34. PRACOVNÍ DNY DĚDIČNÉ METABOLICKÉ PORUCHY , OLOMOUC PROGRAM A SBORNÍK ABSTRAKT A POSTERŮ

Transkript

1 34. PRACOVNÍ DNY DĚDIČNÉ METABOLICKÉ PORUCHY , OLOMOUC PROGRAM A SBORNÍK ABSTRAKT A POSTERŮ

2 34. PRACOVNÍ DNY DĚDIČNÉ METABOLICKÉ PORUCHY května 9 Clarion Congress Hotel, Olomouc ZÁŠTITA: ORGANIZAČNÍ VÝBOR: prof. MUDr. Roman Havlík, Ph.D. ředitel FN Olomouc prof. MUDr. Milan Kolář, Ph.D. děkan LF Univerzity Palackého Olomouc T. Adam D. Friedecký E. Hlídková H. Janečková POŘADATEL: Oddělení klinické biochemie, Fakultní nemocnice Olomouc VĚDECKÝ VÝBOR: T. Adam (Olomouc) D. Behúlová (Bratislava) V. Bzduch (Bratislava) K. Fabriciová (Bratislava) L. Fajkusová (Brno) D. Friedecký (Olomouc) K. Hálová (Banská Bystrica) A. Hlavatá (Bratislava) T. Honzík (Praha) J. Hyánek (Praha) P. Ješina (Praha) S. Kmoch (Praha) V. Kožich (Praha) R. Pazdírková (Praha) K. Pešková (Praha) D. Procházková (Brno) J. Šaligová (Košice) O. Ürge (Bratislava) J. Zeman (Praha)

3 PROGRAM

4 SBORNÍK ABSTRAKT PŘEDNÁŠEK Prof. Soumeya BEKRI Metabolic Biochemistry Department Rouen University Hospital, Rouen, France Short biography Prof. Soumeya BEKRI, is the head of the Metabolic Biochemistry Department at Rouen University Hospital and Chair of Medical Biochemistry and Molecular Biology at Rouen Medical School, France. She has over three decades of medical practice as a clinical biochemist, geneticist, researcher and educator. She is an international expert in inborn errors of metabolism field particularly in Lysosomal Storage Disorders (LSDs). Her research involves translational studies taking basic molecular genetics research and developing direct clinical applications. Her work in LSDs has involved the development of protocols, basic and translational molecular research. She works on expanding biomarker screening using omics-based technologies (mass spectrometry and NGS) for inherited metabolic diseases and on refining methods of clinical interpretation using machine learning-based expert tools to diagnose, treat and monitor diseases in the post genomic era. Her current research projects involve the implementation of innovative multi-omics and new systems medicine-based approaches for the management of IEM. INBORN ERRORS OF METABOLISM IN THE OMICS ERA AND BEYOND The new era of biomedicine has been marked by recent tremendous technological advances that enabled the assessment and management of human health at an amazing resolution scale. This allows the probing of human health and disease at an unprecedented biological depth including different biological information layers: omics, phenotype, lifestyle and behavioral attributes. Understanding and acting upon these biological and behavioral drivers using biological knowledge, engineering and big data analytics will set the foundation of a new data-driven medicine practice leading to the Precision Medicine (PM) era. However, the different technologies, including omics, exhibit an uneven maturity regarding their use in a clinical setting. This talk we will cover state of the art high throughput omics technologies as well as the clinical actionability of omics-based biomarkers in the inborn errors of metabolism field. Challenges facing their clinical implementation regarding the technical, ethical and regulatory ecosystem will be highlighted through case study demonstration. LAMP DEFICIENCY (DANON DISEASE) IS AN UNDERDIAGNOSED X-LINKED CARDIOMYOPATHY OVERVIEW AND PITFALLS TO CLINICAL AND LABORATORY DIAGNOSTICS. J. Sikora Research Unit for Rare Diseases, Department of Pediatrics and Adolescent Medicine, First Faculty of Medicine, Charles University, Prague, Czech Republic Danon disease (DD, MIM #357) is an X-chromosome-linked disorder that is caused by mutations in the lysosomal-associated membrane protein type gene (LAMP, Xq4). LAMP is critical for lysosomal processing of a variety of autophagic substrates. The majority of reported LAMP mutations completely abolish protein expression. DD manifests as a combination of cardiomyopathy, myopathy, cognitive deficit, retinopathy, and hepatopathy in males. The phenotype in females is variable and mitigated as a likely consequence of tissue-specific patterns/ratios of X-chromosome inactivation. Although clinically complex, myocardial dysfunction associated with pre-excitation at electrocardiography is the dominant DD symptom. DD thus represents an important differential diagnostic option in the group of early-onset cardiomyopathies including those of metabolic origin. Given the rare occurrence of DD, diagnosis is often established late in many patients/families. It is particularly the heterozygous female probands who are identified retrospectively. Timely diagnosis therefore represents a critical prerequisite not only for early therapeutic intervention(s) but also for efficient family counseling. Provided the assessment of the clinical phenotype triggers specific diagnostic efforts, the optimal laboratory testing algorithm combines identification of the absence of LAMP protein in cells/tissues and, as the ultimate proof, characterization of the mutation within the LAMP gene. Alternatively, many DD patients are identified using various non-selective genomic analytical tools. While the latter approach is very effective, testing the individual variants (frequently of unknown significance) at the mrna or protein level is often necessary to establish the final diagnosis. Endomyocardial or skeletal muscle biopsies allow identification of LAMP deficiency in male patients. Diagnostic utility of these samples is, however, limited in DD females. Flow cytometry in peripheral white blood cells, on the contrary, offers both minimal invasiveness and detection sensitivity down to ~.% of LAMP deficient granulocytes. Such a sensitivity is of importance in samples from suspected heterozygous XCI mosaic female DD patients and even more critically in de-novo mosaic mutation carriers. VÝZNAM METABOLOMIKY V DIAGNOSTICE DĚDIČNÝCH METABOLICKÝCH PORUCH D. Friedecký, R. Karlíková, L. Mádrová, Š. Kouřil, H. Janečková, J. Václavík, J. Rendlová, K. Mičová, A. Gardlo, J. Jáčová, D. Dobešová, A. Kvasnička, K. Zuzaňáková, T. Adam Fakultní nemocnice a Lékařská fakulta Univerzity Palackého v Olomouci Již několik dekád hraje hmotnostní spektrometrie zásadní roli v klinické diagnostice. Úspěšně se tato technika aplikuje na oblast terapeutického monitorování léčby, stanovení vybraných biomarkerů, toxikologický screening anebo diagnostiku dědičných metabolických poruch. Metabolomika je logickým vývojovým krokem vpřed v komplexní analýze biologického materiálu. Zahrnuje široké spektrum metabolitů dle specifik zvolených separačních technik (LC, GC). Obecně jsou aplikovány dva metodické přístupy první, cílená metabolomika, je založena na relativní kvantifikaci vybraných metabolitů (řádově stovky) za pomocí hmotnostních analyzátorů s jednotkovým rozlišením. Druhý přístup, necílená metabolomika, využívá vysoce rozlišující hmotnostní spektrometry pro komplexní screening tisíců komponent představující potenciální metabolity. Provedení metabolomického experimentu vyžaduje specifický postup, který se skládá z plánování, přípravy vzorku, měření, zpracování dat, statistického vyhodnocení a interpretace. Vzhledem ke komplexitě je nezbytné každý krok pečlivě naplánovat a kontrolovat. Především v posledních pěti letech byla publikována řada prací v oblasti dědičných metabolických poruch, jejichž výsledky přinášejí nový pohled na celou řadu onemocnění, o kterých se věřilo, že jsou dostatečně prozkoumána. V příspěvku budou prezentovány výsledky, respektive nové poznatky získané za pomocí metabolomiky a lipidomiky zaměřené na hledání nových charakteristických metabolitů a lipidů pro vybrané dědičné metabolické poruchy. Grantová podpora: GAČR 8-4S

5 SBORNÍK ABSTRAKT PŘEDNÁŠEK METABOLOMICKÁ ANALÝZA HELA BUNĚČNÝCH LINIÍ DEFEKTNÍCH V JEDNOTLIVÝCH KROCÍCH PURINOVÉ DE NOVO SYNTÉZY L. Mádrová,, R. Karlíková, D. Dobešová, J. Václavík,, D. Friedecký,, V. Barešová 3, M. Zikánová 3 a T. Adam, Ústav molekulární a translační medicíny, Lékařská fakulta, Univerzita Palackého a Fakultní nemocnice Olomouc Oddělení klinické biochemie, Fakultní nemocnice Olomouc 3 Klinika dětského a dorostového lékařství,. lékařská fakulta, Univerzita Karlova v Praze a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze Úvod: V rámci purinové de novo syntézy (PDNS) byly zatím popsány dvě geneticky podmíněné metabolické poruchy. Jedná se o deficit enzymu adenylosukcinátlyasy (ADSL, EC 4.3.., OMIM 35) a AICA ribosidurii (deficit ATIC, EC...3 a , OMIM 68688). Tyto poruchy se projevují neurologickými problémy, jako jsou mentální retardace, epileptické záchvaty, slepota, autistické chování a jiné. Existence dalších geneticky podmíněných poruch této metabolické dráhy zatím nebyla potvrzena, ale je vysoce pravděpodobná. Cílem práce byl popis metabolomického profilu CRISPR-Cas9 editovaných HeLa buněčných liniích, defektních v jednotlivých krocích PDNS, které představují první lidské buněčné modely lidské modely pro známá i potenciální onemocnění PDNS. Metody: Pro komplexní analýzu metabolomického profilu buněčných linií byla použita kombinace necíleného a cíleného přístupu metabolomické analýzy. Obě analýzy byly provedeny pomocí ultraúčinné kapalinové chromatografie ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometrií. Získaná data byla vyhodnocena metodami jedno- a vícerozměrné statistické analýzy. V rámci vícerozměrné statistiky byly aplikovány nesupervizované a supervizované metody. Identita významných metabolitů z necílené analýzy byla potvrzena fragmentací. Výsledky: Ke statisticky významným metabolitům všech defektních linií v porovnání s kontrolou patřily především meziprodukty PDNS. Dále byly pozorovány změny v hladinách purinů, pyrimidinů, acylovaných karnitinů a metabolitů účastnících se jednouhlíkového metabolismu (serin, fosfoserin, cystathionin, methionin a další). Rovněž byly nalezeny rozdíly v hladinách meziproduktů glykolýzy a pentosafosfátové dráhy. Závěr: Zjištěné změny v metabolomu defektních buněk mohou sloužit jako simulace analogických změn nastávajících u pacientů trpících poruchami PDNS, a mohou tak vést ke zkvalitnění diagnostiky a usnadnění studia prevalence. Granty: GA ČR 8-4S, NPU I (LO34), IGA_LF_8_, PRIMUS/7/MED/6, PROGRES Q6/LF, NPU II (LQ64). DIAGNOSTIKA ORGANICKÝCH ACIDURIÍ A PORUCH Β-OXIDACE MASTNÝCH KYSELIN POMOCÍ LC-MS/MS J. Jáčová, K. Mičová, T. Adam, D. Friedecký Laboratoř dědičných metabolických poruch, Oddělení klinické biochemie, FN Olomouc, I. P. Pavlova 6, Olomouc Laboratoř metabolomiky, Ústav molekulární a translační medicíny, Lékařská fakulta, Univerzita Palackého v Olomouci, Hněvotínská 5, Olomouc Úvod: Diagnostika organických acidurií a poruch β-oxidace mastných kyselin se tradičně provádí pomocí GC-MS. Tato metoda vyžaduje zdlouhavou a náročnou přípravu vzorku, a proto lze současně analyzovat pouze malý počet vzorků. Metoda umožňuje analyzovat organické kyseliny, ale acylglyciny jako polární látky zachytí až ve vyšších koncentracích a acylkarnitiny jí nelze analyzovat vůbec. Metodika: Byla vyvinuta LC-MS/MS metoda, která za použití kapalinového chromatografu UltiMate 3 RS (Dionex) spojeného s tandemovým hmotnostním spektrometrem na principu trojitého kvadrupólu 65 (Sciex) umožňuje současně analyzovat 4 organických kyselin, acylglycinů a acylkarnitinů v moči, séru i dalších biologických materiálech. Metoda využívá gradientové eluce v kyselém prostředí (kys. mravenčí, ph.3) na koloně s reverzní fází (C8 Acquity HSS T3, Waters). Identifikace probíhá v obou módech režimu monitorování vybraných reakcí (MRM), které byly optimalizovány pomocí standardů. Obvyklý čas analýzy je 6 min. Výsledky: Příprava vzorku je velmi rychlá, v případě moči zahrnuje pouze naředění na koncentraci kreatininu mmol/l. Metoda umožňuje diagnostikovat a detekovat diagnosticky významné biomarkery všech testovaných dědičných metabolických poruch (GAI, SCAD, MSUD, IVA, MMA aj). Analyty poskytují lineární odezvu (r >.99). V negativním módu lze detekovat již látky o koncentraci v řádu umol/l (organické kyseliny), v pozitivním módu nmol/l (acylglyciny, acylkarnitiny), s opakovatelností lepší než %. Metoda umožňuje analýzu velkého množství vzorků a tím i využití v metabolomice. V metabolomickém experimentu se vzorky pacientů s GAI byly nejvíce diskriminujícími metabolity 3-hydroxyglutarát a glutarylkarnitin, u pacientů s MSUD -hydroxy- a -oxoisokaproát. Závěr: LC-MS/MS metoda minimalizuje nedostatky tradiční GC-MS metody. Nabízí rychlou a přesnou diagnostiku (TAT<h) organických acidurií a poruch β-oxidace mastných kyselin. Správnost diagnózy lze současně ověřit hned 3 skupinami biomarkerů (organické kyseliny, acylglyciny, acylkarnitiny). Metodu lze alternativně využít i v metabolomických studiích. Grantová podpora: GAČR [8-4S] a NPU I (LO34) MCADD V NOVORODENECKOM SKRÍNINGU NA SLOVENSKU. Z. Mydlová, M. Knapková, M. Machková, I. Šatková, S. Dluholucký Skríningové centrum novorodencov SR pri DFNsP Banská Bystrica Novorodenecký skríning deficitu dehydrogenázy mastných kyselín so stredným reťazcom MCADD sa na Slovensku vyšetruje od roku 3. Metóda tandemovej hmotnostnej spektrometrie dokáže ochorenie spoľahlivo odhaliť. Skríningové markery ochorenia sú strednoreťazcové acylkarnitíny, C6, C8, C, C: aj pomery acylkarnitínov C8:C a C8:C. Naspoľahlivejší parameter je oktanoylkarnitín C8. Parametre dekanoyl C a decenoyl karnitíny C: nie sú vždy pozitívne pri pacientoch s MCADD. Pre stanovenie acylkarnitínov používame derivatizovaný kit Clinspot od RECIPE. Merací prístroj je Agilent 6/64 HPLC- MS/MS. Od roku 3 do roku 8 sme vyšetrili v skríningu dedičných metabolických porúch novorodencov. Z nich sme potvrdili 33 ochorení MCADD, s vysoko pozitívnym nálezom C8 a C8/C. Incidencia ochorenia za uvedené obdobie je : 77. Majoritné etnikum v počte 87 5 novorodencov má počet zachytených prípadov, incidencia : 6 4. Oproti tomu rómske etnikum v počte 5 99 novorodencov má počet zachytených prípadov, incidencia rómskeho etnika je : 359. Najčastejšia mutácia pre zachytené prípady je c.985a>g. Celková incidencia ochorenia MCADD na Slovensku je častejšia oproti popisovaným frekvenciám : 5. Pri zohľadnení etnicity v skríningu novorodencov odhaľuje veľmi častý výskyt u rómskeho etnika. Majoritné etnikum za obdobie 6 tich rokov vykazuje pomerne nízky výskyt tohto ochorenia. NOVÉ POTENCIÁLNÍ BIOMARKERY 3-HYDROXY-3-METHYLGLUTAROVÉ ACIDURIE J. Václavík,, L. Mádrová,, Š. Kouřil,, J. Rendlová,, R. Karlíková,, D. Friedecký,, F. M Vaz 3, R. J. A. Wanders 3, L. A. J. Kluijtmans 4, R. A. Wevers 4, T. Adam, Ústav molekulární a translační medicíny, Lékařská fakulta, Univerzita Palackého Olomouc, Hněvotínská 5, Olomouc, 775 5, Česká republika Oddělení klinické biochemie, Fakultní nemocnice Olomouc, I. P. Pavlova 6, 775, Olomouc, Česká republika 3 Laboratory of Genetic Metabolic Diseases, Department of Clinical Chemistry, Meibergdreef 9, 5 AZ Amsterdam, the Netherlands 4 Translational Metabolic Laboratory, Department of Laboratory Medicine, Radboud University Medical Centre, Geert Grooteplein, 655 GA Nijmegen, the Netherlands Deficit 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA lyázy (HMGCLD, OMIM 4645) je vzácná, autozomálně dědičná metabolická porucha způsobená mutací genu kódující enzym 3-hydroxymetylglutaryl-CoA lyázu. Tento mitochondriální enzym se účastní degradační dráhy leucinu a hraje klíčovou roli při tvorbě ketolátek. Pacienty obvykle postihuje akutní metabolická krize v průběhu prvního roku života, která může způsobit dlouhotrvající neurologické problémy popřípadě smrt. Diagnóza bývá určena po pacientově první metabolické krizi pomocí metabolického screeningu na základě zvýšené odezvy pro C4DC + C5-OH acylkarnitin tandemovou hmotnostní spektroskopií. Zvýšený signál tohoto SRM přechodu reprezentuje řadu dalších acylkarnitinů, které slouží jako markery různých dědičných metabolických poruch. Pro rozlišení mezi těmito chorobami musí být provedena analýza organických kyselin v moči pacientů. Provedli jsme necílenou metabolomickou analýzu s využitím kapalinové chromatografie ve spojení s vysoko-rozlišující hmotnostní spektrometrií na pěti plazmatických vzorcích pacientů trpících HMGCLD ve snaze nalézt nové potenciální biomarkery, které by byly detekovatelné v krevní skvrně a umožnovali diagnostiku v rámci novorozeneckého screeningu. V krvi pacientů byly identifikovány acylkarnitiny odvozené od meziproduktů leucinové degradační dráhy. Mezi nejvíce diskriminujícími metabolity oddělující pacienty a kontrolní skupinu byly i organické kyseliny odvozené od meziproduktů leucinové degradační dráhy. V plazmě naměřené hodnoty nově detekovaných organických kyselin naznačují, že by tyto organické kyseliny mohly být zařazeny do novorozeneckého screeningu a posloužit jako specifické biomarkery HMGCLD. Přímá diagnóza z primární krevní skvrny v rámci novorozeneckého screeningu umožní včasnou intervenci, která může předejít intoxikačnímu poškození pacienta. Tato práce byla financována Grantovou agenturou České republiky (8-4S) a NPU I (LO34).

