Univerzita Karlova v Praze, 2. lékařská fakulta. Náhodně zjištěn á hyperglykémie II dětí a. ado lescentů. MUDr. Eva Feigerlová

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze, 2. lékařská fakulta Náhodně zjištěn á hyperglykémie II dětí a ado lescentů MUDr. Eva Feigerlová Praha 2007

2 2 Tato disertační práce byla realizována v rámci postgraduálního doktorského studia biomedicíny, zařazeného do oborové rady POSB Fyziologie a patofyziologie člověka. Práce vznikla ve spolupráci Kliniky dětí a dorostu Univerzity Karlovy - 3. lékařské fakulty a Steno Diabetes Center and Hagedorn Research Institute, Gentofte, Dánsko. Autor: MUDr. Eva Feigerlová Adresa pracoviště autora: H6pital des Enfants Unité ďendocrinologie 330, avenue de Grande Bretagne Toulouse Cedex 9 Francie eva.feigerlova@seznam.cz Školitel: Prof. MUDr. Jan Lebl, CSc. Adresa pracoviště školitele: Pediatrická klinika UK-2. LF a FN Motol V Úvalu Praha 5 Oponenti: Autoreferát byl rozeslán dne: Obhajoba diseltace se koná dne:

3 3 Poděkování: Mé poděkování a uznání patří především mému školiteli Prof. MUDr. Janu Leblovi, CSc., za příkladné celého mého studia. vedení projektu, myšlenkovou podporu a podnětné rady v průběhu Děkuji rovněž MUDr. Štěpánce Průhové, PhD., za vstřícnou a obětavou pomoc a užitečné připomínky ke studii a doc. MUDr. Marii Černé, CSc., za laskavou pomoc při provádění molekulárně genetické analýzy. V neposlední řadě patří mé poděkování endokrinologům a diabetologl'rm z celé České republiky, jejichž nemalým přispěním byl realizován výběr probandl'r do studie.

4 4 OBSAH OBSAH... 4 POUŽITÉ ZKRATKY... 6 VLASTNÍ PRÁCE... 8 I. TEORETICKÁ ČÁST... 8 I. ÚVOD DIABETES MELLlTUS I. TYPU (Tl DM) MODY ] HEPATOCYTÁRNÍ NUKLEÁRNÍ FAKTOR-4A (MODY I) GLUKOKINÁZA (MODY2) HEPATOCYTÁRNÍ NUKLEÁRNÍ FAKTOR-IA (MODY3) INZULÍNOVÝ PROMOTOROVÝ FAKTOR l (MODY4) HEPATOCYTÁRNÍ NUKLEÁRNÍ FAKTOR-lB (MODY5) PROTEIN NEUROGENNÍ DIFERENCIACE NEURO-DIIB2 (MODY6) KRUPPEL-LlKE TRANSKRIPČNÍ FAKTOR KARBOXYL-ESTER LIPÁZA MODYX NEONATÁLNÍ DIABETES MELLITUS TRANSIENTNÍ NEONATÁLNÍ DIABETES MELLlTUS (TNDM) PERMANENTNÍ NEONATÁLNÍ DIABETES MELLITUS (PNDM) KIR SURI GLUKOKINÁZA IPF-I FOXP WOLCOTTŮV-RALLISONŮV SYNDROM PTF-IA AUTOIMUNITNÍ PNDM DIABETES MELLITUS 2.TYPU JINÉ FORMY DIABETU STRESOVÁ HYPERGLYKÉMIE REGULACE GLYKÉMIE - ÚLOHA B-BUŇKY PANKREATU II. P RA KTiCKÁ ČÁST NÁHODNĚ ZJIŠTĚNÁ HYPERGLYKÉMIE ČLÁNEK I ČLÁNEK

5 5 9.3 MUTACE GENU KCNJlJ, KÓDUJícíHO KI R6.2 - TERAPEUTICKÝ PŘÍSTUP STUDIE MODY ČLÁNEK III. ZÁ VĚR ll. NÁHODNÁ HYPERGLYKÉMIE l\10dy LITERATURA VLASTNÍ PUBLIKAČNÍ ČiNNOST AI ČLÁNKY V ČASOPISECH S IMPAKT FAKTOREM BI ČLÁNKY V ČESKÝCH ČASOPiSECH CI ABSTRAKTA S PUBLIKACí BEZ PUBLIKACE... 95

6 6 POUŽITÉ ZKRATKY ABCC8 ADP AntÍ-GAD65 Anti-IA-2 ATP SMl CEL DEND dhplc ElF2AK3 FOXP3 FPIR GCK GCK GLUT2 G-6-P HbA1c HNF-Ia HNFIA HNF-l~ HNFIB HNF-4a HNF4A HYMAI IAA ICA IFCC IGT/PGT IPEX ATP-binding cassette, subfamily C, member 8 adenosindifosfát protilátky proti izoformě 65 dekarboxylázy kyseliny glutamové protilátky proti tyrozinové fosfatáze adenosintrifosfát body mass index carboxyl-ester lipáza developmental delay, epilepsy, neonatal diabetes denaturační vysokovýkonná chromatografie eukaryotic translation initiation factor-2a kináza 3 forkhead box P3 first-phase of insulin release/první fáze inzulinové sekrece glukokináza gen kódující glukokinázu specifický glukózový transportní protein-2 ~ - buňky pankreatu glukóza-6-fosfát glykosylovaný hemoglobin hepatocytámí nukleární faktor-l a gen kódující HNF-la/TCF1 hepatocytální nukleární faktor-i ~ gen kóduj ící HNF -I ~ /TCF2 hepatocytální nukleární faktor-4a gen kódující HNF-4a hydatidiform mole-associated and imprinted transcript proti látky proti inzulínu protilátky proti ostrúvkovým buňkám [nternational Federation ofclinical Chemistry impaired glucose tolerance/porušená glukózová tolerance immunodysregulation, polyendocrinopathy and enteropathy,

7 7 x-linked IPF-I IVGTT KCNJll Kir6.2 KLFII LOT I MODY Neuro-D I / ~2 NGT OGTT PACAPl PCR PDX-I PLAGLl PND/PNDM RCAD PTF-lA SPIR SURI TNDM TCFI TCFi TCF2 TCF2 TIDM T2DM VNTR WRS ZAC insul in promoter factor-i intravenózní glukózový tole ranční test potassium channel, inwardly rectifying, subfamily J, member 1I inwardly rectifying K + channel Kruppel-like transcription factor 11 lost on transformation I Maturity-onset diabetes ofthe young neurogenic differentiation factor Dl/~-cell-E box transactivator 2 normální glukózová tolerance orální glukózový toleranční test pitiutary adenylate cyclase activating po ly peptide receptor I polymerázová řetězová reakce pankreas duodenum homeobox-i pleomorphic adenoma gene-likel permanentní neonatální diabetes mellitus renal cysts and diabetes pancreas transcription factor-l, alpha subunit second-phase of insulin release/druhá fáze inzulínové sekrece sulfonylureový receptor I transientní neonatální diabetes mellitus transkripční faktor I gen kódující HNF-Ia/TCFI transkripční faktor 2 gen kódující HNF-l ~/TCF2 diabetes mejlitus 1. typu diabetes mellitus 2. typu variab le number of tandem repeats WoJcottův-Ral1isonův syndrom Zn(2+)-activated channel

8 8 VLASTNÍ PRÁCE J. Teoretická část 1. Úvod Donedávna se v souvislosti s diabetem v pediatrické populaci uvažovalo téměř výhradně O diabetu mellitu I. typu (Tl DM) s jeho typickou klinickou symptomatologií zahrnující polyurii, polydipsii, váhový úbytek a případně projevy ketoacidózy. Nyní na diabetes mellitus dětského věku a adolescence pohlížíme jako na heterogenní onemocnění zahrnující skupinu poruch s rozdílnou patogenezí, průběhem a odpovědí na léčbu (ADA 2005). V některých případech je klinická symptomatologie velmi sporá a může se omezit jen na náhodné zjištění mírné hyperglykémie v rámci vyšetřování pro různé klinické stavy. Náhodnou hyperglykémií se rozumí zvýšená glykémie nad referenční mez u jinak zdravého, klinicky asymptomatického jedince, stanovená z náhodného žilního odběru nalačno za bazálních podmínek (např. v rámci preventivní prohlídky) či během zátěžové situace (např. v průběhu akutně probíhající onemocnění, v souvislosti s chirurgickým zákrokem či úrazem). Dle definice (ADA 2005, WHO 1999) se za fyziologické považují hodnoty plazmatické glykémie nalačno nižší než 5,6 mmol/i za předpokladu dodržení podmínek preanalytické přípravy. Normální hodnota glykémie měřená 2 hodiny po standartní zátěži v průběhu OGTI (orálního glukózového tolerančního testu) je nižší než 7,8 mmolll. I přes existenci jasných kritérií nepovažuj í některé biochemické laboratoře stanovenou hraniční dolní mez plazmatické glykémie nalačno za striktní a zařazuj í do abnormálního pásma i hodnoty nižší (např. > 5,4 mmolll). Nejednotnost přístupu různých pracovních skupin signalizuje, že doporučená arbitrální kritéria nejsou zatím všeobecně akceptována.

9 9 Pro klinickou praxi následně vyvstává dů lež itá otázka stupně závažnosti nálezu náhodné hyperglykémie u dítěte, které nemá klinické příznaky hyperglykémie. V úvahu přichází řada patologických stavů, které znázorňuje obr. I. Obr. 1: Etiologie asymptomatické hyperglykémie u dětí a adolescentů Sekundární DM Metabolický stres Jiné raritní typy DM Náhodná hyperglykémie Diabets mellitus (časná fáze) TIDM (časná fáze) Glukokinázový diabetes (MODY2) Diabetes transkripčních faktorů: - (MODYI, 3-6) - Defekt KLFl1? Syndromy asociované s DM CEL? I Transientní \ Neonatální diabetes Permanentní CEL - carboxyl-ester lipase, KLFl1 - Kruppel-like transcription factor II Diabetes mellitus 1. typu (TI DM) je charakterizován absolutním nedostatkem inzulínu v důsledku autoimunitní destrukce ~-buněk pankreatu s nutností inzulínové terapie a s následným významným rizikem pozdních mikro- a makrovaskulárních

10 10 komplikací. Klinickou manifestaci TIDM pře dcház í preklinická neboli premanifestní fáze, jejíž průběh je velmi variabi lní (Kulmala 2003). Maturity-onset diabetes of the young (MODY), diabetes mellitus s časným začátkem a autozomálně dominantní dědičností, představuje skupinu monogenně podmíněných poruch funkce pankreatických p-buněk. Dle definice Americké diabetologické společnosti (ADA 2005) se jedná o diabetes mellitus řazený do skupiny poruch způsobených genetickým defektem p-buněk. Klinická diagnóza MODY je založena na: (i) mladém věku při manifestaci poruchy (před 25. rokem života), (ii) rodinném výskytu s autozomálně dominantním typem dědičnosti a vysokou penetrancí a (iii) zachované sekrece C-peptidu při inzulínové léčbě (Hattersley 1998, Velho 2003a, Winter 2003). Doposud bylo identifikováno 6 specifických podtypů MODY (MODY1-MODY6) na základě příslušné genetické poruchy. Mezi další potenciální MODY geny mohou být nově řazeny genu pro transkripční faktor KLF II a genu pro karboxyl-ester lipázu. nedávno popsané defekty dvou genll: MODY2 je způsoben mutacemi GCK genu kódujícího glukokinázu (GCK), což je enzym nezbytný pro fosforylaci glukózy vp-buňkách pankreatu a v jaterních buňkách (obr. 2). Postižení jedinci mají mírnou hyperglykémii od narození do pozdního věku. Pacienti jsou většinou bez klinických symptomů a nemají vážné orgánové komplikace. Věk diagnózy závisí na prvním změření hladiny krevní glukózy (Fajans 2001). Další podtypy MODY diabetu (MODY1, 3-6 a potenciálně defekt transkripčního faktoru KLF11) vznikají následkem chybné regulace transkripčních mechanismů pankreatické ~-buňky. Ke klinické manifestaci onemocnění u postižených jedinců dochází obvykle v pozdní pubertě nebo v časné dospělosti. Charakteristická je ve většině případů progresivní porucha inzulínové sekrece a glukózové regulace s vysokým rizikem pozdních diabetických komplikací.

11 I 1 Nedávno popsaná mutace genu pro karboxyl-ester lipázu (carboxyl-ester lipase, CEL) je prvním příkladem monogenní formy diabetu s časným začátkem a s primární expresí genového produktu v exokrinním pankreatu (Reader 2006). Neonatální diabetes mellitus (transientní nebo permanentní) je charakterizován nálezem hyperglykémie během prvních měsíců života s nutností inzulínové terapie (Gloyn 2004, Marquis 2002). Transientní neonatální diabetes mellitus (TNDM) vyžaduje přechodně exogenní dodávku inzulínu, během roku dochází k ústupu onemocnění s rizikem recidivy v pozdějším věku (Polak 2007). Na druhé straně pacienti s permanentním neonatálním diabetem mellitem (PNDM) zůstávají závislí na inzulínu (Shield 2000). Jako příčina PNDM byla v posledních letech u podstatné části postižených dětí detekována mutace genu KCNJII kódujícího Kir6.2 podjednotku ATP-senzitivního K+ kanálu pankreatické ~-buňky (Gloyn 2004). Recentně byla prokázána spojitost mezi neonatálním diabetem a mutací genu ABCC8, který kóduje SUR I podjednotku K ATP kanálu (Proks 2006). Diferenciální diagnóza náhodně zachycené hyperglykémie dále zahrnuje diabetes mehitus vyvolaný léky, sekundární diabetes mellitus při současné endokrinopatii nebo při onemocnění exokrinního pankreatu, genetické syndromy spojené s diabetem mellitem, jiné vzácné formy diabetu mellitu a hyperglykemické stavy způsobené stresovou situací. Pro komplexní pojetí problému diabetu dětí a adolescentů je nutné navíc zmínit diabetes mejlitus 2. typu (T2DM), jehož výskyt je stále častější mladých lidí v zemích s epidemickou obezitou (Pontiroli 2004). u velmi obézních Rozlišení jednotlivých příčin asymptomatické hyperglykémie a stanovení etiologie je potřebné, neboť jednotlivé stavy se významně liší svým přirozeným průběhem, optimální terapií a dlouhodobou prognózou. V první části studie jsme se zaměřili na určení etiologických příčin a posouzení klinické závažnosti náhodně hyperglykémie u neobézních českých dětí (BMI < 97.

12 12 percentil pro daný věk a pohlaví), které neměl y rizi kové faktory pro rozvoj poruchy glukózové tolerance (endokrinopatii, onemocně ní exokrinního pankreatu ani medikaci s možným vlivem na glykémii). Dle výsledků předcházející studie publikované naší pracovní skupinou je nejčastější formou monogenního diabetu v České republice MODY2 (Prllhová 2003), který je zpllsoben mutací genu pro glukokinázu (GCK) (Froguel 1992, Vionnet 1992). Jde o benigní formu metabolické odchylky ve srovnání s ostatními subtypy MODY a přináší postiženým jedincům prognosticky příznivou zprávu. Projevy onemocnění se obvykle omezují na mírnou stabilní asymptomatickou hyperglykémii a pacienti bývají zachyceni náhodně při vy š etřování z jiných důvodů (Fajans 2001, Hattersley 2006). Screening GCK mutací u jedinců s klinickým podezřením na MODY diabetes pomáhá odlišit tyto pacienty od pacientí'! s jinými, rizikovými formami hyperglykémie. Druhá část práce se proto zabývá vyšetřením mutací genu pro glukokinázu u jedincí'! z české populace s klinicky suspektním MODY. 2. Diabetes mellitus 1. typu (TIDM) buněk Diabetes mellitus 1. typu (Tl DM) je onemocnění charakterizované destrukcí p pankreatu autoimunitním procesem (Atkinson 1994), který vede k rozvoj i inzulínové nedostatečnosti a k chronické závislosti na exogenní dodávce inzulínu. Riziko mikro- a makrovaskulárních komplikací je velké (ADA 2005). Výskyt TIDM u dětí v globálním měřítku stoupá (Onkamo 1999). Jeho incidence v České republice je dle recentních údajů ve srovnání s ostatními zeměmi středně vysoká (Cinek 2005). Mechanismus vzniku onemocnění není dosud plně obja s něn. Vnímavost je pravděpodobně částečně podmíněna genetickou predispozicí, na které se podílejí zejména geny HLA systému na krátkém raménku chromozómu 6 (Atkinson 1994, Kulmala 2003). V etiopatogenetickém procesu zřejmě hrají roli i vlivy environmentální (uvažuje se o faktorech infekčních a dietních) (Atkinson 1994). Předpokládá se, že efektorovými buňkami v procesu autoimunitní destrukce p-buněk jsou T Iymfocyty. V

13 13 séru lze stanovit autoprotilátky proti různým komponentám ~-buněk: protilátky proti ostrůvkovým buňkám (ICA), protilátky proti isoformě 65 dekarboxylázy kyseliny glutamové (anti-gad65), protilátky proti tyrozinové fosfatáze (anti-ia-2) a protilátky proti inzulínu (IAA). Klinickou manifestaci TIDM předchází bezpříznakové stádium, tzv. premanifestní neboli preklinická fáze TIDM, jejíž trvání je variabilní v rozmezí od několika měsíců do několika let (Kulmala 2003). Během tohoto období progreduje autoimunitní destrukce ~-buněk pankreatu. Pozitivita autoprotilátek může být v této fázi vedle porušené sekrece inzulínu a C-peptidu jednou z časných známek nadcházejícího onemocnění (Mrena 2003, Kulmala 2003). Míru funkčního poškození ~-buněk lze odhadnout stanovením první fáze inzulínové sekrece (FPIR) v průběhu intravenózního glukózového tolerančního testu (lvgtt). Premanifestní fáze TIDM Je charakterizována dynamickým průběhem se značnou variabilitou, což komplikuje predikci onemocnění. Není známo, zda jedinec v premanifestní fázi nevyhnutelně dospěje do klinické fáze Tl DM (Kulmala 2003). Někteří pacienti mohou mít při první manifestaci TIDM známky ketoacidózy, jiní mají pouze mírnou hyperglykémii nalačno, která se však ml'lže rychle zhoršit za stresové situace (Duck 1988, Vardi 1990). 3. MODY Doposud byly molekulárně-geneticky identifikovány heterozygotní mutace v 6 (potenciálně 8) rozdílných genech jako příč ina MODY. MODY I je způsoben mutací genu HNF4A pro hepatocytární nukleární faktor-4a, MODY2 je následkem mutace genu GCK kódujícího glukokinázu (GCK), příčinou MODY3 je mutace genu HNF1A/TCFl pro hepatocytární nukleární faktor-la/transkripční faktor I (HNFla/TCF!), MODY4 je způsoben mutací genu pro inzulínový promotorový faktorl/pankreas duodenum homeobox-l (lpf-i/pdx-!), MODY5 mutací genu HNF1B/TCF2 pro hepatocytární nukleární faktor-l~ /transkripční faktor 2 (HNF I ~ITCF2), MODY6 mutací genu pro protein neurogenní diferenciace (Neuro-DI/~2).

14 14 Recentně byly popsány mutace genu pro trans kripční faktor KFL II a genu pro karboxyl-ester lipázu jako další možné podtypy MODY. Téměř všechny zmíněné geny jsou exprimovány v ~-buňkách pankreatu, defekt v kterémkoliv z nich vede k poruše fungování ~-buněk a diabetu mellitu. U nejméně 20% pacientů s klinickou diagnózou MODY se současnými metodami genetickou příčinu objasnit nedaří (Chevre 1998, Stride 2002a). Tyto tzv. MODY X případy mohou být způsobeny mutacemi v dosud ne identifikovaných genech nebo mohou být následkem komplexních molekulárních interakcí ve známých MODY genech, které nebyly detekovány při prováděném vyšetření. Světová prevalence MODY není známá, protože hyperglykém ie může být diagnostikována až v dospělém věku (Velho 2002) a pacienti s diagnózou diabetu mellitu 2. typu nebo diabetu mellitu I. typu bez přítomnosti rizikového HLA haplotypu mohou mít ve skutečnosti MODY (Ledermann 1995, Miller 1998). Relativní prevalence udávané jednotlivými studiemi se liší, což může být dáno genetickým pozadím dané populace, ale mnohem pravděpodobněji rozdílnou strategií při sběru populačních vzorků. Dle recentních údajů MODY2 představuje 22% ze všech MODY pacientů, diabetes transkripčních faktorů 65% (z toho MODYI 5%, MODY3 58%, MODY4 <I %, MODY5 2%, MODY6 <1 %) (Frayling 2001, Hattersley 2006, Raeder 2006). V rozsáhlé české studii z roku 2003 MODY2 reprezentoval 30%, MODY3 11% a MODYI 5% ze všech pacientů s MODY (Průhová 2003). 3.1 Hepatocytární nukleární faktor-4a (MODY1) MODYI je způsoben mutací genu HNF4A, který kóduje hepatocytární nukleární faktor-4a (HNF-4a). Gen HNF4A je lokalizován na dlouhém raménku chromozómu 20 (Yamagata 1996). K expresi genu dochází v játrech, ledvinách, střevech a pankreatu. HNF-4a má zásadní roli v řízení tkáňově specifické exprese genů v játrech a pankreatu (Parviz 2003, Shih 2000).

