Exempla trahunt - pøíklady táhnou Bc. Milada Nezvedová, RNDr. Zdenìk Veškrna Oddìlení klinické biochemie, Nemocnice Znojmo, p.o. Stanovení PAPP-A a free βhcg na analyzátoru Elecsys 2010 Úvod ree βhcg a PAPP-A jsou dùležitými parametry pøi hodnocení rizika vrozených vývojových vad v 1. trimestru tìhotenství. Výpoèet rizika se provádí pomocí speciálního programu, který vyžaduje vložení dalších parametrù - vìku a hmotnosti matky, data ultrazvuku a odbìru krve, hodnot ultrazvukových markerù CRL (crown rump length, délka plodu od temene po kostrè) a NT (nuchal translucency, projasnìní šíje). Mìøení tìchto markerù vyžaduje certifikovaného ultrazvukistu. Na Oddìlení klinické biochemie Nemocnice Znojmo, p.o. provádíme hodnocení rizika vrozených vývojových vad v 1. a 2. trimestru od roku 2007, kdy došlo ke zrušení laboratoøe Oddìlení nukleární medicíny. Do února roku 2010 jsme stanovení markerù pro první trimestr provádìli na analyzátoru Siemens Immulite 1000 a vyhodnocení pomocí programu Prisca. Kvùli dalšímu zkvalitnìní vyšetøení (uvádìná pøesnost, použití èárových kódù) jsme se rozhodli pøevést mìøení PAPP-A a free βhcg na analyzátor Roche Elecsys 2010 a vyhodnocení do programu Alpha, který jsme už døíve využívali pro hodnocení pravdìpodobnosti rizika ve 2. trimestru. V èervnu 2010 jsme zároveò s pøestìhováním do nové laboratoøe vymìnili Elecsys 2010 Rack za cobas e 411 Rack. V souèasné dobì zavádíme hodnocení rizika vývojových vad na základì sekvenèního screeningu, u kterého byla studiemi potvrzena nižší falešná pozitivita než pøi hodnocení rizika u jednotlivých trimestrù samostatnì. Pøíloha Labor Aktuell 04/10 1
Souèástí testování bylo i ovìøení stability analytù pøi pokojové teplotì v plné srážlivé krvi ve spolupráci s ordinací MUDr. Pavkové, která provádí v naší nemocnici mìøení UZV parametrù a odbìr vzorkù pro 1. trimestr. Screening vrozených vývojových vad v 1. trimestru tìhotenství Screening vrozených vývojových vad v prvním trimestru je zamìøený pøedevším na zjištìní rizika chromozomálních aberací plodu, z nichž nejvýznamnìjší jsou trizomie 21 (Downùv syndrom) a trizomie 18 (Edwardsùv syndrom). Mimo to jej lze také využít i ke zjištìní nìkterých morfologických vad a porodnických komplikací (3). Screening se provádí na základì kombinace mìøení šíjového projasnìní (NT), sérových markerù (PAPP-A, free βhcg) a vìku matky. Použitím tìchto markerù mùžeme dosáhnout až 85% detekèní úèinnosti pøi 5% falešné pozitivitì. Základním pøedpokladem je pøesné urèení délky tìhotenství ultrazvukem, jinak se míra detekce snižuje (1,5,9,10). Pokud k tìmto parametrùm pøipojíme vyšetøení nosní kosti (NB), jejíž absence je ve vysoké míøe spojená s Downovým syndromem, odhaduje se, že pøi 5% falešné pozitivitì bude záchyt trizomie 21. chromozomu pøibližnì 95 % (2). Obr. 1: Chromozomální výbava plodu postiženého trizomií 21 Hladina free βhcg je u tìhotenství s trizomií 21 v mateøském séru zvýšená a hladina PAPP-A je oproti chromozomálnì normálním plodùm snížená. U trizomií 18 a 13 (Pataùv syndrom) jsou hodnoty free βhcg a PAPP-A v mateøském séru snížené. Byla také prokázaná významnì zvýšená hodnota NT, která je obecnì markerem aneuploidií (Turnerùv syndrom, Klinefelterùv syndrom). Aberace pohlavních chromozomù se projevuje sníženou hodnotou PAPP-A v séru matky pøi normální hodnotì βhcg. Paternální triploidie jsou charakterizovány zvýšenými hodnotami βhcg a mírnì sníženými hodnotami PAPP-A, naopak maternální triploidie je spojována s výraznì sníženými hodnotami βhcg a PAPP-A v mateøském séru (1). Optimální doba vyšetøení biochemických markerù v prvním trimestru je udávaná mezi 8. a 11. gestaèním týdnem, urèení hodnoty NT mezi 11. a 13. týdnem (pøesnìji pøi hodnotì CRL 45-84 mm) (7). Biochemické markery pro hodnocení rizika VVV v 1. trimestru tìhotenství ree βhcg Obr. 2: Chromozomální výbava plodu postiženého trizomií 18 Lidský choriový gonadotropin je glykoproteinový hormon, který lze v krvi proká- 2 Pøíloha Labor Aktuell 04/10
