MC30P14 Vysokoúčnná kapalnová chroatografe, 010/011 Vysokoúčnná kapalnová chroatografe Josef Cvačka, 311011 3.11.011 1 MC30P14 Vysokoúčnná kapalnová chroatografe, 010/011 Základy chroatografckého procesu K dělení dochází v separační koloně, která obsahuje staconární fáz (sorbent) aoblní fáz (eluent). Rozdílné analyty (dělené látky) ají rozdílnou afntu ke staconární fáz. Různé analyty podléhají různé dstrbuc (rozdělování) ez oblní a staconární fází. Rozdílné analyty jsou rozdílně zadržovány a rozdílně zpožďovány (retardovány).
MC30P14 Vysokoúčnná kapalnová chroatografe, 010/011 Retenční velčny t R, tm + t' R, Retenční čas t R je celkový čas od nástřku vzorku do zaznaenání píku detektore. Mrtvý čas t M je retenční čas analytu, který není v koloně zadržován, tj. analytu, který se pohybuje kolonou stejnou rychlostí jako oblní fáze. Všechny analyty stráví v oblní fáz stejný čas - rtvý čas kolony. Redukovaný retenční čas t R je čas, který příslušný analyt stráví ve staconární fáz. 3 MC30P14 Vysokoúčnná kapalnová chroatografe, 010/011 Retenční velčny V R, VM + V ' R, Retenční obje V R je celkový obje oblní fáze, která proteče systée od nástřku vzorku do zaznaenání píku detektore. Mrtvý obje V M je retenční obje analytu, který není v koloně zadržován, tj. analytu, který se pohybuje kolonou stejnou rychlostí jako oblní fáze. Je to obje kolonové trubce ínus obje náplně. Redukovaný retenční obje V R je dán rozdíle retenčního a rtvého objeu. 4
MC30P14 Vysokoúčnná kapalnová chroatografe, 010/011 Průtok oblní fáze Lneární rychlost oblní fáze u [c/n] u L t M L délka kolony Objeová průtoková rychlost oblní fáze F [l/n] V F t V M M V R, F tr, V ' R, F t' R, V obje oblní fáze v koloně ě 5 MC30P14 Vysokoúčnná kapalnová chroatografe, 010/011 Dstrbuční konstanta Dstrbuční konstanta K D je poěr rovnovážné koncentrace analytu ve staconární a oblní fáz K D ( c ) ( c ) s ( n ) ( n ) s V V s (c ) s koncentrace analytu ve staconární fáz (c ) koncentrace analytu v oblní fáz V obje oblní fáze V s obje staconární fáze 6
MC30P14 Vysokoúčnná kapalnová chroatografe, 010/011 Retenční poěr t' R, k t M t R, t t M M k ( n ) s V K D, ( n ) V s V R, VM + K D, V s Retenční poěr k jedna z nejužívanějších retenčních velčn. Udává kolkrát více času stráví analyt ve staconární fáz než ve fáz oblní, tj. v kolkanásobku rtvého času (objeu) analyt eluuje. Je to poěr látkových nožství analytu ve staconární a oblní fáz za rovnovážných podínek. 7 MC30P14 Vysokoúčnná kapalnová chroatografe, 010/011 Separační faktor k K α D, k1 K D, 1 Separační faktor (selektvta) α paraetr charakterzující vzájenou retenc dvou analytů. 8
MC30P14 Vysokoúčnná kapalnová chroatografe, 010/011 Teore chroatografckého patra Kolonu lze hypotetcky y rozdělt na nožství tzv. pater, na které dochází k okažtéu ustavení rovnováhy. Tvar eluční křvky z teore chroatografckého patra vyplývá, že eluční křvka á tvar Possonova rozdělení, které lze pro vysoký počet pater lze nahradt Gaussovou křvkou. c c ax ( t exp t R, σ t ) w b šířka píku př základně w 05 0,5 šířka píku v polovně výšky 9 MC30P14 Vysokoúčnná kapalnová chroatografe, 010/011 Teore chroatografckého patra Počet teoretckých pater n bezrozěrná velčna pro vyjádření účnnost chroatografcké kolony. Vypočítá se z šířky píku v chroatograu n t 16 R, w b 5,54 t w R, 0,5 Výškový ekvvalent teoretckého patra délka kolony přpadající na jedno teoretcké patro L n 10
