Imobilization Techniques. Figure 1. Classification of enzyme immobilization methods

Transkript

1

2 Imobilization Techniques Figure 1. Classification of enzyme immobilization methods

3 Methods for Insoluble Enzymes Carrier Binding Enzymes are large protein molecules with chemically reactive groups, ionic groups, and hydrophilic domains that can all participate in the immobilization process through physical adsorption, ionic, hydrophobic binding, or covalent linkage.

4 Methods for Insoluble Enzymes Physical Adsorption Ionic Binding Hydrophobic Binding Chelate Binding. Biospecific Binding

5 Nespecifická sorpce anorganické materiály neutrální polymerni nosiče Výhody: Jednoduchý postup: roztok enzymu do kontaktu s povrchem adsorbentu Nízká cena Opakované použití nosiče Rychlá sorpce Nevýhody: Slabé vazby labilní zachycení snadná desorpce Často částečná nebo úplná inaktivace Vyšší koncentrace solí Vyšší koncentrace substrátu urychlují desorpci Omezení negativních vlivů: Fixace sorbovaného enzymu zesítěním bifunkčními činidly Elektrodeposice ( kolagen )

6 Methods for Insoluble Enzymes Physical Adsorption. Bentonity enzyme adheres to the surface attachment by physical interactions: van der Waals forces hydrogen bonding hydrophilic hydrophobic effects. no conformational changes occur in the enzyme loss of activity is minimal. binding forces between the enzyme and carrier are generally weak leakage of enzyme by desorption may occur in flow systems. changes of operational parameters such as ph, ionic strength, or temperature can increase leakage dramatically. alumina, activated carbon, clay, diatomaceous earth, glass, and hydroxyapatite.

7 Methods for Insoluble Enzymes Ionic Binding simple way of immobilizing enzymes ion ion interactions (stronger than physical adsorption) binding stability is affected by changes of ph or ionic strength anion and cation exchangers can be used as carriers

8

9 Ionexy Katexy záporný náboj vazba kationtů Anexy kladný náboj vazba aniontů

10 silný anex Q Sepharosa 0,1 M NaOH

11 Nosiče polystyren Amberlit, Dowex celulosa X-Sephacel dextran X-Sephadex prokřížená agarosa X-Sepharosa syntetické polymery MonoBeads, MiniBeads (Q, S)

12 DEAE-Sephacel velikost částic µm X-Sephadex prokřížený dextran Sephadex G25 nebo G 50

13 Údaje od výrobce

14 Výběr vhodného ph pro ionexovou vazbu

15 Eluční gradient ph gradient

16 gradient iontové síly lineární x skokový

17 Immobilizace na ionexech Výhody: Snadnost a jednoduchost Opakované použití nosiče Relativně vysoká vazební kapacita Nevýhody: Disociace při zvýšení iontové síly Disociace při změně ph Opatření: Zvýšení náboje enzymu chemickou modifikací např.polyamin. enzym. pr. se vázaly prakticky ireverzibilně na Katex (DEAE celulozu) amyloglukoxidasa kont. hydrolysa škrobu - 3 týdny bez ztráty activity

18 Hydrofobní interakce ( imobilizace, hydrofobní chromatografie ) Nosič: Agarosa s nepolárními substituenty ( alkylagarosa ) Sepharose NH (CH2)nx x = H, NH2, COOH, OH, CH3, C6H5 aj. Princip: Hydrofobní raménko alkyl. řetězce se zasune do hydrofobní kapsy proteinu Sepharose NH (CH2)n CH3 n=0-7 Schopnost vázat enzym je závislá na délce uhlovod. řetězce Při: n = 0-1 fosforylasa b neinteragovala n=2 - interag. částečně n=3 - sorbována Eluce možná deformačními pufry, reversní změny struktury n = 5 fosforylasa b silně sorbována Uvolnění možné 0,2M kys. octovou, enzym inaktivní

19 Hydrofobní interakce Měření na základě jejich adsorpce na hydrofobní gely neionogenní hydrofobní gel:sepharose 4-B ( s váz. hydrazidem kys. kaprylové) OVA < β - laktoglobulin < HSA neváže se částečně se váže silně se váže +3M NaCl zvýšní sorpce 3M guanidin HCl ( vzhledem k vysol.efektu ) eluce vzrůstající koncentrace solí silnější hydrofobní interakce nutno rozlišovat nosiče obsahující jen hydrofobní skupinu a nosiče obsahující též ionog. skup. ( např. benzoylová DEAE celulosa ) nebo Carboxymethyl benzylamide sulfonate dextrans (CMDBS), t zv. amphiphilic gels ( obojetné )

