et al, 1987,. Fagnart et al, 1988,. Lolli a Amaducci, 1989; Rudick et al, 1986,.. Stanescu et al, 1991) Žádná nedosáhla širokého využití v praxi v důsledku pracnosti a nedostatečné standardizace.

Volné lehké řetězce 2001 Bradwell et al. - turbidimetrické / nefelometrické metody stanovení flc v séru následné zavedení těchto testů do klinické praxe pro diagnostiku a sledování pacientů s MG nejen v séru, ale i v moči 2004 Fischer et al. - zveřejnil studii týkající se využití soupravy Freelite pro stanovení fklc v CSF na analyzátoru BN II Siemens. 2005 Desplat-Jégo et al. publikoval hodnoty fklc i fllc v CSF za použití stejných reakčních činidel na stejném analyzátoru. Koncentrace fklc v CSF měřená v podskupině s nezánětlivým onemocněním byla podstatně vyšší ve srovnání s předchozí studii, a hladiny fllc v CSF v této podskupině byly také překvapivě vysoké.

Volné lehké řetězce 2014 The Binding Site - CE soupravy pro stanovení fklc a fllc v CSF Přetrvávající problémy: 1) neexistuje primární standard zdrojem většiny komerčně dostupných purifikovaných flc jsou séra nebo moče pacientů s paraproteinémií nebo Bence Jonesovou paraproteinurií důsledek využití různých primárních standardů různé normální hodnoty v séru 2) křížová reaktivita protilátek s navázanými lehkými řetězci výrazné nadhodnocení flc v biologickém materiálu, koncentrace Ig-ů je přibližně tisíckrát větší než koncentrace flc některé protilátky použité v testech flc detekují lépe flc dimery než monomery, zatímco stupeň flc dimerizace se může měnit za patologických podmínek.

Přetrvávající problémy: Volné lehké řetězce 3) všechny testy flc byly primárně vyvinuty s cílem pomoci při diagnostice a monitorování dyskrazie plazmatických buněk (onemocnění charakterizované přítomností monoklonálního imunoglobulinu v séru a moči), zatímco jejich stanovení v jiných indikacích nebylo dostatečně validováno. 4) koncentrace flc v normálním CSF často velmi nízké nelze měřit ani po úpravě původního testu (navýšení počtu latexových částic, omezení turbidimetrických / nefelometrických metod - koncentrace nižší než 0,1 mg/l).

Volné lehké řetězce Klinická senzitivita detekce/stanovení fklc podobná nebo dokonce mírně lepší než detekce oligoklonálních IgG pásů bez ohledu na použitou metodu stanovení (kvalitativní vs. kvantitativní) Význam detekce/stanovení fllc v CSF méně jasný První studie prokázali intratekální syntézu fllc častěji než fklc (Bracco et al, 1987;. Gallo a kol., 1989, Vakaet a Thompson, 1985), Téměř ve všech pozdějších studiích s jednou výjimkou (Arneth a Birklein, 2008) prokázána především intratekální syntéza fklc. o Některé pracovní skupiny problém se zavedením metody stanovení fllc v CSF důvod rozporuplných výsledků může být dán relativním nedostatkem údajů o fllc následek publikační zkreslení.

Cíl práce Výběr nejvhodnější metody pro rutinní detekci intratekální syntézy flc Porovnání výsledků kvalitativního a kvantitativního stanovení flc

Materiály a metody Do studie bylo zařazeno celkem 166 párových vzorků séra a likvoru vyšetřených na Úseku analýzy likvoru ÚLD FNO Pacienti rozděleni do skupin dle diagnózy: 1. roztroušená skleróza (MS; n = 17) 2. klinicky izolovaný syndrom (CIS; n = 30) 3. jiná zánětlivá neurologická onemocnění (OIND; n = 20) 4. nezánětlivá neurologická onemocnění (NIND; n = 57) 5. neprokázáno organické onemocnění nervového systému (symptomatické kontroly, n = 18) 6. neznámé nebo nejisté diagnózy (n = 24)

Kvantitativní metody stanovení flc (A) Turbidimetrický test Freelite Kappa SPA PLUS kit (kat. č. LK016.L.S), Freelite Lambda SPA PLUS kit (kat. Sylvajz - oslava + dárekč. LK018.L.S), The Binding Site Ltd., (B) Nefelometrický test na BN ProSpec s N Latex FLC kit (Siemens, kat. č. OPJA03 - OPJF03). (C) Human Immunoglobulin Free Light Chains Kappa and Lambda ELISA kit (BioVendor Laboratorni Medicina a.s., kat. č. RD194088100R). (D) In-house ELISA s použitím purifikovaných monoklonálních volných lehkých řetězců (Bethyl Laboratories, Montgomery, Texas, USA, kat. č. P080-126 a P080-127) pro kalibraci. (E) In-house ELISA jako v (D), ale za použití vhodně zředěných (1/200) Freelite standardů 1-6.