MC30P14 Vysokoúčnná kapalnová chroatografe, 010/011 Van Deeterova rovnce + + + F L M S K celkovéu výškovéu ekvvalentu teoretckého patra přspívá: výřvá (turbulntní) dfúze v oblní fáz F axální dfúze v oblní fáz L odpor prot převodu hoty v oblní fáz M odpor protí převodu hoty ve staconární fáz S Vířvá dfúze nepravdelnost ve staconární fáz způsobují, že některý kanálky proudí oblní fáze s analyte rychlej než jný λ F d p λ geoetrcký faktor d p velkost částc 11 MC30P14 Vysokoúčnná kapalnová chroatografe, 010/011 Van Deeterova rovnce Axální dfúze koncentrační gradenty po stranách zóny způsobují pohyb analytu do oblast s nžší koncentrací D L u D dfúzní koefcent analytu v oblní fáz u lneární rychlost oblní fáze Odpor prot přenosu hoty ve staconární fáz některé olekuly analytu pronknou hlouběj do staconární fáze než jné S d p u k 30 D +1 ( k ) 1
MC30P14 Vysokoúčnná kapalnová chroatografe, 010/011 Van Deeterova rovnce Odpor prot přenosu hoty v oblní fáz př průchodu oblní fáze kanálke ají částce uprostřed nohe větší rychlost než u stěny M ω d D p D u ω faktor závslý na typu náplně + + + F L M S V prax se používá zkrácený záps Van Deeterovy rovnce závslost výškového ekvvalentu teoretckého patra na lneární rychlost oblní fáze B A + + C u A,B,C, konstanty ypro daný u chroatografcký systé 13 MC30P14 Vysokoúčnná kapalnová chroatografe, 010/011 Van Deeterova rovnce Účnnost separace roste se snžující se velkostí částc náplně (~,5d p ). Mnu křvky udává průtokové rychlost, př které kolona vykazuje největší účnnost. Mnu je pro alé částce ploché, tj. je ožno pracovat v šrší rozsahu průtoků bez ztráty účnnost. 14
MC30P14 Vysokoúčnná kapalnová chroatografe, 010/011 PLC a UPLC (UPLC) UPLC Ultra gh Perforance Lqud d Chroatography h Vysokoúčnná kapalnová chroatografe s částce enší než μ a vel vysoký provozní tlake (do ~ 1000 bar). Dosahuje se vyšších účnností separace a vel krátkých retenčních časů. 15 MC30P14 Vysokoúčnná kapalnová chroatografe, 010/011 Velkost částc a tlak v systéu Tlak v PLC systéu je přío úěrný průtoku, vskoztě oblní fáze a délce kolony a nepřío úěrný druhé ocnně velkost částc a průěru kolony. ΔP ~ F d p η L d c 16
MC30P14 Vysokoúčnná kapalnová chroatografe, 010/011 Teplota a její vlv na účnnost Teperature gradents have negatve pact on the colun effcency due to heterogeneous dstrbuton of the oble phase lnear velocty, vscosty and densty throughout the colun, whch affect the equlbru constant of a copound dstrbuton between oble and statonary phases (decreases wth ncreasng teperature), and retenton factors of the analytes. The dfference between the teperatures at the nlet and the outlet of the colun can be as uch as 0K, and the dfference between the teperatures of the center and the colun wall can reach up to 6K, f the colun s operated under regular convecton condtons. The radal teperature gradent ncreases slowly along the colun [17]. 17 MC30P14 Vysokoúčnná kapalnová chroatografe, 010/011 Mokolonové příspěvky k rozšřování zón K celkové šířce píku přspívá nejen kolona, ale ostatní část PLC systéu: σ σ + σ + σ + σ + σ celkový nj kolona σ nj příspěvek njektoru. Obje vzorku by ěl být co nejenší (< 1 teor. patro), nastříknutá zóna by ěla být σ nj K pravoúhlá. spoj det el V nj K faktor závslý na konstrukc njektoru σ spoj příspěvek spojovacích trubc. Spojovací trubce usí ít alý vntřní průěr a usí být co nejkratší σ R 4 spoj π 4D l F R,l vntřní poloěr a délka trubce 18