15 15 Patofyziologické mechanismy a fenotypové projevy MODY1 a MODY3 jsou velmi podobné. Exprese HNF-4a a HNF-1a podléhá vzájemné regulaci (Fajans 2001, Hansen 2002). Pacienti s mutací v těchto genech mohou mít zpočátku mírnou formu diabetu, která ale má tendenci k progresi. Glykémie nalačno může být iniciálně jen mírně zvýšená, charakteristický je významný vzestup koncentrace plazmatické glukózy při OGTT. Již v premanifestním stádiu lze detekovat sníženou inzulínovou sekreci po zátěži glukózou (Byrne 1995). Hyperglykémie má tendenci zhoršovat se s časem a vyžaduje zahájit léčbu perorálními antidiabetiky nebo inzulínem. Empirická data ukazují, že inzulínem bývá léčeno % postižených. Tyto formy MODY jsou spojeny rizikem vzniku mikro- a makrovaskulárních komplikací. Výše rizika cévních komplikací je zřejmě závislá na kvalitě kompenzace onemocnění (lsomaa 1998, Iwasaki 1998, Velho 1996). 3.2 Glukokináza (MODY2) MODY2 je způsoben heterozygotní mutací genu GCK kódujícího glukokinázu (GCK), enzym katalyzující přeměnu glukózy na glukóza-6-fosfát. Ten se nachází mimo jiné v ~-buňkách pankreatu a v jaterních buňkách. Gen pro glukokinázu je lokalizován na chromozomu 7 (Froguel 1992, Vionnet 1992). GCK je označována jako "glukózový senzor" ~-buňky (Matschinsky 1990). Enzym se vyznačuje nízkou afinitou ke glukóze při ph 7,4 a koncentračním rozmezí 5-7 mm ol/i a není inhibován reakčním produktem glukóza-6-fosfátem (Matschinsky 1998, Matschinsky 2002). Patogenní mutace GCK genu vede ke změně aktivity enzymu resp. ke změně afinity glukózy ke glukokináze. To vede k trvalé regulaci glykémie na vyšší hladině. Postižení jedinci mají chronickou mírnou hyperglykémii nalačno v rozmezí od 6 do 8 mmolll (Fajans 2001). Pacienti jsou obvykle bez klinických symptomů a bez orgánových komplikací. Věk při diagnóze závisí na prvním změření glykémie v životě. Klinický fenotyp je v průběhu života relativně stálý, pravděpodobně v důsledku kompenzačně zvýšené exprese druhé nemutované alely (Stride 2002b, Sturis 1994). Hladiny inzulínu

16 16 jsou podobné jako hladiny II zdravých jed inců, ale při zvýšené glykémii nalačno (Pearson 200 I, Velho 1997). Glykemická odpověd při OGTT je charakterizována vzestupem glykémie menším než o 3,5 mmoj/1 (Stride 2002b). Léčba většinou není nutná. Nové zkušenosti ukazují, že terapie inzulínem nebo PAD má jen malý vliv na glykémii. Postižení mají hladinu HbA 1c lehce zvýšenou nad horní hranici normy, rozdíly v HbA 1c mezi léčenými a neléčenými jedinci nebyly prokázány. Léčba bývá často indikována v těhotenství, kdy se porucha může poprvé rozpoznat a je pak zpravidla označena jako "gestační diabetes mellitus" (Hattersley 2006). 3.3 Hepatocytární nukleární faktor-ia (MODY3) MODY3 je způsoben heterozygotní mutací genu HNF 1 A/TCF 1 pro hepatocytární nukleární faktor-ia (HNF-la), nazývaný někdy také TCFI (transkripční faktor I). Gen se nachází na dlouhém raménku chromozomu 12. HNF-Ia se převážně exprimuje v játrech, pankreatu a ledvinách a je velmi významnou komponentou transkripční regulační sítě beta-buněk. Porucha funkce tohoto faktoru v pankreatické tkáni vede k diabetu (Fajans 2001). Funkce HNF-la a HNF-4aje vzájemně podmíněna ve společné regulační smyčce (Hansen 2002). MODY3 je charakterizován postupným selháváním funkce ~-buněk a manifestací diabetu mezi 10. a 30. rokem života (Frayling 2001, Pearson 2001). Porucha ~-buněk má tendenci ke zhoršování i po propuknutí diabetu; následkem je vzrůstaj ící hyperglykémie a nutnost zintenzivnění terapie (Pearson 2001). Riziko mikrovaskulárních a makrovaskulárních komplikací je závažné (Isomaa 1998). Glykémie nalačno mohou být zpočátku v normě nebo blízké hranicím normy, typická je zejména pozátěžová hyperglykémie (Byrne 1996). Vzestup hladiny plazmatické glukózy během orálního glukózového tolerančního testu je obvykle > 5 mmol/l (Stride 2002b). Pacienti mají snížený renální práh pro glukózu a glykosurii (Menzel 1998). MODY3 dobře reaguje na léčbu deriváty sulfonylurey (Pearson 2000, Sovik 1998). Prllkaz přinesla randomizovaná studie (Pearson 2003), v níž MODY3 pacienti

17 17 pětinásobně lépe odpovídali na léčbu gliclaz idem ve srovnání s metforminem a čtyřnásobně lépe na deriváty sulfonylurey ve srovnání s pacienty s diabetem mellitem 2. typu. Podobně MODY3 pacienti původně vedení pod diagnózou TIDM a léčení inzulínem byli úspě š ně převedeni na deriváty sulfonylurey, bez rizika vzniku ketoacidózy. U mnohých z nich došlo dokonce ke zlepšení glykemické kontroly (Stepherd 2003). Studiemi na zvířatech a buněčných liniích byla prokázána porucha v transportu glukózy (specifický glukózový transportní protein-2 ~-buňky, GLUT2), v metabolismu glukózy (pyruvátkináza) a v mitochondriálním metabolismu (Dukes 1998, Pontoglio 1998, Shih 2001, Wang 1998, Wang 2000, Wolheim 2000). Porucha je tedy lokalizována v buněčné metabolické dráze výše než K ATP kanál, což vysvětluje možnost úspěšného terapeutického zásahu deriváty sulfonylurey. Mechanismus postupného zhoršování funkce ~-buněk však zůstává neobjasněn. 3.4 Inzulínový promotorový faktor-l (MODY4) MODY 4 vzniká následkem heterozygotní mutace genu pro IPF-l /PDX-l (inzulínový promotorový faktor-i/pankreas duodenum homeobox-i), lokalizovaného na chromozómu 13. IPF -I je nutný pro transkripci genu pro inzulín, hraje významnou roli ve vývoji pankreatu a pravděpodobně zasahuje do procesu determinace a diferenciace společných pankreatických prekurzorových buněk ve vyvíjejícím se střevě (Jonnson 1994, Ohlsson 1993). U myši jej lze detekovat mezi 8. a 9. dnem embryonálního vývoje. Zprvu se exprimuje v endokrinních i exokrinních buňkách, v průběhu morfogeneze pankreatu se jeho exprese omezuje na ~- a o-buňky ostrůvků, kde se podílí na regulaci genové exprese. Mutace IPF-l mohou vést k neonatálnimu diabetu (při patogenní mutaci obou alel), představovat predispozici k T2DM (některé polymorfismy) nebo způsobovat MODY (při patogenní mutaci jedné alely) (Hani 1999, Macfarlane 1999). MODY 4 je raritní, poprvé byl popsán v rodině dítěte s agenezí pankreatu, u jehož příbuzných byla zjištěna heterozygotní mutace genu pro IPF-I s manifestací diabetu

18 18 kolem 35. roku života (Stoffers 1997a). Výskyt komplikací se zdá být vzácný (Vel ho 2003b). 3.5 Hepatocytární nukleární faktor-ip (MODY5) MODY5 je způsoben mutací genu HNFl B/TCF2, který kóduje hepatocytární nukleární faktor-i ~ (HNF-1 ~), známý též jako transkripční faktor-2 (TCF-2). HNF-I ~ patrně hraje roli v epiteliální diferenciaci (Kolatsi-Joannou 2001). Gen HNFl B/TCF2 je lokalizován na chromozomu 17 (Bach 1991, Edghill 2006). Původně bylo postižení popsáno jako MODY (Horikawa 1997), klinicky se však diabetes manifestuje jako izolované onemocnění jen ojediněle (Beards 1998, Edghill 2006). Pro fenotyp jsou typické zejména vývojové anomálie ledvin, nejčastěj i charakteru renálních cyst (Bingham 2004). Klinická jednotka se někdy označuje jako RCAD (Renal Cysts and Diabetes) (Bingham 2004). Klinická symptomatologie je však značně heterogenní. K dalším anomáliím, které se mohou vyskytnout, patří abnormality dělohy a pohlavního ústrojí, poruchy jaterních testů a/nebo stenóza pyloru (Bingham 2004). Věk při manifestaci diabetu je variabilní, onemocnění může propuknout před desátým rokem nebo ve středním věku (Edghill 2006). Mutace TCF2 vede k projevům inzulínové rezistence (hyperinzulinémie, snížení HDL cholesterolu a zvýšení hladin triglyceridů) (Brackenridge 2006, Pearson 2004) a k dysfunkci ~-buněk. Zhoršení funkce ~-buněk má progresivní charakter, byly popsány i případy ketoacidózy (Bingham 2003). Asi dvě třetiny postižených jedinců jsou léčeni inzulínem (Frayling 2001). Nedávné nálezy dokumentují roli HNF-1~ v embryonálním vývoji pankreatické tkáně. Jedná se o průkaz přítomnosti HNF-1~ v kmenových nediferenciovaných buňkách pankreatu (Maestro 2003) a o případ neonatájního diabetu u pacienta s patogenní mutací obou alel genu pro HNF-1 ~ (Yorifuji 2004).

19 Protein neurogenní diferenciace Neuro-DlI~2 (MODY6) MODY6 je následkem mutace genu pro transkripční faktor Neuro-D1 / ~2 (neurogenic differentiation factor DlI~-cell-E box transactivator 2), který se váže na kritickou oblast inzulínového promotoru a hraje roli ve vývoj i endokrinního pankreatu a v neurogenezi. Gen je lokalizován na chromozómu 2 (Tamimi 1996). Chybění Neuro DlI~2 u myši je spojeno se snížením počtu ~-buněk pankreatických ostrůvků, snížením exprese genu pro inzulín a těžkou formou diabetu. U člověka je výskyt mutace Neuro DlI~2 vzácný, klinická manifestace a průběh jsou v současnosti málo známy (Velho 2003b). 3.7 Kruppel-like transkri p ční faktor 11 Recentně byla prokázána spojitost mutace genu kódujícího transkripční faktor KLF 11 (Kruppel-like transcription factor 11) a diabetu u tří rodin s diabetem s časným začátkem, který splňoval kritéria MODY (Neve 2005). KLFl1 patří do rodiny transformačních růstových faktorů ~ (TGF-~), které regulují buněčný růst (Cook 1998). KLF11 hraje pravděpodobně významnou roli v řízení exprese inzulínového genu. Gen pro KLF11 se nachází na chromozómu 2 (Scohy 2000). 3.8 Karboxyl-ester lipáza U dvou norských rodin s MODY diabetem byla jako příčina poruchy funkce ~-buněk zjištěna mutace ve VNTR (variable number of tandem repeats) exonu 11 genu pro karboxyl-ester lipázu (karboxyl-ester lipase, CEL) (Reader 2006). Jednalo se o rodiny s autozomálně dominantně dědičnou formou diabetu a dysfunkcí exokrinního pankreatu. Věk při manifestaci příznaků byl méně než 25 let u 3 ze 14 nositelů mutace s diabetem. Postižení členové rodin měli biochemické a klinické známky primární poruchy inzulínové sekrece, bez známek autoimunitního procesu, a nebyli obézní. Ketoacidóza se nevyskytla u žádného z nich.

20 20 Gen pro CEL se exprimuje hlavně v acinámích buňkách exokrinního pankreatu a v mléčných žlázách v době laktace. V ~-buň kách pankreatu se pravděpodobně neexprimuje (Lombardo 2001, Raeder 2006). Fyziologickou rolí karboxyl-ester lipázy je zejména hydrolýza esterů cholesterolu v duodenu a trávení mléčného tuku u novorozenců (Hui 2002, Lombardo 2001). Jedinci s mutací tohoto genu mají fenotypové projevy snížené aktivity CEL: mírnou, často asymptomatickou poruchu exokrinní pankreatické sekrece, změnu hladin sérových lipidll a poruchu glukózové tolerance. Mechanismus postupného selhávání funkce ~-buněk nebyl objasněn. Pomocí zobrazovacích metod se podařilo prokázat atrofii pankreatické tkáně s pravděpodobnou tukovou infiltrací; autopsie prokázala známky fibrózy. Jedná se o první známou příčinu monogenní formy diabetu s primární expresí genového produktu v exokrinním pankreatu. Představuje zřejmě jen malý zlomek ze všech MODY pacientů (Hattersley 2006). 3.9 MODYX Diabetes, jehož klinická charakteristika odpovídá kritériím pro MODY, u kterého se však nepodařilo prokázat mutaci v dosud známých genech, naznačuje existenci dalších potenciálních MODY genů (Chevre 1998). Zatím se označuje jako MODYX. V jednotlivých studovaných souborech se jedná obvykle asi o 20 % pacientů s klinickou diagnózou MODY (Chevre 1998, Stride 2002a). Přesnou prevalenci MODYX je obtížné určit vzhledem k odlišným kritériím užívaným různými výzkumnými skupinami při selekci probandů do screeningových vyšetření MODY rodin. 4. NEONAT ÁLNÍ DIABETES MELLITUS Neonatální diabetes mellitus je vzácné onemocnění (I: : živě narozených) (Polak 2007). Je charakterizován nálezem hyperglykémie během prvních 3 měsíců života, která vyžaduje inzulínovou terapii (Gloyn 2004). Podle klinického

21 21 průběhu se novorozenecký diabetes dělí na transientní (TNDM) a permanentní (PNDM). 4.1 Transientní neonatální diabetes mellitus (TNDM) TNDM představuje 50 až 60 % případů neonatálního diabetu (Polak 2007). Manifestuje během prvních dnů života hyperglykémií, dehydratací a neprospíváním. Charakteristická je anamnéza intrauterinní růstové retardace (Temple 2000). Bývá přítomna minimální ketóza, hladiny inzulínu jsou nízké nebo nedetekovatelné a je nutné zahájit inzulínovou terapii. Stav má tendenci k úpravě a během roku dochází k ústupu onemocnění (Polak 2007). Může však dojít k recidivě během adolescence nebo dospělosti (Gardner 2000, Marquis 2002, Shield 1997, Temple 2000). Postižení nemají pozitivní specifické autoprotilátky proti ostrůvkovým buňkám pankreatu či jiné projevy autoimunitního onemocnění ani HLA haplotyp typický pro TIDM (Metz 2002, Shield 1997). Porucha funkce pankreatu patrně přetrvává po celou dobu života. Jako jedno z možných vysvě tlení klinického průběhu se nabízí variabilní schopnost pankreatu produkovat dostatečné množství inzulínu; k manifestaci onemocnění dochází pravděpodobně pouze v období zvýšených metabolických nároků organismu, jako je např. puberta nebo těhotenství (Ma 2004, Polak 2005). Výskyt TNDM je většinou sporadický. Část pacientů má anomálie chromozomu 6q (lokus 6q24) (Gardner 2000, Temple 2000) - paternální uniparentální izodizomii, paternální duplikaci a/nebo poruchy metylace. Mezi kandidátní geny patří: (1) gen pro transkripční faktor ZAC/LOTIIPLAGLI (Zn(2+)-activated channel/lost on transformation lipleomorphic adenoma gene-like 1), který se podílí na regulaci zástavy buněčného cyklu a apoptózy a na regulaci receptoru pro PACAPl (Pitiutary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide Receptor I), který je si Iným sekretagogem inzulínu (Po lak 2007) a (2) gen HYMAI (hydatidiform mole-associated and imprinted transcript), jehož funkce zatím není známa (Arima 2001, Kamiya 2000).

22 22 Poruchy lokusu 6q24 klinicky vedou k výrazně zvýšené glykémií v rozmezí od 12 do 57 mmolll s nutností inzulínové terapie, jejíž p otřeb né dávky poté obvykle poměrně rychle klesají. Pacienti ve fázi remise musejí být sledováni, protože hrozí riziko relapsu v pozdějším období. V období relapsu mohou být pacienti léčeni dietou, mnohdy je však nutná terapie inzulínem (Polak 2004). Odpověď na perorální léčbu deriváty sulfonylurey nebo metforminem je z dlouhodobého hlediska nejasná. Recentně byla prokázána asociace mezi TNDM a mutacemi v genech kódujících Kir6.2 a SURl podjednotky KATP kanálu: v genu KCNJll a/nebo v genu ABCC8 (Babenko 2006, Proks 2006, Y orifuj i 2005). 4.2 Permanentní neonatální diabetes mellitus (PNDM) K poruše inzulínové sekrece dochází v pozdním fetálním nebo časném novorozeneckém období. Před rokem 2004 byl PNDM indikací k celoživotní inzulínové terapii (Shield 2000). Nebývá přítomen HLA haplotyp rizikový z hlediska Tl DM ani markery autoimunitního procesu (Iafusco 2002, Polak 2007). S PNDM se spojuje řada patologií, z nichž některé se již podařilo objasnit na molekulární úrovni. Z etiologického hlediska lze rozlišit zejména: - aktivační mutace genu KCNJll kódujícího Kir6.2 podjednotku KATP kanálu - aktivační mutace genu ABCC8 kódujícího SURI podjednotku KATP kanálu - homozygotní mutace genu pro glukokinázu - mutace genu pro IPF-I/PDXI - mutace genu FOXP3: IPEX syndrom (immunodysregulation, polyendocrinopathy and enteropathy, x-linked) - Wolcottův-Rallisonův syndrom - mutace genu PTF-IA (neonatální diabetes a cerebellární ageneze) - autoimunitní PNDM - a další.

23 Kir6.2 Mutace genu KCNJll (potassium channel, inwardly rectifying, subfamily J, member II) pro Kir6.2 (inwardly rectifying K+ channel) podjednotku KAT? kanálu ~-buňky pankreatu je nejčastější příčinou permanentního neonatálního diabetu. Je odpovědná za třetinu až polovinu případů PNDM (Gloyn 2004, Hattersley 2006). KA T? kanál ~-buňky pankreatu hraje důležitou roli v glukózou stimulované sekreci inzulínu. Je prostředníkem mezi metabolickými procesy ~-buňky a membránovými elektrickými jevy. KAT? kanál tvoří hetero-oktamer složený ze čtyř podjednotek Kir6.2, které tvoří vlastní iontový kanál, a ze čtyř regulačních podjednotek SURl (Shyng 1997). Kir6.2 i SUR 1 podjednotky jsou nutné pro správnou metabolickou funkci kanálu. ATP při zv)'šení poměru ATP:ADP v buňce způsobí uzavření kanálu vazbou na Kir6.2 podjednotku a následnou depolarizaci membrány. Při nízkém metabolismu glukózy a tedy nízkém poměru ATP:ADP Mg-nukleotidy naopak stimulují aktivitu kanálu díky interakci s podjednotkou SUR1, což vede k hyperpolarizaci buněčné membrány. Rovnováha mezi těmito dvěma mechanismy je nezbytná pro řízení excitability pankreatické ~-buňky (Babenko 1999, Bryan 2004, Tucker 1997). Heterozygotní aktivační mutace KCNJll způsobují PNDM tím, že klesá sekrece inzulínu ~-buňkou v důsledku snížené citlivosti KAT? kanálu na zvýšenou koncentraci intracelulárního ATP (Gloyn 2004). Mutace KNCJll genu vznikají většinou de novo, jen asi 10% případů je familiárních s autozomálně dominantním typem dědičnosti (Sagen 2004, Slingerland 2006a). Funkčně méně závažné mutace mohou vést k TNDM, který se upraví do měsíců, ale později recidivuje (Gloyn 2005). Naopak mutace, výrazně postihující funkci KAT? kanálu, mají za následek vedle diabetu i neurologické poruchy, které se projevují jako opoždění psychomotorického vývoje, svalová slabost a/nebo epilepsie (Gloyn 2004). Klinicky se soubor těchto příznaků označuje jako DEND syndrom (Developmental delay, Epilepsy, Neonatal Diabetes), který má několik forem s různým stupněm závažnosti (Gloyn 2004, Hattersley 2005, Proks 2005b). Nejčastější je intermediární genotyp s mírnějším vývojovým opožděním bez časných

24 24 projevll generalizované epilepsie; tato forma je často (Hattersley 2005, Slingerland 2005). asociována s mutací V59M K fenotypovým projevllm PNDM způsobeného mutací KCNJ}} genu patří: (I) hyperglykémie s nutností inzulínové terapie, (2) v některých případech přítomnost ketoacidózy při manifestaci choroby, (3) nízká hladina bazálního a stimulovaného C-peptidu, (4) negativita autoprotilátek proti ostrůvkovým buňkám pankreatu, (5) HLA haplotyp protektivní nebo neutrální z hlediska rizika TI DM, (6) nízká porodní hmotnost (Gloyn 2004, Vaxillaire 2004). Před rokem 2004 byli pacienti léčeni inzulínem a vedeni pod diagnózou TIDM. Prokázání etiologické příčiny otevřelo nové terapeutické možnosti v podobě derivátů sulfonylurey, které stimulují sekreci inzulínu vazbou na SURI podjednotku a uzávěrem K ATP kanálu na ATP nezávislým mechanismem (Gribble 2003). Výsledky recentních studií zaznamenaly zlepšení glykemického profilu řady pacientů s mutací R20 1 H genu KCNJ}} léčených perorálními deriváty sulfonylurey (Klupa 2005, Sagen 2004, Zung 2004). Dle závěrů funkčních studií in vitro závisí pravděpodobně odpověď na terapii na typu mutace (Proks 2004, 2005a, 2005b) SURl Aktivační mutace genu ABCC8 (ATP-binding cassette, subfamily C, member 8), který kóduje SURl podjednotku K ATP kanálu, byla nedávno popsána jako příčina transientního i permanentního neonatálního diabetu (Babenko 2006, Proks 2006). I u těchto pacientů byly v terapii s úspěchem použity deriváty sulfonylurey (Babenko 2006) Glukokináza Homozygotní nebo složená heterozygotní mutace genu GCK kódujícího glukokinázu vede k absolutnímu deficitu genového produktu a k PNDM. K fenotypovým projevům

25 25 patří intrauterinní růstová retardace a závažná hyperglykémie s nutností exogenní dodávky inzulínu krátce po narození (Njolstad 200 1, Njolstad 2003) IPF-l IPF-l je transkripční faktor, který hraje mimo jiné důležitou roli ve vývoji pankreatické tkáně a v regulaci exprese genu pro inzulín. Inaktivační homozygotní nebo složená heterozygotní mutace genu pro IPF-l je asociována se vznikem PNDM a aplázií pankreatu. Stoffers et al (Stoffers 1997b) popsali případ homozygotní inaktivační mutace tohoto genu, která vedla k úplnému deficitu genového produktu a k agenezi pankreatu FOXP3 IPEX syndrom je vzácné autoimunitní onemocnění s X-recesivně vázanou dědičností. Postižení chlapci mají autoimunitní diabetes a/nebo autoimunitní enteropatii již v novorozeneckém nebo kojeneckém věku. K dalším projevům patří exfoliativní dermatitida, hemolytická anémie, autoimunitní thyreopatie, recidivující infekce a membranózní nefropatie. Smrt nastává následkem sepse nebo těžkého neprospívání během prvních dvou let života (Wildin 2002). Podstatou onemocnění je zvýšená aktivace CD4+ T buněk a nadprodukce cytokinů na podkladě mutace genu FOXP 3 (Shigeoka 1993, Wildin 2001). Genový produkt hraje kritickou roli v regulaci vývoje a funkce CD4+CD25+ T buněk, jak se podařilo objasnit na myším modelu (Hori 2003). Diabetes vzniká pravděpodobně jako následek zánětlivé destrukce ostrůvkových buněk pankreatu Wolcottův-R allis onův syndrom Wolcottův-Rallisonův syndrom (WRS) je vzácné autozomálně recesivní onemocnění, které spojuje několik klinických jednotek: PNDM nebo inzulíndependentní diabetes mellitus vzniklý v časném dětství, spondyloepifyzeální dysplazii a růstovou retardaci. Fenotypové projevy jsou variabilní; dále mohou být přitomny