20 Dextran Carboxymethyl benzylamide sulfonate dextrans (CMDBS), a family of biospecific polymers endowed with numerous biological properties: A review Journal of Biomedical Materials Research Volume 48, Issue 4, Date: 1999, Pages: Delphine Logeart-Avramoglou, Jacqueline Jozefonvicz

21 vliv soli na protein Stacionární fáze vazba hydrofobních oblastí na povrchu proteinu v H2O slabé interakce přídavek soli méně hydrofobní než RPC Mobilní fáze H2O/sůl (~1 M) nejčastěji (NH4)2SO4

22 Eluce klesajícím gradientem soli (1 M 0 M) stacionární fáze nejméně hydrofobní látka středně hydrofobní látka velmi velmi hydrofobní hydrofobní kontaminace látka

23 typy stacionární fáze výběr ligandu Ether < Isopropyl < Butyl < Octyl < Phenyl

24 použití hydrofobních afinit vysoké rozlišení (gradientová eluce) skupinová separace (kroková eluce) separace proteinů na základě jejich hydrofobicity koncentrace naředěného vzorku vhodná jako první nebo střední purifikační krok vhodná jako purifikační krok po precipitaci síranem amonným

25 separace látek na základě jejich hydrofobicity hydrofobní chromatografie x chromatografie na reversní fázi hydrofobní interakce musí být podpořena solí eluce snižující se koncentrací soli lysozym stacionární fáze je vysoce substituovaná CH řetězci vysoká hydrofobicita proteiny, peptidy a oligonukleotidy se adsorbují i v čisté H2O desorbce organická rozpouštědla (např. acetonitril v H2O) vysoká hydrofobicita nižší hydrofobicita vysoce hydrofilní méně hydrofilní

26 Mechanismus rozdělení látky mezi dvě fáze (různé polární vlastnosti)

27 Nepolarní látky Van der Waalsovy interakce odolné vůči polárním rozpouštědlům Polární látky dipolové interakce, vodíkové vazby Voda rozpouštědlo pro polární látky (HX- skupiny X: O, Cl, F, N)

28 Mechanismus adsorbce malé organické molekuly +/rozpustné ve stacionární fázi Peptidy i proteiny mohou interagovat s hydrofobním nosičem Větší velikost nemohou být kompletně pohlceny hydrofobní stacionární fází Velká pravděpodobnost interakce více míst molekuly

29 Pokles polarity mobilní fáze oslabuje hydrofobní interakce Eluční křivka odpovídá distribuci mezi stacionární a mobilní fázi.

30 nejméně hydrofobní látka středně hydrofobní látka velmi velmi hydrofobní hydrofobní kontaminace látka stacionární fáze Ekvilibrace Aplikace vzorku a promytí Gradientová eluce Regenerace

31 Mobilní fáze Organické rozpouště dlo Vhodné pro: Viskosita Poznámka Methanol Org. molekuly Střednínízká možná destabilisace struktury Ethanol Org. molekuly Střednínízká možná destabilisace struktury Isopropanol Proteiny Peptidy Vysoká nejmenší efekt na strukturu Nízká nízký efekt na strukturu Acetonitril (ACN) Org. molekuly Proteiny Peptidy

32 Stacionární fáze Silikagel poresní silika gel zvýšení efektivního povrchu inertní materiál variabilní funkční skupiny C2-C18 stabilní v ph 2-7,5 Polymerní nosič poresní polymer zvýšení efektivního povrchu nepolární stabilní v ph 2-11 Vliv délky řetězce na rozlišení hydrofobní organické látky peptidy, proteiny

33 Experiment vysoké rozlišení (gradientová eluce) skupinová separace (kroková eluce) velikost částic µm - pro purifikace 5-12 µm - pro analytiku polymerní lepší pro separaci proteinů (lze čistit pomocí NaOH) velikost částic 30 µm nebo větší vyšší průtok délka 1-10 cm nezáleží, krátká, silná lepší pro vyšší průtok Oligonukleotidy alkalické podmínky Peptidy ACN, TFA ~ ph 2 nemá významný vliv (50 %ACN) objem vzorku 0,5-5% objemu kolony při isokratické eluci bez omezení při gradientové eluci na objemu nezáleží množství vzorku 5-10 % celkové kapacity kolony (dobré rozlišení) 40 % celkové kapacity kolony stacionární fáze kolona mobilní fáze

34 Methods for Insoluble Enzymes Chelate Binding chelating properties of a transition metal such as titanium or zirconium X couple enzymes to an organic material (e.g., cellulose, sawdust, alginic acid) or an inorganic support (celite or glass)

35 Imobilizace bílkovin tvorbou chelátů s kovovými ionty Aktivace anorganických nosičů (porézního skla aj.) sloučeninami tranzitních kovových iontů (TiCl4, SnCl2). Tvorba polymérních nerozpustných gelů s následnou chelatací bílkoviny do vznikajícího precipitátu nebo přímým zapolymerováním do struktury gelu. Příprava cheláty tvořících komplexů z hydrofilních gelů (např. derivátů agarózy a tranzitních kovových iontů (Cu2+, Zn2+,..)

