Využití Sequence Capture v diagnostice svalových onemocnění

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Využití Sequence Capture v diagnostice svalových onemocnění"

Kristina Konečná
před 8 lety
Počet zobrazení:

1 Využití Sequence Capture v diagnostice svalových onemocnění Kristýna Stehlíková Daniela Skálová Lenka Fajkusová Centrum molekulární biologie a genové terapie IHOK, FN Brno Sekce vrozených genetických poruch

Lenka Fajkusová Centrum molekulární biologie a

2 Diagnostika svalových onemocnění - postižení kosterního svalstva Neuromuskulární onemocnění vzácná onemocnění (<1:2000), která postihují některou z částí neuromuskulárního systému: - svaly, periferní nervy, spojení mezi nervy a svaly, motorické neurony - Všechna onemocnění jsou progresivní, vedou ke svalové slabosti a úbytku svalů - Nástup onemocnění od narození až do pozdějšího věku - Délka přežití - různorodá - Pacienti často trpí respiračními a srdečními obtížemi - Výsledná svalová slabost vede ke křečím, ztuhlosti, deformitám kloubů a chronické bolesti

jsou progresivní, vedou ke svalové slabosti a úbytku svalů - Nástup onemocnění od narození až do pozdějšího věku - Délka přežití - různorodá

3 Diagnóza svalové dystrofie je založena na klinických nálezech, EMG, MR, výsledcích svalové biopsie, biochemických nálezech (zvýšená hodnota kreatin fosfokinázy) IH: Normální exprese α-dystroglykanu v kontrolní vzorku IH: Sekundární deficit α-dystroglykanu v LGMD2I 1. Fenotypové projevy neuromuskulárních chorob mohou být společné pro nemoci asociované s mutacemi v různých genech a často nelze rozlišit, o jaký konkrétní typ svalové dystrofie se jedná. 2. Mutace v jednom genu různé fenotypové projevy u pacienta je vyšetřováno několik genů bez detekované mutace možnosti: Sangerovo sekvenování dalších genů časová a finanční náročnost jiná metoda NGS + Sequence Capture

Fenotypové projevy neuromuskulárních chorob mohou být společné pro nemoci asociované s mutacemi v různých genech a často nelze rozlišit, o jaký konkrétní typ svalové

4 Vybrané nemoci (geny): - Duchennova svalová dystrofie (gen DMD) - Emery-Dreifussova svalová dystrofie (geny EMD, FHL1, LMNA) - pletencové svalové dystrofie, dominantní (geny MYOT, LMNA, CAV3) - pletencové svalové dystrofie, recesivní (geny CAPN3, DYSF, SGCG, SGCA, SGCB, SGCD, TCAP, TRIM32, FKRP, TTN, POMT1, ANO5, FKTN, POMT2, POMGNT1) - kongenitální svalové dystrofie (LAMA2, LARGE, SEPN1, COL6A1, COL6A2, COL6A3, ITGA7, DNM2) - kongenitální myopatie, distální myopatie, and další myopatie (NEB, TPM3, ACTA1, TPM2, TNNT1, CFL2, RYR, MTM1, BIN, CRYAB, DES, LAMP2, PABPN1) 42 genů, 1020 exonů V případě analýzy všech exonů a přilehlých intronových oblastí vybraných genů je potřeba sekvenovat cca bází na pacienta.

dystrofie (LAMA2, LARGE, SEPN1, COL6A1, COL6A2, COL6A3, ITGA7, DNM2) - kongenitální myopatie, distální myopatie, and další myopatie (NEB, TPM3, ACTA1, TPM2, TNNT1, CFL2, RYR, MTM1,

5 Sequence Capture 1. Třídenní hybridizace + sekvenování GS Junior 2. Double capture + sekvenování GS Junior 3. Double capture + sekvenování MiSeq NimbleGen SeqCap EZ Library LR User s Guide SeqCap EZ Library SR User s Guide

6 Příprava knihovny NimbleGen SeqCap EZ Library LR User s Guide SeqCap EZ Library SR User s Guide 1. Štěpení gen. DNA (nebulizace, sonikace) 2. Fragment End Polishing 3. Ligace Adaptorů 4. Odstranění krátkých fragmentů 5. Pre-Captured LM-PCR 6. Hybridizace 3 dny double capture hybridizace přes noc, PCR, hybridizace přes noc 7. Odstranění nenavázaných úseků DNA SeqCap EZ Capture Beads Streptavidin Dynabeads 8. Post-Captured LM-PCR 9. Přečištění 10. Kontrola knihovny

Pre-Captured LM-PCR 6. Hybridizace 3 dny double capture hybridizace přes noc, PCR, hybridizace přes noc 7.

7 Sekvenování GS Junior 1.Třídenní hybridizace 2. Double capture protokol NimbleGen SeqCap EZ Library LR User s Guide Příprava knihovny před hybridizací štěpení + 1 den Příprava vzorku pro sekvenování 1,5 dne Třídenní hybridizace 3 pacienti coverage: 20x - 95%; 100x - 12% ready v cílové oblasti: 58 %; prům.coverage: 70x 2 dvojice pacientů v hybridizační reakci: ready v cílové oblasti: 40 % nedostatečná coverage nutno sekvenovat 2x Double capture protokol 2 pacienti coverage 20x 95;94 %; 100x 53;63 % ready v cílové oblasti: 89;90 %; prům.coverage: 107x;126x 12 dvojic pacientů v hybridizační reakci: coverage 20x 65 %; 100x 5 % ready v cílové oblasti: 83 %; prům.coverage: 33x Sekvenování GS Junior DNA: wells 0,3:1 Passed Filter Wells:

pacienti coverage: 20x - 95%; 100x - 12% ready v cílové oblasti: 58 %; prům.

8 Sekvenování MiSeq Double capture protokol SeqCap EZ Library SR User s Guide Příprava knihovny před hybridizací štěpení + 1 den Příprava vzorku pro sekvenování 0,5 dne 1. sekvenační běh 24 pacientů 6 pacientů v jedné hybridizační reakci coverage: 20x - 99%; 100x - 95% ready v cílové oblasti: 98 %; prům.coverage: 393x Smíchání před hybridizací koncentrace knihovny (Nanodrop) Smíchání před sekvenací - qpcr -KAPA quantification kit, Roche lightcycler II - Mgr. Filip Párdy (CEITEC MU)

sekvenační běh 24 pacientů 6 pacientů v jedné hybridizační reakci coverage: 20x - 99%; 100x - 95% ready v cílové

9 Vyhodnocení SeqPilot (JSI medical systems) Dosud: 57 pacientů 27 s uzavřeným výsledkem

10 Library LR + GS Junior Library SR + MiSeq Obsah GC párů 70,5 %

11 Poděkování Roche Dr. Jaroslav Vohánka Dr. Xavier Miró Dr. Viktor Horváth CEITEC MU Brno Centrální laboratoř - Genomika Dr. Boris Tichý Mgr. Filip Párdy Mgr. Nikola Tom

12 Děkuji za pozornost

Podobné dokumenty

KONGENITÁLNÍ SVALOVÉ DYSTROFIE

KONGENITÁLNÍ SVALOVÉ DYSTROFIE Vondráček P. Hermanová M. Fajkusová L. Klinika dětské neurologie LF MU a FN Brno Patologicko-anatomický ústav LF MU a FN Brno CMBGT IHOK FN Brno Kongenitální svalové dystrofie