MC30P14 Vysokoúčnná kapalnová chroatografe, 010/011 Mokolonové příspěvky k rozšřování zón Profly rychlostí v trubc: Lanární proudění vznká př běžných rychlostech oblní fáze v PLC. Kapalnu lze považovat za soubor vrstev, ez nž působí vskózní síly. Turbulentní proudění vznká př vel vysokých rychlostech (~100l/n.), uspořádaná dstrbuce rychlostí je narušena, pohyb oblní fáze je chaotcký, dochází k ntenzvníu proíchávání. σ det příspěvek detektoru. Závsí na objeu a geoetr Vdet detekční cely σ det K σ el příspěvek elektronky. Závsí na časových konstantách elektronckých obvodů (zeslovačů). σ konst el F 19 MC30P14 Vysokoúčnná kapalnová chroatografe, 010/011 Syetre píku A S B A w T f f 0,05 Faktor asyetre A s íra souěrnost chroatografckého píku, určuje se v 10% výšky. Talng faktor T f obdobná velčna jako faktor asyetre používaná ve faraceutcké analýze. Určuje se v 5% výšky píku. T f >1 pro píky asyetrcké v sestupné část ( talng píky) T f <1 pro píky asyetrcké ve vzestupné část ( frontng píky) 0
MC30P14 Vysokoúčnná kapalnová chroatografe, 010/011 Rozlšení Rozlšení velčna kvantfkující schopnost chroatografckého systéu vzájeně oddělt dva analyty. R 1, t t R, R,1 0,5 ( w b, + wb, 1 ) 1 MC30P14 Vysokoúčnná kapalnová chroatografe, 010/011 Rozlšení Dva píky jsou rozděleny na základní ln pokud je R>1.5
MC30P14 Vysokoúčnná kapalnová chroatografe, 010/011 Rozlšení PŮVODNÍ R n k ( α,1 1) 4 1 + k1 1 1, ) účnnost selektvta retence ZMĚNA k Ovlvnění selektvty a retence Volba oblní fáze, volba staconární fáze, teplota. Ovlvnění účnnost Délka kolony, velkost částc, průtok. ZVÝŠENÍ α ZVÝŠENÍ n 3 MC30P14 Vysokoúčnná kapalnová chroatografe, 010/011 Rozlšení n k 1 R 1, ( α,1 1) 4 1 + k1 α Největší vlv na rozlšení zvýšení lze dosáhnout optalzací staconární oblní fáze. n Má význa, ale rozlšení roste jen s druhou odocnnou n. k Pro vyšší retenční časy se poslední člen blíží k 1 a neá tedy sysl dále retenc zvyšovat. 4
MC30P14 Vysokoúčnná kapalnová chroatografe, 010/011 Isokratcká a gradentová eluce Izokratcká eluce: Složení oblní fáze (její eluční síla) se běhe analýzy neění. Gradentová eluce: Eluční síla oblní fáze vzrůstá běhe analýzy. Výhody gradentové eluce: Vhodnější pro koplexní vzorky s velký počte analytů Lepší rozlšení pro píky na začátku a konc chroatograu Vyšší ctvost pro píky na konc chroatograu Větší kapacta píků (víc se jch vejde do chroatograu) Nevýhody gradentové eluce: Náročnější nstruentace (čerpadla) Náročnější vývoj etody Delší doby analýzy vyplývající z nutnost ekvlbrace kolon 5 MC30P14 Vysokoúčnná kapalnová chroatografe, 010/011 Účnnost v gradentové eluc kapacta píku Př gradentové eluc se (téěř) neění íšík šířka píku s čase a nelze tedy pro hodnocení účnnost použít rovnc: tr, n 16 wb Kapacta píku P: Velčna pro srovnávání účnnost různých gradentů podíl celkové doby gradentu a průěrné šířky píku v chroatograu P 1 + P: 100-00 (gradent) t g + n (1/ n) 1 w b 6 t g doba trvání gradentu
MC30P14 Vysokoúčnná kapalnová chroatografe, 010/011 Ovlvnění separačního procesu v PLC Separac lze ovlvnt: -zěnou velkost nterakce ez analyte, staconární a oblní fází terodynacký aspekt -ovlvnění šířky zón eluujících složek knetcký aspekt Terodynacký aspekt: V V + K V R, M D, s Ovlvňujee dstrbuční konstanty analytů zěna oblní nebo staconární fáze. K D je závslá na teplotě, teplota ovlvňuje separac. Knetcký aspekt: Šířku píků lze ovlvnt vše paraetry vyskytující y se v plné verz Van Deeterovy rovnce, tj. lneární rychlostí oblní fáze, velkostí částc sorbentu, dfůzní koefcenty (lze ovlvnt teplotou!), délkou kolony. 7