Cytometrické metody pro stanovení proliferace lymfocytů RNDr. Jan Lašťovička, CSc. Ústav imunologie 2.LF UK a FN Motol
Funkční testy lymfocytů Stanovení proliferace lymfocytů Schopnost lymfocytů reagovat na antigen Důležité pro diagnostiku imunodeficitů i pro výzkum Fáze aktivace, mitóza, klonální expanze
Aktivace lymfocytů Specifické antigeny (tetanus, varicella, pneumococcus, candida apod.) Nevýhoda stimulace jen malého množství specifických lymfocytů Polyklonální aktivátory stimulují nezávisle na specifitě TCR Polyklonální mitogeny Mitogen Phytohemaglutinin (PHA) Concanavalin A (ConA) Pokeweed mitogen (PWM) Lipopolysacharid (LPS) Odpovídající populace T lymfocyty T lymfocyty T i B lymfocyty B lymfocyty
Superantigeny proteiny se dvěma vazebnými místy pro MHC gp II a druhé pro vnější stranu Vβ regionu TCR superantigen je specifický pro jeden až několik různých Vβ domén, kterých je 20-50 superantigen tak může aktivovat 1-20% T lymfocytů polyklonální mitogeny spouštějí v zásadě stejné reakce jako antigeny podobný efekt dosáhneme protilátkami proti TCR nebo CD3
Cytometrické metody detekce proliferace Měření povrchových aktivačních markerů (CD69, CD71, CD25, HLA-DR) Kvantifikace vznikajících blastů v procesu blastické transformace Kvantifikace celkové DNA (PI, EB) Měření intracelulárních aktivačních markerů (Ki-67) Inkorporace značených prekurzorů do nově syntetizované DNA (thymidin, BrdU, EdU,) Obarvení cytoplazmy nebo membrány buněk (CFSE, Oregon Green, CellVue Claret apod.)
Blastogeneze lymfocytů Intracelulární změny a přeměna klidových lymfocytů na lymfoblasty: T buněčné blasty jsou velké lymfocyty s výrazným objemem cytoplazmy
FASCIA Flow Cytometric Assay of specific cell-mediated immune response in activated whole blood Kvantifikuje blasty vznikající při aktivaci lymfocytů Development and evaluation of a flow-cytometric assay of specific cell-mediated immune response in activated whole blood for the detection of cell-mediated immunity against varicella-zoster virus. Svahn A, Linde A, Thorstensson R, Karlen K, Andersson L, Gaines H. J Immunol Methods. 2003 Jun 1; 277(1-2):17-25. Heparinizovaná krev zředěná médiem 1:8 + mitogeny Kultivace 3-7 dní Značení CD3, CD4, CD8, lýza erytrocytů a měření
Měří se BD Trucount a vypočítá se absolutní počet proliferujících buněk/ml Možnost multiplexu s povrchovými znaky
Nestimulované, 72 h kultivace PHA, 72 h kultivace
Měření celkové DNA etidium bromid, propidium jodid, hexidium jodid tzv. interkalační barviva s červenou fluorescencí barvivo se vmezeří mezi páry bazí dvojité šroubovice DNA nejsou specifická pro DNA, proto vyžaduje použití RNAzy barvení předchází permeabilizace buněk (-20 o C) nedává informaci o nově syntetizované DNA, nekoreluje s 3 H-thy Development of a propidium iodide fluorescence assay for proliferation and cytotoxicity assays. Dengler W.A., Anti-Cancer Drugs 09/1995; 6(4):522-32
Ki-67 Proliferating cell associated protein Jaderný protein role v regulaci buněčného dělení Intenzivně studovaný v souvislosti s proliferací nádorových buněk Exprimovaný během všech aktivních fází buněčného dělení Není exprimovaný v klidové fázi Specifický a kvantitativní indikátor proliferace Korelace s BrdU 0,80 0,93 Korelace s Oregon green 0,94-0,98 (Soarez et al., 2010)
Ki-67 Výhody: jednoduché provedení k buňkám v kultuře se nic nepřidává Biolegend anti Ki67 APC Lymfocyty 72 h s PHA celkem levná varianta značení buněk běžný intracelulární protokol možnost současného stanovení dalších antigenů
CD3+ NS PHA CD4+
Komerční reagencie anti-human Ki-67 Antibody BioLegend (www.biolegend.com) (AF488, AF647, APC, BV421, BV510, BV605, BV711, Pacific Blue, PE, PE- Cy7, PerCP-Cy5.5) BD Pharmingen (www.bdbiosciences.com) (AF488, AF555, AF647, AF700, FITC, PE-Cy7, PerCP-Cy5.5)
Inkorporace 3 H-thymidinu Zlatý standard detekce proliferace, používá se od r. 1953 Metoda s vysokou citlivostí Inkorporace značeného thymidinu se měří na β-counteru, výsledek v cpm Typické hodnoty nestimulovaných lymfocytů ~1.300 cpm Stimulované lymfocyty (PHA) ~100.000 cpm Stimulační index (stimulované/nestimulované) U zdravých dárců SI nad 50 Výsledky jsou relativní ke zdravé kontrole
Bromodeoxyuridin (BrdU) 5-bromo-2-deoxyuridin syntetický nukleotid, analog thymidinu Inkorporace do nově syntetizované DNA dělících se buněk (během S fáze) Substituce thymidinu Značení BrdU protilátkou vyžaduje permeabilizaci buněk a denaturaci DNA (kyselina, teplo, nukleáza apod.)