26 26 mentální retardace a různé orgánové dysfunkce (Delepine 2000, Senée 2004). Klinická heterogenita může být vysvětlena genetickou heterogenitou, jej íž podstata není obja s něna v celém rozsahu. Byla popsána asociace WRS s mutací genu pro enzym EIF2AK3 (eukaryotic transjation initiation factor-2a kinase 3) nutný pro regulaci proteosyntézy v endoplazmatickém retikulu (Shi 1998). Expresi EIF2AK3 se podařilo prokázat v lidských fetálních tkáních i tkáních dospělých ledvinách, játrech (Brickwood 2003). lidí: v pankreatu, kostech, PTF-tA Syndrom cerebellární a pankreatické ageneze s PNDM a faciálním dysmorfismem byl popsán u pokrevně příbuzných rodin; poprvé u neobézní pákistánské rodiny (Hoveyda 1999) s familiárním výskytem diabetu a následně u norské rodiny, u které byl následně identifikován defekt genu pro PTF-IA (pancreas transcription factor-i, alpha subunit) (Sellick 2004). Na myším modelu byla prokázána významná role PTFIA ve vývoji pankreatu a mozečku (Sellick 2004). Byla popsána autozomálně recesivní děd i čnost onemocnění (Slingerland 2006a) Autoimunitní PNDM Autoimunitní proces v případě neonatálního diabetu autoimunutního púvodu nastává zřejmě již in utero. V těchto případech bývá asociován s enterovirovou infekcí matky (Otonkoski 2000). 5. DIABETES MELLITUS 2.TYPU V současnosti vlivem narústající prevalence obezity stoupá v některých zemích výskyt T2DM u dětí a adolescentů. I když příslušníci etnických minorit jsou ve větším riziku, problém se týká obézních ze všech etnických skupin. K manifestaci onemocnění dochází obvykle během střední až pozdní puberty. Může se objevit mírná polyurie

27 27 a/nebo polydipsie. Většina pacientů trpí extrémní obezitou a má známky metabolického syndromu s inzulínovou rezistencí, acanthosis nigricans, hypertenzí a poruchou metabolismu lipidů. Dívky mohou mít syndrom polycystických ovarií. V rodinně anamnéze lze často najít příbuzné s T2DM. Klinická symptomatologie ale může být poměrně chudá: jedna třetina dětí s T2DM patřících do minoritních skupin a většina dětí kavkazské populace s T2DM byly zachyceny díky screeningovému vyšetření nepřítomnosti klinických příznaků (Reinehr 2005). při 6. JINÉ FORMY DIABETU K dalším typům diabetu patří diabetes mellitus vyvolaný léky, sekundární diabetes mel! itus při současné endokrinopati i nebo při onemocnění exokrinn ího pankreatu, genetické syndromy asociované s diabetem mellitem a tzv.,jiné raritní formy diabetu mel!itu" (dle klasifikace ADA 2005). 7. STRESOVÁ HYPERGLYKÉMIE Stresová situace (např. akutní infekce, trauma, cirkulační porucha, akutní dechová tíseň, chirurgický zákrok, fyzická námaha, hypotermie, hypertermie) vyvolává komplexní odpověď organismu, která může být dle stupně závažností, trváni a celkového stavu organismu spojena s poruchou glukózové tolerance, inzulínovou rezistencí a hyperglykémií. Mechanismus vzniku hyperglykémie je vysvětlován synergickým účinkem kontraregulačních hormonů (glukagonu, růstového hormonú, katecholaminů, k0l1izolu) a zánětlivých mediátorů na glukózový metabolismus, což vede k následné nerovnováze mezi produkcí a utilizací glukózy. Zejména klesá inhibiční účinek inzulínu na jaterní neoglukogenezi a oslabuje se pozitivní účinek inzulínu na utilizaci glukózy periferními tkáněmi (McCowen 2001, Mizock 2001, Weissman 1990). V důsledku toho narůstá lipolýza a proteolýza a hromadí se laktát jako substrát pro jaterní neoglukogenezi. Ta je zvýšena i při existující hyperglykémii a

28 28 zvýšenou sekreci inzulínu. Posiluje se glykogenolýza a brzdí se glykogeneze (Watt 200 I). Na úrovni periferních tkání dochází k alteraci funkce specifických glukózových transportních systémů a k poruše aktivity některý c h e n zymů (Stephens 1992, Virkamaki 1994, Wolfe 1987). V jedné prospektivní observační studii byla hyperglykémie v souvislostí se stresovou situací nalezena u 5% dětí (41 z 833) akutně ošetřovaných z důvodu traumatu nebo horečnatého onemocnění, zejména pokud bylo komplikovanáho febrilními křečemi a/nebo teplotou nad 39 stupňů (Valerio 200 I). Riziko progrese stresové hyperglykémie do klinického stádia diabetu je podle různých studií velmi variabilní od O do 32% (Bhisitkul 1996, Herskowitz 1988, Herskowitz-Dumont 1993, Shehaden 2001, Schatz 1989, Vardi 1990). Logicky je častější u dětí, u nichž byla stresová hyperglykémie zachycena v průběhu méně závažného onemocnění (Herskowitz-Dumont 1993). Tento údaj naznačuje, že v řadě případů se mohlo jednat o náhodnou koincidenci dlouhodobě probíhající závažné poruchy funkce beta-buňky a akutní zátěžové situace, která vedla k vyšetření glykémie. Z toho vyplývá, že i dítě s tzv. stresovou hyperglykémií je třeba spolehlivě vyšetřit k vyloučení závažné poruchy regulace glykémie. 8. REGULACE GL YKÉMIE - ÚLOHA ll-buňky PANKREATU Metabolismus glukózy je regulován řadou vzájemně propojených mechanismů, které udržují glykémii v úzkém fyziologickém rozmezí. Cílová hodnota glykémie je u zdravých osob blízká 5 mmolll (Matschinsky 1993, Matschinsky (998). Odchylka aktuální glykémie od této hodnoty určuje, zda se momentálně aktivují nhné systémy zapojené do kontroly glukózové homeostázy. Klíčovou roli v regulačním okruhu hraje inzulín najedné straně a glukagon, adrenalin, kortizol a růstový hormon na straně druhé (Cryer 2004, Dimitriadis 2004). Uvolňování těchto hormonli je řízeno buňkami, které mají schopnost detekovat koncentraci glukózy. Zásadní úlohu glukózového senzoru většiny buněk má enzym glukokináza (GCK) (Matschinsky 2006). Detekce koncentrace glukózy probíhá buď přímo (např. v ~-buňkách pankreatu produkujících inzulín) nebo nepřímo (např. v chromafinních buňkách secernujících adrenalin, které jsou

29 29 stimulovány cholinergními neurony řízenými centry autonomního nebo centrálního nervového systému) (Cryer 2004, Matschinsky 2006). Účinky glukagonu, kortizolu a rllstového hormonu jsou pravděpodobně nepřímé. Pankreatické a-buňky produkující glukagon obsahují také GCK (Heimberg (996), ale sekrece glukagonu je pravděpodobně řízena faktory uvolňovanými ~-buňkami pankreatu (Zelent 2006). Ostatní kontraregulační hormony jsou zřejmě pod kontrolou hypothalamických s timulačních a inhibičních neurohormonů (Cryer 2004). V pankreatické ~-buňce je významnou komponentou systému, který reguluje glykémii, cytoplazmatický enzym glukokináza neboli hexokináza IV (GCK) (Matschinsky 1998). GCK reálně pů s obí jako glukózový senzor ~-buňky (Matschinsky (990). Katalyzuje fosforylaci glukózy na glukóza-6-fosfát v přítomno s ti MgATp 2 - jako kofaktoru. Fosforylace glukózy je klíčovým bodem pro další průběh glykolýzy, a proto i velmi malé změny aktivity GCK mění práh pro spuštění glukózou stimulované inzulínové sekrece (Liang 1997). Glukóza se transportuje do nitra buňky prostřednictvím specifického transportního proteinu pro glukózu (GLUT2), který je umístěn na povrchu buňky (Bell (990). Množství glukózy, která vstupuje do buňky, odpovídá aktuální glykémii. V buňce se glukóza metabolizuje. Prvním krokem je fosforylace glukózy glukokinázou na glukóza- 6-fosfát. Konečným krokem je produkce ATP, která vede ke zvýšení poměru ATP/ ADP, což je signálem pro uzávěr K ATP kanálů a následně pro depolarizaci buněčné membrány. Ta otevře napěťově řízené kalciové kanály a umožní tím vstup extracelulárního kalcia do buňky (Agui1ar-Bryan 1999). Zvýšení intracelulární koncentrace kalcia spouští fúzi sekrečních granul obsahujících inzulín s cytoplazmatickou membránou a následnou exocytózu inzulínu (Seino 1999).

30 30 II. Praktická část 9. Náhodně zjištěná hyperglykémie Formou retrospektivně-prospektivní studie jsme v období od ledna 1998 do prosince 2004 provedli analýzu dat a vyšetření 82 dětí a adolescentů odeslaných pediatry, dětskými endokrinology a dětskými nemocničními odděleními pro náhodně zjištěnou hyperglykémii. Do studie byly zařazeny děti, které splňovaly následující kritéria: asymptomatická hyperglykémie nalačno nepřítomnost obezity (BMl < 97. percentil pro daný věk a pohlaví) nepřítomnost rizikových faktorů pro rozvoj poruchy glukózové tolerance (obezita, syndrom polycystických ovarií, jiná známá endokrinopatie, steroidní terapie) etnický původ v kavkazské populaci. Z pětně byla posouzena dokumentace pacientů s cílem zjistit prediktivní data pro manifestaci diabetu, byla provedena metabolická a molekulárně-genetická vyšetření. Metabolické vyšetření zahrnovalo základní biochemické vyšetření (hodnoty glykémie, inzulínu ac-peptidu nalačno, HbA1c) a dynamické testy na zjištění poruchy glukózové tolerance a inzulínové sekrece (OGTT, 1VGTT). Během prospektivní fáze studie v průměrné délce trvání 3,9 let (0,7 až 6,9 let) byl sledován vývoj klinických a biochemických parametrů v čase. Molekulárně-genetické vyšetření bylo zaměřeno na hledání mutací a polymorfismů v již známých genech způsobujících diabetes MODY a PNDM. Při indikaci genové analýzy jsme vycházeli z publikovaných údajů o prevalenci jednotlivých mutací v evropské a české populaci (Gloyn 2004, Průhová 2003). Vyšetřili jsme následující geny: HNF4A, GCK, HNFIA/TCFl, KCNJJ J.

31 31 Kladli jsme si za cíl zjistit etiologii, stanovit prevalenci a zhodnotit V)lvoj jednotlivých poruch, ověřit diagnostický postup a výpovědní hodnotu IVGTT a na základě získaných výsledků stanovit diagnostická kritéria, která by umožnila co nejpřesnější stanovení diagnózy a tím i zahájení co nejvhodnější léčby již na počátku onemocnění. Studie byla realizována na základě spolupráce Kliniky dětí a dorostu UK-3. LF a FNKV v Praze, Oddělení buněčné a molekulární biologie UK-3. LF UK v Praze a Steno Diabetes Center and Hagedorn Research Institute v Dánsku.

32 Článek 1 Feigerlová E, Průhová Š, Pintérová D, Kološtová K, Černá M, Lebl J (2005) Intravenózní glukózový toleranční test v diferenciální diagnostice náhodně zjištěné hyperglykémie u dětí a dospívajících. Česko-slovenská pediatrie 60: Intravenózní glukózový toleranční test v diferenciální diagnostice náhodně zjištěné hyperglykémie u dětí a dospívajících I Klinika dětí a dorostu UK-3.LF a FN Královské Vinohrady, Praha přednosta prof. MUDr. 1. Lebl, CSc. 2 0ddělení buněčné a molekulární biologie UK-3.LF, Praha vedoucí doc. RNDr. 1. Kovář, DrSc. Souhrn Cíl: Při náhodném záchytu hyperglykémie u dítěte či dospívajícího s normálním BMI je zapotřebí odlišit pacienty s časnou fází diabetu mellitu 1. typu (Tl DM), s některým podtypem diabetu MODY a jedince bez prokazatelné poruchy metabolismu glukózy. Cílem studie bylo posoudit validitu intravenózního glukózového tolerančního testu (LVGTT) jako jediného vyšetření při zvýšené glykémie. iniciálním posouzení příčiny náhodně zjištěné Soubor a metodika: Pro náhodný záchyt hyperglykémie (definované jako plazmatická hladina glukózy na lačno vyšší než 5,4 mmolll) bylo vyšetřeno 43 dětí a dospívajících (24 chlapců) ve věku 2,7-18,5 let (medián 13,1) s normálním BMl pro daný věk a pohlaví. U všech byl proveden IVGTT (glukóza 0,5 g/kg tělesné hmotnosti). Byla vyhodnocena glykémie v čase O a 60 minut a hladiny inzulínu a C-peptidu v čase O

33 33 (lačná hodnota), 1+3 minut (první fáze inzulínové sekrece; FPIR) a 60 minut (druhá fáze inzu línové sekrece; SPIR). Podle dalšího průběhu a výsledku moleku lárněgenetického vyšetření byli pacienti rozděleni do tří diagnostických skupin: I. časná fáze TIDM; 2. MODY2; 3. normální glukózová tolerance (NGT). Výsledky: FPlR 26 mluii a nižší je příznačná pro presymptomatickou fázi TIDM (senzitivita 100 %, specificita 98 %), a to v celé sledované věkové skupině (věk 2,7 roků a vyšší) bez ohledu na stáří a stupeň pubertálního vývoje. FPIR se mezi NGT a MODY2 neliší. Při FPIR 26 miu/i a vyšší je nejspolehlivější hodnotou pro odlišení MODY2 a NGT glykémie nalačno (v čase O). Hladiny nad 5,3 mmoll l svědčí pro MODY2 (senzitivita 97 %, specificita 100 %). Diagnózu MODY2 následně potvrdí molekulárně-genetické vyšetření. Ostatní hodnoty z průběhu IVGTT maj í pouze doplňkový význam. Závěr: rvgtt je velmi spolehlivou metodou pro odlišení nejčastějších příčin náhodně zjištěné pohlaví. Klíčová glukózový toleranční hyperglykémie u dětí a adolescentů s normálním BMI pro daný věk a slova: FPIR (první fáze inzulínové sekrece), IVGTT (intravenózní (diabetes mellitus 1. typu) test), MODY (maturity onset diabetes of the young ), Tl DM Náhodný záchyt asymptomatické hyperglykémie u dětí a dospívajících může předcházet rozvoji klinických symptomů diabetu mellitu. Proto je zapotřebí každému takovému nálezu věnovat pozornost a pokusit se o přesné určení typu a tíže poruchy. Diabetes mellitus je heterogenní onemocnění sdružující skupinu poruch s rozdílnou patogenezí, průběhem a odpovědí na léčbu [2]. Společnou charakteristikou těchto poruch jsou funkční abnormality ~-buněk pankreatických ostrůvků [4, 10, ll], které se mohou objevit v prúběhu patogeneze procesu i několik let před klinickou manifestací choroby. Podmínkou pro možnou intervenci již v tomto stádiu je jejich včasné rozpoznání, k čemuž lze využít intravenózní glukózový toleranční test (IVGTT).

34 34 lvgtt je stimulační test, který umožňuje in vivo stanovit bifázickou odpověď ~ buněk pankreatických ostrůvků v uvolňování inzulínu na intravenózní podání glukózyprvní a druhou fázi stimulované inzulínové sekrece [8]. Tuto bifázickou odpověď nelze prokázat orálním glukózovým tolerančním testem (OGTT). První fáze stimulované inzulínové sekrece (first phase insulin release; FPIR) je charakterizována rychlým uvolněním již nasyntetizovaného inzulínu z granul uložených v blízkosti plazmatické membrány ~-buněk [7]. Porucha FPIR je jednou z nejčasněji detekovatelných změn u jedinců v subklinické fázi diabetu mellitu I. typu (TlDM) i diabetu mellitu 2. typu (T2DM) [15, 23]. V následující druhé fázi stimulované inzulínové sekrece (second phase insulin release; SPIR) dochází k postupnému uvolňování inzulínu z granul ~ buněk. Druhá fáze inzulínové sekrece bývá relativně dobře zachována u pacientů s T2DM, zatímco u pacientů s Tl DM tato odpověď ~-buněk chybí, jak dokládaj í výsledky studi í na dospělé populaci diabetických pacientů [20]. Další předností intravenózního přístupu je eliminace variability absorpce glukózy z gastrointestinálního traktu, která komplikuje hodnocení OGTT při střevních chorobách. Naopak při IVGTT je vyloučen vliv enterohormonů na inzulínovou sekreci [14].V literatuře dosud chybějí údaje o diagnostickém přínosu IVGTT u diabetu typu MODY, který podle recentních pozorování může představovat poměrně významný podíl pacientů s náhodně zjištěnou hyperglykémií. Diabetes MODY (maturity onset diabetes of the young; "dospělá" forma diabetu u mladých) je monogenně podmíněná forma diabetu mellitu. Pro onemocnění je příznačný mladý věk při manifestaci, (před 25. rokem života), familiární výskyt s autozomálně dominantní dědičností a vysokou penetrancí (až 90%), nezávislost na inzulínu nejméně 2 roky od diagnózy, žádná tendence ke ketoacidóze a nepřítomnost autoimunitních projevů [21, 24]. Fenotypové projevy jsou spojeny s poruchou sekrece inzulínu; inzulínová senzitivita je u těchto pacientů normální [9]. MODY diabetes je geneticky heterogenní. V současné době je popsáno 6 podtypů, označených MODY1-MODY6. MODY2 je způsoben mutací v genu pro glukokinázu (GCK), enzym důležitý pro fosforylaci glukózy v (3-buňce. Projevuje se mírnou hyperglykémií od narození do stáří bez tendence k progresi a nemá klinické příznaky. Věk při diagnóze proto závisí na tom,

35 35 kdy poprvé byla u daného jedince změřena glykémie. Právě proto je diferenciálně diagnosticky tak důležitý v dětském věku. Porucha je zřejmě benigní, riziko pozdních komplikací diabetu není žádné nebo je velmi nízké (12). MODY I, 3, 4, 5 a 6 jsou vyvolány defektem některého z genů pro transkripční faktory, nezbytné pro normální funkci r3-buněk. Tento "diabetes transkripčních faktorů" se projevuje nejčastěji v pozdní pubertě nebo časné dospělosti, je pro něj příznačný nepříznivý průběh s progresivně se zhoršující tolerancí glukózy a rizikem pozdních diabetických komplikací. Cílem této studie bylo stanovit výpovědní hodnotu IVGTT testu jako jednoho z prvních vyšetření při diferenciální diagnostice u náhodně zjištěné hraniční hyperglykémie nad 5,4 mmol/i u dětí a dospívajících s normálním BMI pro daný věk a pohlaví. Soubor a metodika Soubor pacientů Do studie bylo zařazeno 43 dětí a dospívajících (24 chlapců) ve věku od 2,7 do 18,5 let (medián 13,1), odeslaných k vyšetření pro náhodně zachycenou hyperglykémii v období od ledna 1997 do ledna Všichni pacienti byli vyšetřeni na Klinice dětí a dorostu 3.LF UK a FNKV v Praze v časovém období do 3 měsíců od prvního záchytu hyperglykémie. Podmínkou pro zařazení do studie bylo splnění následujících kritérií: glykémie nalačno vyšší než 5,4 mmolll podle vyšetření vzorku žilní krve v laboratoři klinické biochemie, zachycená náhodně za bazálních podmínek či během zátěžové situace v prllběhu akutně probíhaj ícího onemocnění; nepřítomnost rizikových faktorů pro rozvoj poruchy glukózové tolerance (obezita, syndrom polycystických ovarií, jiná známá endokrinopatie, steroidní terapie) body-mass index [hmotnost/(výška)2; BMI] < 97. percentil pro daný věk a pohlaví.

36 36 Rozdělení do diagnostických skupin Následné rozdělení vyšetřovaných osob do diagnostických skupin bylo provedeno na základě klinického průběhu (známky ketoacidózy, závislost na léčbě inzulínem), rozboru rodinné anamnézy a molekulárně-genetického vyšetření. U 22 pacientli (věk od 4,5 do 18,5 let, medián 13,5) byl prokázán defekt v genu pro glukokinázu (MODY2). Vyšetření bylo provedeno dříve popsanou metodikou [16]. Bylo zjištěno celkem 13 různých genových mutací: Arg36Trp, Glu40Lys, Gly44Asp, Phel50Leu, Glu 157Lys, Cys220Stop, Va1226Met, Glu260Stop, Gly294Asp, Gly318Arg, Phe419Leu, Cys434Tyr, Ala454Glu. U všech těchto pacientů byla následně cíleným vyšetřením zjištěna pozitivní rodinná anamnéza stejného typu poruchy. U 8 pacientů (věk od 4,3 do 14,5 let, medián 13,3) byl prokázán T1DM. U těchto pacientů byl negativní nález při vy š etření MODY genů. U všech došlo nejdéle do 2 let od prvního záchytu asymptomatické hyperglykémie k závislosti na léčbě inzulínem v dávce větší než 0,5 IU/kg/den. U I3 dětí a dospívajících (věk od 2,7 do 17,4 let, medián 11,6) byla prokázána normální glukózová tolerance, nebyly zjištěny projevy Tl DM a nebyly nalezeny mutace v MODY genech. U těchto pacientů se jednalo zřejmě o zcela ojedinělý nález mírné hyperglykémie, který nebyl projevem metabolického onemocnění. U žádného z pacientů s náhodně zachycenou hyperglykémií nebyla molekulárněgenetickým vyšetřením zjištěna I, 3, 4, 5 a 6). některá z forem diabetu transkripčních faktorů (MODY Protokol intravenózního glukózového tolerančního testu (IVGTT) Postupovali jsme podle standardního protokolu [5]. Nejméně tři dny před testem pacienti dostávali běžnou stravu bez omezení přívodu sacharidů. V den před testem nebyli vystaveni nadměrné fyzické aktivitě. Kontraindikací testu bylo akutně probíhající onemocnění a aplikace léků potenciálně způsobujících hyperglykémii. Test byl zahájen po hodinovém lačnění mezi 8. a 9. hodinou ráno zavedením dvou intravenózních kanyl do předloketních žil pravé a levé horní končetiny. Z jedné kanyly byly provedeny odběry bazálních vzorkú na stanovení inzulínu, C-peptidu a glykémie. Do druhé kanyly

37 37 byla aplikována glukóza v dávce 0,5 g/kg těles n é hmotnosti (maximum 35 g) ve formě 40 % roztoku rovnoměrnou i.v. injekcí po dobu 3 m inut +/- 15 sekund. Konec aplikace glukózy byl považován za O. minutu testu. Krevní vzorky na stanovení inzulínu, C peptidu a glykémie byly odebrány v 1., 3., 5., 10., 30. a 60. minutě testu ze žíly, z níž byly provedeny nativní odběry. Byla vyhodnocena glykémie v čase O a 60 minut, hladiny inzulínu a C-peptidu v čase O (lačná hodnota), 1+3 minut (FPIR) a v čase 60 minut (SPIR). Hladiny inzulínu byly vyjádřeny v miu/i, hladiny C-peptidu v pmol/ I. Laboratorní diagnostické metody Všechny krevní vzorky byly analyzovány na Oddělení klinické biochemie a imunochemie FNKV v Praze v den odběru. Hladina krevní glukózy byla stanovena enzymatickou hexokinázovou metodou za použití automatického analyzátoru Kanelab 60 firmy VIAN. C-peptid a inzulín byly analyzovány chemiluminiscentní imunometrickou technikou pomocí komerčních setů lmmulite 2000 C-peptid a lmmulite 2000 lnsulin firmy DPC, Los Angeles, CA, USA. Statistická analýza Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr +/- SEM. Ke zpracování dat byl použit statistický program GraphPad Prism, verze Rozdíly mezi všemi sledovanými skupinami byly stanoveny analýzou rozptylu one-way ANOV A. Rozdíly mezi jednotlivými dvěma skupinami byly stanoveny nepárovým Hestem. Hladina p<0,05 byla považována za statisticky významnou. Etika Studie byla schválena Etickou komisí 3.LF UK. Pacienti a/nebo jejich zákonní zástupci podepsali informovaný souhlas s odběrem a vyšetřením DNA.

