PŘEHLED SEKVENAČNÍCH METOD

Transkript

1 PŘEHLED SEKVENAČNÍCH METOD Letní škola bioinformatiky 2014, Brno Ing.Matej Lexa, Phd (FI MU Brno)

2 CO JE TO SEKVENACE A CO SE BUDE SEKVENOVAT?

3 POŘADÍ NUKLEOTIDU V DNA

4 SEKVENOVÁNÍ DNA od manuálních metod po plně automatizované 1. generace (od cca 1976): Maxam-Gilbert (čtyři štěpící reakce G, AG, C, TC) Sangerova metoda (terminace syntezy druhého vlákna) 2. generace (next-gen; NGS; od cca ): Solexa/Illumina (polymerace fluorescenčně značených oligonukleotidů) 454/Roche (pyrosekvenace, PP enzymaticky vázán na emisi světla) SOLiD/LifeTechnologies (ligace fluorescenčně znač. oligonukleotidů) Polonator (ligace fluorescenčně znač. oligonukleotidů) Complete Genomics (nepoužívá PCR, ligace na shluky ssdna) Sekvenování jednotlivých molekul: Helicos (optika) SMRT/Pacific Biosciences (nanopovrch s ukotvenou polymerázou) IonTorrent (polovodičové sekvenování, místo světla protony) Sekvenování na membránách: Oxford Nanopore NABSys NobleGen

5 KRITICKÁ FÁZE ANALÝZ 1. a 2. GENERACE Příprava knihovny Sekvenace Analýza dat

6 PRINCIPY SEKVENACE DNA sekvenčně-specifické štěpení DNA polymerace: ATCAGTGCGATGCA - (ANCHOR) TAGTCACG DNA pol <-C* hybridizace: ATCAGTGCGATGCA - ANCHOR TAGTCACGCTACGT* ligace: ATCAGTGCGATGCA ANCHOR TAGTCACG----CTacgt* DNA lig nanopory a průchod membránou

7 DUVODY SEKVENACE - de novo sekvenace - organismy - populace (metagenomika) - resekvenování - detekce polymorfismů - SNP - rekombinace - zjištění stavu metylace - měření exprese (jako náhrada technik založených na hybridizaci)

8 DRUHY SEKVENACE dle způsobu přípravy vzorků a použitých reaktantů DNA-seq ChIP-seq (imunoprecipitace chromatinu) RNA-seq srna-seq Bis-seq, BisChIP-seq (metylační analýza) CLIP-seq ( cross-linking immunopreciputation ; RNA-prot) Ig-seq,... (viz

9 Klíčové kroky a parametry sekvenování DNA - izolace DNA - fragmentace DNA - ligace adaptérů - namnožení sekvencí - typ podložky nebo média - typ enzymů (pol, lig) - typ detekce (světlo, proud)

10 Shotgun genome sequencing

11 Maxam-Gilbert

12 Maxam-Gilbert

13 Maxam-Gilbert

14 Sangerova metoda (terminace dideoxynukleotidy)

15 Sangerova metoda

16 Sangerova metoda

17 454 (pyrosekvenování)

18 454 (pyrosekvenování)

19 454 (pyrosekvenování

20 Roche 454 GS FLX

21 POLONATOR

22 SOLiD (sekvenace ligací, polony = polymerase colony

23 SOLiD

24 SOLiD

25 SOLiD 3 Plus

26 Illumina

27 Illumina ( bridge amplification )

28 Illumina ( bridge amplification )

29 Illumina

30 Illumina

31 WT Sanger Institute Sequencing Centre - Hinxton

32 Complete Genomics zhluky DNA nanoballs (nepoužívá PCR, ale rolling circle replication)

33 Complete Genomics 300 nm pozic, 2.8 mld na jednom sekvenovacím sklíčku

34 Complete Genomics

35 Complete Genomics cpal Probe-Anchor Ligation sequencing, 70 bazí / zhluk

36 Ion Torrent (polovodičové sekvenování) dnes součást LifeTechnologies detekuje protony uvolněné při polymerizaci DNA

37 tsms single molecule sequencing Helicos (existuje jenom několik strojů) - 10^9 bp / day - >35bp readlength

38 SMRT single molecule real time Pacific Biosciences

39 Sekvenování nanopory

40 Oxford Nanopore Technologies Nanopor tvořen proteinem alpha-hemolysin s cyclodextrinovým adapterem (místo detekce nukleotidů).

41 Typický postup zpracování NGS dat Sequencing Quality Control Data Cleaning Parameter Adjustment Read Mapping Mapping 1 Variant Calling Method 1 n Mapping 2 Methylation Analysis Method 1 n Validations & Biological Interpretation Mapping n Expression Analysis Method 1 n

42 Kontrola kvality a čištění dat Zastoupení nukleotidů Kvalita nukleotidů na pozicích (log skóre phred ; 10 = 90%) Kontaminace adaptéry a jinými cizími sekvencemi Stupeň duplikca sekvencí Zkrácení sekvencí na společnou délku Např.:

43 Mapování sekvencí Index Tabulky slov, hešovací tabulky Suffixové stromy a pole Burrows-Wheelerova-Transformace (BWT) sufixového pole FM-Index Filtrování S jednou nebo více shodami Verifikace prodloužení Dynamické programování BWA, Bowtie2, Soap2 mrfast, SHRiMP2, RazerS3, Masai GSNAP, Stampy, BWA mem (tolerují mezery) RNA-Seq, Bis-Seq, speciální obsluha repetitivních sekvencí TopHat, STAR, Bismark, lobstr,

44 Analýza DNA pomoci STM (scanning tunelling microscope)

45 Data growth in DNA sequencing

46 Ding et al., Analysis of next-generation genomic data in cancer: accomplishments and challenges. Hum Mol Gen 19

47

48

49 Human Longevity