BrdU Na posledních 2-24 h ke kultuře přidáme BrdU (18µg/ml, Sigma) Buňky harvestujeme a označíme povrchové antigeny Denaturace a permeabilizace: 70% etanol, deoxyribonukleáza, Tween20 Anti-BrdU značená protilátka Poměr BrdU pozitivních k celkovému počtu buněk Dobrá korelace s inkorporací 3H-thymidinu (r=0,934 pro ConA)
BrdU Nevýhoda: nešetrný protokol pro denaturaci DNA může mít za následek destrukci buněčné morfologie a antigenních determinant, na které se váže protilátka Kity s DNAzou jsou relativně drahé (cca 25.000.-Kč/100 testů) Varianta ELISA levnější (16.700.-Kč/1000 testů)
Komerční reagencie SIGMA (www.sigmaaldrich.com) 5-Bromo-2 -deoxyuridine, 100mg (496.-Kč) Anti BrdU protilátky: BioLegend (www.biolegend.com) ebioscience (www.ebioscience.com) BrdU Staining Kit for Flow Cytometry (APC, PE, FITC) 24.900.-Kč Abcam (www.abcam.com) Serotec (www.abdserotec.com) FITC, AF647, AF488, PE, APC (cca 12.000.-Kč/100 testů)
EdU (5-ethynyl-2 deoxyuridine) novější alternativa k BrdU detekce je založena na tzv. click reakcí mezi azidem a alkenovou skupinou alkenová skupina je obsažena v ethynylu azid je konjugován s Pacific Blue, AF647 nebo AF488 nízké pozadí, vysoká citlivost
Struktura analogů nukleosidu Ethynyl du Brom du www.lifetechnologies.com
www.lifetechnologies.com Princip click reakce Click značení nevyžaduje denaturaci DNA Fluorochrom s azidem reaguje s alkenovou skupinou na dsdna EdU vestavěný do DNA
EdU protokol Přidáme EdU do buněčné kultury, inkubace (2-24h) Buňky harvestujeme naznačíme protilátkami proti povrchovým antigenům dle potřeby (nelze použít PE) Inkubujeme 15 min s fixačním roztokem, promyjeme Inkubujeme 15 min s permeabilizačním roztokem, promyjeme Inkubujeme 30 min s reakčním pufrem, promyjeme Měříme na cytometru
NS PHA
Komerční soupravy Invitrogen (Life Technologies) www.lifetechnologies.com Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit Cena 12.700.-Kč / 50 testů
Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester (CFDA-SE) CFSE MW=557 Používán od roku 1994 Lipofilní molekula, která je minimálně fluorescenční, dokud není transportována do buňky Do buňky proniká pasivní difuzí V buňce esterázy štěpí acetylové skupiny a molekula se stává výrazně fluorescenční Succinimidyl ester se váže kovalentně k volným aminoskupinám na makromolekulách v cytoplazmě Nenavázaný zbytek se z buňky vyloučí
CFSE WANG et al.,2005 Komplexy CFSE zůstávají v buňce během celého vývoje a dělení detekováno ještě po 8 týdnech Polovina CFSE se dostává do dceřiných buněk při každém dělení nebo při buněčné fúzi CFSE není předáváno okolním buňkám v kultuře
CFSE koncentrace Doba kultivace CFSE 4 h 1 24 h 48 h 72 h 5µM 95% 53% 33% 28% 2.5µM 97% 90% 85% 84% Doporučené koncentrace: Výrobce (Invitrogen): 5µM 2,5µM (Garza et al., 2011) 0.5µM 95% 90% 89% 88% 0.05µM 94% 93% 92% 90% 0 (blank) 97% 95% 93% 92% Stanovení životnosti lymfocytů trypanovou modří - třídenní kultivace Garza et al., 2011
CFSE FITC Excitace Emise 492 517 495 519 Cell Trace Violet 405 450 Pacific Blue 403 455 CellVue Claret 655 675 PerCP 490 678
CFSE protokol - lymfocyty Celá řada modifikací barvícího postupu Lymfocyty v 1 ml PBS (nesmí obsahovat sérum), minimálně 5.10 6 přidáme CFSE (několik µl podle požadované koncentrace) Inkubace 15 minut za občasného míchání Přidáme 4 ml PBS s 2% FCS Promyjeme 3x (poslední promytí v komplet. médiu) Spočítáme buňky a naředíme na koncentraci 1-2.10 6
Kultivace 72 h PBMC % divided
Vyhodnocení Proliferující frakce: procento buněk, které se rozdělí jednou nebo vícekrát % buněk nebo MFI populace, SI Nezajímá nás, kolikrát se buňka rozdělí, ale kolik vznikne nových buněk Srovnáváme pacienta se zdravou kontrolou Frekvence prekurzorů: procento rodičovské populace, které odpovídá na mitogenní stimulaci
Komerční soupravy Life Technologies (Invitrogen) www.lifetechnologies.com CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit - For Flow Cytometry (4.850.-Kč/100-1000 testů) CellTrace Violet Cell Proliferation Kit, for flow cytometry (8.390.-Kč/100-1000 testů) ABCAM www.abcam.com CFSE - Cell Labeling Kit (8.400.-Kč) ebioscience www.ebioscience.com CFSE Cell Proliferation Dye efluor 450 Cayman Chemicals www.caymanchem.com CFSE Cell Division Assay Kit SIGMA (www.sigmaaldrich.com) CellVue Claret Far Red Fluorescent Cell Linker Mini Kit (5.200.-Kč/10 testů)
Ekonomické hledisko Metoda FASCIA 0 Propidium jodid 9 Cena Kč/test CFSE 5-50 CellTrace Violet 8-80 BrdU ELISA * 50 Ki-67 130 3 H-thymidin * 140 *Stanovení v tripletech Ceny nezahrnují náklady na izolaci a kultivaci buněk FASCIA s BD Trucount 230 BrdU 250 EdU 250 CellVue Claret 520