38 38 Výsledky Tabulky 1 a 2 shrnují výsledné hladiny glykémie, inzulínu a C-peptidu v průběhu rvgtt. Porovnání jednotlivých parametrů znázorňují grafy 1 až 4. Výsledky ukázaly, že pacienti s MODY2 a Tl DM mají vyšší gjykémii nalačno než jedinci s normální glukózovou tolerancí (NGT) (p=0,0002) (tab. 1, graf 1). Rovněž glykémie v 60. minutě testu je významně nižší ve skupině NGT ve srovnání s ostatními pacienty (p<o.oool) (graf 2). FPIR II skupiny dětí s TIDM je významně nižší než u skupin MODY2 a NGT (p=0,002). Rozdíly v FPlR mezi skupinami NGT a MODY2 nejsou v)'znamné (tab. I, graf 4). SPIR je ve všech skupinách srovnatelná (tab. 2). Podrobnější analýzy ukázaly, že pohlaví a stupeň pubertálního vývoje významně neovlivňují ani FPIR, ani ostatní hodnocené parametry lvgtt (výsledky k dispozici u autorů). Na základě analýzy rozptylu jednotlivých hodnot lze konstatovat, že: 1. Hodnota FPIR 26 mlu/1 a nižší je příznačná pro presymptomatickou fázi ndm (senzitivita 100 %, specificita 98 %), a to v celé sledované věkové skupině (věk 2,7 let a vyšší) bez ohledu na stáří a stupeň pubertálního vývoje; 2. FPrR se mezi NGT a MODY2 neliší. Při FPIR 26 mlu/1 a vyšší je nejspolehlivější hodnotou pro odlišení MODY2 a NGT glykémie nalačno (v čase O). Hladiny nad 5,3 mmo!!1 svědčí pro MODY2 (senzitivita 97 %, specificita 100 %). Diagnózu MODY2 následně potvrdí molekulárně-genetické vyšetření; 3. Ostatní hodnoty z průběhu lvgtt mají pouze doplňkový význam. Diskuse Při náhodně zjištěné mírné hyperglykémii u dětí a adolescentů s normálním BMl je nutné uvažovat zejména o dvou nozojogických jednotkách se zásadně odlišnou prognózou - o presymptomatické fázi diabetu mellitu 1. typu a o MODY2 - defektu glukokinázy. Presymptomatická fáze Tl DM je obdobím před klinickou manifestací choroby. Je charakterizována probíhající destrukcí inzulín produkujících l3-buněk pankreatu

39 39 autoimunitním procesem. Již v této fázi lze získat informace o pokročilosti patofyziologických pochodů pomocí ukazatelú im unitních (protilátky proti strukturám ~-buněk) a metabolických (porucha FPIR). Po určité době dochází k rozvoji diabetu s plnou závislostí na inzulínu. Pro pacienty je včasné rozpoznání diagnózy a zahájení inzulínové léčby zásadním přínosem, protože předejde klinické manifestaci diabetu s rizikem diabetické ketoacidózy. MODY2 je evidentně nejčastější příčinou náhodně zjištěné hyperglykémie u dětí a dospívajících. Správné zařazení této metabolické odchylky a jej í potvrzení molekulárněgenetickým vyšetřením je pro pacienta jednoznačně dobrou zprávou. Jedná se o stav benigní, bez sklonu k progresi a zřejmě bez rizika komplikací. Léčba není nutná, ani dietní opatření či jiná adjuvantní terapie zřejmě nemůže glykémii při MODY2 ovlivnit. Pacienta je třeba vybavit jednoznačným diagnostickým závěrem, abychom jej pro budoucnost uchránili před zbytečným metabolickým vyšetřováním při dalším záchytu mírné hyperglykémie. Další podtypy MODY diabetu ("diabetes transkripčních faktorů") se v dětském věku manifestují méně často. Jsou typické spíše pro postpubertální a časný dospělý věk [22]. Mezi pacienty s náhodně zjištěnou hyperglykémií jsme jejich výskyt nezaznamenali. U části vyšetřovaných osob jsme při podrobném vyšetření a dalším sledování neprokázali žádnou poruchu metabolismu glukózy. Můžeme jen spekulovat o tom, zda se u nich jednalo o ojedinělou stresovou hyperglykémii, o postprandiální odběr či o laboratorní omyl. Málo pravděpodobná, ale přesto možná je i alternativa, že se latentní poruchu pouze nezdařilo detailním vyšetřením rozpoznat a klasifikovat. Vliv stádia pubertálního vývoje na interpretaci výsledků IVOTf Je často diskutovanou otázkou. Řada studií publikovaných v 80. a 90. letech minulého století prokázala závislost hodnocení výsledků IVOTf u dětí na stádiu pubertálního vývoje [19]. Byly pozorovány vyšší hladiny inzulínu jako odpověď [3-buněk na stimulaci v průběhu IVOTf v pozdní pubertě než u prepubertálních dětí, a to u obou pohlaví nezávisle na glykémii (1, 13, 17, 18, 19). Příčinou by mohla být změna inzulínové rezistence, která se zvyšuje od dětství do pozdní puberty a následně klesá v průběhu časného dospělého věku [3, 6, 18]. V našem souboru sledovaných pacientů jsme zásadní vliv pohlaví a stádia pubertálního vývoje na hodnocení IVOTf neprokázali.

40 40 Při hodnocení SPIR jsme vycházeli z předpok l ad u, že u pacientů s MODY2 a u dětí s normální glukózovou tolerancí je tato hodnota r e la t iv ně zachována, zatímco u pacientů s T I DM by měla být snížena. Ukázalo se však, že SPIR diagnostické zpřesnění nepřináší. Hladiny inzulínu a C-peptidu v 60. minutě testu se mezi jednotlivými skupinami významně nelišily. Hodnocení druhé fáze odpovědi ~-buněk na stimulaci glukózou může mít své opodstatnění u pacientů s diabetem mellitem 2. typu (T2DM), kde lze předpokládat určitý stupeň inzulínové rezistence projevuj ící se laboratorně hyperinzulínémií. S projevy T2DM v pediatrickém věku se však setkáváme prakticky výlučně u pacientů s rizikovými faktory pro rozvoj inzulínové rezistence (masivní obezitou, steroidní terapií). Naše studie prokázala, že hlavním diagnostickým úkolem při náhodně zjištěné hyperglykémii u neobézních dětí a dospívajících je odlišení presymptomatické fáze T I DM, diabetu MODY2 a jedinců bez prokazatelné poruchy metabolismu glukózy. Jako spolehlivou metodu k časnému odlišení těchto stavů lze využít IVGTT. Při FPIR 26 miu/1 a vyšší je nejspolehlivější hodnotou pro odlišení MODY2 a NGT glykémie nalačno (v čase O). Diagnózu MODY2 následně potvrdí molekulárně-genetické vyšetření. Poděkování Provedení studie bylo podpořeno grantem IGA MZ ČR NB/ Molekulárněgenetická vyšetření byla provedena v součinnosti se Steno Diabetes Center and Hagedorn Research Institute, Gentofte, Dánsko. Naše poděkování patří Francové za praktické provádění IVGTT. i paní Heleně Literatura I. Allen, H. F., Jeffers, B. W., Klingensmith, G. 1., Chase, H. P. First-phase insulin release in normal children. J. Paediatr., 1993, roč. 123, Č. 5, s

41 41 2. American Diabetes Association. Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus. Diabetes Care, 2004, roč. 27, Suppl. 1, s. S5-S9. 3. Amiel, S. A, Sherwin, R. S., Simonson, D. c., Lauritano, A. A., Tamborlane, W. V. Impaired insulin action in puberty. A contributing factor to poor glycemic control 10 adolescents with diabetes. New Eng/. J. Med., 1986, 315, s Atkinson, M.A, Maclaren, N. K. The pathogenesis of insulin-dependent diabetes. New Eng/. J. Med., 1994,331, s Bingley, P. J., Colman, P., Eisenbarth, G. S., Jackson, R. A, McCulloch, D. K., Riley, W. J. and Gale, W. J. Standardization of IVGTT to predict 100M. Diabetes Care, 1992, roč. 15, č. 10, s Bloch, C. A., Clemons, P., Sperling, M. A. Puberty decreases insulin sensitivity. J. Pediatr., 1987, 110, s Daniel, S., Noda, M., Straub, S. G., Sharp, G. W. ldentification of the docked granule pocl responsible for the first phase of glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes, 1999, 48, s DeFronzo, R. A., Bonadonna, R. c., Ferrannini, E. Pathogenesis of NIDDM: a precarious balance between insulin action and insulin secretion. In Alberti K.G. M. M., DeFronzo, F. A., Keen, H., Zimmet, P., eds. lnternational Textbook of Diabetes Mellitus. New York: Wiley, 1992, s Fajans, S. S., Bell, G. 1., Polonsky, K. S. Molecular mechanisms and clinical pathophysiology ofmaturity-onset diabetes ofthe young. New Eng!. J. Med., 2001,345, s John, E. G. ls reduced first-phase insulin release the earliest detectable abnormality in individuals destined to develop type 2 diabetes? Diabetes, 2002,51, s. S117-S121. ll. Kahn, S. E. The importance of the f3-cell in the pathogenesis of type 2 diabetes mell itus. Amer. J. Med., 2000, 108, Supp/. 6a, s. 2S-8S. 12. Lebl, J., Průhová, Š. Diferenciální diagnostika hyperglykémie. In Lebl, J., Zapletalová, J., Koloušková, S. Dětská endokrinologie. 1. vyd. Praha: Galén, 2004, s Lorini, R., Vanelli, M. Normal values of first-phase insulin response to intravenolls glucose in healthy Italian children and adolescents. The Prediabetes Study Group ofthe

42 42 Italian Society for Pediatric Endocrinology and Diabetology (SIEDP). 1. Pediatr. Endocrino!. Metab., 1996, roč. 9, č.2, s Masopust, J. Poruchy intermediárního metabolismu. ln Masopust, 1. Klinická biochemie. 1. vyd. Praha: Karolinum, 1998, s Porte, D. 1. Banting lecture Beta cells in type 2 diabetes melllitus. Diabetes, 1991,4~ s Prl'lhová, Š., Ek, 1., Lebl, 1., Šumník, Z., Saudek, F., Anděl, M., Pedersen, O., Hansen, T. Genetic epidemiology of MODY in the Czech republic: new mutations in the MODY genes HNF-4a, GCK and HNF-Ia. Diabetologia, 2003, 46, s Smith, C. P., Archibald, H. R., Thomas, 1. M., Tarn, A. c., Williams, A. J. K., Gale, E. A. M., Sabate, M. O. Basal and stimulated insulin levels rise with advancing puberty. Clin. Endocrinol., 1988,28, s Smith, C. P., Williams, A. 1. K., Thomas, J. M., Archibald, H. R., AIgar, V. O., Bottazzo, G. F., Gale, E. A.. M., Sabate, M. O. The pattern of basa I and stimulated insulin response to intravenous glucose in first degree relatives of Type I (insulindependent) diabetic children and unrelated adults aged 5 to 50 years. Diabetologia, 1988,31, s Srikanta, S., Ganda, O. P., Gleason, R. E., Jackson, R. A., Soeldner, 1. S., Eisenbarth, G. S. Pre-type I diabetes. Linear loss of beta cell response to intravenous glucose. Diabetes, 1984,33, s Tankova, T., Dakovska, L., Kirilov, G., Koev, D. Intravenous glucose tolerance test and anti-gad65 antibodies in the diagnosis of the type of diabetes mellitus. Pract. Diab. lnt., 2003, 20, s Velho, G. Le diabete MODY en pratique. Quand y penser? Pourquoi y penser? Ann. Endocrinol., 2003, roč. 64, čís. 3, Supp\., s. ls17-is2i. 22. Velho, G., Robert, J-J. Maturity-Onset Diabetes of the YOllng (MODY): Genetic and clinical characteristics. Horm. Res., 2002,57, Supp!., s Wallum, B. J., Kahn, S. E., McCulloch, D. K., et al. lnslllin secretion in the normal and diabetic human. In Alberti K. G. M. M., DeFronzo, F. A., Keen, H., Zim met, P., eds. lnternational textbook ofdiabetes Mellitus. New York: Wiley, 1992, s I. 24. Winter, W. E. Newly defined Genetic Diabetes Syndromes: Maturity Onset Diabetes of the Young. Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders, 2003, 4, s

43 43 Tabulka 1. Hladiny glukózy, C-peptidu, inzulínu v průběhu JVGTT. parametr: glykémie glykémie 60 inzulín inzulín minuta: O O 1+3 (FPIR) TlDM 5,8 ± 0,7 10,1 ± 1, 1 7,6 ± 1,5 13,9 ± 2,3 (n=8) (4,1-7,4) (7,5-12,7) (4, 1-11,1) (8,3-19,4) (4,3-14,5 let) MODY2 6,2 ± 0,2 8,3 ± 0,5 10,2 ± 1,4 127 ± 17 (n=22) (5,8-6,5) (7,3-9,3) (7,4-13,1) (91-163) (4,5-18,5 let) NGT 4,5 ± 0,1 # 5,0 ± 0,4 6,6 ± 0,9 116 ± 21 * (n= 13) (4,2-4,8) (4,2-5,8) (4,7-8,6) ( ) (2,7-17,4 let) p (one-way 0,0002 <0,0001 n.s. 0,002 ANO VA) C-peptid # p < 0, porovnáno s MODY2 (nepárový t-test) * p = n.s. - porovnáno s MODY2 (nepárový t-test). Hodnoty jsou vyjádřeny jako prllměr +/- SEM (v závorce interval 95% spolehlivosti); glykémie v mmol/i, inzulín v miu/i, C-peptid v pmol/i. O 516 ± 68 ( ) 566 ± 56 ( ) 495 ± 61 ( ) n.s. C-peptid ± 91 ( ) 3135 ± 275 ( ) 2907 ± 253 ( ) <0,0001 Tabulka 2. Druhá fáze inzulínové sekrece (SP JR) v pn/běhu JVGTT parametr: inzulín C-peptid minuta: 60 (SPIR) 60 TIDM 17,0 ± 3,0 925 ± 83 (n=8) (4,3-14,5 let) (5,0-3 2,0) ( ) MODY2 19,6 ± 7, ± 289 (n=14) (4,5-18,5 let) (5,6-110,0) ( ) NGT 16,5 ± 3, ± 153 (n=lo) (2,7-17,4 let) (2,0-47,0) ( ) p (one-way ANOVA) n.s. n.s. Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr +/- SEM (v závorce interval 95% spolehlivosti); inzulín v miu/i, C-peptid v pmol/i.

44 44 i.v.gtt: glykémie O min B o 7 g 6..:c. Cll 'E 4 'Cll.:.t! 3 e,._. E.....?:- Cl 2 o T 1DM MODY2 Graf J. Glykémie v čase O minul na počátku IVGTI. Pacienti s MODY2 a TIDM mají vyšší glykémii nalačno než jedi nci s normální glukózovou tolerancí (NGT). Cll E 'Cll.:.t!.?:- Cl 14 i.v.gtt: glykémie 60 min. II I.i": Graf 2. Glykémie v čase 60 minut IVGTT. Gl ykém ie v 60. minut ě testu je v)'znamně ni žš í ve s kupině NGT ve srovnán í s ostatními pacienty ::; E 15 i.v.gtt: inzulin O min. p=n.s. (ANOV A) ~ 10 N. E..- 5.:. T1DM NGT MODY2 Graf 3. Hladiny inzulinu v čase O minut na počátku IVGTT. Rozdíly mezi skupinami nej sou významné. 350 i.v.gtt: FP IR (inzulin 1+3 min.) 300 p=o,002 (ANOV A) e- 250 ~ E ~ ~ ::J N. E o T1DM NGT MODY2 Graf 4. Hladiny inzu línu v čas e 1+3 minut (FPIR) v průběhu IVGTT. FPIR u skupiny dět í s Tl DM je vý z namn ě ni žší než u skupin MODY2 a NGT. Rozdíly v FPIR mezi skupinami NGT a MODY2 nejsou významné.

45 45 Dophlující poznámky Výsledky této studie ukazují, že FPlR jsou relativně spolehlivým parametrem v rozlišení nejčastějších příčin (TIDM a MODY2) náhodně zjištěné hyperglykémie u neobézních dětí a adolescentů. Hodnota FPIR rovna a nižší než 26 mlu/i je příznačná pro presymptomatickou fázi Tl DM. Literární údaje uvádějí vliv věku a pubertálního vývoje na hodnotu FPJR (Allen 1993, Lorini 1996, Smith 1988a, Srikanta 1984). V naší skupině pacientů jsme vliv stádia pubertálního vývoje na hodnotu FPIR nezaznamenali; nicméně vel ikost a složení souboru nám nedovolují spolehlivě tento parametr posoudit. Věkový rozptyl analyzovaných dětí je široký, mladší věkové kategorie jsou však zastoupeny v malém počtu (5 dětí ze 43, tj. 12 %). Statisticky významný rozdíl ve věkovém složení jednotlivých diagnostických podskupin jsme nepozorovali.

46 Článek 2 Feigerlova E, Pruhova S, Ditlertova L, Pinterova D, Kolostova K, Cerna AI, Pedersen 0, Hansen T, Lebl J (2006) Aetiological heterogeneity oj asymptomatic hyperglycaemia in children and adolescents. Eur J Pediatr 165: Aetiological heterogeneity of asymptomatic hyperglycaemia in children and adolescents E. Feigerlová', Š. Pruhová', L. Dittertová', J. Lebl', D. Pinterová 2, K. Kološtová 2, M. Černá 2, o. Pedersen 3, T. Hansen 3., Department ofpaediatrics, 3 rd Faculty ofmedicine, Charles University Prague, Czech Republic 2 Department of Cellular and Molecular Biology, 3 rd Faculty of Medicine, Charles University Prague, Czech Republic 3 Steno Diabetes Centre and Hagedorn Research Institute, Gentofte, Denmark Received: 16 December 2005 / Revised: 3 February 2006 / Accepted: 6 February 2006 Corresponding author: Dr. Jan Lebl, Department oj Paediatrics, 2 nd Faculty oj Medicine Charles University, Vinohradska 159, Prague 10, Czech Republic, CZ lebl@fnkv.cz Abstract Introduction: Randomly estimated fasting hyperglycaemia in an asymptomatic individual may represent the first sign of pancreatic ~-cell dysfunction. Objective: We aimed at specifying the genetic aetiology of asymptomatic hyperglycaemia in a cohort of children and adolescents.

47 47 Subjects and methuds: We analysed the aetiological diagnosis in 82 non-obese paediatric subjects (38 males) aged years (median: 13.1) who were referred for elucidation of a randomly found blood glucose level above 5.5 mmol/i. ln addition to fasting glycaemia and circulating levels of insulin and C-peptide, the sllbjects were tested by an oral glucose tolerance test and an intravenous glucose tolerance test and screened for mutations in the genes encoding glucokinase (GCA..j, HNF-la (TCF]), Kir6.2 (KCN.JJ 1) (if aged < 2 years) and HNF-4a (HNF4A) (those with a positive family history of diabetes). Results and discussion: We identified 35 carriers of GCK mutations causing MODY2, two carriers of TCF1 mutations callsing MODY3, one carrier of a HNF4A mutation causing MODY 1 and one carrier of a KCNJ11 mutation causing permanent neonatal diabetes mellitus. Of the remaining patients, II progressed to type 1 diabetes mellitus (Tl DM) and 9 had impaired glucose tolerance or diabetes mellitus of unknown origin. In 23 subjects, an impairment of blood glucose levels was not confirmed. We conclude that 39 of 82 paediatric patients (48%) with randomly found fasting hyperglycaemia suffered from single gene defect conditions, MODY2 being the most prevalent. An additional II patients (13%) progressed to overt Tl DM. The aetiological diagnosis in asymptomatic hyperglycaemic children and adolescents is a clue to introducing an early and effective therapy or, in MODY2, to preventing any future extensive re-investigations. Keywords: hyperglycaemia, genetics, children, MODY, type I diabetes mellitus, permanent neonatal diabetes mellitus Abbreviations: FPIR: first-phase insulin release; GCK: glucokinase; GCK: gene encoding glucokinase; HbA 1c : glycosylated hemoglobin; HNF-Ia: hepatocyte nucjear factor-ia; HNF4A: gene encoding HNF-4a ; HNF-4a: hepatocyte nllclear factor-4a; HNF-l: hepatocyte nuclear factor-l; IGT/DM: impaired glucose tolerance/diabetes mellitus; IPF-I: inslllin promotor factor; IVGTT: intravenous glucose tolerance test; KCNJ11: gene encoding Kir6.2; Kir6.2: inwardly rectifying K+ channel subunit; MODY: Maturity-onset diabetes of the young; NGT: normal glucose tolerance; OGTT:

48 48 oral glucose tolerance test; PND: permanent neonatal diabetes mellitus; SDS: standard deviation score; TIDM: type 1 diabetes mellitus; TCF]: gene encoding HNF-la. IntroductioD For decades, the diagnosis of paediatric diabetes mellitus has being considered trivia\. In the majority of patients, suggestive symptoms of recent polyuria, polydipsia and weight loss, in some cases associated with ketoacidosis, clear\y indicate the need for blood glucose measurement to establish the diagnosis of type 1 diabetes mellitus (TI DM). However, an unexpected finding of elevated blood glucose may arise from a random measurement in children without typica! symptom s of diabetes, while elaborating various medical conditions; in others, a positive dipstick test for glycosuria may have led to a subsequent estimation of hyperglycaemia. As these children may suffer from presymptomatic progressive pancreatic ~-cell effective diagnostic action is required. dysfunction, a rapid and Maturity-onset diabetes of the young (MODY) is a family of monogenic forms of impaired ~-cell function. The clinical diagnosis of MODY is based on (1) young age at onset (before 25 years of age), (2) familial occurrence with autosoma! dominant inheritance and high penetrance and (3) no need for insulin treatment for at least 2 years following diagnosis [20,22]. So far, six distinct MODY subtypes (MODY l-mody6) have been defined according to the underlying genetic defect. MODY2 is caused by mutations of the gene encoding glucokinase (GCK), an enzyme required for glucose phosphorylation in the pancreatic ~-cells and in the liver cells (Fig. 1). The affected subjects exhibit mild hyperglycaemia from birth up to old age and are usllally free of symptom s and severe organ damage. The age at diagnosis depends on the first blood glllcose estimation. The additional MODY subtypes (MODYl and 3-6) result from defective ~-cell transcriptional regulation (Fig. 1). The affected individuals usually manifest in late puberty or early adulthood and suffer from progressively impaired insulin secretion and impaired glucose regulation and a high risk of late diabetes-associated complications. Neonata! diabetes mellitus (either transient or permanent) is characterised by hyperglycaemia revealed within the first months of life requiring insulin treatment [7,

49 49 12]. Transient neonatal diabetes mellitus resolves within a median of3 months [17]. On the contrary, patients with permanent neonatal diabetes mellitus (PND) remain insulin dependent [17]. A defect of KCNJJJ encoding the K ir6.2 subunit of the ~-cell A TPsensitive K+ channel has recently been established as a cause for PND in a substantiaj proportion of affected chi Idren (Fig. 1) [7]. To make the spectrum of diabetic conditions aminy children and adolescents even more complex, type 2 diabetes mellitus is recently being reported among severe ly overweight young people from countries with an epidemic of obesity [14]. Here, we studied mutations and the phenotypic expression in the genes TCFl, GCK, HNF4A and KCNJll in an unselected cohort of 82 children and adolescents, consecutively referred for investigation of asymptomatic fasting hyperglycaemia... "cose J. T jlm" gril!"? :.-., : PFK-2. CK ~ '...." ~ - - -,.. T rgel QeJlf'<: I.~ InsuFn. GLUT2. : I GCK. PFPCK. I PFI< 2. l.pi< t ~ I I Fig. I Main pathways regulating insulin secretion in ~-cells (left) and the current concept of~cell transcriptional regulation network (right). Glucose molecules enter ~-cells via the GLUT2 membrane transporter. The cytoplasmic enzyme glucokinase (Gel() senses the glucose concentration and initiates subsequent steps leading to insulin release. Adenine nucleotides interact with the sulphonylurea binding component (SUR I) of the inward rectifying potassium channel (Kir6.2). Potassium channel closure depolarises the cell membrane, opening voltagegated calcium channels. [ncreased intracellular calcium concentration promotes exocytosis of insul in granules. Decreased GeK activity due to a heterozygous GeK gene mutation (I) is associated with persistent mild hyperglycaemia [rom birth up to old age (MODY2). Defects of Kir6.2 subunit of the potassium channel due to a KCNi]] mutation (2) tlead to permanent neonatal diabetes (PND). Failure of transcriptional regulation results in gradual loss of insulin secretion. A ffected individuals become hyperglycaemic in late childhood, adolescence or young adult age as seen in defects of HNF-4a (3) encoded by HNF4A (MODY!) or of HNF-Ia (4) encoded by TCF] (MODY 3).