36 Afinita bílkovin pro kovové ionty Imobilizace + metal chelate affinity chromatography Princip: Tvorba stabilních komplexů hystidinu, cysteinu (tryptofanu) s Zn2+ a Cu2+ ( Cd2+, Hg2+, Co2+, Ni2+ ) v neutrálních vodných roztocích Nosiče: Hydrofilní gely s pevně vázanými Zn2+ a Cu2+ ( deriváry agarozy ) Použití: Selektivní adsorbenty pro peptidy a bílkoviny obs. histidin a cystein Podmínka: Kovový ion musí mít mnohem vyšší afinitu k nosiči než k enzymu Eluce: Snížení ph, přídavek EDTA Absorpce může probíhat při vysoké koncentraci soli ( eliminace nespecifických ion interakcí )

37 Příprava chelátového nosiče

38 Methods for Insoluble Enzymes Biospecific Binding for example biospecific interactions between enzymes and other molecular species (e.g., lectins or antibodies) specific monoclonal antibodies attached to carriers Schematic representation of biospecific immobilisation

39 Princip afinitní vazby 1. afinitní chromatografie analog substrátu Enzym afinitní ligand + Matrix Spacer arm 2. Imunoafinitní chromatografie ligand protilátka Proteinový epitop + Matrix Spacer arm

40 Příklady afinitních interakcí enzym analog substrátu, inhibitor, kofaktor protilátka antigen,virus, buňka lektin polysacharid, glykoprotein, buněčný povrch, receptor nukleová kys. komplementární sekvence, histony, DNA/RNA polymerasy, DNA/RNA vázající proteiny hormon, vitamin receptor, přenašeče glutathion glutathion-s-transferasa nebo GST fůzní proteiny kovové ionty Poly (His) fusní proteiny, nativní proteiny s His, Cys, Trp na povrchu

41 Stacionární fáze nejčastěji agarosa (Sepharosa) ligand kovalentně navázaný přes OH skupinu cukerné jednotky nosiče velké póry umožňující průnik velkých molekul co nejnižší nespecifické adsorbce ligandy: specifické reversibilní vazba schopnost navázat na nosič bez ovlivnění vazby vazba na protein nesmí být ani slabá ani silná

42 Ligand x raménko ligand Mr<1000 raménko krátké raménko látka se na ligand špatně váže dlouhé raménko možná nespecifická vazba snížení selektivity velká hustota ligandů - sterická nepřístupnost přebytečných ligandů

43 Vhodné vazebné a eluční podmínky ideální podmínky vazba mezi ligandem a purifikovanou molekulou KD = [L].[P] [LP] vazba KD M eluce KD M

44 KD > 10-4 ~ slabá interakce KD < 10-6 ~ silná interakce obtížná eluce Možnosti eluce Metoda 1 změna ph nebo iontové síly Metoda 2 Extremní ph nebo vysoká koncentrace močoviny nebo guanidin hydrochloridu Metoda 3 a 4 přídavek kompetičního činidla

45 Typy afinitních ligandů Ligandy používané pro mono-specifickou afinitní chromatografii Látky používané pro připojování ligandů aktivátor N-hydroxysukcinimid (NHS) CNBr Karbodiimid Epoxid skupina ligandu -NH2 -NH2 -NH2, -COOH -SH, -NH2, -OH

46

47 N-hydroxysukcinimid (NHS-Sepharosa) > 30 mg / 1 ml nosiče připojení přes primární amino skupinu (často protilátka nebo antigen) první výběr při přípravě imunospecifického média

48 Ligandy používané pro skupinově-specifickou vazbu skupinově specifický ligand specifita Protein A Fc region IgG Protein G Fc region IgG Lektiny glukopyranosylové a mannopyranosylové skupiny Cibacron Blue široká skupina enzymů, NAD+ dependentní enzymy, sérový albumin Procion Red NADP+ Lysin plasminogen, rrna Arginin serinové proteasy Benzamidin serinové proteasy Kalmodulin proteiny regulované kalmodulinem Heparin kolagulační faktory, lipoproteiny, lipasy, hormony, steroidní receptory, nukleové kyseliny vázající enzymy Streptavidin Biotin a biotinylované látky Oligo (dt, da,...) mrna, nukleasy Kovové ionty proteiny a peptidy obsahující dostupný His