Detekce oligoklonálních flc (bona fide referenční metoda) vzorky - nativní mozkomíšní mok (CSF) a arbitrárně ředěné sérum (1/100) metoda - izoelektrické fokusace s následným afinitním imunoblottingem (Multiphor II) - modifikovaná metoda prof. Sindica (1991) první protilátka: polyklonální králičí proti flc (DAKO, kat. č. A0100 a A0101) druhá protilátka: totožná s první, biotinylovaná pomocí komerčního kitu (EZ- Link NHS-PEO 4 -Biotinylation Kit, Pierce) následně inkubace se streptavidinem značeným ALP a detekce pomocí BCIP/NBT kitu (Vector)

Statistická analýza MedCalc Statistical Software verze 14.12.0 (MedCalc software bvba, Ostende, Belgie http://www.medcalc.org; 2014). Rozdíly mezi jednotlivými metodami hodnoceny pomocí korelačního koeficientu (po logaritmické transformaci), log-log diagramů rozptylu, Passing-Bablokovy regrese a Bland-Altmanových diagramů. ROC křivky byly analyzovány a porovnány z hlediska predikce pozitivity výsledku o-flc a z hlediska predikce diagnózy RS nebo IND. Korelace mezi kategorickými proměnnými (o-igg a o-flc) zkoumány pomocí Chi-kvadrát testu.

Výsledky Obr. 1:pozitivní o-fklc v obou vzorcích; Obr. 2: o-fllc pozitivní pouze v druhém vzorku. Koncentrace flc ve vzorcích likvoru: L5: CSF fklc 5,09 mg/l CSF fllc 0,10 mg/l L6: CSF fklc 1,74 mg/l CSF fllc 1,06 mg/l.

Oligoklonální fklc a fllc detekované metodou IEF/AIB. Anoda je nahoře. Zleva doprava: flc standard (15 a 1.5 ng); Flebogamma (500 mg/l IgG); 4 párové vzorky neředěných likvorů a 1/100 ředěných sér. Ve vzorcích L1, L2 i L4 jsou viditelné o-fklc i o-fllc, ale ve vzorku L2 je jasná predominance fklc. Vzorek L3 je negativní.

Výsledky o-igg, o-fklc, o-fllc ve vztahu k diagnóze Diagnóza o-igg o-fklc o-fllc Neg. Pos. Neg. Pos. Neg. Pos. 1 (RS) 4 13 2 15 8 9 2 (CIS) 2 28 2 28 7 23 3 (OIND) 14 6 9 11 11 9 4 (NIND) 52 5 46 11 51 6 5 (Kontroly) 18 0 18 0 18 0 6 (Neznámé vzorky) 19 5 15 9 18 6 Kritérium: 2 oligokl. pásy v CSF

Výsledky o-igg, o-fklc, o-fllc ve vztahu k RS a IND o-igg o-fklc o-fllc Neg. Pos. Neg. Pos. Neg. Pos. RS 4 24 2 26 10 18 Non-RS 84 11 73 22 80 15 Chi-kvadrát test 54,798 (P<0,0001) 41,270 (P<0,0001) 23,497 (P<0,0001) IND 18 30 11 37 21 27 NIND 70 5 64 11 69 6 Chi-kvadrát test 42,117 (P<0,0001) 45,332 (P<0,0001) 32,295 (P<0,0001) Kritérium: 2 oligokl. pásy v CSF RS roztroušená skleróza; non-rs IND zánětlivé neurologické onemocnění; NIND nezánětlivá neurologická onemocnění a kontrolní vzorky

Poměr fklc/fllc v likvoru u pacientů s RS vs. non-rs v naší studii Mann-Whitney test: P<0,0001 RS (n=26) Non-RS (n=92) Medián 2,59 1,22 Rozpětí (min-max) 0,65-76,71 0,06-12,67 Interkvartilové rozpětí 1,36-16,48 1,00-1,62