50 50 Subjects and methods Subjects Between January 1998 and December 2004, a total of 82 children and adolescents (38 males, 44 females; aged 2 months years, median: 13.1 years) were referred by general paediatricians, paediatric endocrinologists or paediatric departments of local hospitals to the Department of Paediatrics of the 3rd Medical Faculty in Prague for elucidation of asymptomatic fasting hyperglycaemia. AII patients were of Caucasian origin. Their body mass index (BM1) ranged between 13.7 and 25.0 kg/m2 (median: 18.9). None of the subjects was severe!y overweight (BMI >97th percentile of the ageand gender-matched reference population) [3]. Non-symptomatic elevated fasting blood glucose was originally estimated either within the elaboration of an acute condition (tonsillitis, gastroenteritis/vomiting, bronchitis, influenza, pyelonephritis, otitis media, fatigue, abdominal pain, head injury, vertigo, dyspnoea, collapse or tachycardia) or following a positive glycosuria testing at a routine preventive examination or at urine examination for various other reasons. None of the patients suffered from polyuria/polydipsia/weight loss or was ketotic at initial evaluation. The age of patients at the first recognition of hyperglycaem ia was 2 weeks-16.1 years (median: 12.0 years) and fasting plasma gjucose leve! at the referring physician' s office ranged from 5.6 mmol/i (lol mg/dl) to 20.9 mmol/i (376 mg/dl) (median: 7.1 mmol/i ; 127 mg/dl). Those with fasting plasma glucose < 5.6 mmol/i (lol mg/dl) at initial examination were excluded from the study cohort. At the first examination following referral, levels of fasting plasma glucose ranged from 4.0 mmol/i (71 mg/dl) to 22.6 mmol/i (407 mg/dl) (median: 5.9 mmovl; 106 mg/dl).

51 51 Study protocol Baseline investigations The baseline evaluation included family history, fasting glycaemia, fasting serum insulin and C-peptide, and glycosylated haemoglobin (HbA1c). FamiJy history was considered positive if at \east one parent and/or one sibling had diabetes mellitus. Al! individuals were tested with an oral glucose tolerance test (OGTT) which was evaluated according to the American Diabetes Association (ADA) criteria [I]. Children with resujts within normal range (fasting plasma glucose <5.6 mmol/i and 2-h postload plasma glukose <7.8 mmoili; < 140 mg/dl) were considered to have normal glucose tolerance (NGT). Intravenous glucose tolerance test (IYGTT) to assess pancreatic ~-cell function by estimating the first-phase serum insulin release (FPIR) was performed in all children above 2 years of age. AIJ subjects were investigated for mutations in the genes encoding GCK and HNF-lu. The KCNJII gene encoding the Kir6.2 subunit of the ~ cell ATP-sensitive K + channel was analysed in aj! chi Idren younger than 2 years. ln addition patients with a positive family history of diabetes mellitus in first-degree relatives but with negative search for mutations in GCK, TCFI and KCNJII genes were screened for mutations in the gene encoding HNF-4u. Low-dose insulin therapy and home blood glucose monitoring were initiated in patients who had abnormal glucose tolerance (a pathological result during an OGTT) in association with decreased FPIR (lower than I st percentile). Although that is stili not a standard therapeutic option, we personajly believe that it may prevent a rapid progression to overt T1DM. Clinicalfollow up AII study participants were followed prospectively. The median follow-up time was 3.9 years (range: years). Yenous blood was sampled for HbAJc and profiles of blood glucose levels over 24 h (three to five measurements before main meals and at bedtime) were performed every 6 months.

52 52 ln those on insulin therapy, the treatment was aimed at maintaining nearnormoglycaemia. The insulin requirements were recorded at regular outpatient visits every 3 months. Ethics Informed written consent was obtained from all subjects and/or their parents before entering the study protocol. The study was approved by the Ethical Committee of the 3rd Faculty ofmedicine, Charles University ofprague. Testing procedures Both OGTT and rygtt [2] were performed according to standard protocols. The subjects were on regular diet with unrestricted carbohydrate intake at least 3 days preceding the test. Excessive physical activity was not allowed I day before testing. The test was not provided in cases of acute íilness and/or administration of drugs with potential effect on blood glucose levels (including inhaled corticosteroids). After an overnight fast for h, testing was initíated between 8 and 9 a.m. For lygtt, two contralateral antebrachial veins were cannulated. Sampling was performed from one cannula to measure basal plasma glucose and serum insulin and C peptide. ImmediateJy thereafter, 0.5 g glucose per kg of body weight (maximum: 35 g) as a 40% aqueous solution was infused into the second cannula within 3 min ± 15 s. Serum insulin and C-peptide Jevels at time points 1 and 3 min were used for calculation of the first-phase insulin response (FPIR). The results were evaluated according to published standards [9, 18]. For OGTT, 1.75 g glucose per kg of body weight (maximum: 75 g) was given. Blood samples to measure plasma glucose and serum insulin and C-peptide were obtained at time points O, 60 and 120 min. The results were evaluated according to ADA criteria [J ].

53 53 Routine laboratory assays Plasma glucose Plasma glucose concentration was measured by the enzymatic hexokinase method using the automatic analyse Konelab 60 (Thermo Clinical Labsystem Oy, Espoo, Finland). C-peptide and insulin C-peptide and insulin in serum were analysed by a chemiluminescent immunometric technique using the commercial sets lmmulite 2000 C-peptide and lmmulite 2000 Insulin (Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA, USA). HbA/c Estimation of HbA1 c was performed with the DS5 AnaJyser (Drew Scientific Ltd., Barrow in Furness, Cumbria, UK) using cation exchange chromatography in conjunction with gradient elution. The assigned values of HbA1c were calibrated to the International Federation of Clinical Chemistry (IFCC) system (normal levels: %). Genetic analyses Preparation oj genomic DNA Genomic DNA was isolated from leukocytes in blood samples anticoagulated with ethylenediaminetetraacetate (EDTA).

54 54 Ana/yses ofgenes encoding HNF-lo., GCK and HNF-4o. Denatured high-performance liguid chromatography (dhplc) and direct seguencing were used for analysis of all exons, the intron-exon boundaries and the promoter regions of the TCFl and GCK genes [4]. Analysis of the HNF4A gene and of its Pl promoter was performed by direct seguencing using ABI PRISM Dye Primer Cycle Seguencing Kit with AmpliTag DNA polymerase FS. Ana/ysis ofthe KCNJll gene The published primers and previously described protocol were used to carry out the polymerase chain reactions (PCR) in addition to fragment 6 for which the annealing temperature used was 70 C [8]. PCR were performed using AmpliTag Gold and a Gene-Amp PCR system 9700 thermocycler (Perkin Elmer, Foster City, CA, USA). After per, the prodllcts were purified lising an ExoSAP-IT treatment (USB Corporation, Cleveland, OH, USA), and all of them were seguenced in both directions using the BigDye Terminator v3.icycle Seguencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). The seguencing was performed on an ABI PRISM 3100-Genetic Analyse (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Dejinition oj diagnostic subgroups Positive screening for mutations in the HNF4A, GCK, TCFl and KCNJll genes was considered diagnostic for MODYI, MODY2, MODY3 and PND, respectively. Subjects with negative search for mutations in genes mentioned above, but with persistent increased fasting glycaemia and abnormally high plasma glucose response to an OGTT were considered diabetic. Of these, individuals with FP1R below the 1 st percentile who reguired a daily insulin dose ~ 0.5 IU/kg to maintain near-normoglycaemia within the follow-lip period were considered to manifest an early (pre-manifest) phase of Tl DM. Those with normal FP IR (and no insulin treatment) or those with low FPIR but daily insulin reguirements <0.5 IU/kg were assigned as impaired glucose tolerance/diabetes

55 ss mellitus (lgt/dm) of undetermined origin. ~ -cell-specific autoantibodies were not included into the diagnostic work-up. lndividuals negative for mutations in the analysed genes who had normal fasting plasma glucose and normal OGTT and physiological FPIR at re-evaluation following referral were considered as NGT. Statistics The values are expressed as mean±sem if not given otherwise. The data on diagnostic subgroups were statistically evaluated if the entire subgroup included ~ 9 individuals. The group differences in the clinical and metabolic variables were assessed by the one-way analysis of variance (ANOVA) and by Studenťs appropriate. t-test where Results Monogenic forms of hyperglycaemia The genetic findings are summarised in Table 1. One patient carried a heterozygous mutation in the HNF4A gene causing MODY\. In 35 subjects, we identified 19 different heterozygous mutations in the GCK gene (MODY2). ln two individuals, we determined heterozygous mutations in the TCFl gene causing MODY3. One patient carried a heterozygous mutation in the KCNJll gene, an arginine-tohistidine substitution at position 201 (R201H), causing PND. He was originally investigated for prolonged cough at age 2.5 months. In spite of a blood glucose level of 22.6 mmol/i (407 mg/dl) at referral, he was free of diabetic symptoms. We have not previously reported this patient; however, the R201H mutation is known to be the most prevalent PND-causing variant within the entire KCNJll gene [7J. Thus, in 39 of 82 patients (48%) the randomly found hyperglycaemia led to the disclosure of a single gene defect condition, MODY2 being the most prevalent. The clinical and biochemical phenotypes of affected individuals are summarised in Table 2.

56 56 Type 1 diabetes mellitus (pre-manifest phase) Eleven children who tested negative for mutations in the screened genes (13% of the study group) had fasting hyperglycaemia (9.1±1.2 mmol/ I; 164±22 mg/dl), abnormally high plasma glucose response to an oral glucose load and substantially decreased FPlR (13.7±3.0 mlu/i) (Table 2). None ofthem was ketotic at diagnosis or within the followup period of 3.8±OA years. The reason for the initial plasma glucose estimation was an intercurrent infection in five, fatigue in three and head injury in one subject. In two subjects, glycosuria was detected in a random urine sample at a preventive examination. ln all of the subjects, low-dose insulin therapy was initiated to prevent the development of overt clinical symptoms of diabetes and the daily insulin requirements to maintain near-normoglycaemia exceeded 0.5 IUlkg during the follow-up. Thus, these subjects were considered to suffer from T I DM that was randomly detected within the presymptomatic phase. Impaired glucose tolerance/diabetes mellitus (IGTIDM) of undetermined origin Nine patients (ll %) who tested negative at mutation screening had an abnormal plasma glucose response to an oral glucose load (OGTT) and a borderline fasting plasma glucose level (6.1±0.5 mmol/i; 110±9 mg/dl). Their FPlR ranged from low normal to moderately decreased values (54A±19.5 mlu/l) (Table 2). The reason for the initial examination was glucosuria at a preventive examination (4), intercurrent infections (3) or fatigue (2). According to standard procedures, insulin therapy was initiated in those with FPIR below the 1st percentile. However, the daily insulin requirements to maintain near-normoglycaemia remained :::::; 0.3 IU/kg. Members of this subgroup were not obese (BMI-SDS ranging from to+0.63), making a diagnosis of type 2 diabetes mellitus improbable. However, eight of nine reported a history of diabetes in one parent (three cases were classified as gestational diabetes and five cases as type 2 diabetes).

57 57 Normal glucose tolerance ln 23 subjects (28% of the study cohort), we did not confirm the hyperglycaemia originally reported by the referring physician. These patients had normal fasting plasma glucose, OGTI and FPIR. The screening for mutations in the selected genes was negative. Furthermore, HbA1c and profiles of blood glucose levels remained normal during follmv-up. The initial examínation of plasma glucose was provided \vhen elaborating an intercurrent infection (.ll), fatigue (7) or abdominal pain (5). Summary of clinicallaboratory data in diagnostic subgroups The clinical and laboratory data on subgroups of patients with asymptomatic hyperglycaemia are summarised in Table 2. lndividuals with the four most prevalent conditions (T I DM, MODY2, JGT/DM, NGT) were of simílar age at first examination for hyperglycaemia, had simijar age- and gender-matched body mass index (BMI) and similar fasting serum levels of ínsulín and C-peptide. On the contrary, fasting plasma glucose, FP1R and HbA 1c díffered significantly among the subgroups, dístinguishíng children with pre-manifest T1DM by lower FPIR and higher fasting plasma glucose in association with increased HbA 1c.

58 58 Table J: Genetic findings: 39 heterozygous mutalions identified within the cohort oj 82 unrelated children and adolescents with randomly Jound hyperglycaemia Gene HNF4A (I subject) GCK (35 subjects) TCFI (2 subjects) KCNi 11 (I subject) Identifi ed mutations Va112 11le Arg36Trp(1 subject) Glu40Lys (8 subjects) Gly44Asp (2 subjects) Phe 150Leu (l subject) Glul57Lys (1 subject) Alal88Thr (I subject) Cys220Stop (4 subjects) Val226Met (2 subjects) Met251 Val (I subject) Glu268Stop CI subject) Gly294Asp (I subject) Leu315His (2 subjects) Phe316Val (I subject) Gly318Arg (3 subjects) Ser383Leu (I subject) Phe419Leu (I subject) Cys434Tyr (2 subjects) I1e436Asn (1 subject) Ala454Glu (I subject) P379fsdelCT Arg229 Stop Arg20lHis ldentification of mutations in the HNF4A, GCK and TCFl genes in individual patients have been given in our previously published reports [15, Pinterova, submitted for publ ication).

59 59 Table 2: Clinical and metabo/ic characteristics oj diagnostic subgroups oj children with randomly Jound asymptomatic hyperglycaemia. TIDM MODYI MODY2 MODY3 PND IGTIDM NGT Number (%) II (13) I (I) 35 (43) 2 (2) I (I) 9 (ll) 23 (28) Age at tirst detection 9. IH ± ± ±15 9.6±1.0 of hyperglycaemia (years) Sex (FIM) 4/7 I/O /0 O/I 6/ BMI (kg/m z ) 18A± I±OA 21.2± ± _0.7 Fasting p-glucose (mmol/i) 90±1.4 8A 6.4± a ± ±0. 1 Fasting s-insulin (mi UlI) 7.3± 1.6 NA 10.0± a NA 6.8± 1.l 6.7±0.7 Fasting s-c-peptide 479± ±51 512±258 NA 645±83 508±69 (pmolll) OGTr: I-hour postload 12.6± ±0.6 NA NA 11.6± ±05 p-glucose (mmol/ I) OGIT: 2-hour postload 10.4± ± a NA 11.8± J.7 5.3±0.3 p-glucose (mmolll) r:t' IR (mru/i) 13.7±3.0 NA 130.2± a NA 54.4± ± HbA 1c (%) 6.6± ±0.3 5A±O.9 5A 6.1± ±0.4 Number of affected parents 0/3/8 0/1/0 2/28/5 0/2/0 0/0/1 0/8/ 1 0/5118 (2/ 1/0) Values are shown as mean ± SEM (single values for the one member groups). BMI was expres sed as SOS according to recent loeal standards [3]. Tl DM - type one diabetes mellitus, PND - permanent neonatal diabetes mellitus, IGT/DM - impaired glucose tolerance/diabetes mellitus, NGT - normal glucose tolerance, SOS - standard deviation seore, FPIR - first-phase of insulin release during an ivgtt, p - plasma, s - serum, NA - not available *p<o.ooo I (TlDM, MODY2, IGTIDM and NGT; ANOVA); **p<o.005 (Tl DM, MODY2, IGT/DM and NGT; ANOVA); ***p<o.ol (TI DM vs. NGT; t-test); a ln a single patient on ly. Discussion

60 60 Within the cohort of 82 children and adolescents with asymptomatic hyperglycaemia, we identified 35 mutation carriers in the glucokinase gene (MODY2) and 3 patients with mutations in genes encoding transcription factors: one case of MODY I, two cases of MODY3 and one infant with a KCNJl1 mutation causing PND. Thus, in 39 patients (48% of the study cohort) the randomly found hyperglycaemia led to the disclosure of a single gene defect condition, MODY2 being the most common. Among the mutation-negative subjects, II (13%) developed TIDM, 9 (J 1%) had IGT/DM of unknown cause and 23 (28%) were glucose tolerant. These findings have important clinical implications: 35 of 59 subjects who were confirmed to be hyperglycaemic by re-investigation suffered in fact fl om MODY2, a benign and non-progressive form of impaired glucose regulation. No diet or drug therapy is required in most of these patients [13] and an annual follow-up with HbA 1 c measurement would suffice. The risk of diabetes-associated complications is low [6]. However, affected women may require insulin therapy during pregnancy to prevent foetal macrosomia [5]. A!so exact genetic diagnosis is important in order to prevent redundant periodic metabolic examinations of affected individuals. The clinica! diagnosis of MODY2 may be supported by a positive autosomal dominant family history of mild hyperglycaemia. If maternally transmitted, affected women may have a history of gestational diabetes mellitus in all pregnancies. If transmitted by the father, the diagnosis is not necessarily known. A simple estimation of parental fasting plasma glucose levels may be helpfuj. The affected grandparent may be known to have "mild type 2 diabetes mellitus" and being recommended to follow a "diabetic diet". On the contrary, the additional MODY subtypes tend to manifest in later childhood, adolescence or young adulthood [21] and gradually develop to a symptomatic stage. These forms of diabetes are characterised by progressive decrease in ~-cell function and high risk of microvascular complications. Therapy with insulin or oral hypoglycaemic drugs is required to maintain near-normoglycaemia [22]. A positive autosomal dominant family history of a clinically overt diabetes mellitus may help in establishing the clinical diagnosis ofmody.

61 61 Among infants, asymptomatic hyperglycaemia may be the first sign of PND. This condition is known to result from defects of the KCNJll gene in a substantial proportion of cases [7]. Our patient carrying thc R20 J H mutation within the KCNJll gene was randomly detected to be hyperglycaemic at 2.5 months of age. His daily insulin requirements did not exceed 0.4 lu/kg and the metabolic regulation was excellent within the follow-up period of3.3 years. Currently, studies are ongoing to test the therapeutic potential of sulphonylurea derivates instead of insulin in chi ldren affected by mutations in the KCNJll gene. Thus, genetic diagnosis may open new future treatment options in these children [16]. ln J I patients (13 %), random hyperglycaemia was apparently the first sign of TlDM. Early recognition oftidm makes it possible to initiate insulin treatment before the clinical onset of the disease and to reduce the risk of unrecognised diabetic ketoacidosis upon manifestation of Tl DM. The early stages of the disease process may be detected by decreased FPIR and by ~-cell-specific autoantibodies. However, in young children the levels of autoantibodies may vary, introducing difficulties in the interpretation of the reslllts [10, ll]. Temporary positive titres of an autoanti body against molecularly defined antigens (anti GAD65, anti-la2 or anti-iaa) might also reflect the population variabi lity [19]. Therefore, we performed the study irrespectively of autoimmune markers. The IGT/DM group 10 which the moleclllar pathogenesis was not understood included nine (ll%) of the examined subjects. They were alj asymptomatic, had impaired glucose tolerance or diabetes mellitus according to diagnostic criteria and their FPIR was low normal or mildly decreased, making the diagnosis of T1DM unlikely. However, eight of them had a first-degree relative affected with diabetes mellitus indicating that undetected or unknown MODY gene variants may be involved in the aetiology. Low-dose insulin therapy was in some of the subjects necessary to achieve near-normoglycaem ia. ln the remaining subgroup of 23 subjects (28%) with NGT, a detailed clinical and metabolic examination did not reveal any metabolic disorder. The randomly found fasting hyperglycaemia might have been due to an isolated stress hyperglycaemia, postprandial blood sampling or errors in sample handling.