49 Protein A a Protein G protein A Staphylococcus aureus protein G Streptococcus purifikace: monoklonální protilátky IgG polyklonální protilátky IgG imunokomplexy

50 Heparin A hexuronová kyselina - D-glukuronová kyselina nebo L-iduronová kyselina (C-5 epimer) B D-glukosamin R1 = -H nebo -SO3 R2 = -SO3 nebo -COCH3. DNA vázající proteiny iniciační a elongační faktory, restrikční endonukleasy, DNA ligasa, DNA and RNA polymerasa inhibitory serinových proteas - antithrombin III Enzymy lipoprotein lipasy, koagulační enzymy, superoxid dismutasa růstové faktory extracelulární matrixové proteiny hormonální receptory - androgenní receptory Lipoproteiny

51 Streptavidin streptavidin - molekula isolovaná z Streptomyces avidinii biotinylované protilátky purifikace antigenů 5 -AMP-Sepharosa ATP-dependentní kinasy 2'5 -ADP-Sepharosa NADP+-dependentní dehydrogenasy silně interagují s 2'5 -ADP

52 Cibacron Blue F3G-A (Blue Sepharosa) Cibacron Blue F3G-A ~ analog NAD+ enzymy vyžadující kofaktory obsahující adenyl - kinasy, dehydrogenasy vazba albuminu, koagulačních faktorů, lipoproteinů a interferonu (elektrostatické a hydrofobní interakce)

53 Procion Red (Red Sepharosa) Procion Red ~ analog s NADP+ enzymy vyžadující kofaktor NADP+ vazba albuminu, koagulačních faktorů, lipoproteinů a interferonu (elektrostatické a hydrofobní interakce)

54 Konkavalin A lektin z Canavalia ensiformis (jack bean) tetramerní metalloprotein větvené mannosidy, cukry s terminální mannosou nebo glukosou (αman > αglc > GlcNAc) purifikace glycoproteinů, polysacharidů a glykolipidů detekce změn ve složení látek obsahujících cukry isolace povrchových buněčných glykoproteinů Lentil lektin lektin z Lens culinaris (čočka) větvené mannosidy obsahující fukosu α 1,6 vázanou na N-acetylglukosamin (αman > αglc > GlcNAc) membranové glykoproteiny, povrchové buněčné antigeny, virální glykoproteiny

55 Pšeničný lektin ze semen Triticum vulgare (pšenice) homodimerní neglykosylovaný protein vazba - N-acetylglukosaminových zbytků, chitobiosového jádra N-oligosacharidů, N-acetylneuraminové kyseliny Kalmodulin vysoce konservovaný regulační protein eukaryotních buněk účastní se mnoha buněčných procesů metabolismus glykogenu, přenos nervových impulsů, regulace, kontrola poměru NAD+/NADP+ purifikace kalmodulin vázajících proteinů - ATPasy, adenylát cyklasy, protein kinasy, fosfodiesterasy, neurotransmitery

56 Aktivovaný thiol Thiol-obsahující látky ~ kovalentní chromatografie

57 Rekombinantní fůzní proteiny fůzní kotva imobilizovaný ligand podmínky vazby podmínky eluce Glutathion Stransferasa GST redukovaný glutathion Neutrální ph, nedenaturující prostředí, glutathion musí být redukovaný a GST musí být aktivní volný redukovaný glutathion Histidinová kotva His-tag Chelatovaný nikl nebo kobalt Neutrální ph bez redukčních a oxidačních látek >200 mm Imidazol, nízké ph, silné chelatační činidlo Maltose Binding Protein MBP Amylosa Neutrální ph, nedenaturující prostředí; přídavek NaCl k snížení nespecifické sorbce maltosa Protein A IgG Neutrální ph, nedenaturující prostředí změna ph, iontové síly Green Fluorescent Protein GFP Anti-GFP antibody Neutrální ph, nedenaturující prostředí nízké ph, iontová síla

58 GST fůzní protein glutathion S-transferasa glutathion SDS elektroforesa

59 Pharmacia

60 Histidinová kotva R HN O N O HC C N 2+ NH H2 Ni O N HC C H2 N O NH O H 2 C N CH CH2 O O O stacionární fáze: NiNTA Agarosa His Bind HiTrap Chelating H N OH O NiNTA Agarosa

61 MBP (maltosu vázající protein)

62 použití afinitní chromatografie Mono-specifická AC jednokroková purifikace enzymů, receptorů, protilátek ~ s využitím specifických ligandů Skupinově-specifická AC jednokroková purifikace proteinů obsahujících obecnější vazebné místo jako jsou některé skupiny protilátek, glykoproteiny, NADP-dependentní proteiny,... Fůzní proteiny AC jednokroková purifikace afinitní část je k proteinu připojena pomocí genového inženýrství