Preanalytika Efekt okamžitého (A) vs. o 7 dnů odloženého (B) zamražení vzorků likvoru na -30 C (Freelite, SPA PLUS ): - statisticky významný rozdíl pro fklc (párový t-test po log transformaci: P = 0,0114), nevýznamný pro fllc (P = 0,5304) - klinicky pravděpodobně nevýznamný rozdíl (průměr: -0,0517 pro fklc, +0,0191 pro fllc; geometrický průměr podílu hodnot 0,8878 pro fklc, 1,045 pro fllc)

Porovnání kvantitativních metod flc v likvoru podle metod u o-flc negativních a o-flc pozitivních vzorků

Porovnání kvantitativních metod flc v séru podle metod u o-flc negativních a o-flc pozitivních vzorků

Porovnání kvantitativních metod Q flc podle metod u o-flc negativních a o-flc pozitivních vzorků

Porovnání kvantitativních metod Poměr fklc/fllc v likvoru: všechny metody Freelite na SPA PLUS; N Latex FLC na BN ProSpec; ELISA BioVendor; ELISA in-house; ELISA in-house s Freelite kalibrátorem 100 Poměr fklc/fllc v likvoru 10 1 0.1 0.01 ratiol1 SPA ratiol1 BN ratio C EBV ratioc EIH ratioc EIHrek

Porovnání kvantitativních metod Poměr fklc/fllc v séru: všechny metody Freelite na SPA PLUS; N Latex FLC na BN ProSpec; ELISA BioVendor; ELISA in-house; ELISA in-house s Freelite kalibrátorem 1000 Poměr fklc/fllc v séru 100 10 1 0.1 ratios1 SPA ratios1 BN ratios EBV ratios EIH ratios EIHrek

Q fklc Q fllc 10 3 10 3 Korelace mezi Q-fLC a Q-ALB Závislost Q-fKLC na Q-Alb? modré kroužky: <2 o-fklc pásy červené čtverečky: 2 o-fklc pásy 10000 Závislost Q-fLLC na Q-Alb? modré kroužky: 2 o-fllc pásy červené čtverečky: 2 o-fllc pásy 10000 1000 1000 100 100 10 10 1 1 10 100 Q Alb 10 3 1 1 10 100 Q Alb 10 3

Korelace mezi Q-fLC a Q-ALB Skupina N r 95% CI P o-fklc <2 87 0,6028 0,4491-0,7218 <0,0001 o-fklc 2 70-0,1322-0,3561-0,1060 0,2752 o-fllc<2 109 0,5171 0,3645-0,6427 <0,0001 o-fllc 2 49-0,0494-0,3261-0,2350 0,7359

Pozor! Volné lehké řetězce mají menší molekulu než albumin, tj. vyšší hodnotu difúzního koeficientu D pro závislost Q flc na Q Alb musíme najít inverzní funkci k Reiberově hyperbole Q flc = b 2 a 2 Q Alb + c 2 b 2 = b Q Alb + c a 2 1

Alternativa: empirický vztah založený na dosud největší publikované kontrolní skupině Presslauer et al. PLoS One 2014, 9(2): e89945 (Figure 1)

Výsledky ROC analýzy Predikce ith. syntézy o-fklc ( 2 CSF-oligokl. pásy) jednotlivými kvantitativními metodami, optimální cut-off hodnoty získané analýzou ROC křivek n CSF fklc fklc kvocient fklc index (o-fklc+/ o-fklc-) (mg/l) ( 10 3 ) Freelite 70/89 (70/87) pro fklc >0.54 >30.61 >6.07 (SPA PLUS ) kvocient a index) (85.4; 96.1) (86.4; 97.6) (76.7; 95.2) N Latex FLC 20/29 >0.417 >17.60 >3.21 (BN ProSpec) (85.0; 100) (90.0; 96.6) (80.0; 100) ELISA 22/16 >0.025 >9.09 >1.20 (BioVendor) (90.9; 87.5) (81.8; 93.8) (77.3;87.5) ELISA (in-house, 49/84 (46/82 pro fklc >0.216 >19.18 >2.75 monokl. standardy) kvocient a index) (87.8; 90.5) (89.1; 95.1) (84.8; 96.3) ELISA (in-house, 56/85 >0.340 >17.48 >2.17 Freelite standardy) (85.7; 94.1) (89.3; 96.5) (89.3; 89.4)