62 62 In conclusion, the underlying cause of a randomly found asymptomatic hyperglycaemia was fully elucidated in a considerable number of affected individuals in our study. For many of them, the final diagnosis bears a positive message on the benign nature of the condition; however, cases of pre-manifest type 1 diabetes mellitus and of MODYI and MODY3 require a rapid and adequate treatment to prevent an unfavourable short-term and long-term outcome. In different populations, the results might differ largely. Cases of type 2 diabetes mellitus would probably be recognised among hyperglycaemic youngsters in countries with epidemie childhood obesity. However, the spectrum of newly established monogenic conditions is worthy of inclusion in the diagnostic work-up anyway. Acknowledgements The study was supported by a grant of IGA MZ CR No. NB and by a research project of MSM The authors are grateful to all the referring physicians and to the families for an excellent collaboration and to Mrs. Helena Francová for the skilful assistance with metabolic tests. References I. American Diabetes Association (2005) Diagnosis and c1assification of diabetes mellitus. Diabetes Care 28(Suppl 1 ):S37-S42 2. Bi ngley PJ, Colman P, Eisenbarth GS, Jackson RA, McCulloch OK, Riley WJ, Gale EAM (1992) Standardization oftygtt to predict 100M. Diabetes Care 15: laha P, Yignerova J, Riedlova J, Kobzova J, Krejcovsky L, Brabec M (2005) 6. celostatni antropologicky vyzkum deti a mladeze 2001 Ceska republika. Statni zdravotni ustav, Praha, pp Boutin P, Yasseur F, Samson C, Wahl C, Froguel P (2001) Routine mutation screening of HNF-I alpha and CGK genes in MODY diagnosis: how effective are the techniques of DHPLC and direct sequencing used in combination? Diabetologia 44:

63 63 5. El1ard S, Beards F, Allen LIS, Shepherd M, Ballantyne E, Harvey R, Hattersley AT (2000) A high prevalence of glucokinase mlltations in gestational diabetic sllbjects selected by clinical criteria. Diabetologia 43: Fajans SS, Bell Gl, Po Ionsky KS (2001) Moleclllar mechanisms and clinical pathophysiology ofmaturity-onset diabetes ofthe young. N Engl J Med 345: Gloyn AL, Pearson ER, Antcliff JF, Proks P, Brllining GJ, Slingerland AS, Howard N, Srinivasan S, Silva JM, Molnes J, EdghiJI EL, Frayling TM, Temple IK, Mackay D, Shield JP, Sumnik Z, van Rhijn A, Wales JK, Clark P, Gorman S, Aisenberg J, Ellard S, Njolstad PR, Ashcroft FM, Hattersley AT (2004) Activating mutations in the gene encoding the ATP sensitive potassium-channel subunit Kir6.2 and permanent neonatal diabetes. N Engl J Med 350: lnoue H, Ferrer J, Warren-Perry M, Zhang Y, Millns H, Turner RC, Elbein SC, Hampe CL, Suarez BK, Tnagaki N, Seino S, Permutt MA (1997) Sequence variants in the pancreatic islet beta-cell inwardly rectifying K + channel Kir 6.2 (Bir) gene: identification and lack ofrole in Caucasian patients with NIDDM. Diabetes 46: Keskinen P, Korhonen S, Kupila A, Veijola R, Erkkili:i S, Savolainen H, Arvilommi P, Simel1 T, llonen J, Knip M, Simell O (2002) First-phase insulin response in young healthy children at genetic and immunological risk for Type I diabetes. Diabetologia 45 : Kulmala P, Rahko J, Savola K, Vi:ihi:isalo P, Veijola R, Sjoroos, M, Reunanen A, lionen J, Knip M (2000) Stability of autoantibodies and their relation to genetic and metabolit markers oftype I diabetes in initially unaffected schoolchildren. Diabetologia 43: ll. Levy-Marchal C, Dubois F, Noěl M, Tichet J, Czernichow P (1995) Immunogenetic determinants and prediction oflddm in French schoolchildren. Diabetes 44: Marquis, Robert JJ, BOLlvattier C, Bellanne-Chantelot C, Junien C, Diatloff-Zito C (2002) Major difference in etiology and phenotypic abnormalities between transient and permanent neonatal diabetes. J Med Genet 39: Pearson ER, Velho G, Clark P, Stride A, Shepherd M, Frayling TM, Bulman MP, Ellard S, Froguel P, Hattersley AT (2001) ~-cell gene s and diabetes: quantitative and qualitative differences in the pathophysiology of hepatic nuclear factor-i ex and glucokinase mlltations. Diabetes 50:S I O I-S 107

64 Pontiroli AE (2004) Type 2 diabetes mellitus is becoming the most common type of diabetes in school children. Acta Diabetol 41 : Pruhova S, Ek J, Lebl J, Sumnik Z, Saudek F, Andel M, Pedersen O, Hansen T (2003) Genetic epidemiology of MODY in the Czech republic: new mutations in the MODY genes HNF-4a, GCK and HNF-la. Diabetologia 46: Sagen.IV, Raeder H, Hathout E, Shehadeh N, Gudmundsson K, Baevre H, Abueto O, Phomphutkul C, Moines.I, Bel! GI, Gloyn AL, Hattersley AT, Molven A, Sovik O, Njolstad PR (2004) Permanent neonatal diabetes due to mutations in KCNJ II encoding Kir6.2: patient characteristics and initial response to sulfonylurea therapy. Diabetes 53: Shield JP (2000) Neonatal diabetes: new insights into etiology and implications. Horm Res 53(Suppl 1): Srikanta S, Ganda OP, Gleason RE, Jackson RA, Soeldner JS, Eisenbarth GS (1984) Pre-type I diabetes: linear loss of beta cell response to intravenous glucose. Diabetes 33: Vavrinec J, C inek O Sumnik Z, Kolouskova S, Malcova H, Drevinek P, Snajderova M (2002) Predikce diabetes mellitus 1. typu u ceskych prvostupnovych pribuznych diabetických pacientu. Vnitrni lekarstvi 48: Velho G (2003) Le diabete MODY en pratique. Quand y penser? Pourquoi y penser? Ann Endocrinol (Paris) 64 (Suppl I):S 17-1 S Velho G, Robert JJ (2002) Maturity-onset diabetes of the zouny (MODY): genetic and clinical characteristics. Horm Res 57 (Suppl 1): Winter WE (2003) Newly defined genetic diabetes syndromes: maturity onset diabetes ofthe young. Rev Endocr Metab Dis 4 :43-51 Doplňující poznámky Naše výsledky potvrzují klinický význam náhodně zjištěné hyperglykémie u asymptomatických dětí a adolescentů. Určení etiologické příčiny náhodně hyperglykémie hraje zásadní roli v ča s ném zavedení účinné terapie, v dětském věku se jedná předev š ím o T IDM, nebo ušetří pacienta od dalšího extensivního vyšetřování, v

65 65 případě MODY2. V tomto ohledu jsou výsledky naší studie povzbudivé: 43 % případů náhodně zjištěné hyperglykémie u pediatrických pa cientů z české populace představuje MODY2, charakterizovaný benigním průbě hem. 11 % případů bylo spojeno s presymptomatickou fází Tl DM, jediný pacient (l %) s MODYI a dva pacienti (2%) s MODY3. Podařilo se zachytit i jeden případ permanentního neonatalního diabetu mellitu na pokladě mutace genu KCNJll. Molekulárně genetické vyšetření dokáže spolehlivě odlišit známé monogenně podmíněné formy diabetu. U jedinců s negativním nálezem napomůže k určení etiologie klinický průběh, laboratorní data (glykémie nalačno, HbAlc, výsledky dynamických testů OGTT a IVGTT se stanovením FPIR) a případná nutnost exogenní dodávky inzulínu, navíc i s přihlédnutím k potřebné dávce. Pro premanifestní fázi Tl DM byla charakteristická nutnost denní dávky inzulínu?: 0.5 IU/kg k udržení hladin glykémie blízkých normálním hodnotám. Rozbor situací, při nichž bylo provedeno iniciální vyšetření glykémie, neprokázal významné rozdily z hlediska klinické závažnosti mezi jednotlivými diagnostickými podskupinami. Podskupinu PGT/DM (ll %) se nepodařilo přesně specifikovat. Výsledky molekulárně genetického vyšetření neprokázaly u těchto pacientů mutaci v testovaných genech. Opakované vyšetření potvrdilo přetrvávání zvýšené glykémie nalačno s patologickou glykemickou křivkou v průběhu OGTT. Hodnota FPIR byla normální nebo středně snížená. V průběhu sledování nedošlo k rozvoji klinických symptomů. Inzulínová terapie k udržení hladin glykémie blízkých normálním hodnotám byla zahájena u části pacientů, přitom inzulínová potřeba byla nižší než 0,3 IU/kg. Pacienti měli normální BMI pro daný věk a pohlaví. Rozbor rodinné anamnézy svědčil u velké části probandů pro výskyt diabetu s autozomálně dominantní dědičností. Předpokládáme tedy, že by se mohlo jednat o pacienty s mutací v dosud ne identifikovaných MODY genech (MODYX).

66 Mutace genu KCNJll, kódujícího Kir6.2 - terapeutický přístup Formou kazuistiky jsme referovali o nálezu mutace R201 H genu KCNJll, který kóduje Kir6.2 podjednotku kaliového kanálu. Tento nález přinesl nový pohled na onemocnění a umožnil změnit dosavadní terapii z inzulínu na perorální antidiabetikum. Nová terapie znamenala nejen zvýšení kvality života pacienta, ale především zlepšení kompenzace diabetu. vedla ke Jedná se o chlapce, který byl zachycen díky studii " Náhodně zjištěná hyperglykémie u dětí a adolescentů." Pruhova S, Lebll, Pinterova D, Feigerlova E, Hansen T, Pedersen O (2004) R201 H mutalion oj the KlR6.2 gene caus ing permanent neonatal diabetes mel/itus. Slovenska Pediatrija ll: 83. R201H mutation Dr the KlR6.2 gene causing permanent neonatal diabetes mellitus Background: Permanent neonatal diabetes mellitus (PNDM) is defined as persistent hyperglycaemia diagnosed within the first three months of life. Recent findings have shown that a substatnial proportion of cases of PNDM are caused by mutations of the Kir6.2 gene encoding a subunit ofthe ATP-senstive potasium-channel. Case report. A full-term male offspring of healthy parents was investigated at 18 days for prolonged neonatal jaundice and was found to be mildly hyperglycaemic (8,7 mmol/i). At re-investigation in 2,5 months, his blood glucose was 13,6 mmol/i and he was referred to our department. At admission, he had permanent glycosuria and blood glucose 22,6 mmol/j with no signs of ketoacidosis. The level of C-peptide was 183 pmol/i and autoantibodies (antigad) were negative. We started NPH insulin in 3 daily doses; he was normoglycaemic at 3,25 IU/day (0,4 IU/kg/day). Currently at 3,5 years, he is given insulin 0,22 IUlkg/day and his metabolic control is excellent.

67 67 Recently, we provided molecular genetic analysis of the Kir6.2 gene using PCR and direct sequencing and found a R201H mutation that was for the first time described in subjects with PNDM earlier this year. This fin ding opened the possibility to test OHA (glibenclamide) instead of insulin to control his blood glucose levels. Conclllsions. We have proven that testing for Kir6.2 mutations may be recommended in subjects with PNDM and maybe in all children with early-onset diabetes within the first year of life. Some preliminary reports suggest that patients with " Kir6.2-diabetes" may profit from therapy with OHA (glibenclamide) instead of insulin. Doplňující poznámky Mutace genu KeNi]], kódujícího Kir6.2 podjednotku kaliového kanálu, je nejča s tější příčinou diabetu diagnostikovaného před 6 měsíci věku. Mutace KeNi]] mohou z působit PNDM, TNDM nebo jiné mírnější formy diabetu s nástupem později v životě (Gloyn 2004, Gloyn 2005, Hattersley 2005, Slingerland 2005, Yorifuji 2005). Rodinná anamnéza je většinou negativní, neb o ť 90 % mutací vzniká de novo (Slingerland 2006a). Izolovaný výskyt diabetu bývá častý, asi 20 % pacientů má neurologické komplikace. Pacienti postižení mutací Kir6.2 jsou klinicky inzulíndependentní; u 30% z nich se diabetes manifestuje ketoacidózou, hladina C-peptidu je často neměřitelně nízká a terapie inzulínem byla v minulosti považována za nevyhnutelnou (Hattersley 2005). U našeho pacienta molekulárně genetická analýza genu pro Kir6.2 prokázala de novo mutaci R20 I H (záměna argininu za histidin v pozici 201). Dle publikovaných dat se jedná pravděpodobně o oblast KeNi]] genu, která nejčastěji podléhá mutacím. Nalézá se v -COOH terminálním úseku Kir6.2 (Edghill 2004) a obsahuje CpG dinukleotid, který představuje u savců "hot spot" pro genové mutace. Toto by mohlo vysvětlovat opakované nálezy mutace R201H u nepříbuzn ý ch rodin z rozdílných zemí světa. Jelikož velká část mutací vzniká spontánně, rodinná anamnéza diabetu bývá negativní. Funkční studie prokázaly, že mutace má za následek čtyřicetinásobné snížení citlivosti kanálu

68 68 vůči ATP, což následně vede k selhání uz áv ě ru kanálu ~-buňky ATP dependentním mechanismem a k poruše sekrece inzulínu (Gloyn 2004). V nedávné době se podařilo prokázat, že perorál ní terapie deriváty sulfonylurey je pro pacienty s mutací R20 I H genu KCNJJJ přínosná. Mechanismus působení spočívá ve vazbě farmaka na SUR I podjednotku a uzávěrem K ATP kanálu mechanismem nezávislým na ATP (Gribble 2003). Bylo prokázáno, že terapie nejen zlepšuje kvalitu života, ale zejména přispívá ke zlepšení glykemického profilu bez zvýšení frekvence hypoglykémií. Počáteční denní dávky glibenclamidu mohou dosáhnout 0,5 až I mg na kilogram tělesné hmotnosti (Slingerland 2006a). S postupem doby je u některých pacientli možno denní dávku léku snížit a to při zachování výborného glykemického profilu (Colombo 2005, Conner 2005, Klupa 2005, Massa 2004, Pearson 2006, Sagen 2004, lung 2004). Po stanovení genetické diagnózy jsme u našeho pacienta zahájili p.o. léčbu glibenclamidem s postupným snižováním dávky inzulínu. Po týdnu léčby byl inzulín zcela vysazen a pokračovalo se jen v p.o. léčbě glibenclamiden v počáteční dávce 0,07 mg/kg/den. Glykemický profil na terapii glibenclamidem byl velmi uspokojiv)/. Vyšetření 2 měsíce po vysazení inzulínu prokázalo normalizaci hladiny C-peptidu. Po půl roce léčby glibenklamidem se zlepšila kompenzace diabetu. Nepozorovali jsme žádné nežádoucí účinky této terapie. Jde o první případ, kdy byla v České republice úspěšně změněna terapie PNDM na základě genetického nálezu. Jedná se tedy o zřejmý příklad uplatnění farmakogenetiky v klinické praxi.

69 Studie MODY2 V této části práce jsme se zaměřili na pacienty, jejichž onemocnění svým charakterem vyvolávalo podezření na MODY. Exaktní určení diagnózy je potřebné pro určení etiologie onemocnění a pátrání po přidružených komplikacích, pro účinné vedení terapie a odhad očekávané odpovědi na léčbu, pro stanovení průběhu onemocnění a jeho prognózy. Přesná diagnóza hraje velkou roli v případném genetickém poradenství a má velký význam pro členy postiženého. rodiny Výsledky předchozí studie (Průhová 2003) ukázaly, že nejčastější formou monogenní formy diabetu v Če s ké republice je MODY2. MODY2 je charakterizovaný benigním průběhem a příznivou prognózou (William 2003). Screening mutací v GCK genu u jedinců s klinickým podezřením na MODY diabetes by pomohl odlišit tyto pacienty od pacientů s vyšším rizikem progrese do klinického diabetu a s ním souvisejících komplikací. Hlavním naším cílem bylo prostřednictvím molekulárně genetického vyšetření u souboru 92 proband ů z české populace identifikovat mutace genu pro glukokinázu. K vyšetření byli doporučeni probandi splňující klinické kritérium MODY: pozitivní rodinná anamnéza diabetu (poruchy glukózové tolerance, gestačního diabetu, mírné hyperglykémie) s výskytem nemoci do 30 let věku generaci. v každé Mezi podpůrná kritéria patří: manifestace diabetu (hyperglykémie) bez známek diabetické ketoacidózy, trvalá stacionární mírná hyperglykémie, dobrá kompenzace na malých dávkách inzulínu, na dietě, případně na PAD, glykosurie i při normálních glykémiích (nízký renální práh),

70 70 negativita anti-gad65, lca, IAA protilátek, případně silně protektivní HLA genotyp vzhledem k autoimunitnímu diabetu. Studie se u s kutečnila ve spolupráci Kliniky dětí a dorostu UK-3. LF a FNKV, Praha, Oddělení buněčné a molekulární biologie UK-3. LF, Praha a Steno Diabetes Center and Hagedorn Research Institute, Dánsko.

71 Článek 3 Pinterova D, Ek 1, Kolostova K, Pruhova S, No vota P, Romzova M, Feigerlova E, Cerna M, Lebl1, Pedersen O, Ransen T (2007) Six novel mutations in the GCK gene in MODYpatients. Ctin Genet 71: Six novel mutations in the GCK gene in MODY patients D Pinterova a, J Ek b, K Kolostova a, S Pruhova c, P Novota a, M Romzova a, E Feigerlova\ M Cerna a, J Lebl c, O Pedersen b, T Hansen b adepartment of Cell and Molecular Biology and cdepartment ofpediatrics, 3rd Faculty ofmedicine, Charles University, Prague, Czech Republic, and bsteno Diabetes Center and Hagedorn Research Institute, Gentofte, Denmark Contract grant sponsor: Research Program of Czech Ministry of Education and Youth: Identification code MSM (Prevention, diagnostics and therapy of diabetes mellitus, metabolic and endocrinal affections of organism), The Danish Medical Research Council; The Danish Diabetes Association; The Danish Heart Foundation; The Velux Foundation, EEC; Contract grant number: , BMH4-CT and QLRT -CT Correspondence: Daniela Pinte ro va, Department oj Tumor Biology, 3rd Faculty oj Medicine, Charles University, Ruska 87, Prague 10, Czech Republic. Tel.: Fax: , pinterod@seznam.cz. To the Editor: Maturity-onset diabetes of the young (MODY; MTM# ) is a genetically and clinicaljy heterogeneous form of diabetes meljitus, characterized by an autosomal dominant inheritance, early-onset non-insulin-dependent diabetes mellitus and by a

72 72 primary defect in the pancreatic beta-cell function ( I). Until now, six types of MODY diabetes have been identified, depending on the gene causing the disease (2). Screening for glucokinase (GCK) mutations in subjects with c1inical characteristics of MODY allows distinguishing between patients with a benign metabolic condition (GCK mutation positive, clinical diagnosis MODY2) and those with a higher risk of progressive hyperglycemia associated with more prevalent and severe diabetic complications (GCK mutation negative). The first mutation in the GCK gene was reported in 1992 (3). Up to now, 195 mutations in GCK have been described, in 285 families (4). Diabetic complications are rare in GCK-MODY, thus GCK-MODY patiens only need to be followed by annual HbA Ic examination. AIso, screening of GCK for heterozygous inactivating mutations allows to determine the subtype of MODY diabetes and to predict the lifelong prognosis. AII 12 exons (exons I a, 1 b, 1 c and 2-10), the intron-exon boundaries and promotor region of GCK (GenBank accession number, AF041 O 12-22) were screened; in 92 Czech probands fujfrlling classical MODY criteria, using denaturing high performance liquid chromatography as previously described (5). The nature of identified mutations was establ ished by direct nucleotide sequencing using BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, USA) according to manufacture's instructions. Mutations were confirmed using a second, independent amplification of the affected part of GCK and re-sequenced the following day. The probands were recruited from pediatricians and endocrinologists from the entire Czech Republic. Fifteen different missense mutations were identified in 27 patients. or these, six were novel missense mutations R250C (exon 7, c.748c>t), L315H (exon 8, c.944t>a), F316V (exon 8, c.946t>g), F419L (exon 10, c.1255t>c), I436N (exon 10, c.1307t>a) and A454E (exon 10, c.136ic>a). Some ofthe identified GCK missense mutations are located near putative functional domains: R250C was found in the close vicinity of a putative glucose binding site, while F419L was detected near a putative MgATP binding site and could thus affect binding kinetics (6). Five of these mutations co-segregated with hyperglycemia in the fam ily, suggesting that the variants are new disease causing mutations. For the novel R250C variant, family members were not avaijable for cosegregation studies. AII codons, which are changed by the six novel mutations, are conserved in the human, mouse, rat and chimpanzee genomes and we

73 73 found none of these mutations Ín 50 unrelated healthy Czech CaucasÍan subjects. Therefore, we assume that the mutations are probably novel disease-causing mutations. We also compared the clinical characteristics 01' patients with GCK mutations and those without mutation in GCK (data not shown in details). In short - the treatment of hyperglycemia with diet was more frequent (p < 0.00 I) in the group of probands with mutations in GCK and they had a significantly lower frequency of diabetic complications (p = 0.02). None of the patients with mutations in GCK was treated with insulin (p < 0.00 I). Moreover, GCK mutation carriers had a lower level of glycosylated hemoglobin (p = 0.02). The mean HbA1c (%) in GCK-positive probands vs negative was 5.7 ± 0.2 vs 6.5 ± 0.2. In conclusion, we identified 29% of GCK mutation carriers among Czech MODY probands, confirming that mutations in GCK are a common cause of MODY in the Czech population. The present high relative prevalence of GCK-MODY, compared with some other European studies, might reflect not only a specific genetic background, but also the mode of recruitment, because most of the probands in the present investigation were recruited by 95 pediatricians. The prevalence of known types of MODY differs in reports from various European populations. Mutations in GCK were described to be a common cause of MODY in France (7) and Italy (8) whereas mutations in TCFl (MODY3) predominated in the UK (9), Denmark (10) and Germany (II). O ur findings again highlight the concept that molecular diagnostic methods In clinical practice may help to verify a diagnosis ofmody. References I. Fajans ss. Scope and heterogeneous nature ofmody. Diabetes Care 1990: 13 : Fajans SS, Bell GI, Polonsky KS. Mechanisms of disease: Molecular mechanisms and clinical pathophysiology of maturity-onset diabetes of the young. New Engl J Med 2001: 345 : Vionn t N, Stoffel M,Takeda J et aj. Nonsensemutation in the glucokinase gene causes early-onset non-i nsul i n-dependent d iabetes-mell i tus. Nature 1992: 356:

74 74 4. Gloyn AL. Glucokinase (GCK) mutations in hy per- and hypoglycemia: maturityonset diabetes of the young, permanent neonatal diabetes, and hyperinsulinemia of infancy. Hum Mutat 2003: 22: Boutin P, Vasseur F, Samson C, Wahl C, Froguel P. Routine mutation screening of HNF-I alpha and GCK genes in MODY diagnosis: how effective are the techniques of DHPLC and direct sequencing used in combination? Diabetologia 2001 : 44: Mahalingam B, Cuesta-Munoz A, Davis EA, Matschinsky FM, Harrison RW, Weber lt. Structural model of human glucokinase in complex with glucose and ATP: implications for the mutants that cause hypo- and hyperglycemia. Diabetes 1999: 48 : Velho G, Blanche H, VaxiJlaire M et aj. ldentification of 14 new glucokinase mutations and description of the clinical profile of 42 MODY -2 famijies. Diabetologia 1997: 40: Massa O, Meschi F, Cuesta-Munoz A et al. High prevalence of glucokinase mutations in ltalian children with MODY. Inf1uence on glucose tolerance, first-phase insulin response, insulin sensitivity and BMI. Diabetologia 2001: 44: Frayling TM, Bulman MP, Ellard Set al. Mutations in the hepatocyte nuclear factor- 1 alpha gene are a common cause of maturity-onset diabetes of the young in the UK. Diabetes 1997: 46: Johansen A, Ek J, Mortensen HB, Pedersen O, Hansen T. Half of clinically defined maturi ty onset diabetes of the young patients in Denmark do not have mutations in HNF4A, GCK and TCFI. J Clin Endocr Metab 2005: 90 (8): ll. Lindner TH, Cockburn BN, Bell Gl. Molecular genetics of MODY in Germany. Diabetologia 1999: 42: Doplňující poznámky Dle závěrú předchozí studie (Prúhová 2003) je prevalence MODY2 v České republice mezi jednotlivými podtypy MODY 30 %. Naše výsledky se s uvedeným nálezem shodují: 27 probandů z celkového po č tu 92 (29 %) mělo pozitivní nález mutace genu pro GCK.