zat bìhem tìhotenství. Intaktní hcg je tvoøen dvìma podjednotkami, alfa a beta, které nejsou stejné a jsou spojené nekovalentní vazbou. Tyto podjednotky se mohou vyskytovat i ve volné formì, ale biologickou aktivitu má pouze intaktní hcg. Alfa podjednotka je svoji strukturou podobná alfa podjednotkám hormonù hypofýzy (LH, SH a tyreotropinu). Beta podjednotka je specifická pro každý výše uvedený hormon. Volná podjednotka β se v séru nachází po celou dobu tìhotenství, její koncentrace vzrùstá do 12. týdne gravidity, dále klesá. Produkce podjednotek α je v prvních tøech mìsících tìhotenství nižší oproti produkci podjednotek β, ale po této dobì je tomu naopak. Poloèas podjednotky je 1,5-2,5 dne. Kromì detekce chromozomálních vad v tìhotenství se tento marker využívá také k diferenciaci mezi benigním a maligním trofoblastickým onemocnìním, pøi monitoringu pacientù s germinativními nádory varlat, k diagnostice netrofoblastických nádorù, k pøedpovìdi výsledku IV. Zvýšení koncentrace je také pozorováno u 20 % všech maligních nádorù (4,8). PAPP-A Tìhotenský plazmatický protein A je glykoprotein pocházející z placenty. U mužù je tvoøen játry. Hladina PAPP-A roste bìhem tìhotenství, kdy do 30. týdne dochází k pomalému vzestupu koncentrace, nejvìtší nárùst je pozorován v závìru gravidity. Je považován za nejlepší marker Downova syndromu, kdy dochází k poklesu hladin, ovšem pouze v 1. trimestru tìhotenství. Pøi použití tzv. integrovaného testu, kdy je riziko vrozených vývojových vad vyhodnoceno na základì výsledkù stanovení biochemických a ultrazvukových markerù 1. a 2. trimestru, je možný až 94% záchyt postižených plodù. Jeho nižší hladiny mohou být také ukazatelem hrozícího potratu. Je také markerem nestability aterosklerotického plátu, tj. kardiovaskulárního rizika. Poloèas rozpadu je 3-4 dny (2,4,8). Parametry stanovení na jednotlivých analyzátorech Siemens Immulite 1000 Tab. 1: Základní namìøená data na obou analyzátorech Chemiluminiscenèní imunochemická reakce, sendvièový princip. Èinidla obsahují alkalickou fosfatázu konjugovanou s pøíslušnou monoklonální protilátkou, kterou je potažena rovnìž kulièka v testovací nádobce. Potøebný objem vzorku: PAPP-A 10 µl free βhcg 5 µl Obr. 3: Graf porovnání výsledkù free βhcg Doba stanovení: PAPP-A 42 minut free βhcg 72 minut (8) Roche Elecsys 2010/ cobas e 411 Elektrochemiluminiscenèní reakce, sendvièový princip. Èinidla obsahují mikroèástice potažené streptavidinem (1. nádobka), pøíslušnou biotinylovanou monoklonální myší protilátku v pufru TRIS (2. nádobka) a monoklonální myší protilátku znaèenou rutheniovým komplexem ve fosfátovém pufru (3. nádobka). Potøebný objem vzorku: PAPP-A 15 µl free βhcg 10 µl Obr. 4: Graf porovnání výsledkù PAPP-A Doba stanovení: 18 minut (8) Pøíloha Labor Aktuell 04/10 3
Obr. 5: Regrese dle Passing-Babloka - free βhcg, r=0,991 Obr. 7: Regrese dle Passing-Babloka - PAPP-A, r = 0,990 Obr. 6: Rozdílový graf - free βhcg Obr. 8: Rozdílový graf - PAPP-A 4 Pøíloha Labor Aktuell 04/10