Výsledky ROC analýzy Predikce ith. syntézy o-fllc ( 2 CSF-oligokl. pásy) jednotlivými kvantitativními metodami, optimální cut-off hodnoty získané analýzou ROC křivek n CSF fllc fllc kvocient fllc index (o-fllc+/ o-fllc-) (mg/l) ( 10 3 ) Freelite 49/110 (49/109) pro >0.30 >30.58 >6.27 (SPA PLUS ) fllc kvocient a index) (91.7; 89.3) (88.9; 91.7) (76.4; 94.9) N Latex FLC 15/33 >0.368 >16.92 >3.82 (BN ProSpec) (93.3; 87.9) (100; 90.9) (86.7; 100) ELISA 17/21 >0.039 >7.38 >0.92 (BioVendor) (94.1; 90.5) (82.4; 95.2) (82.4;80) ELISA (in-house, monokl. 40/102 >0.358 >22.05 >3.03 standardy) (87.5; 91.2) (77.5; 96.1) (75.0; 91.2) ELISA (in-house, 40/102 >0.272 >21.11 >2.88 Freelite standardy) (92.5; 85.3) (80.0; 92.2) (77.5; 90.2)

Srovnání různých kalibrátorů Kalibrátory použité v metodách pro měření flc byly zředěny na podobné koncentrace flc a analyzovány in-house ELISA metodou. A(S): kalibrátory Freelite z kitů pro stanovení flc v séru a moči (LK016.S a LK018.S) A: kalibrátory Freelite z kitů pro stanovení flc v séru, moči a likvoru (LK016.L.S a LK018.L.S) B: kalibrátory z kitu N LATEX FLC C: kalibrátory z kitu ELISA metody firmy BioVendor D: purifikované monoklonální flc firmy Bethyl

ROC křivky pro predikci dg. RS Senzitivita Specifičnost o-igg ( 2) 85,7 % 88,4 % o-fklc ( 2) 92,9 % 72,6 % o-fllc ( 2) 64,3 % 84,2 % fklc_csf>0,78 mg/l 80,8 87,0 fklc kvocient >46,13 84,6 89,0 fklc index >4,12 92,3 85,7 fllc_csf>0,52 mg/l 57,7 87,0 fllc kvocient >43,74 61,5 88,0 fllc index >7,55 65,4 93,5

ROC křivky pro predikci dg. zánětlivého neurologického onemocnění

Volné lehké řetězce (flc) údaje zjištěné pro metodu Freelite na analyzátoru SPA PLUS (nelze je použít pro jinou metodu stanovení!!!) Referenční meze (n=30 pacientů, u nichž nebylo prokázáno žádné organické onemocnění nervového systému) Cut-off pro průkaz intrathek. syntézy (optimum z analýzy ROC křivek za podmínky minimální specificity 89 %; za standard průkazu ith. syntézy považovány alespoň 2 pásy flc v moku nepřítomné v séru na IEF/AIB) Referenční meze CSF fklc (mg/l) 0,00-0,35 CSF fllc (mg/l) 0,00-0,29 Q fklc. 10 3 5,51-30,29 Q fllc. 10 3 4,07-28,30 fklc index 1,12-5,73 fllc index 1,11-5,54 CSF (fklc/fllc) 0,37-2,68 (CSF-fKLC/fLLC)/ S(fKLC/fLLC) 0,36 2,10 Cut-off Senzitivita (%) CSF-fKLC (mg/l) 0,54 85,4 96,1 CSF-fLLC (mg/l) 0,30 91,7 89,3 Q-fKLC 10 3 30,61 86,4 97,6 Q-fLLC 10 3 30,58 88,9 91,7 fklc index 6,07 76,7 95,2 fllc index 6,27 76,4 94,9 Specificita (%)

Dominance ith syntézy lehkých řetězců kappa U části pacientů s RS i jinými zánětlivými ději v nervovém systému výrazně dominuje ith syntéza LŘ kappa; zpravidla nacházíme korelaci mezi poměrem IgG kappa/igg lambda a poměrem free kappa/free lambda Příčina tohoto shiftu zcela nejasná Většina teoretických prací zabývajících se problematikou lehkých řetězců nemůže tuto problematiku postihnout, neboť pracují s myšími modely