75 75 Pro evropskou populaci se nálezy prevalence MODY2 různí. Mutace genu pro glukokinázu jsou nejčastější příčinou MODY v Itálii, ve Francii a v Německu (Massa 2001, Toaima 2005, Velho 1997). Na druhé stra ně například ve Velké Británii a v Dánsku je prevalence MODY2 mezi jednotli vými podtypy MODY nižší (Frayling 2001, Johansen 2005). Uvedené rozdíly pravděpodobně závisejí nejen na typu vyšetřované populace, ale také na populačním vzorku a na kritériích výběru prob a ndů do studie (Barri o 2002, Gragnoli 2001). Jak již bylo zmíněno, pro MODY2 je charakteristická perzistující mírná preprandiální hyperglykémie (Stride 2002b, Sturis 1994). Udává se, že riziko makrovaskulárních a mikrovaskulárních komplikací je nízké. Přesto může dojít k manifestaci diabetu v pozdějším věku, zejména v době těhotenství (až 50 % postižených žen splní v těhoten s tví kritéria pro gestační diabetes) (Ellard 2000, Chevre 1998, Page 1995, Velho 1997). I proto je užitečné jednou ročně sledovat glykémii a hladinu glykosylovaného hemoglobinu.

76 76 III. Závěr 11. Náhodná hyperglykémie Mezi 82 případy náhodně zjištěné hyperglykémie u dětí a adolescentll české populace jsme identifikovali: u 1 jedince heterozygotní mutaci genu HNF4A pro HNF4a (MODYl), u 35 jedinců 19 různých heterozygotních mutací genu GCK pro glukokinázu (MODY2), u 2 jedinců 2 různé heterozygotní mutace genu HNF1A/TCFl pro HNFla/TCFl (MODY3), u I jedince heterozygotní mutaci genu KCNJll pro Kir6.2 (PNDM), u 11 jedinců presymptomatickou fázi TIDM, u 9 jedinců blíže neurčenou PGT/DM, u 23 jedincll jsme poruchu regulace glykémie podrobným vyšetřením nepotvrdili. Monogenní onemocnění představovala 48 % z celkového počtu vyšetřovaných případů, z toho připadá na MODYI I %, MODY2 43 %, MODY3 2 % a na PNDM v důsledku mutace Kir6.2 I %. U 13 % jedinců se postupně rozvinul Tl DM. U jednotlivých podskupin jsme popsali klinický průběh a vývoj metabolických parametrů v čase, což může být významným pomocníkem při diferenciálně diagnostickém postupu v klinické praxi. Podskupinu PGT/DM (ll %) se nepodařilo přesně specifikovat. Výsledky molekulárně genetického vyšetření neprokázaly u těchto pacientů mutaci v testovaných genech. Dle klinického průběhu a rozboru rodinné anamnézy předpokládáme, že by se mohlo jednat o pacienty s mutací v dosud neidentifikovaných MODY genech (MODYX).

77 77 Naše pozorování ukázala, že IVGrr s urč ním FPIR je spolehlivou metodou k odlišení nejčastějších příčin (MODY2 a T l DM) náhodné hyperglykémie u dětí a adolescentů. Stanovení etiologické diagnózy umožnilo u velké části dětí s náhodně zjištěnou hyperglykémií zavedení včasné a účinné léčby nebo (v případě MODY2) uchránilo pacienta před dalším zbytečným vyšetřováním. Na příkladu nálezu mutace genu KCNJll jako etiologické příčiny neonatálního diabetu jsme ukázali zásadní přínos poznání genetické podstaty onemocnění v optimalizaci terapeutického postupu a současně klinický význam náhodné asymptomatické hyperglykémie, na jejímž základě byl tento pacient zachycen. 12. MODY2 Ve studii MODY2 bylo identifikováno 29 % nositelů mezi 92 pro bandy s klinicky suspektním MODY. mutací v genu pro glukokinázu Celkem jsme prokázali 15 nhných mutací u 27 pacientů, z toho 6 mutací nebylo dosud v literatuře popsáno. Pacienti s mutacemi GCK ve srovnání s pro bandy, u nichž mutace GCK zjištěny nebyly, měli signifikantně nižší výskyt diabetických komplikací a nevyžadovali terapii inzulínem. Naše výsledky potvrzují, že mutace GCK genu jsou nejčastější příčinou MODY v české populaci, i kdyžje nutno mít na zřeteli způsob výběru probandů do studie. Nález mutace GCK znamená pro pacienty, jej ich rodiny a ošetřuj ící lékaře příznivou prognostickou zprávu a ušetří pacienta od dalších zbytečných vyšetřování.

78 78 LITERATURA I. Aguilar-Bryan L, Bryan J (1999) Molecular biology of adenosine triphosphatesensitive potassium channels. Endocrine Rev 20: Allen HF, Jeffers BW, Klingensmith GJ, Chase HP (1993) First-phase insulin release in norma I children. J Paediatr 123 : American Diabetes Association (2004) Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus. Diabetes Care 27, Supp!. I: S5-S9. 4. American Diabetes Association (2005) Diagnosis and Classification of Diabetes MelIitus. Diabetes Care 28, Supp!. I: S37-S Amiel SA, Sherwin RS, Simonson DC, Lauritano AA, Tamborlane WV (1986) Impaired insulin action in puberty. A contributing factor to poor glycemic control in adolescents with diabetes. New Engl J Med 315: Arima T, Drewell RA, Arney KL, Inoue J, Makita Y, Hata A, Oshimura M, Wake N, Surani MA (200 I) A conserved imprinting control region at the HYMAlIZAC domain is implicated in transient neonatal diabetes mellitus. Hum Mol Genet 10: Atkinson MA, Maclaren NK (1994) The pathogenesis of insulin-dependent diabetes. N Engl J Med 331: Babenko AP, Gonzalez G, Aguilar-Bryan L, Bryan J (1999) Sulfonylurea receptors set the maximal open probability, ATP sensitivity and plasma membrane density of KA TP channels. FEBS Lett 445: Babenko AP, Polak M, Ca ve H, Busiah K, Czernichow P, Scharfmann R, Bryan J, Aguilar-Bryan L, Vaxillaire M, Froguel P (2006) Activating mutations in the ABCC8 gene in neonatal diabetes mellitus. N Engl J Med 355: Bach I, Mattei MG, Cereghini S, Yaniv M (1991) Two members of an HNFl homeoprotein family are expressed in human liver. Nucleic Acids Res 19: Barrio R, Bellanne-Chantelot C, Moreno JC, Morel V, Calle H, Alonso M, Mustieles C (2002) Nine novel mutations in maturity-onset diabetes of the young (MODY) candidate genes in 22 Spanish families. J Clin Endocrinol Metab 87: Beards F, Frayling T, Bulman M, Horikawa Y, Allen L, Appleton M, Bell GI, ElIard S, Hattersley AT (1998) Mutations in hepatocyte nuclear factor I beta are not a common cause of maturity-onset diabetes of the young in the U.K. Diabetes 47: BelI Gl, Kayano T, Buse 18, Burant CF, Takeda J, Lin O, Fukumoto H, Seino S (1990) Molecular biology of mammalian glucose transporters. Diabetes Care 13 : Bhisitkul DM, Vinik AI, Morrow AL, She JX, Shults J, Powers AC, Maclaren NK (1996) Prediabetic markers in children with stress hyperglycemia. Arch Pediatr Adolesc Med 150: Bingham C, ElIard S, van't Hoff WG, Simmonds HA, Marinaki AM, Badman MK, Winocour PH, Stride A, Lockwood CR, Nicholls AJ, Owen KR, Spyer G, Pearson ER, Hattersley AT (2003) Atypical familial juvenile hyperuricemic nephropathy

79 79 associated with a hepatocyte nuciear factor- l beta gene mutation. Kidney lnt 63: Bingham C, Hattersley AT (2004) Renal cysts and diabetes syndrome resulting from mutations in hepatocyte nuclear factor- l beta. Nephrol Dial Transplant 19: Bingley Pl, Colman P, Eisenbarth GS, Jackson RA, McCulloch OK, Riley W J, Gale EAM (1992) Standardization of IVGTT to predict 100M. Diabetes Care 15: Bláha P, Vignerová J, Riedlová J, Kobzová J, Krejčovský L, Brabec M (2005) 6. celostátní antropologický výzkum dětí a mládeže 200 I Česká republ ika. Státní zdravotní ústav, Praha. p Bloch CA, Clemons P, Sperling MA (1987) Puberty decreases insulin sensitivity. J Pediatr 110: Boutin P, Vasseur F, Samson C, Wahl C, Froguel P (2001) Routine mutation screening of HNF-l alpha and GCK genes in MODY diagnosis: how effective are the techniques of DHPLC and direct sequencing used in combination? Diabetologia 44: Brackenridge A, Pearson ER, Shojaee-Moradie F, Hattersley AT, Russell-Jones O, Umpleby AM (2006) Contrasting insulin sensitivity of endogenous glucose production rate in subjects with hepatocyte nuciear factor-i {beta} and -I {alpha} mutations. Diabetes 55: Brickwood S, Bonthron DT, AI-Gazali LI, Pi per K, Heam T, Wilson DI, Hanley NA (2003) Wolcott-Rallison syndrome: pathogenic insights into neonatal diabetes from new mutation and expression studies of EIF2AK3. J Med Genet 40: Bryan J, Vila-Carriles WH, Zhao G, Babenko AP, Aguilar-Bryan L (2004) Toward linking structure with function in A TP-sensitive K + channels. Diabetes 53: Suppl 3:S104-S Byrne MM, Sturis J, Fajans SS, Ortiz FJ, Stoltz A, Stoffel M, Smith MJ, Bell GI, Halter JB, Polonsky KS (1995) Altered insulin secretory response to glucose in subjects with a mutations in the MODY 1 gene on chromosome 20. Diabetes 44 : Byrne MM, Sturis J, Menzel S, Yamagata K, Fajans SS, Dronsfield MJ, Bain SC, Hattersley AT, Ve/ho G, Froguel P, Bell GI, Polonsky KS (1996) Altered insulin secretory responses to glucose in diabetic and nondiabetic subjects with mutations in the diabetes susceptibility gene MODY3 on chromosome 12. Diabetes 45: C inek O, Šumník Z, Vavřinec J (2005) Dětský diabetes mellitus v České republice: stále více a čím dál dříve. Čas lék českých 144: Codner E, Flanagan S, Ellard S, Garcia H, Hattersley AT (2005) High dose glibenclamide can replace insulin therapy despite transitory diarrhea in early-onset diabetes caused by a novel R20 ll Kir6.2 mutation. Diabetes Care 28: Colombo C, Delvecchio M, Zecchino C, Faienza MF, Cavallo L, Barbetti F (2005) Transient neonatal diabetes mellitus is associated with a recurrent (R20 I H) KCNJ II (KIR6.2) mutation. Diabetologia 48: Cook T, Gebelein B, Mesa K, Mladek A, Urrutia R (1998) Molecular cloning and characterization of TIEG2 reveals a new subfamily of transforming growth factor-

80 80 beta-inducible Sp I-like zinc finger-encoding genes involved in the regulation of cell growth. 1 Biol Chem 273: Cryer P (2004) Glucose counterregulatory honnones (physiology, pathophysiology, and relevance to clinical hypoglycemia). ln Diabetes mellitus: a fundamental and c1inical text. LeRoith D, Olefsky 1M, Taylor SI, Eds. Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins Publishers, p Daniel S, Noda M, Straub SG, Sharp GW (1999) Identification of the docked granule pool responsible for the first phase of glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes 48: DeFronzo RA, Bonadonna RC, Ferrannini E (1992) Pathogenesis of NIDOM: a precarious balance between insulin action and insulin secretion. In Alberti KGMM, OeFronzo FA, Keen H, Zimmet P eds. International textbook of diabetes mellitus. New York: Wiley, p Oelepine M, Nicolino M, Barrett T, Golamaully M, Lathrop G, lulier C (2000) ElF2AK3, encoding translattion initiation Factor 2-alpha kinase 3, is mutated in patients with Wolcott-Rallison syndrome. Nat Genet 25: Oimitriadis G, Newsholme EA (2004) Integration of biochmeical and physiological effects of insulin on the control of blood glucose concentrations. In Diabetes mellitus: a fundamental and clinical text. LeRoith D, Olefsky 1M, Taylor SI, Eds. Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins, p Duck SC, Wyatt DT (1988) Factors associated with brain herniation in the treatment ofdiabetic ketoacidosis. 1 Pediatr 113: Oukes ID, Sreenan S, Roe MW, Levisetti M, Zhou VP, Ostrega O, Bell GI, Pontoglio M, Yaniv M, Philipson L, Polonsky KS (1998) Oefective pancreatic beta-cell glycolytic signal ing in hepatocyte nuclear factor-i alpha-deficient m ice. 1 Bíol Chem 273: Edghill EL, Bingham C, ElIard S, Hattersley AT (2006) Mutations in hepatocyte nuclear factor-i-beta and their related phenotypes. 1 Med Genet 43: Edghill EL, Gloyn AL, Gillespie KM, Lambert AP, Raymond NT, Swift PG, ElIard S, Gale EAM, and Hattersley AT (2004) Activating mutations in the KCN1l1 gene encoding the ATP-Sensitive K + channel subunit Kir6.2 are rare in clinicaj\y defined type 1 diabetes diagnosed before 2 years Diabetes 53: I. 39. Ellard S, Beards F, A Ilen LI, Shepherd M, BaJJantyne E, Harvey R, Hattersley A T (2000) A high prevalence of glucokinase mutations in gestational diabetic subjects selected by clinical criteria. Diabetologia 43: Fajans SS (1990) Scope and heterogeneous nature of Mody. Diabetes Care 13: Fajans SS, BeJl GI, Polonsky KS (2001) Mechanisms of disease: Molecular mechanisms and clinical pathophysiology of maturity-onset diabetes of the young. N Engl 1 Med 345: Frayling TM, Bulamn MP, Ellard S, Appleton M, Oronsfield Ml, Mackie AD, Baird 10, Kaisaki Pl, Yamagata K, Bell Gl, Bain SC, Hattersley AT (1997) Mutations in the hepatocyte nuclear factor-i alpha gene are a common cause of maturity-onset diabetes ofthe young in the UK. Diabetes 46: Frayling TM, Evans lc, Bulman MP, Pearson E, Allen L, Owen K, Bingham C, Hannemann M, Shepherd M, Ellard S, Hattersley AT (2001) Beta-cell genes and

81 81 diabetes: molecular and clinical characterization of mutations in transcription factors. Diabetes 50: S Froguel P, Vaxil\aire M, Sun F, Vel ho G, Zoual i H, Butel MO, Lesage S, Vionnet N, Clement K, Fougerousse F, Tanizawa Y Weissenbach J, Beckmann JS, Lathrop GM, Passa P, Permutt MA, Cohen O (1992) Close linkage of glucokinase locus on chromosome 7p to early-onset non-insulin-dependent diabetes mellitus. Nature 356: Gardner RJ, Mackay OJ, MungalJ AJ, Polychronakos C, Siebert R, Shield JP, Temple IK, Robinson DO (2000) An imprinted locus associated with transient neonatal diabetes mellitus. Hum MO.I Genet 9: G loyn AL (2003) Glucokinase (GCK) mutations in hyper- and hypoglycemia: maturity-on set diabetes of the young, permanent neonatal diabetes, and hyperinsulinemia of infancy. Hum Mutat 22: Gloyn AL, Pearson ER, Antcliff JF, Proks P, Bruining GJ, Slingerland AS, Howard N, Srinivasan S, Silva JM, Molnes J, Edghill EL, Frayling TM, Temple IK, Mackay O, Shield JP, Sumnik Z, van Rhijn A, Wales JK, Clark P, Gorman S, Aisenberg J, Ellard S, Njolstad PR, Ashcroft FM, Hattersley AT (2004) Activating mutations in the gene encoding the ATP-sensitive potassium-channel subunit Kir6.2 and permanent neonatal diabetes. N Engl J Med 350: G loyn AL, Reimann F, Girard C, Edghill EL, Proks P, Pearson ER, Temple IK, Mackay OJ, Shield JP, Freedenberg O, Noyes K, Ellard S, Ashcroft FM, Gribble FM, Hattersley AT (2005) Relapsing diabetes can result from moderately activating mutations in KCNJ11. Hum Mol Genet 14: Gragnoli C (2001) Early-onset type II diabetes mellitus in ltalian families dueto mutations in the genes encoding hepatic nuclear factor 1 a and glucokinase. Oiabetologia 44: Gribble FM, Reimann F (2003) Sulphonylurea action revisited: the post-clon ing era.oiabetologia 46: Hani EH, Stoffers OA, Chevre JC, Ourand E, Stanojevic V, Oina C, Habener JF, Froguel P (1999) Oefective m utations in the insu!in promoter factor-l (IPF -1) gene in late-onset type 2 diabetes mellitus. J Clin Invest 104: R41-R Hansen SK, Parrizas M, Jensen ML, Pruhova S, Ek J, Boj SF, Johansen A, Maestro MA, Rivera F, Eiberg H, Andel M, Lebl J, Pedersen 0, Ferrer J, Hansen T (2002) Genetic evidence that HNF-I alpha-dependent transcriptional control of HNF-4 alpha is essential for human pancreatic beta cell function. J Clin Invest 110: Hattersley AT (1998) Maturity-onset diabetes of the young: clinical heterogeneity explained by genetic heterogeneity. Oiabet Med 15: Hattersley A T, Ashcroft FM (2005) Activating mutations in Kir6.2 and neonatal diabetes: new clinical syndromes, new scientific insights, and new therapy. Diabetes 54: Hattersley AT, Pearson ER (2006) Minireview: pharmacogenetics and beyond: the interaction of therapeutic response, beta-cell pbysiology and genetics in diabetes. Endocrinology 147: Heimberg H, De Vos A, Moens K, Quartier E, Bouwens L, Pipeleers O, Van Schaftingen E, Madsen 0, Schuit F (1996) The glucose sensor protein glucokinase

82 82 is expressed in glucagon-producing alpha-cells. Proc Natl Acad Sci U S A 93: l. 57. Herskowitz RD, Wolfsdorf JI, Ricker AT, Vardi P, Dib S, Soeldner JS, Eisenbarth GS (1988) Transient hyperglycemia in childhood: identification of a subgroup with imminent diabetes mellitus. Diabetes Res 9: Herskowitz-Dumont R, Wolfsdorf JL, Jackson RA, Eisenbarth GS (1993) Distinction between transient hyperglycemia and early insulin-dependent diabetes mellitus in childhood: a prospective study of incidence and prognostic factors. J Pediatr 123: I-Jori S, Nomura T, Sakaguchí S (2003) Control of regulatory T-cell development by the transcription factor foxp3. Science 299: l. 60. Horikawa Y, lwasaki N, Hara M, Furuta H, Hinokio Y, Cockburn B, Lindner T, Yamagata K, Ogata M, Tomonaga 0, Kuroki H, Kasahar T, Jwamoto Y, Bell GI (1997) Mutation in hepatocyte nuclear factor-l b gene (TCF2) associated with MODY. Nature Genetics 17: Hoveyda N, Shield JPH, Garrett C, Chong WK, Beardsall K, Bentsi-Enchill E, Mallya H, Thompson MH (1999) Neonatal diabetes mellitus and cerebellar hypoplasiajagenesis: report of a new recessive syndrome. J Med Genet 36: Hui DY, Howles PN (2002) Carboxyl ester lipase: structure-function relationship and physio logical role in lipoprotein metabolism and atherosclerosis. J Lipid Res. 43: Chťwre JC, Hani EH, Boutin P, Vaxillaire M, Blanche H, Vionnet N, Pardini VC, Timsit J, Larger E, Charpentier G, Beckers D, Maes M, Bellanne-Chantelot C, Velho G, Froguel P (1998) Mutation screening in 18 Caucasian families suggest the existence of other MODY genes. Diabetologia 41: lafusco D, Stazi MA, Cotichini R, Cotellessa M, Martinucci ME, Mazzella M, Cherubini V, Barbetti F, Martinetti M, Cerutti F, Prisco F (2002) Permanent diabetes mellitus in the first year of life. Diabetologia 45 : Inoue H, Fener J, Warren-Perry M, Zhang Y, Millns H, Turner RC, Elbein SC, Hampe CL, Suarez BK, Tnagaki N, Seino S, Permutt MA (1997) Sequence variants in the pancreatic islet beta-cell inwardly rectifying K + channel Kir 6.2 (Bir) gene: identification and lack of role in Caucasian patients with NIDDM. Diabetes 46: Isomaa B, Henricsson M, Lehto M, Forsblom C, Karanko S, Sarelin L, Haggblom M, Groop L (1998) Chronic diabetic complications in patients with MODY3 diabetes. Diabetologia 41 : Iwasaki N, Ogata M, Tomonaga 0, Kuroki H, Kasahara T, Vano N, lwamoto Y (1998) Liver and kidney function in Japanese patiens with maturity-onset diabetes of the young. Diabetes Care 2 I: 2 I Johansen A, Ek J, Mortensen HB, Pedersen 0, Hansen T (2005) Half of clinically defined maturity-onset diabetes of the young patients in Denmark do not have mutations in HNF4A, GCK, and TCFl. J Clin Endocrinol Metab 90: John EG (2002) Is reduced first-phase insulin release the earliest detectable abnormality in individuals destined to develop type 2 diabetes? Diabetes 51: S 117- S 121.