Porovnání stanovení PAPP-A a free βhcg na analyzátorech Immulite 1000 a Elecsys 2010 Tab. 2: Deklarované parametry souprav Roche, n = 60 (Zdroj: Pøíbalové letáky dg. souprav Elecsys PAPP-A, free βhcg) Tab. 3: Srovnání namìøených a deklarovaných hodnot kontrol PC Maternal Care, n=16 (Pozn. Cílová hodnota - støední hodnota kontroly uvedena v pøíbalovém letáku dané šarže PC Maternal Care) Porovnávání stanovení markerù PAPP-A a free βhcg na obou analyzátorech jsme provádìli v prùbìhu devíti týdnù na souboru 70 vzorkù u PAPP-A a 71 vzorkù u free βhcg. Základní popisné velièiny namìøených dat jsou uvedeny v tabulce 1. K porovnání byla použita Passing-Bablokova regrese a rozdílový graf, které byly vytvoøeny v programu Method Validator (obrázky 4, 5, 7 a 8), grafy obrázkù 3 a 6 zobrazují srovnání výsledkù analýzy na obou pøístrojích a jsou vyhotoveny v programu Microsoft Excel. Ovìøení parametrù souprav Elecsys free βhcg a PAPP-A K ovìøení mezilehlé pøesnosti a pravdivosti (správnosti) soupravy jsme použili kontrolní materiál Roche PreciControl Maternal Care. Jednotlivé namìøené hodnoty markerù v kontrolních materiálech jsou spolu s hodnotami SD a CV uvedeny v tabulce è. 3. Hodnoty SD a CV jsou pøevzaty z programu Biorad QC OnCall, který naše laboratoø využívá v rámci vnitøní a mezilaboratorní kontroly kvality. Pravdivost (správnost) metody je vyjádøená hodnotami bias (%). Ovìøení stability analytù Tab. 4: Namìøené hodnoty PAPP-A a fβhcg po jedné, tøech a pìti hodinách od odbìru krve Odbìr krve od každé tìhotné ženy byl proveden do tøí zkumavek. Centrifugace a separace séra z první zkumavky byla provedena do jedné hodiny po odbìru, zpracování krve z druhé zkumavky bylo provedeno po tøech hodinách po odbìru a ze tøetí zkumavky po pìti hodinách od odbìru krve. Vzorky byly do zpracování uchovávány pøi pokojové teplotì, po separaci bylo sérum zmraženo. Výsledky jednotlivých mìøení jsou uvedeny v tabulce 4 a grafické znázornìní výsledkù na obrázcích 9 a 10. Závìr Obrázek 9: Srovnání výsledkù mìøení PAPP-A v èasových odstupech separace séra po odbìru 1/ Srovnání metod Immulite 1000 vs. Elecsys 2010 Z výše uvedených grafù vyplývá velmi dobrá korelace hodnot získaných na obou analyzátorech. Výsledky na- Pøíloha Labor Aktuell 04/10 5
Literatura: Obr. 10: Srovnání výsledkù mìøení fβhcg v èasových odstupech separace séra po odbìru mìøené na Elecsys ukazují nižší hodnoty free βhcg (Elecsys = 0,79 x Immulite + 0,904) a vyšší hodnoty PAPP-A (Elecsys = 1,68 x Immulite - 0,025). Hodnocení rizika je založeno na relativních hodnotách násobku mediánu (MoM), kde se uvedený posun neprojeví. Pro provoz je pøínosem i zkrácení doby analýzy. 2/ Ovìøení pøesnosti a pravdivosti I pøes nízký poèet mìøení mùžeme øíci, že obì soupravy splòují s velkou rezervou požadavky na pøesnost, jak jsou uvedeny v doporuèení odborných spoleèností ÈLS JEP (pro free βhcg 10 %, pro PAPP-A 10 %). 3/ Ovìøení stability analytù Z naší studie vyplývá, že stabilita obou parametrù v primární zkumavce pøi pokojové teplotì je nejménì 5 hodin, což plnì vyhovuje našemu zpùsobu odbìru a transportu vzorkù. 1) Nicolaides K. H. UZ screening v 11.-13. gestaèním týdnu, Univerzita Palackého v Olomouci, 2004, s. 41-45 2) Calda P. a kol. Ultrazvuková diagnostika v tìhotenství, Aprofema Praha,2007, s. 56, 59 3) Hájek Z. a kol. Rizikové a patologické tìhotenství, Grada Publishing, 2004, s. 53 4) Kopáè J. Lékaøská a laboratorní diagnostika, Polygraf Turnov, 2004 5) Zima T. Laboratorní diagnostika, Galén, 2002, s. 417 6) Roche Diagnostics, Základy screeningu Downova syndromu 7) Info Line Immunotech, Screening VVV v 1. a 2. trimestru, Immunotech, 2001s. 5 8) Pøíbalové letáky od diagnostických souprav Elecsys PAPP-A, free βhcg a Immulite PAPP-A, free βhcg 9) Wald N.J., Walters J., Rodeck C., Chitty L., Mackinson A.M., SURUSS, J. Med. Screen. 2003; 10:56-104 10) Malone.D., Canick J.A., ASTER, N. Engl. J. Med. 2005, 353:2001-11 Mùžeme konstatovat, že zavedení souprav Roche free βhcg a PAPP-A pøispìlo ke zvýšení kvality v hodnocení rizika vrozených vývojových vad v 1. trimestru v naší laboratoøi. 6 Pøíloha Labor Aktuell 04/10