CSF fklc jako náhrada IgG OCB?! Opakovaná úvaha vedená snahou racionalizace a ekonomizace laboratorních vyšetření Přesto se domníváme: V žádném případě NE! IgG OCB je základní vyšetření s dlouholetou tradicí, jeho výsledek je vizuálně kontrolovatelný 2 IgG pásy v CSF nepřítomné v séru definují pozitivní likvor v diagnostických kritériích RS Počet buněk, Q-Albumin, IgG v likvoru a séru (+ odvozené výpočty), IgG OCB je naprosto nepodkročitelný minimální standard analýzy CSF v kontextu (diferenciální) diagnostiky RS Ostatní vyšetření CSF včetně flc jsou nadstavbová; mohou - 1) upřesnit diferenciální diagnostiku - 2) mít prognostický význam (který, ač zatím neznámý, bude v případě jeho prokázání možné použít i retrospektivně) - 3) naznačit některé (možná dosud neznámé) aspekty imunopatogeneze onemocnění Více studií ukazuje, že flc jsou (ještě) méně specifické pro RS než oligoklonální IgG pásy

Quantity or quality for CSF flc? Kvantifikace Výhody: - jednodušší (výsledek teoreticky dostupný cca za 1-2 hodiny od dodání vzorku) - kratší doba odezvy (max. 1 týden), dle potřeby lze vyšetřit týž den - lepší reprodukovatelnost při opakovaných vyšetřeních, tj. i lepší potenciál ke sledování dynamiky v čase - může být výhodnější pro studium klinickolaboratorních korelací Nevýhody: - potřeba většího množství vzorku (min. 250 µl) - neposkytuje přímou informaci o oligoklonalitě o-flc (IEF/AIB) Výhody: - potřeba minimálního množství vzorku (min. 20 µl) - informace o mono-/ oligoklonalitě Nevýhody: - velmi pracná metoda (1,5 dne) - delší doba odezvy (až 4 týdny), nelze získat výsledek týž den - horší reprodukovatelnost při opakovaných vyšetřeních - pouze kvalitativní (max. semikvantitativní: +, ++, +++) informace, tj. méně vhodná pro sledování dynamiky v čase a pro studium klinickolaboratorních korelací

ZÁVĚRY I. Jedinou kvantitativní metodou pro stanovení flc v likvoru se statutem IVD je Freelite na přístrojích SPA PLUS a BN II Nezjistili jsme zásadní rozdíly v predikci ith. syntézy flc při použití různých metod kvantifikace (Freelite, N Latex FLC, ELISA), cut-off hodnoty se ovšem zřetelně liší Při zavádění stanovení flc v likvoru se laboratoř musí rozhodovat o METODĚ a PŘÍSTROJI Naše rozhodnutí: Freelite na přístrojích SPA PLUS nejvíce uživatelsky přívětivá a pro účely klinické (diagnostické) senzitivity postačující Stanovení na přístrojích BN (kity Freelite nebo N Latex FLC) nebo ELISA metody mohou být přínosnější pro výzkum rozdělení koncentrací flc v normálních likvorech (nižší mez stanovitelnosti)

ZÁVĚRY II. Intrathékální syntéza flc je senzitivním ukazatelem přítomnosti zánětlivého onemocnění nervového systému. Jednoznačný význam má vyšetření zejm. v případě negativního nebo hraničního výsledku o-igg. Lékař by si měl být vědom existence HRANIČNÍCH nálezů Senzitivita kvalitativní (o-flc) a kvantitativní (kvocient a index flc) metody průkazu ith. syntézy flc je velmi podobná (na rozdíl od IgG) Při detekci o-flc se (zatím?) neupravují vzorky CSF a séra na stejnou koncentraci flc, tj. kvalitativní metoda má i nezanedbatelný (semi)kvantitativní aspekt Ačkoliv obě metody poskytují lékaři prakticky shodnou informaci, kvantifikace flc může být výhodnější pro analýzu klinicko-laboratorních korelací (event. pro srovnání nálezů v čase) Z praktických a ekonomických důvodů asi lékaři (pokud se vůbec rozhodnou vyšetření flc v likvoru indikovat) budou volit mezi kvantitou a kvalitou ; pro hlubší poznání imunopatogeneze nemoci je však optimální mít k dispozici výsledky obou testů (a optimálně ještě informaci o zastoupení monomerních/dimerních/ oligomerních forem flc v likvoru a v séru)

Poděkování: MUDr. Ing. Davidu Zemanovi, Ph.D. Kolektivu úseku analýzy likvoru, OKB, ÚLD, FN Ostrava Děkuji za pozornost!