83 Jonnson J, Carlsson L, Edlund T, Edlund H (1994) Insulin-promoter-factor I is required for pancreas development in mice. Nature 371: Kahn SE (2000) The importance of the fi-cell in the pathogenesis of type 2 diabetes mellitus. Amer J Med 108, Supp\. 6a: 2S-8S. 72. Kamiya M, Judson H, Okazaki Y, Kusakabe M, Muramatsu M, Takada S, Takagi N, Arima T, Wake N (2000) The cell cycle control gene ZAC/PLAGLl is imprinted a strong candidate gene for transient neonatal diabetes. Hum Mol Genet 9: Keskinen P, Korhonen S, Kupila A, Veijola R, Erkkila S, Savolainen H, Arvilommi P, Simell T, llonen J, Knip M, Simell O (2002) First-phase insulin response in young healthy children at genetic and immunological risk for Type I diabetes. Diabetologia 45: Klupa T, Edghill EL, Nazim J, Sieradzki J, Ellard S, Hattersley AT, Malecki MT (2005) The identification of a R201 H mutation in KCNJlI, which encodes Kir6.2, and successful transfer to sustained-release sulphonylurea therapy in a subject with neonatal diabetes: evidence for heterogeneity of beta cell function among carriers of the R20 I H mutation. Diabetologia 48: Kolatsi-Joannou M, Bingham C, Ellard S, Bulman MP, Allen LIS, Hattersley AT, Woolf AS (2001) Hepatocyte nuclear factor-}-beta: a new kindred with renal cysts and diabetes and gene expression in normal human development. J Am Soc Nephrol 12: Kulmala P (2003) Prediabetes in children: natural history, diagnosis, and preventive strategies. Paediatr Drugs 5: Kulmala P, Rahko J, Savola K, Vahasalo P, Veijola R, Sjoroos, M, Reunanen A, flonen J, Knip M (2000) Stability of autoantibodies and their relation to genetic and metabolit markers of Type I diabetes in initially unaffected schoolchildren. Diabetologia 43: Lebl J, Průhová Š (2004) Diferenciální diagnostika hyperglykémie. In Lebl J, Zapletalová J, Koloušková S. Dětská endokrinologie. 1. vyd. Praha: Galén, p Ledermann HM (1995) Is maturity onset diabetes at young age (MODY) more common in Europe than previously assumed? Lancet 345: Levy-Marchal C, Dubois F, Noěl M, Tichet J, Czemichow P (1995) Immunogenetic determinants and prediction of IDDM in French schoolchi Idren. Diabetes 44: Liang Y, Najafi H, Smith RM, Zimmerman EC, Magnuson MA, Tal M, Matschinsky FM (1992) Concordaot glucose induction of glucokinase, glucose usage, and glucose-stimulated insulin release in pancreatic islets maintained in organ culture. Diabetes 41: Lindner TH, Cockburn BN, Bell GI. Molecular genetics of MODY in Germany (1999) Diabetologia 42: Lombardo D (2001) Bile sajt-dependent lipase: its pathophysiological implications. Biochim Biophys Acta 1533: Lorini R, Vanelli M (1996) Normal values of first-phase insulin response to intravenous glucose in healthy ltalian children and adolescents. The Prediabetes Study Group of the Italian Society for Pediatric Endocrinology and Diabetology (SIEDP). J Pediatr Endocrinol Metab 9:

84 Ma O, ShieJd lph, Dean W, Lederc I, Knauf C, Burcelin R, Rutter HA, Kelsey G (2004) Impaired glucose homeostasis in transgenic mice expressing the human transient neonatal diabetes mehitus locus, TNDM. 1 CJin Invest 114: Macfarlane WM, FrayJing TM, ElIard S, Evans le, Allen LIS, Bulman MP, Ayres S, Shepherd M, Clark P, MiJlward A, Demaine A, Wilkin T, Docherty K, Hattersley AT (1999) Missense mutations in the insulin promoter factor-i gene predispose to type 2 diabetes. 1 Clin Invest 104: R33-R Maestro MA, Boj SF, Luco RF, Pierreux CE, Cabedo 1, Servitja 1M, German MS, Rousseau GG, Lemaigre FP, Ferrer 1 (2003) Hnf6 and Tcf2 (MODY5) are linked in a gene network operating in a precursor cell domain of the embryonic pancreas. Hum Mol Genet 12: Mahalingam B, Cuesta-Munoz A, Davis EA, Matschinsky FM, Harrison R W, Weber IT (1999) Structural model of human glucokinase in complex with glucose and ATP: implications for the mutants that cause hypo- and hyperglycemia. Diabetes 48: Marquis E, Robert ]J, Bouvattier C, Bellanne-Chantelot C, lunien C, Diatloff-Zito C (2002) Major difference in aetiology and phenotypic abnormalíties between transient and permanent neonatal diabetes. 1 Med Genet 39: Masopust 1 (1998) Poruchy intermediárního metabolismu. In Masopust 1 Klinická biochemie. 1. vyd. Praha: Karolinum 1998, p Massa 0, lafusco O, O' Amato E, Gloyn AL, Hattersley AT, Pasquino B, Tonini G, Dammacco F, Zanette G, Meschi F, Porzio 0, Bottazzo G, Crino A, Lorini R, Cerutti F, Vanelli M, Barbetti F, Early Onset Diabetes Study Group of the Italian Society of Pediatric Endocrinology and Diabetology (2004) KCNl II activating mutations in Italian patients with perrnanent neonatal diabetes. Human Mutat 25: Massa 0, Meschi F, Cuesta-Munoz A, Caumo A, Cerutti F, Toni S, Cherubíni V, Guazzarotti L, Sulli N, Matschinsky FM, Lorini R, Iafusco O, and Barbetti F (2001) High prevalence of glucokinase mutations in ltalian children with MODY. Inf1uence on glucose tolerance, first-phase insulin response, insulin sensitivity and BMl. Diabetes Study Group of the Italian Society of Paediatric Endocrinology and Diabetes (SIEDP). Diabetologia 44: Matschinsky FM (1990) Glucokinase as glucose sensor and metabolic signal generator in pancreatic beta-cells and hepatocytes. Diabetes 39: Matschinsky FM (2002) Regulation of pancreatic ~-cell glucokinase: from basics to therapeutics. Diabetes 51, Suppl. 3: S394 -S Matschinsky FM, Glaser B, Magnuson MA (1998) Perspectives in diabetes pancreatic ~-cell glucokinase closing the gap between theoretical concepts and experimental realities. Diabetes 47: Matschinsky F, Liang Y, Kesavan P, Wang L, Froguel P, Velho G, Cohen O, Permutt MA, Tanizawa Y, letton TL, Niswender K, Magnuson MA (1993) Glucokinase as pancreatic beta cell glucose sensor and diabetes gene. 1 Clin Invest 92: Matschinsky FM, Magnuson MA, Zelent O, letton TL, Doliba N, Han Y, Taub R, Grimsby 1 (2006) Perspectives in diabetes: the network of glucokinase expressing cells in glucose homeostasis and the potential of glucokinase activators for diabetes therapy. Diabetes 55: 1-12.

85 McCowen KC, Malhotra A, Bristrian BR (200 I) Stress-Induced Hyperglycemia. Crit Care Clin 17: Menzel R, Kaisaki Pl, Rjasanowski J, Heinke P Kerner W, Menzel S (1998) A low renal threshold for glucose in diabetic patients with the mutation in the hepatocyt nuclear factor-4 alpha (HNF-l alp ha) gene. Diabet Med 15: Metz C, Cave H, Bertrand AM, Oeffert C, Gueguen-Giroux B, Czernichow P, Polak M, NOM French Study Group. Neonatal diabetes mellitus (2002) Neonatal diabetes mellitus: chromosomal analysis in transient and permanent cases. 1 Pediatr 141: Mizock BA (200 I) Alterations in fud metabolism in critical illness: Hyperglycaemia. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 15: Mizock BA (2003) Blood glucose management during critical illness. Rev Endocr Metab Oisord 4: Miller AM, Oalgaard LT, Pociot F, Nerup J, Hansen T, Pedersen (1998) Mutations in the hepatocyte nuclear factor-l alpha gene in Caucasian families originally classified as having Type I diabetes. Oiabetologia 41: Moller AM, Oalgaard L T, Pociot F, Nerup J, Hansen T, Pedersen (1998) Mutations in the hepatocyte nuclear factor-l alp ha gene in Caucasian families originally classified as having Type I diabetes. Oiabetologia 41: Mrena S, Savola K, Kulmala P, Akerblom HK, Knip M, Childhood Diabetes in Finland Study Group (2003) Natural course of preclinical type I diabetes in siblings ofaffected children Acta Paediatr 92: Neve B, Fernandez-Zapico ME, Ashkenazi-Katalan V, Oina C, Hamid YH, Joly E, Vaillant E, Benmezroua Y, Ourand E, Bakaher N, Oelannoy V, Vaxillaire M, Cook T, Dallinga-Thie GM, Jansen H, Charles MA, Clement K, Galan P, Hercberg S, Helbecque N, Charpentier G, Prentki M, Hansen T, Pedersen 0, Urrutia R, Melloul D, Froguel P (2005) Role of transcription factor KLF II and its diabetes-associated gene variants in pancreatic beta cell function. Proc Nat Acad Sci 102: Njolstad PR, Sagen N, Bjorkhaug L, Odili S, Shehadeh N, Bakry O, Sarici SU, Alpay F, Molnes J, Molven A, Sovik 0, Matschinsky FM (2003) Permanent neonatal diabetes caused by glucokinase deficiency: inborn error of the glucoseinsulin signaling pathway. Diabetes 52: Njolstad PR, Sovik 0, Cuesta-Munoz A, Bjorkhaug L, Massa 0, Barbetti F, Undl ien DE, Shiota C, Magnuson MA, Molven A, Matschinsky FM, Bell Gl (200 I) Neonatal diabetes mellitus due to complete glucokinase deficiency. N EngJ J Med 344: hlsson H, Karlsson K, Edlund T (1993) IPFl, a homeodomain-containing transactivator ofthe insulin gene. EMBO J 12: nkamo P, Vaananen S, Karvonen M, TuomiJehto J (1999) Worldwide increase in incidence oftype 1 diabetes - the analysis ofthe data on published incidence trends. Oiabetologia 42: Otonkoski T, Roivainen M, Vaarala 0, Dinesen B, Leipala JA, Hovi T, Knip M (2000) Neonatal type I diabetes associated with maternal echovirus 6 infection: a case report. Oiabetologia 43: Page RC, Hattersley AT, Levy JC, Barrow B, Patel P, Lo D, Wainscoat JS, Permutt MA, Bell GI, Turner RC (1995) Clinical characteristics of subjects with a missense mutation in glucokinase. Diabet Med 12:

86 Parviz F, Matullo C, Garrison WO, Savatski L, Adamson JW, Ning G, Kaestner KH, Rossi JM, Zaret KS, Ouncan SA (2003) Hepatocyte nuclear factor 4-alpha controls the development of a hepatic epithelium and liver morphogenesis. Nature Genet 34: Pearson ER, Badman MK, Lockwood CR, Clark PM, Ellard S, Bingham C, Hattersley A T (2004) Contrasting diabetes phenotypes associated with hepatocyte nuclear factor-i alpha and -1 beta mutations. Diabetes Care 27: Pearson ER, Flechtner 1, Njolstad PR, Malecki MT, Flanagan SE, Larkin B, Ashcroft FM, Klimes 1, Codner E, Iotova V, Slingerland AS, Shield J, Robert JJ, Holst JJ, Clark PM, Ellard S, Sovik 0, Polak M, Hattersley AT (2006) Neonatal Diabetes lnternational Collaborative Group switching from insulin to oral sulfonylureas in patients with diabetes due to Kir6.2 mutations. N Engl J Med 355: Pearson ER, LiddeH WG, Shepherd M, Corrall RJ, Hattersley A T (2000) Sensitivity to sulphonylureas in patients with hepatocyte nuclear factor 1 alpha gene mutations: evidence for pharmacogenetics in diabetes. Oiab Med 17: Pearson ER, Starkey BJ, Powell RJ, Gribble FM, Clark PM, Hattersley AT (2003) Genetic cause of hyperglycaemia and response to treatment in diabetes. Lancet 362: Pearson ER, Velho G, Clark P, Stride A, Shepherd M, FrayJing TM, Bulman MP, Ellard S, Froguel P, Hattersley AT (2001) ~-cell genes and diabetes: quantitative and qualitative differences in the pathophysiology of hepatic nuclear factor-i Cl and gjucokinase mutations. Diabetes 50: S 1 O I-S I Po lak M (2005) Diabetes sucrés néonatals. In :Endocrinologie périnatale. Édit Groupe Liaisons SA p PoJak M, Cavé H (2007) Neonatal diabetes mellitus: a disease linked to multiple Mechanisms. Orphanet Journal ofrare Oiseases 2: Po lak M, Shield J (2004) Neonatal and very-early-onset diabetes meljitus. Semin Neonatol 9: Pontiroli AE (2004) Type 2 diabetes mellitus is becoming the most common type of diabetes in school children. Acta Oiabetol41: Pontoglio M, Sreenan S, Roe M, Pugh W, Ostrega O, Ooyen A, Pick AJ, 8aldwin A, Velho G, Froguel P, Levisetti M, Bonner-Weir S, Bell GI, Yaniv M, Po Ionsky KS (1998) Oefective insulin secretion in hepatocyte nuclear factor I alpha-deficient mice. J Clin Invest lol: Porte OJ (1991) Banting lecture Beta cells in type 2 diabetes melllitus. Diabetes 40: Proks P, Antcliff JF, Lippiat J, Gloyn AL, Hattersley AT, Ashcroft FM (2004) Molecu lar basis of Kir6.2 mutations associated with neonataj diabetes or neonatal diabetes plus neurological features. Proc Natl Acad Sci USA 101 : Proks P, Arnold AL, 8ruining J, Girard C, Flanagan SE, Larkin B, Colclollgh K, Hattersley A T, Ashcroft FM, Ellard S (2006) A heterozygous activating mutation in the sulphonylurea receptor SURl (ABCC8) causes neonatal diabetes. Hum Mol Genet 15: Pro ks P, Girard C, Ashcroft FM (2005a) Functional effects of KCNJ11 mlltations causing neonatal diabetes: enhanced activation by MgATP. Hum Mol Genet 14:

87 Proks P, Girard C, Haider S, Gloyn AL, Hattersley AT, Sansom MS, Ashcroft FM (2005b) A gating mutation at the internal mouth of the Kir6.2 pore is associated with DEND syndrome.embo Rep 6: Pruhova S, Ek J, Lebl J, Sumnik Z, Saudek F, Andel M, Pedersen 0, Hansen T (2003) Genetic epidemiology of MODY in the Czech republic: new mutations in the MODY genes HNF-4a, GCK and HNF-la. Diabetologia 46: Raeder H, Johansson S, Holm PI, Haldorsen IS, Mas E, Sbarra V, Nermoen I, Eide SA, Grevle L, Bjorkhaug L, Sagen JV, Aksnes L, Sovik 0, Lombardo D, Molven A, Njolstad PR (2006) Mutations in the CEL VNTR cause a syndrome of diabetes and pancreatic exocrine dysfunction. Nature Genetics 38: \. Reinehr T (2005) Clinical presentation of type 2 diabetes mellitus in children and adolescents. lntl Obes (Lond) Suppl2: SI05-SII Sagen JV, Raeder H, Hathout E, Shehadeh N, Gudmundsson K, Blevre H, Abuelo D, Phornphutkul C, Moines J, Bell Gl, Gloyn AL, Hattersley AT, Molven A, Sovik 0, Njolstad PR (2004) Permanent neonatal diabetes due to mutations in KCNJlI encoding Kir6.2: patient characteristics and initial response to sulfonylurea therapy. Diabetes 53: Scohy S, Gabant P, Van Reeth T, Hel1veldt V, Dreze PL, Van Vooren P, Riviere M, Szpirer J, Szpiper C (2000) ldentification of KLF 13 and KLF 14 (SP6), novel members ofthe SPIXKLF transcription factor family. Genomics 70: I Seino S (1999) ATP-sensitive potassium channels: a model of heteromultimeric potassium channellreceptor assemblies. Ann Rev Physiol 61: Sellick GS, Barker KT, Stolte-Dijkstra l, Fleischmann C, Coleman RJ, Garrett C, Gloyn AL, Edghill EL, Hattersley AT, Wellauer PK, Goodwin G, Houlston RS (2004) Mutations in PTFIA cause pancreatic and cerebellar agenesis. Nat Genet 36: Sennée V, Wattem KM, Delépine M, Rainbow LA, Haton C, Lecoq A, Shaw NJ, Robert ]J, Rooman R, Diatloff-Zito C, Michaud JL, Bin-Abbas B, Taha D, Zabel B, Franceschini P, Topaloglu AK, Lathrop GM, Barrett TG, Nicolino M, Wek RC, and Julier C (2004) Wolcott-Rallison Syndrome. Clinical, genetic, and functional study of ElF2AK3 mutations and suggestion of genetic heterogeneity. Diabetes 53: Schatz DA, Kowa H, Winter WE, Riley W J (1989) Natural history of incidental hyperglycem ia and glycosuria of childhood. J Pediatr 115: Shehadeh N, On A, Kessel T, Perlman R, Even L, Naveh T, Soloveichik L, Etzioni A (1997) Stress hyperglycemia and the risk for the development of type 1 diabetes. J Pediatr Endocrinol Metab 10: Shi Y, Vattem KM, Sood R, An J, Liang J, Stramm L, Wek RC (1998) Identification and characterization of pancreatic eukaryotic initiation factor 2 alpha-subunit dinase, PEK, involved in translational contro!. Mol Cell Biol 18: Shield JP (2000) Neonatal diabetes: new insights into aetiology and implications. Horm Res 53, SuppJ 1: 7-1 \ Shield JP, Gardner RJ, Wadsworth EJK, Whiteford ML, James RS, Robinson DO, Baum JD, Temple lk (1997) Aetiopathology and genetic basis of neonatal diabetes. Arch Dis Child 76: F39-F42.

88 Shigeoka AO, Chance PF, Fain P, Barker DF, Book LS, Rallison ML (1993) An X linked T cell activation syndrome maps near the Wiskott-Aldrich locus Xp 11.2 : diarrhea, respiratory infections, autoimmune disease and endocrinopathies in the absence of plate let defects. Clin Res 41, Suppl: 41 A Shih D, Dansky H, Fleisher M, Assmann G, Fajans SS, Stoffel M (2000) Genotype/Phenotype relatíonships in HNF-4alpha/MODY I: haploinsufficiency is associated with reduced apolipoprotein (Afl), apolipoprotein (ClIl), lipoprotein (a), and triglyceride levels. Diabetes 49: Shih DQ, Screenan S, Munoz KN, Philipson L, Pontoglio M, Yaniv M, Polonsky KS, Stoffel M (2001) Loss ofhnf-la/pha function in mice leads to abnormal expression of genes involved in pancreatic islet development and metabolism. Diabetes 50: Shyng SL, Nichols CG (1997) Octameric stoichiometry of the KA TP channel complex. J Gen Physiol 110: Slingerland SA (2006a) Monogenic diabetes in children and young adults: challenges for researcher, clinician and patient. Rev Endocrinol Metab Disord 7: Slingerland AS, Hattersley AT (2005) Mutations in the Kir6.2 subunit ofthe KATP channel and permanent neonatal diabetes: new insights and new treatment. Ann Med 37: Slingerland AS, Nuboer R, Hadders-Algra M, Hattersley AT, Bruining GJ (2006b) Improved motor development and good long-term glycaem ic control with sulfonylurea treatment in a patient with the syndrome of intermedíate developmental delay, early-onset generalised epi1epsy and neonatal diabetes associated with the V59M mutation in the KCNJ 1 1 gene. Diabetología 49: Smith CP, Archibald HR, Thomas JM, Tam AC, Williams AJK, Gale EAM, Sabate MO (1988a) Basal and stimulated insulin levels rise with advancing puberty. Clin Endocrinol28: Smith CP, Williams AJK, Thomas JM, Archibald HR, A!gar YD, Bottazzo GF, Gale EAM, Sabate MO (l988b) The pattem of basal and stimulated insulin response to intravenous glucose in first degree relatives of Type 1 (insulindependent) diabetic children and unrelated adu!ts aged 5 to 50 years. Diabetologia 31: Sovik O, Njolstad P, Folling 1, Sagen J, Cockbum BN, Bell GI (1998) Hyperexcitability to sulphonylurea in MODY3. Diabetologia 41: Srikanta S, Ganda OP, Gleason RE, Jackson RA, Soeldner JS, Eisenbarth GS (1984) Pre-type 1 diabetes. Linear los s of beta cell response to intravenolls glucose. Diabetes 33: Stephens JM, Bagby GJ, Pekala PH, Shepherd RE, Spitzer Jl, Lang CH (1992) Differentia! regulation of g!ucose transporter gene expression in adipose tissue or septic rats. Biochem Biophys Res Commun 183: Shepherd M, Pearson ER, Houghton J, Salt G, ElIard S, Hattersley AT (2003) No deterioration in glycemic contro! in HNF I a maturity-onset diabetes of the young following transfer from long-term insulin to sulphonylureas. Diabetes Care 26:

89 Stoffers DA, Ferrer J, Clarke WL, Haben r JF (l997a) Early-onset type-ii diabetes mellitus (MODY4) linked to IPFl. (Letter) Nature Genet 17: l Stoffers DA, Zinkin NT, Stanojevic V, Clarke WL, Habener JF (l997b) Pancreatic agenesis attributable to a single nucleotide deletion in the human IPF-I gene coding sequence. Nat Genet 15: Stride A, Hattersley AT (2002a) Different genes, different diabetes: lessons from maturity-onset diabetes ofthe young. Ann Med 34: Stride A, Vaxillaire M, Tuomi T, Barbetti F, Njolstad PR, Hansen T, Costa A, Conget I, Pedersen 0, Sovik 0, Lorini R, Groop L, Froguel P, Hattersley AT (2002b) The genetic abnormality in the beta ceu determines the response to an oral glucose load. Diabetologia 45: Sturis J, Kurland IJ, Byrne MM, Mosekilde E, Froguel P, Pilkis SJ, Bell GI, Polonsky KS (1994) Compensation in pancreatic beta-cell function in subjects with glucokinase mutations. Diabetes 43: Tamimi R, Steingrimsson E, Copeland NG, Dyer-Montgomery K, Lee JE, Hernandez R, Jenkins NA, Tapscott SJ (1996) The NEUROD gene maps to human chromosome 2q32 and mou se chromosome 2. Genomics 34: Tankova T, Dakovska L, Kirilov G, Koev D (2003) lntravenous glucose tolerance test and anti-gad65 antibodies in the diagnosis of the type of diabetes mellitus. Pract Diab Int 20: Temple IK, Gardner RJ, Mackay DJ, Barber JC, Robinson DO, Shield JP (2000) Transient neonatal diabetes: widening the understanding of the etiopathogenesis of diabetes. Diabetes 49: Toaima D, Nake A, Wendenburg J, PraedicO\'I K, Rohayem J, Engel K, Galler A, Gahr M, Lee-Kirsch M (2005) Identification of Novel GCK and HNFIA/TCFI mutations and polymorphisms in German families with Maturity-onset diabetes of the young (MODY). Hum Mutat 25: Tucker Sl, Gribble FM, Zhao C, Trapp S, Ashcroft FM (1997) Truncation of Kir6.2 produces ATP-sensitive K + channels in the absence of the sulphonylurea receptor. Nature 387: Valerio G, Franzese A, Karlin E, Pecile P, Perini R, Tenore A (2001) High prevalence of stress hyperglycaemia in children with febrile seizures and traumatic inj uries. Acta Paed iatr 90: Vardi P, Shehade N, Etzoni A, Herskowitz T, Soloveizik L, Shmuel Z, Golan D, Barzilai D, Benderly A (1990) Stress hyperglycemia in childhood: a very high risk group for the development oftype 1 diabetes. J Pediatr 117: Vavřinec J, Cinek 0, Šumník Z, Koloušková S, Malcová H, Dřevínek P, Šnajderová M (2002) Predikce diabetes mellitus I. typu u českých prvostupňovych přibuzných diabetických pacientů. Vnitřní lékařství 48: Vaxillaire M, Populaire C, Busiah K, Cavé H, Gloyn AL, Hattersley AT, z rnichow P, Froguel P, Polak M (2004) Kir6.2 mutations are a common cause of permanent neonatal diabetes in a large cohort offrench patients. Diabetes 53: Velho G (2003a) Le diabete MODY en pratique. Quand y penser? Pourquoi y penser? Ann Endocrinol 64, Suppl 1: S 17-S Velho G, Bellanné-Chantelot C (2003b) Le MODY: modele d'étude d'interactions génotype/phénotype dans le diabete de type 2. Médecine Sciences 19: