Polychromatická cytometrie v hemato-onkologii Tomáš Kalina, Ester Mejstříková, Ondřej Hrušák Klinika dětské hematologie a onkologie Univerzita Karlova, 2. LF a FN Motol - cytometrie http://clip.lf2.cuni.cz
Úvod: Polychromatická cytometrie Nová generace cytometrů (Cyan ADP, LSR2, FACS Canto, FACS Aria, CyFlow ML) 3 lasery (až 7), 8 a více fluorescenčních parametrů (publikováno 17) Během minuty lze změřit > 1 milión buněk single-cell měření (možnost sortování)
8 parametrů v periferní krvi CD14 / DAPI / CD3 / CD 16,56 / CD45 / CD4 / CD19 / CD8 Lymfocyty Lymfocyty 19-3- T lymfocyty
8 parametrů v periferní krvi CD14 / DAPI / CD3 / CD 16,56 / CD45 / CD4 / CD19 / CD8 mrtvé mrtvé mrtvé živé živé živé Lymfocyty Monocyty Granulocyty T - lymfocyty NK - buňky B - lymfocyty
Výhody polychromatické cytometrie - Rychlost provedení (cca 2h od obdržení vzorku do analýzy) - Schopnost hodnotit komplexní směsi buněk - Nenáročná příprava vzorku - Single cell analýza - Funkční testy na směsi buněk (viabilita, apoptóza, sekrece cytokinů )
Složitost narůstá
Malignita či regenerující kostní dřeň?
Malignita či regenerující kostní dřeň? CD19+ buňky:
Polychromatická diagnostika - Euroflow Co je Euroflow projekt EU STREP Rotterdam (NL) Salamanca (E) Lisbon (P) Kiel (D) Paris (F) Leeds (GB) Praha (CZ) Zabrze (PL) Cíle Euroflow: - Standardizace diagnostických cytometrických měření - Optimalizované přístupy pro diagnostiku všech hematologických malignit 8 barevnou cytometrií Oblasti: - Akutní lymfoblastická leukémie - AML a MDS - Mnohočetný myelom a plasmatické buňky - B -NHL - Sledování efektu léčby (MRN) - Softwarové nástroje pro diagnostiku http://euroflow.org
Reziduální nemoc v kostní dřeni Současné léčebné protokoly pro léčbu ALL jsou velmi intenzivní, jak dosáhnout dostatečné agresivity léčby a přitom nezatěžovat nadbytečnou léčbou? Koncept monitorace minimální reziduální nemoci je potvrzen >10let Kterou metodu zvolit? RQ-PCR nebo cytometrii Ig/TCR přestavby cca 3 týdny Vyšetření do 2-4 hodin Citlivost > 10exp-4 (záleží na cíli) Standardizace pokročilá Citlivost > 10exp-4 (záleží na aberaci a na pozadí) Standardizace téměř žádná Pro pozdější body léčby, metoda první volby Pro časné body léčby, tam kde chybí Ig/TCR cíl
CD19+ buňky: Reziduální nemoc v kostní dřeni
Reziduální nemoc v kostní dřeni Současné problémy MRN cytometricky ( 4 barevně): Standardizace a kontrola kvality měření Konsenzus na hodnocení citlivosti jednotlivých postupů (různá míra pozadí i citlivosti pro různé typy aberací) Vysoká míra expertní zkušenosti nutná, obtížně předávaná Možná řešení: - Iniciativy Euroflow, ISAC, ESCCA (standardizace, optimalizace, analýza) - Optimalizace protokolů pro 8 barev -Novépřístupy k analýze, pravděpodobnostní analýzy, nové softwary
Polychromatická cytometrie - výzkum B-prekurzorové ALL CD44 (Pgp( Pgp-1) CD27 (TNFRSF7) (%) (%) p<0.0001 TEL/AML1 BCR/ABL MLL Hyperdiploidní Ostatní TEL/AML1 BCR/ABL MLL Hyperdiploidní Ostatní TEL/AML1 leukémie jsou CD44neg a CD27poz Vášková et al., Leukemia 2005
Polychromatická cytometrie - výzkum 27 SP 27/44 DP 27/44 DN 44 SP Vášková et al, 2008
Polychromatická cytometrie - výzkum 27 SP 27/44 DP CD27 27/44 DN CD44 44 SP Vášková et al, 2008
Analýza dat Hierarchické gatování - je pracné, nepřehledné a nedovoluje vidět kompletní obraz NIC LEPŠÍHO ZATÍM NEMÁME!! Dílčí nápady nových přístupů - FlowJo (Treestar, Ashland, OR) www.flowjo.com - Infinicyte (Cytognos, Salamanca, E) www.cytognos.com - R-project platform (Bioconductor) www.r-project.org flowclust Clustering for Flow Cytometry flowcore Basic structures for flow cytometry data flowq Qualitiy control for flow cytometry flowutils Utilities for flow cytometry flowviz Visualization for flow cytometry - GemStone, WinList (Verity, Topsham, ME) www.vsh.com - FCS3 Express (DeNovo, Los Angeles, CA) www.denovosoftware.com
Polychromatická diagnostika Je upgrade na 6 8 barev nezbytný? - Pro diagnostiku běžných hematologických malignit postačují 3-4 barevné parametry - Pro citlivou detekci MRN je 8-10 barev asi nutností Co přechod na 8 barevnou cytometrii přináší za problémy? - Nutnost pečlivé QC a QA - Častější technické problémy komplikovaných instrumentů - Nutnost rozsáhlé optimalizace protokolů pro 8 barev - Interakce fluorescence (artefakty kompenzační, zobrazovací), snížení citlivosti, - Dostupnost reagencií - Složitější analýza - Cena reagencií, cena přístrojů
Poděkování Ondřej Hrušák Ester Mejstříková Martina Vášková Veronika Kanderová Martin Kováč Vendula Pelková Daniel Thürner Lucie Gondorčínová Pavel Semerák Klára Pospíšilová Jan Trka Jan Starý GA ČR 301/06/P162, VZ MŠMT MSM0021620813, EC-STREP-018708- Euroflow