6 SBORNÍK ABSTRAKT PŘEDNÁŠEK DIAGNOSTIKA PRIMÁRNEHO DEFICITU KARNITÍNU STANOVENÍM VOĽNÉHO KARNITÍNU V MOČI V. Bzdúch, K. Brennerová, R. Górová, G. Addová, J. Chandoga 3, J. Lisyová 3, M. Knapková 4, M. Ostrožlíková 5, A. Šalingová 5, C. Šebová 5 Detská klinika LFUK a NÚDCH Chemický ústav, Prírodovedecká fakulta UK 3 Oddelenie molekulovej a biochemickej genetiky, Ústav lekárskej biológie agenetiky a klinickej genetiky LFUK a UNB, Bratislava 4 Skríningové centrum novorodenecov SR, DFNsP, Banská Bystrica 5 Centrum dedičných metabolických porúch NÚDCH, Bratislava Úvod: Primárny deficit karnitínu (OMIM4) je autozómovo recesívne dedičné ochorenie, spôsobené deficitom OCTN karnitínového transportéra, kódovaného SLCA5 génom. U postihnutých jedincov dochádza k deplécii sérového a intracelulárneho karnitínu so zvýšenými stratami karnitínu močom. Väčšina pacientov je identifikovaných novorodeneckým skríningom na základe nízkeho voľného karnitínu a acylovaných karnitínov v krvi. Skríning primárneho deficitu karnitínu nie je súčasťou regulárneho rozšíreného novorodeneckého skríningu na Slovensku, avšak v rámci tzv. periférneho vyhodnocovania bolo zachytených viacero novorodencov so zníženou koncentráciou voľného karnitínu v suchej kvapke krvi. Metodika: Vypracovali sme analytickú metódu umožňujúcu stanovenie karnitínu v moči s využitím tandemovej hmotnostnej spektrometrie s priamym nástrekom vzorky. U troch novorodencov a ich matiek, u ktorých boli zaznamenané nízke koncentrácie voľného karnitínu v krvi, sme touto metódou vyšetrili exkréciu karnitínu v moči. Na potvrdenie primárneho deficitu karnitínu sme použili molekulovo-genetické vyšetrenie celej kódujúcej sekvencie SLCA5 génu ( exonov) a priľahlých intronových oblastí pomocou priamej sekvenčnej analýzy. Výsledky: U troch novorodencov bol periférnym skríningom zachytený nízky voľný karnitín a nízke koncentrácie celkového karnitínu a dlhoreťazcových karnitínov v suchej kvapke krvi. Exkrécia voľného karnitínu v moči, stanovená s využitím tandemovej hmotnostnej spektrometrie u novorodencov nesvedčala pre primárny deficit karnitínu. U matiek týchto novorodencov, u ktorých bol tiež zistený deficit karnitínu sme zistili zvýšený odpad karnitínu močom so zvýšenými frakčnými exkréciami karnitínu v moči ( Fe : 5,63 ; 4, ; karn 68, ), (norma,6 4). Primárny deficit karnitínu u týchto troch matiek sme potvrdili molekulovo-genetickým vyšetrením. Záver: Metóda stanovenie voľného karnitínu v moči s využitím tandemovej hmotnostnej spektrometrie je vhodnou metódou v diagnostike primárneho deficitu karnitínu. Práca bola finančne podporená v rámci OP Výskum a vývoj ITMS 6486 a ITMS 647 ACUTE AND CHRONIC HYPERAMMONEMIA TREATMENT IN ORGANIC ACIDURIA PATIENTS D. Rokicki Clinic of Pediatrics, Nutrition and Metabolic Diseases, The Children s Memorial Health Institute, Warsaw, Poland Hyperammonemia is a metabolic condition, the consequence of disturbance of the urea cycle characterized by an excess of ammonia in the blood. (Häberle ). Metabolic diseases that cause hyperammonemia can be due to primary enzyme deficiencies that involve nitrogen metabolism and excretion (predominantly urea cycle defects, e.g. N-acetylglutamate synthase [NAGS] deficiency) or to secondary enzyme inhibition where metabolites/toxins inhibit urea cycle function or prevent adequate energy for its normal function (e.g. organic acidurias [OAs]). Organic acidurias are a diverse group of disorders characterized by the excretion of non-amino organic acids in the urine due to dysfunction of a specific step in amino acid catabolism, usually the result of deficient enzyme activity at that step. (Seashore 9) Classic organic acidurias include: - Methylmalonic acidaemia (MMA) - Isovaleric acidaemia (IVA) - Propionic acidaemia (PA) The main goal of emergency treatment of organic acidurias is to reduce ammonia levels and prevent brain damage. Current treatment options for patients with hyperammonaemia include: (Baumgartner 4) - Protein-free, high energy (e.g. IV glucose) nutrition - Carglumic acid ( mg/kg bolus, then mg/kg every 6 hours) - Ammonia scavengers, e.g. sodium benzoate (IV) or sodium phenylbutyrate (IV) - Extracorporeal detoxification such as hemofiltration (rescue therapy) Carglumic acid has been shown to be safe and effective at lowering ammonia levels in organic acidaemias and has been approved for the treatment of hyperammonaemia in propionic acidaemia, isovaleric acidaemia and methylmalonic acidaemia. (Ah Mew ) The goals of long-term management are to prevent recurrent hyperammonaemia, control ammonia levels and maintain optimal growth and neurological development by avoiding nutrient imbalance and insufficiency. Continuous long-term administration of carglumic acid in patients of different ages with PA and MMA stabilises metabolic control, reduces the number and severity of episodes of metabolic decompensation, reduces the need for hospitalisation, improves clinical outcomes, allows to increase natural protein intake (Burlina 6). Based on current clinical data in 9 in our institution, a long-term treatment with carglumic acid was started in 4 patients with organic acidosis (3 PA and MMA). All patients had chronic hyperammonaemia at the beginning. Therapy is financed as part of Emergency Access to Drug Technologies based on Minister of Health decision. ZAVEDENÍ INTRACEREBRÁLNÍ ENZYMOVÉ TERAPIE U NEURONÁLNÍ CEROIDLIPOFUSCINÓZY TYP V ČR Magner M, Honzík T Klinika dětského a dorostového lékařství. LF UK a VFN v Praze Neuronální ceroidlipofuscinóza typ (NCL; OMIM 45; pozdně infantilní typ, nemoc Battenova nebo Janský-Bielschowsky) patří k nejčastějším neurodegenerativním onemocněním v dětství patřícím do skupiny lysosomálních střádavých onemocnění. Způsobena je sníženou aktivitou enzymu tripeptidylpeptidázy (TPP, gen CLN, chromosom p5). Od zahájení diagnostiky v šedesátých letech dvacátého století bylo na ÚDMP/KDDL diagnostikovaných 43 českých pacientů s touto diagnózou. Onemocnění se manifestuje mezi druhým a čtvrtým rokem života a mezi první příznaky patří opoždění vývoje řeči, přidávají se velice špatně ovlivnitelné křeče a ataxie. Dále dochází k regresu ve vývoji v oblasti řeči i motoriky. Porucha zraku se oproti juvenilní formě manifestuje poměrně pozdě, obyčejně až po regresu vývoje. K úplné ztrátě motorických funkcí a rozvoje vegetativního stavu dochází většinou kolem šestého roku života a úmrtí kolem desátého roku života (úmrtí v mid-childhood). Klinické skóre onemocnění bylo vytvořeno na základě studie přirozeného průběhu onemocnění (Steinfeld et al., AJMG ). Progrese onemocnění hodnotí ve čtyřech kateróriích hrubá motorika (chůze), řeč, křeče a zrak. Skóre u každé kategorie je hodnoceno 3 až body (3 - bez příznaků; mírně narušena funkce; závažně narušena funkce; - úplná ztráta funkce), pro body existují definovaná kritéria. Zásadní změnu do chmurné prognózy tohoto onemocnění přinesla intracerebrálně aplikovaná enzymová substituční terapie rekombinantní lidskou tripeptidyl peptidázou (cerliponase alfa) (Schulz et al. NEJM 8). V multicentrické studii u souboru 3 dětí došlo k zástavě progrese onemocnění hodnocené souhrnným klinickým skóre hrubé motoriky a řeči (max.skóre 6 bodů; během 48 týdnů pokles v léčené skupině o,7±,35 bodu, v neléčené skupině,±,98). V ČR jsme zahájili léčbu u dvou dívek ve věku 3 a 5 let s klinickým skóre 4 a 3 body v souhrnném hodnocení řeči a motoriky. Terapie je podávaná intracerebrálně během 4 hodinové infuze ze zásobních roztoků do Ommaya rezervoáru. Problémem bylo zavedení Ommaya rezervoáru u mladší z dívek pro nápadně tenké komory. Další komplikací byla nutnost sedace během aplikace. Nutno zmínit i vysokou cenu léčby, u které schvalovací proces trval měsíců. Terapii budeme vyhodnocovat po šesti měsících klinickým skóre. Jedná se o první zavedenou terapii tohoto typu v ČR. Závěr: Jako u jiných onemocnění, i zde o úspěchu rozhoduje rychlost diagnostiky a časné nasazení léčby. U batolete s opožděným vývojem řeči a prvním epileptickým záchvatem by měla být nyní léčitelná NCL na prvním místě diferenciální diagnostiky. Podpořeno grantem RVO-VFN 6465/. ADULT FORM OF TAY-SACHS DISEASE IN THE CZECH REPUBLIC H. Jahnová, H. Poupětová, H. Vlášková, E. Košťálová, J. Jirečková, M. Magner Department of Paediatrics and Adolescent Medicine, First Faculty of Medicine, Charles University and General University Hospital, Prague, the Czech Republic Background: Tay-Sachs disease (TSD) is a neurodegenerative disorder with autosomal recessive inheritance caused by lysosomal β-hexosaminidase A deficiency due to mutations in the HEXA gene. The adult form of disease (adult TSD) is considered extremely rare, and only limited number of cases have been reported. At present, effective treatment of disease is not available. Methods: Comprehensive data from 5 Czech patients with adult TSD were collated including clinical information, results of enzyme assays and DNA analyses of the HEXA gene. Results: 5 patients ( females, 5 males) were diagnosed between the years and 8 in the Czech Republic (CR). Six patients were siblings. No patient referred to be of Jewish Ashkenazi ancestry. The median age of first symptoms was 3 years (range -33 years), the median diagnostic delay was 3 years (range -34 years). The main clinical symptoms at the time of manifestation were stammering/ slurred speech, proximal weakness of the lower extremities due to anterior horn cell neuronopathy, signs of neo- and paleocerebellar dysfunction and/or psychiatric disorders. Cerebellar atrophy detected through brain MRI was a constant finding. Residual enzyme activity was.8-4.% of controls. All patients carried the c.85g>a (p. Gly69Ser) mutation, responsible for incorrect enzyme dimer forming, on at least one allele. Compound heterozygosity with the novel point mutation, c.754c>t (p.arg5cys) was found in two siblings. Conclusion: At present, adult TSD is the most frequently diagnosed gangliosidosis in CR. Its clinical picture is quite different from the classic infantile TSD. The main symptoms are slowly progressive distal motor neuron disease with variably expressed cerebellar impairment and psychiatric symptomatology. Enzyme assay of β-hexosaminidase A in serum/plasma is a rapid, inexpensive and reliable tool to verify clinical suspicion. In accordance with literary sources, the late-onset manifestation of TSD seems to be associated with the mutation c.85g>a (p.gly69ser) on at least one allele. Granty: MZ ČR RVO VFN6465, UNCE 464; PROGRES Q6/LF.

7 SBORNÍK ABSTRAKT PŘEDNÁŠEK SBORNÍK POSTERŮ KOMPLIKOVAVÉ PŘÍPADY V DIAGNOSTICE CAH Z. Hrubá, L. Fajkusová, S. Pouchlá Centrum molekulární biologie a genové terapie, Fakultní nemocnice Brno, Černopolní 9, 63 Brno Kongenitální adrenální hyperplázie (CAH) zahrnuje autozomálně recesivní enzymové defekty steroidogeneze v kůře nadledvin. Důsledkem těchto defektů je nedostatečná syntéza kortizolu a aldosteronu, zvýšená sekrece adrenokortikotropního hormonu a hromadění produktů steroidogeneze před enzymovým blokem (zvýšená hladina 7-hydroxyprogesteronu, progesteronu a testosteronu v organismu). Více než 9% všech případů CAH je způsobeno deficitem -hydroxylázy, která je kódovaná genem CYPA. Molekulárně genetická analýza CYPA genu je založena na long-range PCR, sekundární PCR, přímém sekvenování CYPA genu včetně jeho intronových oblastí a na metodě MLPA. Analýza CYPA genu je komplikovaná přítomností vysoce homologního pseudogenu CYPAP, častým výskytem chimérního CYPAP/CYPA genu, výskytem alel s duplikovaným CYPA genem (často v kombinaci s jednou či více mutacemi) a také někdy přítomností dvou mutací na jedné alele. V našem souboru máme vyšetřených 8 pacientů s podezřením na deficit -hydroxylázy, přičemž diagnózu jsme potvrdili (nalezením dvou nebo více mutací) u 5 probandů. U 3 pacientů jsme identifikovali pouze jednu mutantní alelu a u 456 jedinců nebyla v CYPA genu nalezena žádná patogenní varianta. Celkem jsme identifikovali 4 různých typů mutantních alel. Nejpočetnější skupinu tvoří alely nesoucí bodovou mutaci (celkem 8 typů), přičemž nejčastější bodové mutace vznikají genovou konverzí z nefunkčního CYPAP pseudogenu. 6 typů námi nalezených bodových mutací z pseudogenu nepochází. Přibližně třetinu mutantních alel tvoří alely nesoucí některý typ chimérního CYPAP/CYPA genu a cca 6% tvoří alely s úplnou nebo částečnou delecí CYPA genu, případně s duplikovaným CYPA genem. Duplikace CYPA genu se v našem souboru vyskytuje často v podobě, kdy jedna kopie genu nese bodovou mutaci p.q39* a druhá je bez mutace. Nález duplikovaného genu nelze vždy zcela jednoznačně interpretovat. Mezi probandy s nalezenou pouze jednou mutovanou alelou je celkem 7 jedinců, kteří mají alelu s duplikací CYPA genu a mutací p.q39* na jedné z kopií genu. Tito jedinci mají převážně mírné projevy CAH a žádná další mutace v CYPA genu u nich nebyla nalezena. Zároveň máme ale v databázi minimálně 45 jedinců (rodičů probandů nebo partnerů probandů), kteří mají shodný nález (tj. kopie CYPA genu na jedné alele a mutace p.q39* na jedné z kopií), ale jsou bez příznaků CAH. Především u rodin s výskytem duplikací a delecí považujeme za nezbytné doplnit analýzu CYPA genu také u rodičů (případně sourozenců a dalších členů rodiny) probandů. Kompletní genotypizace a identifikace všech mutantních alel CYPA genu umožňuje jednak potvrzení klinické diagnózy u probandů, ale také detekci heterozygotních přenašečů a případné využití v prenatální diagnostice. Studie byla podpořena projektem TAČR (TE58) GAUCHER ZTRACENÝ A ZNOVU NALEZENÝ. KASUISTIKA P. Slezák, V. Malinová, H. Ptoszková 3 Centrální laboratoř a hematologická ambulance, Nemocnice Šumperk a.s. Klinika dětského a dorostového lékařství (KDDL). LF UK a VFN Praha 3 Klinika dětského lékařství FN a LF OU Ostrava Úvod: Gaucherova nemoc (GD) je dědičná porucha metabolismu s lysosomálním střádáním glukocerebrosidu v buňkách monocyto- -makrofágového systému. To je způsobeno nedostatečnou aktivitou beta-glukocerebrosidázy. Dědičnost je autozomálně recesivní. Incidence je udávána mezi :5 až :. GD se dělí na tři typy: I.typ non-neuronopatický (nejčastější, přes 9%), II. typ akutní neuronopatický a III. typ subakutní neuronopatický. Klinicky se projevuje splenomegalií, hepatomegalií zejména s trombocytopenií s krvácivými projevy. Dále pestrými kostními změnami. U dětí často menším vzrůstem a neprospíváním. U II. a III. typu i postižením centrálního nervového systému. Metodika: V ČR je komplexní péče o pacienty s GD centralizována na KDDL. LF UK a VFN v Praze. Enzymologická diagnostika se v posledních letech provádí průkazem nedostatečné aktivity betaglukocerebrosidázy v izolovaných leukocytech periferní krve. (Tzv. test ze suché kapky krve). Kauzální enzymatická substituční léčba (ERT) byla v ČR použita poprvé v roce 995, do praxe se dostala o několik let později a zcela nahradila splenektomii. Významnou roli v diagnostice a monitoringu efektu léčby hraje i pro GD specifický biomarker Lyso-Gb. V ČR je sledováno 35 pacientů. Vzhledem k heterogenitě klinických projevů uplyne často i mnoho let od prvních příznaků do stanovení diagnózy, resp. do zahájení léčby. Výsledky: Pacient ve věku 44 let, od dětství drobnějšího vzrůstu. Ve 4 letech zjištěna splenomegalie, trombocytopenie s nečetnými epistaxemi, leukopenie. Hospitalizován ve Vsetíně (již tam v punktátu dřeně nalezeny Gaucherovy buňky), v Ostravě a na Dětské klinice Thomayerovy nemocnice v Praze, kde GD I. typu potvrzena stanovením nedostatečné aktivity beta-glukocerebrosidasy v leukocytech. Pak sledován v Ostravě a Praze, v 8 letech splenektomie (prof. Pafko). Od let (995) pak přestal docházet na kontroly a jakoby zmizel ze světa. Až koncem roku 8 při revizi historických laboratorních dat se zjistilo, že je ve výkonu trestu ve věznici Mírov. A tak se pacient po 4 letech letos vrátil do ordinace hematologa. Až na sporadické epistaxe je po celou dobu bez klinických potíží. V březnu t.r. byla diagnóza GD potvrzena enzymologicky snížená aktivita beta-glukocerebrosidázy, dále prokázána patologicky zvýšená hodnota biomarkeru Lyso-Gb. Genetickým vyšetřením GBA genu identifikovány heterozygotní patologické varianty. Závěr: Pacient bude klinicky i laboratorně sledován zatím ve spádu a po ukončení trestu v pražském centru. Při progresi se zváží ERT. Geneticky došetříme sourozence a žijící matku pacienta. Pokud bude v budoucnu plánovat děti, vyšetříme geneticky i partnerku.. MULTISYSTEM MITOCHONDRIAL DISEASES DUE TO MUTATION IN MTDNA-ENCODED SUBUNITS OF COMPLEX I. T. Daňhelovská, H. Kolářová, H. Hansíková, M. Vaněčková, L. Lambert, V. Kučerová-Vidrová, K. Beránková, T. Honzík, J. Zeman, M. Tesařová. THE EFFECT OF MUTATIONS IN THE DNML GENE ON THE MITOCHONDRIAL ENERGETIC METABOLISM AND MITOCHONDRIAL AND PEROXISOMAL FISSION. N. Volfová, L. Alán, T. Daňhelovská, M. Rodinová, J. Sládková, J. Křížová, H.Hansíková, J. Zeman, M. Tesařová 3. GLYCOLYTIC AND RESPIRATION PARAMETERS IN PATIENTS WITH CONGENITAL DISORDERS OF GLYCOSYLATION. L. Zdražilová, J. Křížová, N. Ondrušková, T. Honzík, J. Zeman, H. Hansíková 4. RANNÁ KETÓZA - NÁLEZ VEDÚCI K DIAGNOSTIKE DEFICITU GLYKOGÉNSYNTÁZY. K. Brennerová, M. Kolníková, L. Dvořáková, K. Juríčková, M. Ostrožlíková, M. Škopková, V. Bzdúch. 5. MUTACE V FAD SYNTÁZE U KOJENCE S GLUTAROVOU ACIDURIÍ TYPU II A PRIMÁRNÍ ADRENÁLNÍ INSUFICIENCÍ. L. Nosková, V. Stránecký, H. Hartmannová, K. Hodaňová, D. Mušálková, H. Trešlová, L. Piherová, M. Magner, J. Zeman a S. Kmoch 6. RUTINNÝ LABORATÓRNY ANALYT KYSELINA MOČOVÁ V DLHODOBOM MONITOROVANÍ CHOROBY JAVOROVÉHO SIRUPU. M. Ostrožlíková, K. Brennerová, A. Vasilenková, J. Perečková, J. Škodová, A. Šalingová, D. Holešová, D. Schich Behúlová, C. Šebová, S.Tárnoková 7. LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA PORUCH BIOSYNTÉZY A TRANSPORTU KREATINU. J. Bártl, O. Martincová, I. Chodorová, J. Hodík, J. Zvoníčková, P. Chrastina a K. Pešková 8. NAŠE ZKUŠENOSTI S NOVOROZENECKÝM SCREENINGEM DEFICITU BIOTINIDÁZY. E. Hlídková, D. Friedecký, H. Janečková, V. Bekárek, L. Kittlová, L. Kowalczuková, S. Petrželová, T. Semeniuk, J. Ševčíková, A. Zábranská, O. Tkachyk, J. Štellmachová, V. Smolka, T. Adam 9. GLYKOSYLACE SÉROVÉHO APOLIPOPROTEINU C-III JAKO MARKER GLYKOGENÓZ TYPU III A IX. N. Ondrušková, Z. Pakanová, T. Honzík, J. Mucha, J. Zeman, H. Hansíková. ANALÝZA CNV V PANELOVÉM SEKVENOVÁNÍ VYBRANÝCH METABOLICKÝCH ONEMOCNĚNÍ. M. Řeboun, M. Nováková, R. Svačinová, P. Chrastina, K. Pešková, T. Honzík, L. Dvořáková. HLEDÁNÍ GENETICKÉ A MOLEKULÁRNÍ PŘÍČINY ZODPOVĚDNÉ ZA ATYPICKOU FABRYHO CHOROBU V 6 ČESKÝCH RODINÁCH S DOMINANTNÍ DĚDIČNOSTÍ A VARIANTOU NEJASNÉHO VÝZNAMU V GLA (C. 8T>C, P. LEU394PRO). M. Živná, G. Dostálová, H. Trešlová, H. Poupětová, H. Vlášková, L. Stolnaja, V. Barešová, K. Hodaňová, H. Hartmannová, P. Vyleťal, M. Votruba, J. Sovová, A. Vrbacká, L. Roblová, E. Honsová, I. Rychlík, A. Linhart, S. Kmoch. ANALÝZA MITOCHONDRIÁLNÍCH PARAMETRŮ V SÍTNICI PRASETE PILOTNÍ STUDIE. Ž. Dosoudilová, S. Drutovič, D. Sedláčková, S. Knopová, T. Ardan, Z. Ellederová, J. Motlík, J. Zeman, H. Hansíková 3. ACTIVATION OF MITOCHONDRIAL METABOLISM DURING PRENATAL AND EARLY POSTNATAL DEVELOPMENT IN RAT WITH EMPHASIS ON COQ BIOSYNTHESIS. J. Krizova, M. Hulkova, H. Kolarova, A. Hrustincova, S. Knopova, D. Sedlackova, V. Capek, J. Zeman and H. Hansikova 4. MULTIPARALELNÉ SEKVENOVANIE CELEJ MTDNA - PRVÉ VÝSLEDKY. M. Škopková, P. Jungová, K. Brennerová, D. Gašperíková 5. NÁŠ PŘÍSTUP K FENYLKETONURII PO 6 LETECH ZKUŠENOSTÍ (CDMP, ÚDMP A KDDL). M. Paulová, E. Klímová, P. Husáková, H. Wiederlechnerová, O. Martincová, K. Pešková 6. KJEROVA ATROFIE OPTIKU KLINICKÁ A MOLEKULÁRNÍ CHARAKTERISTIKA 4 ČESKÝCH PACIENTŮ. S. Kelifová, T. Honzík, M. Tesařová, B. Kousal, L. Ďuďáková, J. Zeman, P. Lišková, H. Kolářová 7. FENOTYPOVÉ PROJEVY PACIENTŮ S VROZENOU EGFR MUTACÍ U ROMSKÉ POPULACE. S. Mazurová, V. Stránecký, M. Tesařová, A. Vondráčková, H. Hansíková, M. Giertlová, A. Baxová, J. Laštůvková, V. Chovanová, J. Zeman, T. Honzík, M. Magner 8. NEUROTRANSMITTER DISORDERS: CZECH REPUBLIC EXPERIENCE. J. Kulhanek, O. Martincova, K. Peskova, P. Chrastina, J. Zeman, T. Honzik 9. THE PHENOTYPIC SPECTRUM OF 43 CZECH PATIENTS WITH SINGLE MITOCHONDRIAL DNA DELETION. N. Anteneová, H. Kolářová, J. Zeman, M. Tesařová, H. Hansíková, T. Honzík. GLYKOGENÓZA TYPU VII VZÁCNÁ PŘÍČINA RABDOMYOLÝZY. E. Košťálová, H. Vlášková, L. Dvořáková. KLINICKÉ, BIOCHEMICKÉ A GENETICKÉ ASPEKTY WILSONOVY CHOROBY. D. Procházková, S. Pouchlá, M. Dastych, P.Konečná, L.Kolbová, L Fajkusová. KOMBINOVANÁ PORUCHA KOMPLEXŮ I A III U PACIENTA S NEPOPSANOU MUTACÍ V GENU UPCRC KÓDUJÍCÍM STRUKTURNÍ PODJEDNOTKU KOMPLEXU III. D. Burska, J. Krizova, J. Sladkova, M. Rodinova, H. Hansikova, J. Zeman, M. Tesarova 3. DEFICIT MITOCHONDRIÁLNÍ ACETOACETYL-COA THIOLÁZY (BETA-KETOTHIOLÁZY) - KAZUISTIKA. O. Tkachyk, H. Janečková, E. Hlídková, V. Bekárek, D. Friedecký, T. Adam, V. Smolka 4. PRVÝ DETSKÝ PACIENT S GENETICKY POTVRDENÝM DEFICITOM LAL NA SLOVENSKU. Ľ. Potočňáková, J. Šaligová, S. Mattošová, J. Chandoga, V. Konstanopoulou., M. Zeyda, K. Šebová, M. Andrejková, J. Šaliga 5. GLUTÁROVÁ ACIDÚRIA. TYPU: VEDĽAJŠÍ NÁLEZ PRI VÝRAZNEJ KETÓZE ALEBO MANIFESTÁCIA METABOLICKEJ PORUCHY? F. Mičev, D. Maceková, A. Hlavatá, R. Górová, V. Podolcová, M. Prídavok, C. Šebová, M. Ostrožlíková 6. OD JEDNEJ DIAGNÓZY K DRUHEJ. A. Szokeová, M. Čiljaková, J. Vojtková, P. Bánovčin, A. Hlavatá

8 Multisystem mitochondrial diseases due to mutation in mtdna-encoded subunits of complex I T. Daňhelovská, H. Kolářová, H. Hansíková, V. Kučerová-Vidrová, K. Beránková, T. Honzík, J. Zeman, M. Tesařová Department of Pediatrics, First Faculty of Medicine, Charles University and General University Hospital, Prague, Czech Republic tereza.danhelovska@vfn.cz Figure: Structure of Complex I (Wirth et al, 6) Introduction: Respiratory chain complex I (CI) deficiency may originate from mutations in nuclear or mitochondrial DNA (mtdna). The aims of the study was to compared the phenotype and genotype in children with multisystem mitochondrial diseases (MD) and mutations in mtdna genes for structural subunits of CI. Material and methods: In the cohort of 6 unrelated families carrying different mtdna mutations, heteroplasmic mutations in MT-ND, MT-ND3 and MT-ND5 genes including novel mutation m.39t>c were found in 3 patients with multisystem MD from families. Mitochondria were isolated from muscle biopsies (Makinen and Lee 968) and stored at -8 C. Protein concentrations were measured by the Lowry method (Lowry et al. 95). The activities of the respiratory chain complexes (Rustin et al. 994) and citrate synthase (Faloona and Srere 969) were measured spectrophotometrically. Mitochondrial energy-generating system (MEGS) analyses was performed according to Janssen (Janssen et al. 6). Results: First symptoms developed since early childhood to adolescence and progressed to multisystem disease with phenotype of Leigh or MELAS syndromes. MRI revealed bilateral symmetrical involvement of deep gray matter typical of Leigh syndrome in 6 children, cortical/white matter stroke-like lesions in 3 patients and combination of cortico-subcortical lesions and gray matter involvement in 4 patients. Spectrophotometric analyses in isolated muscle mitochondria revealed low activity of CI and/or CI+III in all except one sample but enzymatic activities in cultivated fibroblasts were mostly normal. MEGS analyses indicated mitochondrial disturbances in all muscle samples and decreased oxidation of [- 4 C] pyruvate in cultivated skin fibroblasts. Mutations in the DNML gene (Drp) and their impact on the mitochondria, peroxisomes and mitochondrial energetic metabolism Volfová N, Alán L, Daňhelovská T, Rodinová M, Sládková J, Křížová J, Hansíková H, Zeman J, Tesařová M Department of Pediatrics and Adolescent Medicine, First Faculty of Medicine, Charles University and General University Hospital in Prague, Prague, Czech Republic Institute of Physiology, The Czech Academy of Sciences, Prague, Czech Republic Introduction: The dynamin -like protein (Drp), which is encoded by the DNML gene, is an enzyme from a large family of GTPases and is important for mitochondrial and peroxisomal fission. Drp interacts with membrane receptors at the cleavage site and then forms an oligomer allowing Drp filaments to curl into closed rings. Drp oligomerization at the site of fission is followed by constriction of the organelles, and in the last step the membranes are separated by GTP hydrolysis. Drp has four domains: the GTP-binding domain, the middle domain, the insert B, and the GTPase effector domain. The mutations have been described in the middle and in the GTPase domains, and the cultivated myoblasts and fibroblasts from the respective patients show elongated mitochondria. This confirms impaired mitochondrial dynamics. Mutations: ) De novo heterozygous mutation c.76c>t (p.thr59ile) in the DNML gene was found by exome sequencing in our patient, a -year-old girl. The patient exhibits optic atrophy, axial hypotonia, spastic paraparesis and neo- and paleo-cerebellar syndrome. Muscle biopsy showed decreased respiratory chain complex I+III activity. ) Heterozygous mutation c.84g>a (p.gly36ser) in the DNML gene was described in the previous study by Sheffer et al. (6). Their patient (a -year-old boy) presents with a chronic neurological disorder, postnatal microcephaly, developmental delay, and pain insensitivity. Muscle biopsy revealed decreased respiratory chain complex IV activity. Using transient transfection we prepared the fibroblast cell lines with overexpression of the DNML gene with mutations c.76c>t in the GTPase domain, mutation c.84g>a in the middle domain and DNML wild type. All cells were sorted by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and positive cells were used for analysis. In all cell lines we found changes in the mitochondrial network and ultrastructure, as well as unusually long peroxisomes. Furthermore, we observed differences in the energy metabolism (respiration, glycolysis) in both cell lines with the mutations in DNML gene compared to the WT and the control cell lines. Table. Clinical and laboratory data in 3 patients with complex I deficiency and heteroplasmic mtdna mutations in MT-ND, MT-ND3 or MT-ND5 genes Patient mtdna gene MT-ND MT-ND3 MT-ND5 mutation m.3697g>a m.3946g>a m.58t>c m.76t>c m.34g>a m.346t>c m.39t>c m.353g>a mtdna heteroplasmy [%] muscle 93 np np np fibroblasts 8 79 np 85 np np np np blood np hair follicles 93 np np 94 np 9 44 np urinary sediment 96 np np np np buccal smear 93 np np 9 np np median for all tissues age at onset (week, months, years) w w 9 y 4 m 7 y 6 m y y m 6 y y y 5 m first symptom hypotony hypotony stroke like episode hypotony Wernicke aphasia hypotony optic neuropathy migraine hypotony optic neuropathy stroke like episode hearing loss nystagmus failure to thrive initial hypotony/later spasticity +/+ +/+ +/+ +/+ -/- +/+ -/- -/- +/+ -/- -/- +/- +/- cerebellar symptoms strabismus epilepsy migraine optic atrophy ptosis CPEO hearing loss peripheral neuropathy mental insufficiency psychiatric disturbances Figure : The analyses described below were performed in the patient s fibroblasts, cells transfected with mutated (p.thr59ile, p.gly36ser) or wild type (WT) DNML and control fibroblasts after 48-hour cultivation in Dulbeco s MEM Medium, at 37 C, in 5% CO atmosphere. Epifluorescence microscope Nikon Eclipse Ti-U was used to assess the signal from the Mitotracker staining and peroxisome visualization. A) Electron microscopy analysis (4 x magnification) was performed according to Luft (956), with minor modifications. Briefly, the cells were fixed with % KMnO 4 in PBS, dehydrated with 5% and 7% ethanol and analyzed by transmission electron microscopy (Jeol 4 plus). The patient s fibroblasts as well as the cells transfected with mutated DNML showed very narrow and long mitochondria, compared to both control fibroblasts and the cells transfected with wild type DNML. B) Mitotracker Red (Mitosciences) staining ( nm, 3 min, 37 C) revealed a markedly elongated mitochondrial network in the patient s fibroblasts. In the cells transfected with DNML-p.Gly36Ser longer mitochondria were observed compared to cell transfected with DNML- p.thr59ile. C) Peroxisomes were visualized by immunocytochemistry using a catalase antibody. The cells were fixed with the solution containing 4% paraformaldehyde and,5% glutaraldehyde ( min, 37 C), permeabilized with,% Triton-X ( min, RT) and blocked in 5% inactivated fetal bovine serum (ifbs) for 45 min (RT). This was followed by the incubation with the catalase antibody (A987, Invitrogen; : in 5% ifbs) at 4 C overnight and then with the secondary antibody (anti-donkey, IgG, Alexa Fluor 555; : in 5% ifbs) for h (RT). Similarly to the previous experiments, we observed an altered structure of peroxisomes, which were longer in the fibroblasts with mutated Drp compared to the control lines. In the cells transfected with mutated DNML there was no difference. D) Immunocytochemical staining of nucleoids showed bigger nucleoid clusters in the patient s cells and the cells transfected with mutated (p.thr59ile, p.gly36ser) DNML in comparison to the control fibroblasts. In the cells with mutation p.gly36ser there were the biggest nucleoids (doubled in size compared to the control), and in the cells with p.thr59ile were nucleoids increased by only % compare to control. The method was carried out as follows: first, the mitochondrial network was stained using a nm solution of MitoTracker Red (Mitosciences) for 3 min, RT. Then, the cells were fixed in 4% paraformaldehyde with,5% glutaraldehyde and permeabilized with wash buffer:, M glycine,,6% Tween,,6% TritonX- in PBS (Jackson ImmunoResearch) x for min at RT. Blocking with 5% donkey serum (45 min, RT) was followed by incubation with anti-dna (Progen, 64) and anti-mttfa in 5% donkey serum at 4 C overnight, and the next day with secondary antibodies (Alexa Fluor 488 for anti-dna and Alexa Fluor 555 for mt-tfa) in 5% donkey serum for h, RT. The signal was acquired using confocal microscopy Leica SP8. present age (died at years) died at 7 died at.8 3 died at.3 died at died at blood-lactate [controls <.3 mmol/l] CSF-lactate [controls <. mmol/l] np 4.3 Patient A B 3A 3B 5 6 7A 7B 8 9 A B 3 age at MRI y y 7 m 4 y 4 y 36 y m 7 y 7 y 3 y 34 m 9 y 5y 8 y 8 y 3 y deep gray matter lesions stroke-like lesions periventricular atrophy Figure. Brain MRI from patients with mutations in MT-ND, MT-ND3 and MT-ND5 genes in mtdna Table. Activities of respiratory chain complexes I and I+III related to citrate synthase (CS) in muscle mitochondria in patients with mutations in MT-ND, MT-ND3 and MT-ND5 genes. Patient mtdna genes and site of the mutation mtdna heteroplasmy [%] isolated muscle mitochondria activity of CI related to CS (controls) activity of CI+III related to CS (controls) m.3697g>a 93.5 (.45.5).8 (.7.3) MT-ND 3 m.3946g>a 53.3 (.8.38).8 (.8.37) 4 MT-ND3 m.58t>c 95.4 (.45.5).6 (.7.3) 5 m.76t>c 83. (.5.4). (.3.5) 6 m.34g>a 96.6 (.45.5).8 (.7.3) 7 m.346t>c 7.8 (.8.38).6 (.8.37) 8 MT-ND5 m.39t>c 6.6 (.5.4).5 (.3.5) (.8.38).3 (.8.37) m.353g>a 48. (.8.38).8 (.8.37) 97.7 (.8.38).3 (.8.37) [ 4 CO/min/mg prot] [ 4 CO/min/mg prot] [- 4 C]Pyruvate + malate + ADP [- 4 C]Pyruvate + carnitine + ADP [- 4 C]Pyruvate + malate without ADP [- 4 C]Pyruvate without carnitine + ADP Figure. MEGS analysis in cultivated skin fibroblasts from 8 patients (P,, 4, 6, 7, 9-) with mutations in MT-ND, MT-ND3 and MT-ND5 genes revealed significantly decreased oxidation rate of 4 different incubations containing [- 4 C]pyruvate. Conclusions: Patients with multisystem MD due to heteroplasmic mtdna mutations resulting in isolated CI deficiency represent approximately % of all families with maternally inherited MD diagnosed in the Czech Republic. The affected patients developed Leigh or MELAS syndrome, but the overlap between both syndromes was present in 3% of patients. On the biochemical level, analyses of MEGS in cultivated fibroblasts or muscle biopsies may serve as a good and sensitive indicator for disorders of mitochondrial energy-generating system in tissues of mitochondrial patients and may be utilized for analysis of the functional consequences of mutations in the MT-ND genes. Acknowledgement: Special thanks to L. Lambert and M. Vaněčková for MRI consultation, to D. Sedláčková and S. Knopová for their technical support and to M. Kolníková, T. Veverka, D. Štefánková, L. Šromová and S. Šišková for collaboration. [ 4 CO/min/mg prot] Controls (n=) Patients (n=8) Controls (n=) Patients (n=8) [ 4 CO/min/mg prot] Controls (n=) Patients (n=8) Controls (n=) Patients (n=8) Figure : The gene expression analyses. RNA was isolated from the transfected cells and then transcribed into cdna by reverse transcription. TaqMan- FAM/MGB sonds (Thermo Fisher Scinetific) were used to quantify gene expression for our DNML gene and control genes: SDHA (major catalytic subunit of succinateubiquinone oxidoreductase) and HPRT (Hypoxanthineguanine phosphoribosyltr ansferase). Figure 3: The Seahorse XF analyses. Cells were seeded into a Seahorse XF4 microplate in 5 cells/well density. Each sample was seeded in 5 wells and the experiment was performed the following day. Respiration was measured in D53 assay media containing mm Glutamine, mm pyruvate and 5.5 mm Glucose, ph 7.4. Standard Mito Stress Test Kit protocol was performed with injections of μm oligomycin,.7 μm FCCP and.5 μm rotenone +.5μ antimycin A. Data were normalized to protein content. Figure 4: Comparison of steady-state levels of different OXPHOS-related proteins in the analyzed fibroblasts. Whole cell lysates were separated using Tricine-SDS-PAGE and the resulting blotted membranes were marked with antibodies matched with the indicated proteins. Changes were apparent in the levels of CIV subunits (COX, COX5a), as well as in the proteins involved in mitochondrial dynamics (OPA, Mitofusin ) and cristae formation (Mitofilin). Conclusion: We found different biochemical consequences of the DNML mutations p.thr59ile (c.76c>t) and p.gly36ser (c.84g>a). In the fibroblast cells from our patient and in the corresponding transfected cells, we found elongated peroxisomes and mitochondrial networks, as well as mitochondrial nucleoid clustering (Fig. ). In cells with the mutation in the GTPase domain (p.thr59ile (c.76c>t)), we observed a unique mitochondrial ultrastructure with pronounced narrowing between mitochondria in the fission process. Thus we assume that the Drp protein is able to oligomerize, but fission of mitochondrial membrane is hampered due to lower capacity to hydrolyze GTP. At the same time, reduced ATP production and respiratory capacity were observed in these cells, which corresponds to reduced mitochondrial bioenergetic metabolism (Fig. 3). The presence of the mutation p.gly36ser (c.84g>a) leads to Drp which is unable to oligomerize, resulting in very long mitochondrial networks without fission narrowing. The significant colocalization of mtdna clusters with mttfa (Fig. D) in the patient s cells and cells transfected with mutated DNML, a mechanism by which the cells attempt to protect mtdna, suggests elevated mitochondrial stress (Alan et al. 6). Supported by research projects AZV A, RVO-VFN6465/, SVV 6367

9 3 4 Bioenergetic parameters in patients with Congenital Disorders of Glycosylation L. Zdrazilova, J. Krizova, N. Ondruskova, T. Honzik, J. Zeman, H. Hansikova Institute of Inherited Metabolic Disorders, Department of Pediatrics and Adolescent Medicine, First Faculty of Medicine, Charles University and General University Hospital in Prague, Czech Republic Ranná ketóza nález vedúci k diagnostike deficitu glykogénsyntázy K. Brennerová, M. Kolníková, L. Dvořáková 3, K. Juríčková, M. Ostrožlíková 4, M. Škopková 5, V. Bzdúch. Detská klinika LFUK a NÚDCH, Bratislava. Neurologická klinika LFUK a NÚDCH, Bratislava 3. Laboratoř DNA diagnostiky, Klinika dětského a dorostového lékařství VFN a.lfuk, Praha 4. Oddelenie laboratórnej medicíny NÚDCH, Bratislava 5. Diabgene, Ústav experimentálnej endokrinológie, Biomedicínske centrum SAV, Bratislava Introduction: Congenital disorders of glycosylation (CDG) are rare inherited diseases caused by abnormal protein and lipid glycosylation. Recent published and our preliminary data indicated possible interconnection between glycosylation defects and mitochondrial function abnormalities. Aim of study: Aim of study was to analyze mitochondrial respiration and glycolysis in fibroblast cell lines of patients with 8 types of CDG and compare them with control cell lines. Measurements were performed by using Oxygraph-k (Oroboros) and Seahorse Bioanalyzer (Agilent). GLYCOSYLATION CONGENITAL DISORDERS OF GLYCOSYLATION (CDG) Congenital disorders of glycosylation are rare fast growing group of diseases caused by defective protein or lipid glycosylation. CDG with defective N-glycosylation: Type I is caused by defective oligosaccharide biosynthesis taking place in endoplasmic reticulum before giving oligosaccharide on protein. Type II is caused by defective glycoconjugates modification which is mostly in Golgi. More than a CDG defects. O consumption (pmol. s -. mg - ) 6, 5, 4, 3,,,, References: A Fig. : A: N-linked glycan B: O-linked oligosaccharide C: dolichol phosphate structure ATP6AP-CDG Zhang et al., 6 Fig. : Process of N-glycosylation. First steps are localized in ER. Monosaccharides are added on nascent oligosaccharide linked to dolichol. And than transferred to protein and modified mostly in Golgi apparatus. Respiration parameters in fibroblast cell lines from CDG patients and controls CDG I CDG II CDG- dolichol defect controls PGM-Ama CI stim Glycosylation is a process of adding oligosaccharide B chains to proteins or lipids. We divide it into groups: N-glycosylation when glycan is linked to amino group of asparagine and O-glycosylation when glycan is bonded to hydroxyl group C of serine/threonine and very often plays a crucial role in function of this protein or lipid. ADP-PGM ADP stim. High-Resolution respirometry Su-rot CI dep rot-ama CII dep Omy-Ama leak Su-Ama OXPHOS atf-z CIVu Fc-Ama ETCu ALG8-CDG PGM-CDG PMM-CDG ManB-CDG RFT-CDG SLCA7-CDG ATP6AP-CDG NUS-CDG (x) controls (x) Fig.4: Respiration parameters in CDG patient s fibroblasts. Measurements of premeabilized cells on oxygraph showed different respiration profile for all types of CDG patients and most of them also had different (mostly reduced respiration) profile in comparison to controls. Ge-Hong Sun-Wadaa,YohWada. 5 ATP6AP protein 5 is one of two accessory proteins for Vacuolar ATPase subunits. This ATPase is required for luminal acidification of secretory vesicles and is a proton pump that uses the energy from ATP hydrolysis to produce a proton gradient. ATP6AP-CDG CONROL Fig. 5: Mitochondrial respiration in ATP6AP-CDG and control fibroblasts has different profile in comparison to controls. Flux after succinate addition and also other parameters has not shown any increase. Hennet T, Cabalzar J. Congenital disorders of glycosylation: A concise chart of glycocalyx dysfunction. Trends Biochem Sci. 5;4(7): , Filadi R, Theurey P, Pizzo P. The endoplasmic reticulum-mitochondria coupling in health and disease: Molecules, functions and significance. Cell Calcium. 7 (-5) 3 Benoit B. Cell mito stress test kit user manual. Agilent. :-47 4 Benoit B. Agilent Seahorse XF glycolysis stress test kit user guide. Agilent. 7:-4 5 Jansen EJR, Timal S, Ryan M et al. ATP6AP deficiency causes an immunodeficiency with hepatopathy, cognitive impairment and abnormal protein glycosylation Nat Commun. 6; 7: 6 6 Park EJ, Grabińska KA, Guan Z et al. Mutation of Nogo-B receptor, a subunit of cis-prenyltransferase, causes a congenital disorder of glycosylation. Cell Metab. 4;: GLYCOSYLATION AND MITOCHONDRIA Endoplasmic reticulum is one of the main point of glycosylation steps, there was confirmed interaction with mitochondria. Filadi et al.,7 Material: Biological material for this study consisted of fibroblasts cell lines from 9 CDG patiens with 8 different types of CDG and controls fibroblast cell lines. Methods: We measured oxidative respiration on permeabilized cells on Oxygraph and on native nonpermeabilized attached cells by Seahorse bioanalyzer, where we measured also glycolysis. Results were correlated. There were optimized new protocols for measuring on oxygraph, which will be used for fibroblast respiration from CDG patients and control cell lines comparison. OCR (pmol.min -.μg - ) OCR (pmol.min -.μg - ) , 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3,,,, Mitochondrial respiration ALG8-CDG PGM-CDG PMM-CDG ManB-CDG RFT-CDG SLCA7-CDG ATP6AP-CDG NUS-CDG (x) controls (x) basal respiration ATP production proton leak maximal respiration reserve respiration capacity Fig. 6: Mitochondrial respiration in CDG patients and controls. Some similarities in CDG type I group and in CDG type II group were observed in comparison to controls. Seahorse XFe Cell Mito Stress Test Profile Time (min) Seahorse Bioanalyzer control NUS-CDG Fig. 8: Mitochondrial respiration in NUS-CDG in comparison to control. Decreased respiration compared to controls may be due to reduced ability of cells to intake substrates. NUS-CDG Nogo-B receptor is encoded by NUS gene. This protein is involved in dolichol biosynthesis 6. Conclusion: Our results indicate secondary functional abnormalities in mitochondria and glycolytic dysfunction due to a breakdown of the glycosylation pathway. The study of mitochondrial metabolism in congenital disorders of glycosylation may contribute to the elucidation of pathomechanisms in unclear metabolic diseases. Supported by: GAUK9, AZV 6-393A, 8F 9 EURO-GLYCAN-OMICS, SVV 6367, RVO VFN6465/ ECAR (mph.min -.ug - ) ECAR (mph.min -. μg - ) 4,5 4 3,5 3,5,5,5 4,5 4 3,5 3,5,5,5 Fig.3: Possible interrconections between endoplasmic reticulum and mitochondria. For example it is related with calcium transport. And in some types of CDG patients was already confirmed calcium transporters disruption. But there are also many other pathways which can be disturbed due to stress caused by glycosylation defect. Glycolytic function ALG8-CDG PGM-CDG PMM-CDG ManB-CDG RFT-CDG SLCA7-CDG ATP6AP-CDG NUS-CDG (x) controls (x) glycolysis glycolytic capacity glycolytic reserve non-glycolytic acidification Fig. 7: Glycolytic function in CDG patients and controls. glycolysis profile and other parameters are reduced almost in all tested types in comparison to controls. Measuring of mitochondrial respiration in native (nonpermeabilized) fibroblasts was done by using modified Mito stress test protocol 3. Glycolytic function was measured with glyco stress test protocol 4. Seahorse XFe Glycolysis Stress Test Profile Time (min) control NUS-CDG Fig. 9: Glycolytic function in NUS-CDG in comparison to control. Glycolytic profile and parameters are reduced in comparison to controls, which is maybe present due to sparing glucose for glycosylation pathways. Deficit hepatálnej izoformy glykogénsyntázy - glykogenóza typ - je spôsobený mutáciami v géne GYS, lokalizovaného na chromozóme p.. AR dedičné ochorenie, známe od roku 963. Výskyt ochorenia: zriedkavý, mierne formy ochorenia môžu unikať diagnostike. Klinika: najčastejšie po vynechaní nočného kŕmenia alebo počas gastroenteritíd - symptómy súvisiace s hypoglykémiou, neskôr porucha rastu, hyperlipidémia, bez hepatomegálie. Diagnostika: porucha glukózovej homeostázy; - v období hladovania: hypoglykémia, ketóza a aktivovaná glukoneogenéza - typický nález deficitu glukoplastických aminokyselín v plazme - postprandiálne: hyperglykémia, laktátová acidóza (prebytok glukózy sa nemôže uložiť do glykogénu, konvertuje sa na laktát prostredníctvom glykolytickej dráhy) Orálny glukózotolerančný test so stanovením laktátu a 3-OH butyrátu ukáže po podaní glukózy typický pokles ketózy a vzostupu laktátu v plazme, môže byť záchyt hyperglykémie. Liečba: diéta; časté menšie porcie stravy bez voľných sacharidov, zvýšený príjem proteínov. Podanie polysacharidov pred nočným spánkom, v priebehu akútnych ochorení alebo zvýšenej fyzickej aktivity aj v priebehu dňa. glukóza z potravy Laboratórny nález pri prvom vyšetrení v metabolickej ambulancii: asymptomatická hypoglykémia, deficit viacerých aminokyselín v plazme, výrazná ketóza a normolaktatémia nalačno, po jedle pokles 3-OH butyrátu a mierny vzostup laktátu (tabuľka). Predpokladali sme súvis laboratórnych nálezov s výraznou selekciou stravy a odmietaním mliečnych výrobkov pri základnej diagnóze autizmu. Odporučené pridanie proteínov do stravy, maltodextrín pred spaním, následná kontrola. Pri nej glykémia hraničná, pretrváva ketóza s normolaktatémiou. Odporučená hospitalizácia na vyšetrenie glykemického profilu a dif. diagnostiku suspektnej poruchy metabolizmu sacharidov. glukóza z glykogénu glykogénfosforyláza glykogén glukóza--p glukóza-6-p Kazuistika: Chlapec z II. tehotenstva, pôrod v 35. GT spontánne, AS /, následne tachydyspnoe, potreba umelej pľúcnej ventilácie. Krvácanie do CNS bez vzniku hydrocefalu. PMV mierne oneskorený, reč sa rozvíjala do. roku života, recitoval aj básničky. Od 3. roku prestal hovoriť, poruchy správania. Stanovená dg: detský autizmus na organickom podklade. Vo veku 8. roku života hospitalizácia na Neurologickej klinike LFUK a NÚDCH kvôli stavom s vyvracaním bulbov. Pre opakovane zachytenú ketózu ráno nalačno (3-H butyrát,35 a,46 mmol/l) s glykémiou 3,4 mmol/l a leukoencefalopatiu na MRI odoslaný do metabolickej ambulancie na dovyšetrovanie. Tabuľka. Výsledky vyšetrení v metabolickej ambulancii glykémia mmol/l čas min laktát nalačno mmol/l laktát po jedle mmol/l glykémia mmol/l 3-H but nalačno mmol/l laktát mmol/l 3-H but po jedle mmol/l 3-H butyrát mmol/l,7,96,94 3 7,,64,86 6 4,8 4,4, ,8 5,,84 4, 4,97,56 alanín μmol/l (-53) glycín μmol/l (7-37) I. vyš,4,,43 6,7 4, II. vyš 3,5,6, Hospitalizácia: - nočný glykemický profil:.5-5,9; 3.-4,6;.-5,; 5,-4,3 mmol/l - denný glykemický profil: 7.3-3,4; 8.-,7;.5-4,9; 4.-6,7; 7.-5, mmol/l - 3-H butyrát o 7. hod nalačno:,9; o. -,69 mmol/l - realizovaný OGT test - výsledky tabuľka. Tabuľka. Výsledky OGT testu VÝSLEDKY VYŠETRENÍ laktát glykogénsyntáza UDP - glukóza PODOZRENIE NA DEFICIT PEČEŇOVEJ GLYKOGÉNSYNTÁZY Liečba: úprava diéty - frekventné podávanie menších porcií stravy s vyšším obsahom proteínov, redukcia voľných sacharidov, o. hod. a o 6. hod. podanie maltodextrínu. Efekt: vymizli ranné ketózy a hypoglykémie. Po 6 mesiacoch diétnej liečby sa u chlapca zlepšila verbálna komunikácia a zmiernili niektoré prejavy autizmu. MOLEKULOVO-GENETICKÉ VYŠETRENIE: bialelické heterozygotné mutácie v géne GYS c.547ct (p.gln83ter) a c.736ct (p.arg46ter). Diskusia a záver: deficit pečeňovej glykogénsyntázy sa tak ako ostatné typy glykogenóz prejavuje hypoglykémiou s ketózou, ale bez hepatomegálie. Vekom sa výskyt hypoglykémií znižuje a v klinickom obraze dominuje najmä porucha rastu a dyslipidémia. Do roku 5 bolo v literatúre opísaných len pacientov s potvrdenou diagnózou glykogenózy. Predpokladá sa, že mierne formy ochorenia unikajú diagnostike. Opakovaná ranná ketóza s hypoglykémiou a deficitom glukoplastických aminokyselín by mala viesť k zváženiu vyšetrenia orálneho glukózotolerančného testu so stanovením laktátu a 3-OH butyrátu v plazme. Typický priebeh tohto testu má viesť k suspekcii na deficit pečeňovej glykogénsyntázy s následnou molekulovo - genetickou analýzou génu GYS. Literatúra:. Brown LM, Corrado MM, van der Ende RM et al: Evaluation of glycogen storage disease as a cause of ketotic hypoglycemia in children. J Inherit Metab Dis 5; 38: Hacıhamdioğlu B, Özgürhan G, Çaran B, Meydan-Aksanlı E, Keskin E: Glycogen storage disease type due to a novel frameshift mutation in glycogen synthase (GYS) gene in a child presenting with fasting hypoglycemia and postprandial hyperglycemia. Turk J Pediatr 8; 6: Weinstein DA, Correia CE, Saunders AC, Wolfsdorf JI: Hepatic glycogen synthase deficiency: an infrequently recognized cause of ketotic hypoglycemia. Mol Genet Metab. 5;87(4):84 88

10 5 6 Mutace v FAD syntáze u kojence s glutarovou acidurií typu II a primární adrenální insuficiencí. L. Nosková, V. Stránecký, H. Hartmannová, K. Hodaňová, D. Mušálková, H. Trešlová, L. Piherová, M. Magner, J. Zeman a S. Kmoch Laboratoř pro studium vzácných nemocí, Klinika dětského a dorostového lékařství. LF UK a VFN, Klinika dětského a dorostového lékařství. LF UK a VFN ÚVOD: Glutarová acidurie II. typu neboli mnohočetný deficit acyl- CoA dehydrogenáz (MADD) je klinicky i geneticky heterogenní autozomálně recesivní dědičná porucha metabolismu mastných kyselin, aminokyselin a cholinu. Diagnosticky se charakterizuje zvýšenou koncentrací dikarboxylových kyselin v moči a zvýšenými koncentracemi acylkarnitinů v suché krevní kapce. Rutinný laboratórny analyt kyselina močová v dlhodobom monitorovaní choroby javorového sirupu M. Ostrožlíková, K. Brennerová, A. Vasilenková, J. Perečková, J. Škodová, A. Šalingová, D. Holešová, D. Schich Behúlová, C. Šebová, S. Tárnoková Pracovisko klinickej biochémie a Centra dedičných metabolických porúch Oddelenia laboratórnej medicíny Detská klinika Lekárskej fakulty Univerzity Komenského, Národný ústav detských chorôb, Bratislava POPIS PŘÍPADU: Novorozené děvčátko bylo předáno do péče KDDL pro perzistentní hypoglykémii. Podle vyšetření suché krevní kapky a podle profilu organických kyselin v moči bylo vysloveno podezření na glutarovou acidurii II. typu. Nález na UZ nadledvin, extrémně vysoká hodnota ACTH a ACTH stimulační test s nonresponsivní hladinou kortisolu zároveň ukazuje na primární adrenální insuficienci. FAD syntáza je klíčovým enzymem v metabolismu riboflavinu. Katalyzuje přeměnu flavinmononukleotidu (FMN) na flavinadeninedinukleotid (FAD). FAD jako kofaktor využívá v lidském flavoproteomu 64 flavoenzymů, většina z nich je lokalizovaná v mitochondrii. Účastní se reakcí v metabolických drahách Krebsova cyklu, β-oxidace mastných kyselin, degradace aminokyselin či v dýchacím řetězci. Flavoenzymy se účastní take procesu biosyntézy dalších kofaktorů, steroidů či thyroidních hormonů. VLIV MUTACÍ NA PROTEIN: missense varianta v molybdopterinové doméně s FAD hydrolázovou aktivitou loss of function varianta v doméně, která je zodpovědná za syntézu FAD Mutace vedou pravděpodobně ke snížené syntéze FAD a k tvorbě alternativních izoforem proteinu obsahujících zkrácený protein pouze s FAD syntázovou aktivitou lokalizovaný pouze v cytosolu (popsaná je lokalizace v mitochondriích a cytosolu). GENETICKÉ VYŠETŘENÍ: Vzhledem ke genetické heterogenitě onemocnění bylo u děvčátka a jejích rodičů provedeno celoexomové sekvenování. Bylo zjištěno, že probandka je složeným heterozygotem pro mutace v genu FLAD kódující FAD syntázu. Dosud bylo popsáno 9 nepříbuzných pacientů s mutacemi v genu FLAD a obrazem MADD a defekty dýchacího řetězce. c.3dupc (p.leu335profster3) otec matka probandka c.353t>a (p.val8asp) ODRAZ SNÍŽENÉ DOSTUPNOSTI FAD VE VÝSLEDCÍCH METABOLICKÝCH VYŠETŘENÍ OVLIVNĚNÍ ŘADY FAD-DEPENDENTNÍCH ENZYMŮ : DEGRADACE MASTNÝCH KYSELIN DEGRADACE AMINOKYSELIN DÝCHACÍ ŘETĚZEC A KREBSŮV CYKUS Choroba javorového sirupu (MSUD, leucinóza) je autozómovo recesívna porucha rozvetvených aminokyselín zapríčinená inaktivitou dehydrogenázového komplexu ich ketokyselín (Obr.). Defekt vedie k akumulácii toxicky pôsobiacich leucínu a ketokyselín. U dlhodobo monitorovanej pacientky s klasickou formou MSUD sme pozorovali so zhoršujúcou sa metabolickou kompenzáciou ochorenia veľmi podobné zmeny zvyšujúcej sa hladiny leucínu a kyseliny močovej v krvi a cieľom našej práce bolo štatisticky vyhodnotiť vzťah medzi týmito metabolitmi. Pacientka, v súčasnosti 9 ročná, má klasickú formu MSUD s novorodeneckou manifestáciou. Diagnóza bola stanovená na základe biochemických nálezov a potvrdil sa zložený heterozygotný stav pre mutáciu v BCKDHB géne. V terapii bola nutná striktná nízkoleucínová diéta a 4 razy pre závažné metabolické krízy aj hemodialýza. Retrospektívne sme vyhľadali v databáze laboratórneho informačného systému za obdobie 9 rokov výsledky párov analytov (kyselina močová v sére a leucín v plazme) vo vzorkách odobratých v rovnakom čase. Na výpočet korelačného koeficientu medzi nezávislými premennými x (kyselina močová v sére) a y (leucín v plazme) sme použili Pearsonov vzorec. 6 4 Úvod Metodika leucín-p leucín-p p (μmol/l) Obr. Enzýmový defekt pri MSUD () Výsledky Hodnota korelačného koeficienta je,7; čo znamená silnú pozitívnu koreláciu. S rastúcimi hodnotami kyseliny močovej (x) rastú aj hodnoty leucínu (y). Koeficient determinácie r je,495; smernica determinácie y=,8x-35,7; p-hodnota <, na hladine významnosti <,. (Obr.,3) y =,8x - 35,7 R² =,495 kyselina močová-s (μmol/l) Obr. Korelácia kyselina močová v sére a leucín v plazme r=,7; n (x,y)= 8 6 acyl-coa dehydrogenázy zvýšené koncentrace řady acylkarnitinů, zvýšené vylučování kyseliny ethylmalonové, mírně zvýšený poměr C4/C v profilu VLCFA DEGRADACE PURINŮ prolin dehydrogenáza zvýšené vylučování prolinu a hydroxyprolinu acyl-coa dehydrogenázy zvýšené koncentrace leucinu a izoleucinu xantin dehydrogenáza zvýšené koncentrace hypoxantinu a xantinu sukcinát dehydrogenázový komplex, dýchací řetězec zvýšené vylučování -oxoglutarátu STEROIDOGENEZE squalen monooxygenáza 4-dehydrosterol reduktáza souvislost s adrenální insuficiencí??? ZÁVĚR: Mutace v genu FLAD u probandky vysvětlují obraz glutarové acidurie II. typu. Exomovým sekvenováním jsme nenalezli žádnou další patogenní variantu, která by mohla vysvětlit primární adrenální insuficienci. Zda se jedná o souběh diagnóz či o souvislost s mutacemi v FAD syntáze není v současné době jasné. Pacientka je v současné době na terapii riboflavinem, karnitinem a hydrokortizonem; terapie riboflavinem zatím vedla k vymizení některých metabolitů mastných kyselin. 4 kyselina močová-s Obr. 3 Dynamika zmien koncentrácií (μmol/l) kyseliny močovej v sére a leucínu v plazme u pacientky so MSUD v období 5/8-/9 (výraznejšie amplitúdy leucínu) Záver Zhoršovanie metabolickej kompenzácie MSUD je spojené so zvyšovaním koncentrácie leucínu a sekundárne aj kyseliny močovej v krvi. Hodnoty týchto parametrov vykazujú silnú pozitívnu koreláciu. Meranie koncentrácie kyseliny močovej je dostupné v bežných klinických laboratóriách, nie je viazané na špecializované pracovisko a časovo je výrazne kratšie v porovnaní s analýzou spektra aminokyselín v plazme. V dlhodobom manažmente leucinózy je kyselina močová v sére užitočným pomocným markerom pre rýchle terapeutické rozhodnutie, predovšetkým so stúpajúcim vekom, kedy napriek významnému vzostupu leucínu nemusí už byť neurologická symptomatológia vyznačená tak, ako v mladšom veku. Lit. :.

11 7 8 Laboratorní diagnostika poruch biosyntézy a transportu kreatinu Bártl J., Martincová O., Chodorová I., Hodík J., Zvoníčková J., Chrastina P. a Pešková K. Klinika dětského a dorostového lékařství, Diagnostické laboratoře dědičných metabolických poruch Všeobecná fakultní nemocnice v Praze a. lékařská fakulta Univerzity Karlovy N.M. Verhoeven et al. / Clinica Chimica Acta 36 (5) CR GAA CRN Tab. : Biochemické nálezy pro jednotlivé deficity FIA - MS/MS: MS/MS s přímým nástřikem vzorku LC - MS/MS: MS/MS ve spojení se separací kapalinovou chromatograf Laboratorní diagnostický algoritmus založený na využití MS/MS Tab. : Referenční rozmezí pro GAA a CR v moči a séru (plazmě) (Pozn. Referenční rozmezí pro DBS je koncentračně srovnatelné se sérem) Podpořeno MZ ČR RVO VFN6465

12 9 C-III III a IX Nina Ondru Ji V LF UK a VFN, Praha, V x5 Vied, Bratislava, SR : GATK (6 gen Apolipoprotein C-III (ApoC-III) je O-glykoprotein : soubor 39 vzork od s typy GSD (x, 7x Ia, 3x non-ia, 6x v a spolu se N- II, 7x III a 5x IX) a vzorky od s (koncentrace v :. 8. glykoproteinem transferinem (TF) jako marker 6.7 mmol/l; 4. mmol/l) deficitem (LPL). V jedinci s GSD byly na 6. (3 gen screeningu poruch glykosylace ( ongenital disorders (kuku au Ia a non-ia byla zavedena sondou; u 3. of glycosylation, CDG). pacienta nebyla hyperglykemie. abnormality glykosylace se mohou objevovat i u poruch CDG (gen NOTCH3 9. (gen NOTCH3 studie bylo glykosylaci ApoC-III u s typy glycogen storage diseases GSD) metodami A) fokusace a SDS- PAGE a B) spektrometrie. Metody: A) fokusace: bylo fokusace (ph 3.5-5) na PhastSystem Electrophoresis System (GE Healthcare), byly proteiny na nitrocelul, 6 C) a ApoC-III byl pomoci (Biotrend). Kvantifikace byla provedena programu Quantity One (Bio-Rad). SDS-PAGE: bylo SDS-PAGE (%), s Western blotem (viz postup - fokusace). B) spektrometrie (MS): struktury ApoC-III byla provedena dle [] na spektrometru UltrafleXtreme MALDI TOF/TOF mass spectrometer (Bruker Daltonics). Denzitometrickou bylo stanoveno isoforem ApoC-III (ApoC-III // : di-, mono- a asialoforma) fokusace (IEF), a pro hyposializace ApoC-III byl parametr delta dle vzorce:.6*(apoc-iii [%]) +.7*(ApoC-III [%]).78*(ApoC-III [%]). Zat u GSD, Ia a non-ia bylo delta a, u s GSD III a IX jednoho) byla hyposializace ApoC-III a ; v s kontrolami, jako i s typy GSD byly statisticky (p =.4). hypoglykosylace u byla potvrzena SDS-PAGE a MALDI TOF odhalily zna formy ApoC-III se scela, u s GSD typy III a IX. V skupiny nebyla nalezena korelace mezi parametrem delta a triacylglycerol mi (p =.94). Na obr.. je graf s porovn sializace u GSD (), struktura O-glykanu na ApoC-III () a z IEF, SDS-PAGE a MALDI TOF (3,4,5). ) ) 4) 5) u GSD Ia a non-ia jsme detekovali a hyposializaci ApoC-III, GSD typy III a IX vykazovaly glykosylaci ApoC-III s charakteristicky jeho formy. Mezi ApoC-III a triacylglycerolemii nebyla v nalezena korelace. Vzhledem k tomu, pro diagnostiku GSD typu III esej a esej pro typ IX zcela mohou pomoci diagnostice a a vybrat vhodnou genetickou u. se, hypoglykosylace ApoC-III nalezena u GSD III a IX by mohla dostupnosti nukleotid- (specificky UDP-GalNAc) pro reakce. 3) A) ApoC-III B) ApoC- G - D - desializovan A - aglykosylovan Reference: [] Wada Y, Kadoya M, Okamoto N.. Mass spectrometry of apolipoprotein C-III, a simple analytical method for mucin-type O- glycosylation and its application to an autosomal recessive cutis laxa type- (ARCL) patient. Glycobiology : [] Yassine HN, Trenchevska O, Ramrakhiani A, Parekh A, Koska J, Walker RW, Billheimer D, Reaven PD, Yen FT, Nelson RW et al 5. The Association of Human Apolipoprotein C-III Sialylation Proteoforms with Plasma Triglycerides. PLoS One : e4438. Podporov -PAGE pacient s GSD Ia pacient s GSD non-ia 3 pacient s GSD III 4 pacient s GSD IX 5 kontrola po inkubaci s neuraminidasou 6 kontrola Obr..: ApoC-III u. ) hyposializace ApoC-III (delta) fokusace (IEF) byla u skupin GSD typu III a IX v s kontrolami i GSD (, Ia a non-ia). ) Struktura O-glykanu v na ApoC-III. 3) Profil forem ApoC-III IEF u vzorku pacienta s GSD III, disialo- a asialoformy. 4) ApoC-III u s GSD typy Ia, non-ia, III a IX A) IEF a B) SDS-PAGE. U pacient byl IEF nalezen monosialo- a/nebo asialoapoc-iii, a SDS-PAGE u nich o velikosti s celkem glykanem ApoC-III). 5) MALDI TOF charakterizovat strukturu O-glykanu na ApoC-III, a u GSD III a IX bylo disialo- a formy. Na je u vzorku pacienta s GSD III. granty AZV6-393A, RVO-VFN % 6% 94% 9% 88% 33% 9% %. 6% 55 3% 8% %. (9 gen. (9 gen 3. (34 gen 4. (56 gen 5. (4 geny 6. (5 gen. (. (gen : <- > In - v genu u : úsek 3: 33 exonu v genu 9 u. úsek 5/8 9/9 6/ 8/9 8/6 4/59 5: s : - X - X= - X = : ( u (6% V

13 GLA 5 ah cha ; X-van n ac ncnn nn ac v n GLA c -aac - ncv -aacv n ac v GLA v nn nac av - c n han n a aca v ch acn ah ch nvc n n c vn a cnn nvv c hn ch n ah ch vn cnn nc cnn vaan v GLA vch acn v avn aan n nan ch n vaan v GLA c vc na nv vn n nvan vaana nn anvan v n nch aa ha-aaa; hacan; hnaan; h v - nch ncnn a n n n v nc nch nch n avch n a nn n n nac ava -a v a vnch acn nn a na n a v n c c v n vn ncnac c nc a n v vch nch an n chnch hn vn an hn a cha v anc a a nc v n c a cnnh nvvh nah v nch av van a c ah ch na c nva a nn chaava nc n vn a ac h nc v a n ncnn v vanch nch in Silico ana vn na - v -a v n chn anh n n nac av c n chn an n nann navn n chan a vv chnc hn vn acn vanch n anava n COL4A5 avan a na ch X ac v COL4A5 acvan X-van v n v nch nva vaan c v COL4A5 v ch nch v vav v ch nch n n n h nvch acn nn chc c vnvn nv nac a na ana ch n a na a ch X ac ah cha - an n chnch ncnn vn n c a cnnh nvvh n c an hn v cha v anc a a GLA COL4A5?? nh nh n v v an an n n n n n n an an n n n n n n an n n an an an an n n n an an an n n n an an an an n an an an an an n n n n an an n n an an an n n an an an an an an n n n n n n an an n an an n c - - c - h - nh; - haa; - an hn; - van hn - n ; ; - a cch vnc S S S S S S S S S S -nc -nc avn ac - nn - nva a nn chaava nc n vn a ac h nc v a n ncnn v vanch nch - na v - v n chn anh - n n nac av c n chn an n nann navn n na vnnch n cch - - haaac nnh a vaan v - na vn annn v ch vnnch nnch ch - aac - v c vnn n a - c vnvn nv nac n ana n vanch nc vanch n a na a ch X v vch nch nvna vaana v GLA na chx; vaana ncnn navc v v nch nvna vaana v COL4A5 na chx??????? vn nana - an - v c v h aac Scha aac - v c vn ana - ch v h aac ER - endoplazmatické retikulum ERGIC - ER-Golgi intermediární kompartment COP I a COP II - ák tranportuící protein zdo ER pe ERG do Golgi aparátu vn ch a S Snc nn anna anna S n nvvan nvvan n nvvan - anna avna avn n - c a vvn vv va v anh a avn v vnan aac n? - v a n - h an; achva - nan vn an n n; n - nn ac v n n n a na hanc - n an n n; an v cch an v n n nvn nv a nvna nnan a??? ANALÝZA MITOCHONDRIÁLNÍCH PARAMETRŮ V SÍTNICI PRASETE PILOTNÍ STUDIE Dosoudilová Ž, Drutovič S, Sedláčková D, Knopová S, Ardan T, Ellederová Z, Motlík J, Zeman J, Hansíková H Laboratoř pro studium mitochondriálních poruch, Klinika dětského a dorostového lékařství,. LF UK, Praha Laboratoř buněčné regenerace a plasticity, Ústav živočišné fyziologie a genetiky, AV ČR v.v.i., Liběchov ÚVOD Mitochondriální dysfunkce spojené s primárními i sekundárními mitochondriálními chorobami hrají významnou úlohu v širokém spektru očních patologií, včetně retinopatií, které jsou charakterizovány dysfunkcí retinálních gangliových buněk (RGC), fotoreceptorů, retinálních pigmentových epiteliálních buněk (RPE) nebo jejich kombinací. Je známo, že sítnice má značnou metabolickou aktivitu, která souvisí s velkým počtem mitochondrií v uvedených typech retinálních buněk, které zajišťují vysokou produkci ATP nezbytnou pro funkci buněk a jejich přežití. Cílem pilotního experimentu bylo otestovat možnost analyzovat mitochondriální parametry v retinálních buňkách modelu prasete, který bude použit pro přípravu transgenních modelů pro vybrané oční nemoci. MATERIÁL & METODY V experimentu byla analyzována zamražená neuroretinální tkáň prasečího kontrolního modelu. Mitochondrie byly izolovány diferenční centrifugací. Aktivity komplexů dýchacího řetězce a citrát syntázy (CS) byly měřeny spektrofotometricky. Vybrané mitochondriální proteiny byly analyzovány pomocí imunoelektroforetických metod, R a R vzorky byly značeny spektrem protilátek OXPHOS a PDH ke zjištění reaktivity neuroretinových buněk k vybraným proteinům (SDS-PAGE). Na vzorku R3 byla provedena nativní elektroforéza (BN- PAGE). aktivita (nmol/min.mg) Obr. - Western blot analýza vybraných mitochondriálních proteinů v neuroretinálních buňkách. Analyzovány byly vzorky izolovaných mitochondrií z neuroretiny (R, R) pro ověření reaktivity protilátek se studovanou tkání lišící se typem přípravy. Ve vzorku R byla tkáň oproti standartnímu postupu rozsuspendována v PBS. Pro použití v dalších analýzách se však lépe hodí vzorek zpracovaný postupem jako R. AKTIVITA KOMPLEXŮ DÝCHACÍHO ŘETĚZCE A CITRÁTSYNTÁZY Obr. - Schéma retiny v lidském oku. Neurální sítnice (neuroretina) je rozdělena do 9 vrstev: vnitřní membrána, nervová vlákna, gangliové buňky, vnitřní plexiformní vrstva, vnitřní jaderná vrstva, vnější plexiformní vrstva, vnější jaderná vrstva, vnější membrána, fotoreceptory (tyčinky a čípky). Pod touto vrstvou se nachází retinální pigmentový epitel. Zdroj [] Graf - Aktivity komplexů dýchacího řetězce a citrátsyntázy v homogenátu (hom) a v izolovaných mitochondriích (mito) z retinální tkáně kontrolních miniprasat. Hodnoty aktivit enzymů v retině byly srovnatelné s aktivitami měřenými v mozku stejného modelu - bazálních gangliích (BG) a frontální kůře (FK). COX (komplex IV), SCCR (kii+iii), NCCR (ki+ii+iii), NQR (ki), SQR (kii) QCCRr (kiii), CS (citrátsyntáza). Tab. Seznam použitých protilátek Retina BG FK cox hom cs hom cox mito cs mito komplex protilátka výrobce kat.č. ředění NDUFA9 abcam ab473 :3 SDH7 abcam ab475 :5 SDH3 abcam ab474 :5 CORE abcam ab5 :5 COX abcam ab475 : COX5a abcam ab6 : ATPA/Fa abcam ab73 : DRP abcam ab56788 : OPA BD Technologies 666 : VDAC abcam ab4734 : akonitáza abcam ab3 : mitofilin abcam ab39 : PDH koktejl abcam ab46 :5 SDS-PAGE a BN-PAGE ANALÝZA MITOCHONDRIÁLNÍCH PROTEINŮ Obr.3 - Nativní elektroforéza neuroretinálních buněk (R3). BHM (bovine heart mitochondria) a mozková tkáň (BG; bazální ganglia) byly použity jako kontrolní referenční hodnota. ZÁVĚR Komplexy dýchacího řetězce v izolovaných mitochondriích ze sítnice vykazovaly vysoké specifické aktivity srovnatelné např. s mitochondriemi připravenými přímo z mozkové tkáně uvedeného modelu. Byla ověřena reaktivita protilátek proti vybraným mitochondriálním proteinům. Výsledky jsou základem pro budoucí monitorování průběhu nemoci a ke sledování účinků případné terapie na modelech vybraných očních patologií. Zdroje: [] Gupta et. Al, Retinal Anatomy and Pathology; Dev Ophthalmol. 6;55:7-7 Aktivita (nmol/min.mg) SCCR NCCR NQR SQR QCCRr komplex Podporováno: AZV MZ 6-393A, RVO-VFN6465, S

14 3 4 Activation of mitochondrial metabolism during prenatal and early postnatal development in rat with emphasis on CoQ biosynthesis J. Krizova, M. Hulkova, H. Kolarova, A. Hrustincova, S. Knopova, D. Sedlackova, V. Capek, J. Zeman and H. Hansikova Laboratory for Study of Mitochondrial Disorders, Department of Pediatrics and Adolescent Medicine, General University Hospital and First Faculty of Medicine, Charles University, Prague, CZ Introduction Dynamic changes in mitochondrial metabolism were described during fetal development and rapid perinatal switch to extra-uterine conditions to maintain energy demands of the organism is necessary. The aim of the project is to study this process on Rattus norvegicus in the liver and the skeletal muscle tissue and to compare results with similarities and differences found in human studies. Mitochondria are key players in mammalian ATP production. The oxidative phosphorylation (OXPHOS) is executed by the system of several supercomplexes attached to mitochondrial inner membrane. Regulation of ATP production is a complex process including mtdna replication and transcription, the expression of OXPHOS subunits, biosynthesis of electron carriers (e.g. coenzyme Q, CoQ; cytochrome c) or even mitochondrial fission-fusion machinery regulation. Moreover, regulation of both genes encoded in nuclear (ndna) and mitochondrial (mtdna) DNA has to be precisely orchestrated. Therefore it has to be executed by number of regulators. It was described that fetal metabolism is based on glycolysis, because partial oxygen pressure in utero is low. After birth, the concentration of ATP is increased two-fold in the rat liver after first two hours Also, various tissues show distinct stoichiometry of the OXPHOS complexes. In humans, the predominant CoQ form has isoprenoid residues (hence CoQ), but in rodents, the major form has only 9 (CoQ9). Only a few studies have analysed the expression of mitochondrial genes during perinatal development. Our pilot study describes the orchestration of the mrna expression of genes important to ATPase biogenesis during rat perinatal development (Spacilova et al., 6). Together with data obtained in human foetuses, we decided to apply a broad RNA microarray analysis to find specific interconnections of transcription regulators or activators with emphasis on CoQ biosynthesis. We believe that these data may later enable identification of another key factors regulating mitochondrial biogenesis, and also improve diagnostics of metabolic disorders and care of the preterm newborns. Results Microarray analysis We identified major biochemical pathways changing during rat development. We detected genes which changed in liver (54.8%) and in skeletal muscle (63.8%). Moreover, considering 546 mitochondrial genes, more than 8% of them were changed in both tissues (Table ). Table : Ratio of genes significantly changed during specified period (e.g. fetal day 6 postnatal day 4) in rat tissues. In liver, we identified Gene Ontology (GO) objects only between days f6-f, hence major shift in expression of mito genes occurs more than two days before parturition. Tissue All genes Mitochondrial genes f6 p4 f6 f f p p p4 % of sign. changed genes Number of GO objects Liver Sk.muscle For mito genes in liver, GO Term enriched are sumarized in Table, expression in Figure. The most differentiallyexpressed gene was Pdk4, pyruvate dehydrogenase kinase, isozyme 4. Among analyzed genes, some genes involved in CoQ biosynthesis were changed in both tissues (Coq8a, Coq9), although no significant change in GO:6743 CoQ biosynthesis was observed. Biochemistry CoQ content was increased in both rat and human postnatally (Figure ). But I-III and II-III complex activities were increased only in rat liver (Figure 3). Acknowledgements This project was kindly supported by RVO-VFN6465, PROGRESQ3 and NV Table : Gene Ontology (GO) objects and mito genes significantly changed in liver. GO Term Genes Enrichment using acyl-coa dehydrogenase -oxidation protein import into mitochondrial matrix mitochondrial fission long-chain fatty acid metabolic process ATP metabolic process NADH metabolic process release of cytochrome c from mitochondria tetrahydrofolate metabolic process positive regulation of mitochondrial Ca + conc. glutathione metabolic process F6 Acox, Gcdh, Acadsb, Acadm, Acads, Acadl, Acox3, Acadvl, Ivd, Etfdh, Acad, Etfb, Etfa Grpel, Tomm7, Pam6, Timm7a, Tomm4l, Tomm, Tomm4, Dnlz, Tomm, Timm5, Timm44, Timm Mff, Fis, Dnml, Opa, Mief, Mtfp, Mul, Park, Ppprb, Mtfrl, Mtfr Slc7a, Acsl, Cd36, Acot, Slc7a3, Acsl4, Acsl3, Slc7a, Cpta, Acsl5 Atp5d, Atp5e, Ndufaf7, Atp5b, Ak3, Ak, Atp5g, Ak4, Bad, Atp6va, Slc5a5, Atp5l, Atp5o, Atp5a, Atp5i, Atp5h, Ndufs Gpd, Gpd, Dlst, Idh3g, Idh3b, Ogdh, Idh3a, Mdh, Mdh Mff, Bak, Fis, Dnml, Bcl, Bax, Bcla, Tp53, Mapk9, Timm5, Bad, Bcll Figure : In rat liver, expression profiles of mitochondrial genes show generally increasing trend between days F6 and P. A B Figure : In rat (A) and human (B) liver and skeletal muscle, CoQ content is significantly increased after birth. A Figure 3: In rat, II-III complex activity was increased after birth in liver (A) not in sk. muscle (B). I-III complex activity showed equal tendency (not shown). Microarray analysis showed that expression of several CoQ biosynthetic genes correlate with transcription regulators including Estrogen-related receptor gamma family signalling (Figure 6). qpcr analysis demonstrated that multiple CoQ biosynthetic genes are significantly changed in rat tissues including Coq8a (Figure 5). A Figure 5: In rat, in both liver (A) and skeletal muscle (B) Coq8a expression increases nearly 4-fold after birth. Coq8a is an atypical kinase with predicted regulatory role in CoQ biosynthesis Mthfd, Shmt, Mthfd, Tyms, Mthfs, Shmt, Mthfdl 3.8 Micu, Fis, Mcur, Micu, Rapgds, Tgm, Mcu, Bcap3 Gsta4, Aldh5a, Ethe, Clic, Sod, Hagh, Gsr, Gpx, Clic4, Gstk, Gpx4, Idh, Txnrd, Gstp, Mgst F CoQ8a F B B P P Figure 4. Scheme of CoQ biosynthesis. CoQ biosynthesis requires head group and tail production, attachment of the tail to the head group and a series of head group modifications. Biosynthesis intermediates become increasingly lipophilic as they progress through the pathway. The enzymes in the terminal phase form a biosynthetic complex termed complex Q, located on the matrix face of the inner mitochondrial membrane. Physical evidence for complex Q was uncovered. Mass spectrometry proteomics studies demonstrated that deletion of Coq8a or Coq9 in mice causes selective and significant depletion of numerous CoQ proteins, not just that encoded by the deleted gene. (Stefely and Pagliarini. TrendsBiochemSci.7;4(): doi:.6/j.tibs.7.6.8) Figure 6: Pearson correlation based hierarchical clustering of genes annotated for CoQ biosynthesis and mitochondrial transcription activity regulators in rat liver. Data were autoscaled. Heatmap shows that in liver Coq, Coq4, Coq7 and Coq9 transcripts expression was increased after birth just like the Coq8a expression. Coq3 and Coq5 expression was decreased. This orchestration was not observed in skeletal muscle. In both tissues, Tfam expression decreases throughout observed period, whereas estrogen-related receptors (Esr) expression increases. This data can lead further studies of CoQ biosythesis and mitochonrial maturation regulation. For example by endocrine disruptors, hypoxia or others. Relative ratio of anti-coq8a LIVER MUSCLE 4 3 L % Conclusions During the mammalian intra-uterine fetal development, a rapid switch from glycolytic metabolism to oxidative phosphorylation must proceed to cover postnatal adaptation to extra-uterine conditions. We described perinatal mitochondrial metabolism acceleration in rat liver and skeletal muscle during perinatal development and possible correlation with results in human. The most important expression shift occurred in the liver at least two days before parturition. References Benard G et al. Physiological diversity of mitochondrial oxidative phosphorylation. Am J Physiol Cell Physiol. 6;9:C7-8. Fernandez-Ayala DJ et al. Survival transcriptome in the coenzyme Q deficiency syndrome is acquired by epigenetic modifications: a modelling study for human coenzyme Q deficiencies. BMJ Open. 3;3(3). Fischer JC et al. Estimation of NADH oxidation in human skeletal muscle mitochondria. Clin Chim Acta. 986;55(3): Fischer JC et al. Differential investigation of the capacity of succinate oxidation in human skeletal muscle. Clin Chim Acta. 985;53():3-36. Rustin P et al. Biochemical and molecular investigations in respiratory chain deficiencies. Clin Chim Acta. 994;8():35-5. Kolarova H et al. Changes in transcription pattern lead to a marked decrease in COX, CS and SQR activity after the developmental point of the (nd) gestational week. Physiol Res. 8;67():79-9. Krizova J et al. Mitochondrial Metabolism in a Large-Animal Model of Huntington Disease: The Hunt for Biomarkers in the Spermatozoa of Presymptomatic Minipigs. Neurodegener Dis. 7;7(4-5):3-6. Minai L et al. Mitochondrial respiratory chain complex assembly and function during human fetal development. Mol Genet Metab. 8;94:-6. Mosca F et al. Assay of coenzyme Q() in plasma by a single dilution step. Anal Biochem. ;35(): The Gene Ontology C. Expansion of the Gene Ontology knowledgebase and resources. Nucleic Acids Res. 7;45(D):D33-D8. Pejznochova M et al. Mitochondrial DNA content and expression of genes involved in mtdna transcription, regulation and maintenance during human fetal development. Mitochondrion. ;(4):3-9. Spacilova J, et al. Analysis of Expression Profiles of Genes Involved in FF-ATP Synthase Biogenesis During Perinatal Development in Rat Liver and Skeletal Muscle. Physiological Research. 6;65(4): Wharton D, Tzagoloff, A. Cytochrome oxidase from beef heart mitochondria. Methods in Enzymology. 967;:45-5. Material and methods M 5 % F6 F8 F F P P P3 P4 Figure 7: Quantification of Coq8a and reference Hprt protein in rat liver and sk. muscle (Western blot). Expression of Coq8a in the rat liver and skeletal muscle was stable. Chemiluminescent signal was performed twice per each replicate, and the average is presented as ratio of 9-day-old adult control signal ratio of anti-coq8a to anti-hprt antibody. No significant changes were found after birth. The dashed line indicates birth. Totally 54 samples of liver and 35 samples of skeletal muscle from Wistar rat fetuses (6- day-old) and neonates (-4 day-old) were obtained. Earlier, totally 5 and 8 samples of human fetal liver and skeletal muscle, respectively, were collected after termination of pregnancy/autopsy for genetic indications unrelated to mitochondrial deficiency (3-9 weeks of gestation/postnatal controls) (Kolarova et al. 8). Tissues were immediatelly frozen and stored in -8 C. % homogenates were used for spectrophotometric measurements of enzyme activities (complexes I-IV, CS (Fischer et al., 986; Fischer et al., 985; Rustin et al., 994; Wharton, 967). HPLC measurement of COQ content on reverse phase column (Mosca et al., ) and Western blot (Krizova et al. 7; antibodies: Anti-COQ8A (C378) (Assay Biotechnology, Sunnyvale, CA, USA), Anti-HPRT (ab9, Abcam, Cambridge, UK). In rat, we analyzed geneexpression profiles on Rat GeneChip. ST Array (Affymetrix), expression of genes involved in CoQ biosynthesis were analyzed by qpcr TaqMan probes FAM-MGB (Applied Biosystems, Massachusetts, USA; Psmb6 Rn858_g, Hprt Rn5784_m, Coq8a Rn456_m, Coq Rn454_m, Coq3 Rn569878_m, Coq4 Rn75867_m, Coq5 Rn556_m, Coq6 Rn57465_m). Statistical analyses were provided by STATISTICA. (StatSoft, Oklahoma, USA) and R ("R Core Team" URL: Illustrative expression curve profiles were obtained by least squares regression analysis. Results were considered significant when the corresponding p.5. Constructed expression plots consisted of at least three samples of the same age quantified twice in duplicate. Each dot represents a mean value. 5 5 Multiparalelné sekvenovanie celej mtdna - prvé výsledky Diabgene M. Škopková, P. Jungová, K. Brennerová 3, D. Gašperíková Diabgene, Ústav experimentálnej endokrinológie, Biomedicínske centrum SAV, Bratislava; Oddelenie molekulovej a biochemickej genetiky, LF UK a UNB, Bratislava; 3 Detská klinika, Národný ústav detských chorôb a LF UK, Bratislava 6 VÝSLEDKY 5 4 MPS POKRÝVA CELÚ DĹŽKU mtdna Priemerná hĺbka čítania vzoriek (Obr. 3) bola 53x a pokrytie bolo % (pri hĺbke čítania x), resp. 78,4% (pri hĺbke čítania x). Ako pracovný detekčný limit sme pri takomto výstupe určili heteroplazmiu 5 %. Zriedkavé varianty Hot-spot varianty Veľké delécie Nízka heteroplazmia METÓDA 3 Hĺbka čítania Pozícia na mtdna 6569 Obr. 3: Ukážka pokrytia mtdna sekvencie Sanger RFLP - - +/- - qpcr MLPA + + +/- - MPS m.353g>a MPS IDENTIFIKUJE AJ ZRIEDKAVÉ A NOVÉ VARIANTY U testovaných pacientov sme identifikovali spolu 3 variantov s frekvenciou v MitoMap GeneBank <. a s heteroplazmiou > 5 %. Z nich 4 varianty boli nové. 3 varianty boli pravdepodobne benígne, 9 variantov s neznámym významom a jeden známy patogénny variant m.353g>a. Tab. : Vhodnosť metód pri stanovení rôznych typov variantov v mtdna. ÚVOD Analýza mutácií v mtdna je komplikovaná možnosťou nízkej heteroplazmie, rôznou úrovňou heteroplazmie v rôznych tkanivách, či prítomnosťou veľkých delécií. Jednotlivé metódy majú rôzne výhody a nevýhody (Tab. ), pričom novým zlatým štandardom pre analýzu mtdna sa stáva multiparalelné sekvenovanie (MPS), ktorým sme schopní pokryť celú sekvenciu mtdna a detegovať prítomnosť variantov s nízkou heteroplazmiou i väčšie delécie. MPS MÁ SENZITIVITU VHODNÚ NA DETEKCIU HETEROPLAZMICKÝCH MUTÁCIÍ Variant m.353g>a bol v heteroplazmii % (Obr. 4) a v predchádzajúcich analýzach nebol odhalený priamym sekvenovaním. Klinický obraz pacienta zodpovedal fenotypu spájanému s týmto variantom (juvenilný MELAS/Leigh overlap syndrom často CIEĽ Otestovať MPS metódu na súbore 6 pacientov s podozrením na mitochondriopatiu, u ktorých nebola nájdená príčina ich ochorenia predchádzajúcimi vyšetreniami (prítomnosť m.343c>g pomocou qpcr, WES analýza jadrových génov, MLPA). sprevádzaný WPW syndrómom),3. Avšak, u nášho pacienta došlo ku prvým prejavom ochorenia v puberte (porucha sluchu, katarakta) a k opakovaným náhlym cievnym príhodám až vo veku 37 rokov, čo môže byť spôsobené práve nižšou heteroplazmiou. Obr. 4: Vizualizácia čítaní v úseku obsahujúcom patogénny variant m.353g>a v % heteroplazmii. MPS MÁ VYSOKÚ ŠPECIFICITU Metódou MLPA bola v jednom prípade zistená znížená väzba sondy dizajnovanej na rozpoznanie referenčného m.8993t (Obr. 5A). Pri sekvenovaní celej mtdna (Obr. 5B) sme zistili, že išlo o benígny variant m.8994g>a. METÓDY mtdna testovaných pacientov bola amplifikovaná v dvoch prekrývajúcich sa úsekoch dĺžky 8,3 a 8,6 kb (Obr. ). Oba amplikóny boli ekvimolárne zmiešané a použité na prípravu bp fragmentovanej knižnice pomocou Ion Xpress Plus Fragment Library Kit (ThermoScientific). Všetkých 6 knižníc bolo sekvenovaných na čipe Ion34 na IonTorrent PGM sekvenátore (Obr. ) a bioinformaticky spracované pomocou Torrent Suite. m.8994g>a L644-H898 L877-H8789 B) MPS A) MLPA L644 ZÁVER Fragmentácia Multiparalelné sekvenovanie je univerzálnou metódou pre analýzu mtdna. Umožňuje stanoviť diagnózu aj v prípadoch, kde to doteraz nebolo možné a rozširuje naše znalosti o zriedkavých či nových variantoch v mtdna. Ligácia adaptérov L877,5 Klonálna amplifikácia H898 Ref: Gunnarsdóttir et al., Genome Res Santorelli et al., BBRC Wang et al., Pediatr Neonatol 8 Sekvenovanie m.8993t m.8994g C) MLPA sonda,5 H8789 AACCAATAGCCC TGGCCGTACGCC Podporené: APVV-7-96, VEGA /83/7 Obr. 5: Benígny variant m.8994g>a (B) spôsobuje falošnú pozitivitu v MLPA sonde (A) dizajnovanej na zámenu v pozícii m.8993t (C). Obr. : Schematické znázornenie procesu prípravy mtdna knižníc a ich sekvenovanie Obr. : Zobrazenie polohy primerov použitých na amplifikáciu celej mtdna v dvoch úsekoch

15 5 6 Náš přístup k fenylketonurii se šedesátiletou zkušeností (CDMP, ÚDMP a KDDL) M. Paulová, E. Klímová, P. Husáková, H. Wiederlechnerová, O. Martincová, K. Pešková Klinika dětského a dorostového lékařství Diagnostické laboratoře dědičných metabolických poruch VFN a. LF UK, Praha Úvod Hyperfenylaninemie/fenylketonurie (HPA/PKU, MIM 66) je recesivní onemocnění, nejčastěji způsobené deficitem fenylalaninhydroxylázy (PAH). Méně časté jsou poruchy syntézy nebo regenerace tetrahydrobiopterinu (BH4), který slouží jako kofaktor PAH a dalších hydroxyláz aromatických aminokyselin. Incidence HPA/PKU v naší populaci je :55 novorozenců. Rozlišujeme tři formy hyperfenylalaninémie/fenylketonurie (HPA/PKU) podle zbytkové aktivity PAH: klasická fenylketonurie (pod %) atypická (-5%) mírná (nad 5%). Gen PAH je lokalizován na chromosomu q-q4.. U pacientů s PKU v ČR je nejčastější mutace R48W. Incidence HPA/PKU v naší populaci je :55 novorozenců Klinické projevy Akumulace fenylalaninu v těle narušuje vývoj a funkci centrálního nervového systému. Přirozený průběh klasické PKU zahrnuje opožďování vývoje od 3. měsíce věku, mikrocefalii, světlý fenotyp, torpidní ekzémy, specifický zápach moči a potu připomínající myšinu, sekundární epilepsii obtížně ovlivnitelnou antiepileptickou léčbou a mentální retardaci. Léčba Principem léčby je individuální omezení příjmu fenylalaninu (Phe) ve stravě. Výživa je doplněna o směs esenciálních aminokyselin bez Phe, obohacenou o minerály, stopové prvky a vitamíny. Součástí komplexní péče je psychologická péče a genetické poradenství. Speciální pozornost je věnována ženám s HPA/PKU v přípravě na graviditu a během ní. Poruchy metabolismu pterinů vedou k HPA a deficitu neurotransmiterů dopaminu a serotoninu. Léčba spočívá v podáváním BH4, omezení příjmu Phe, suplementaci prekurzorů neurotransmiterů (L-Dopa, 5-hydroxytryptofan) a folátů. Diagnostika a diferenciální diagnostika PKU/HPA u novorozence Novorozenecký screening HPA/PKU se v ČR provádí celoplošně od roku 975. Nejprve inhibičním testem podle Guthrieho a metodou papírové chromatografie a od roku 9 se HPA/PKU vyšetřuje v rámci novorozeneckého laboratorního screeningu dědičných metabolických poruch metodou tandemové hmotnostní spektrometrie. Po potvrzení HPA probíhá na našem pracovišti diferenciální diagnostika s cílem rozlišit mezi deficitem PAH a poruchami metabolismu BH4. U každého novorozence je proveden zátěžový test s BH4 a jsou vyšetřeny profil aminokyselin v séru, pteriny v moči a aktivita dihydropteridinreduktázy (DHPR) v krvi. Spektrum vyšetření může být doplněno o stanovení metabolitů neurotransmiterů (kyseliny homovanilové a 5-hydroxyindolacetátu) v likvoru. Všechna uvedená vyšetření jsou dostupná v Diagnostických laboratořích dědičných metabolických poruch VFN a. LF UK a pracoviště je nabízí pro potřeby všech novorozenců s HPA/PKU v ČR. Diagnóza je potvrzena molekulárně genetickým vyšetřením. Gen PAH je sekvenován v Centru molekulární biologie a genové terapie, Sekce metabolických poruch, při IHOK, FN Brno. Práce byla podpořena MZ ČR RVO VFN6465. CH CHCOO - NH 3 + L-fenylalanin fenylpyruvát fenyllaktát fenylalaninhydroxylasa Tetrahydrobiopterin fenylacetát L-tyrosin Monitorování kompenzace HPA/PKU v DLDMP KDDL O Dihydrobiopterin H O -hydroxyfenylacetát fenylacetylglutamin Schéma metabolismu fenylalaninu a sekundárních cest degradace fenylalaninu u fenylketonurie OH CH CHCOO - Péče o novorozenece s pozitivním screeningem HPA/PKU KP-Phe > μmol/l Je nutno rozlišit, zda se jedná o poruchu z deficitu PAH nebo poruchu metabolismu pterinů. Vyšetření. Zátěžový test s tetrahydrobiopterinem. Aktivita DHPR v erytrocytech (DBS) 3. Profil aminokyselin v séru 4. Profil pterinů v moči - před podáním BH4 Několik porcí moči, moč musí být dostatečně koncentrovaná (U-kreat > mmol/l), zkumavku s močí obalit alobalem (pteriny jsou fotosenzitivní) 5. Profil metabolitů neurotransmiterů v likvoru ihned po odběru zamrazit a dopravit do laboratoře v tekutém dusíku/suchém ledu, uskladnit při -8 C 6. Mutace v genu PAH FN Brno Zátěžový test s BH4 Normální strava během testu (kojení, adaptované kravské mléko) BH4 je fotosenzitivní, chránit před světlem!! KP-Phe před testem 4 μmol/l, je-li nižší, nutno test odložit a hladinu Phe zvýšit Podat BH4 v dávce mg/kg, 3 min. před jídlem Odběry krve na stanovení KP-Phe a KP-Tyr: před podáním BH4 a po podání BH4 za 8, 6 a 4 h. (dle doporučení Věk / stav Fenylalanin v krvi [μmol/l] do roku -4 do let -36 nad let -6 příprava na graviditu -36 gravidní -4 NH 3 + Profil aminokyselin v séru u fenylketonurie HPA/PKU Fyziologický profil pterinů v moči Fenylalanin Porucha metabolismu BH4 Profil pterinů v moči u pacienta s poruchou metabolismu BH4 Profil neurotransmiterů v likvoru Závěr: Při záchytu HPA je nutno zvažovat poruchy metabolismu pterinů. Prognóza dětí s HPA/PKU z deficitu PAH, které jsou léčeny od. měsíce věku a mají dlouhodobě hladiny fenylalaninu v doporučeném rozmezí, je dobrá. Kjerova atrofie optiku klinická a molekulární charakteristika 4 českých pacientů Kelifová S., Honzík T., Tesařová M., Kousal B., Ďuďáková L., Zeman J., Lišková P.,, Kolářová H. Klinika dětského a dorostového lékařství,. lékařská fakulta, Univerzita Karlova a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze Oční klinika,. lékařská fakulta, Univerzita Karlova a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze F žena; M muž; CPEO chronická progresivní externí oftalmoplegie; PNP periferní neuropatie ÚVOD Dominantní atrofie optiku (DOA, OMIM 655) je autosomálně dominantně děděné mitochondriální onemocnění manifestující se pomalou nebolestivou bilaterální ztrátou zrakové ostrosti různého stupně závažnosti na podkladě neurodegenerativního postižení retinálních gangliových buněk vedoucí k atrofii zrakového nervu. Prevalence onemocnění je dle studované populace stanovena na : - :3,. První příznaky se obvykle objevují v prvních dvou dekádách věku, ale vzhledem k pozvolné progresi nelze přesný začátek mnohdy určit. DOA je geneticky heterogenní, u přibližně 6 % pacientů jsou podkladem mutace v genu OPA (OMIM 659). Na očním pozadí je nález bledého optického disku. U přibližně % pacientů jsou popisovány i extraokulární projevy tzv. DOA plus syndrom 3. Proběhl retrospektivní sběr klinických dat pacientů s DOA na podkladě heterozygotní mutace v genu OPA, kteří byli vyšetřeni v Centru pro pacienty s mitochondriálními neuropatiemi optiku v letech -8. Pacienti podstoupili specializované oftalmologické a neurooftalmologické vyšetření, neurologické vyšetření a audiometrii. Screening genu OPA byl proveden pomocí Sangerova sekvenování kódujících exonů a metodou MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification). VÝSLEDKY DOA byla diagnostikována u 33 jedinců (8 žen, 5 mužů) ze 7 rodin. Bylo detekováno 5 příčinných mutací. Kompletní klinické údaje byly dostupné u 4 jedinců z 3 rodin. 8 pacientů (75 %) pozorovalo vznik zrakových obtíží před. rokem věku, z toho u 7 z nich došlo k manifestaci do 6 let věku. Průměrná zraková ostrost v souboru byla,4 (rozsah, -,). Zraková ostrost lepšího oka, byla přítomna u 7/4 (3,4 %). Pouze pacient (5 let) ze souboru je asymptomatický, diagnostikovaný v rámci genetického screeningu rodiny se suspektní autosomálně dominantně děděnou optickou atrofií, potvrzena heterozygotní mutace c.9_9insc v OPA genu (Obr. ). Plus symptomatologie byla popsána u7pacientů (3 %). Jednalo se o poruchu sluchu (5), periferní neuropatii (6), ataxii (5), ptózu (5), progresivní zevní oftalmoplegii () a myopatii () (Tabulka ). U pacienta III/ (Tabulka ) je vzhledem k nálezu oligoklonálních pásů v likvoru podezření na současně probíhající sclerosis multiplex, ale zobrazení magnetickou rezonancí neproběhlo. Výsledky očního vyšetření u 3leté ženy s DOA na podkladě heterozygotní mutace c.99+4a>g v genu OPA. U ženy se objevila porucha zraku v 6 letech, postupně došlo k progresi, optická atrofie diagnostikována v 9 letech, její aktuální visus je VOPL, (Obr. ). Tab. Symptomy pacientů s DOA plus syndromem Začátek zrakových obtíží I/ F let II/ F II/ F II/3 M II/4 M III/ M 4 let 3 let 4 let Školní věk Od dětství Zraková ostrost (věk) VOP,5, VOL,4 (38 let) VOPL,6 (39 let) VOPL, (46 let) VOPL,5 (33 let) VOPL, (35 let) VOP, VOL,5 (4 let) METODY Optická atrofie Porucha sluchu ZÁVĚR DOA je závažné onemocnění vedoucí k signifikantní morbiditě. Dle uvedené prevalence v Evropě se zdá, že je toto onemocnění v České republice poddiagnostikované. Extraokulární příznaky, jako komplikace DOA, se podílejí na morbiditě u téměř /3 pacientů ze souboru. Důležité je aktivní vyhledávání možných přenašečů, či již postihnutých jedinců v mladších generacích, především dětí, a jejich důsledná dispenzarizace, neboť v posledních letech probíhají studie zabývající se možnostmi terapeutického ovlivnění onemocnění a těmto jedincům se tak nabízí možná lepší prognóza onemocnění 4,5. Diagnostický proces a další sledování pacientů by mělo být multidisciplinární, zahrnující neurologické a foniatrické vyšetření. PNP Ataxie Ptóza víček CPEO myopatie IV/ F 47 let VOP,4 VOL,3 (6 let) F žena; M muž; CPEO chronická progresivní externí oftalmoplegie; PNP periferní neuropatie; VOPL visus oka pravého, levého Obr. Rodokmen rodiny s potvrzenou mutací v genu OPA I. II. III. IV. VOP visus oka pravého, VOL visus oka levého A.. Potvrzená mutace c.9_9insc (p.gln97profs*). Anamnesticky suspektní DOA.. 3. Obr. : Bilaterálně centrocékálně absolutní výpady ve zrakovém poli, dále několik mělčích výpadů (A,B). Ztenčení vrstvy retinálních nervových vláken ve všech kvadrantech bilaterálně (C,D). B.. III./3. VOPL. IV./ VOP.5, VOL. IV./ VOP., VOL.5 Obr. Vyšetření perimetru a optické koherenční tomografie u 3leté ženy s DOA Oko pravé Oko levé A. B. C. D. Reference Kjer et al., 996; Chinnery et al., 3; 3 Yu-Wai-Man et al., ; 4 Barboni et al., 3; 5 Sarzi et al., 8. Práce byla podpořena grantem AZV 6-334A RVO-VFN6465 a SVV

16 7 8 Fenotypové projevy pacientů s kongenitální EGFR mutací u romské populace S. Mazurová, V. Stránecký, M. Tesařová, A. Vondráčková, H. Hansíková, M. Giertlová², A. Baxová ³, J. Laštůvková 4, V. Chovanová 5, J. Zeman, T. Honzík, M. Magner Klinika dětského a dorostového lékařství a Ústav dědičných metabolických poruch,. lékařská fakulta Univerzity Karlovy a Všeobecné Fakultní nemocnice v Praze, Česká republika ² Laboratoř Molekulární Genetiky, Medirex a.s., Košice, Slovenská republika ³ Ústav Biologie a lékařské Genetiky,. lékařská fakulta Univerzity Karlovy a Všeobecné Fakultní nemocnice v Praze, Česká republika 4 Oddělení lékařské genetiky, Masarykova nemocnice, Ústí and Labem, Česká republika 5 Odděleníneonatologie, Detská fakultnánemocnica, Košice, Slovenská republika Úvod Receptor pro epidermální růstový faktor (EGFR) se díky své tyrozin-kinázové aktivitě podílí na zprostředkování mnoha růstových a diferenciačních pochodů buňky. Získané aktivační mutace hrají roli v procesech maligní transformace (např. u adenokarcinomu plic či karcinomu prsu). Jediná dosud popsaná kongenitální mutace se vyskytuje v romské populaci, vede k inaktivaci receptoru a specifickému fenotypu s časně postnatální manifestací (Campbell et al., 4). Prezentujeme největší existující soubor romských pacientů s touto mutací. Hlavní fenotypové projevy (viz. Tabulka) Charakteristika souboru Všichni pacienti jsou romského etnika, v souboru je zahrnuto celkem pacientů (6 dívek a 5 chlapců), 6 z nich má potvrzenu prevalentní mutaci c.83g A (p.gly48asp) v genu EGFR. Vzhledem k retrospektivní analýze u 4 pacientů nebylo možno mutaci vyšetřit. Ze souboru je vyčleněn nejdéle žijící pacient, soubor je srovnáván se třemi pacienty publikovanými v literatuře. Prenatální a perinatální období Prematurita a polyhydramnion byly nejčastějšími nálezy (% případů). Medián gestačního stáří v době porodu byl 7.gestační týden. Intrauterinní růstová restrikce byla přítomná v 88% případů a průměrná porodní hmotnost byla 84g (44-47g). Postnatální období bylo komplikováno opakovanými infekty, nejen kožními (5% případů s existujícími daty), ale i systémovými, nejčastěji charakteru sepse (u 5% pacientů z celého souboru). Kožní nález (viz. Obr. -4) Krátce postnatálně dominovalo především postižení kůže s absencí podkožního tuku (95 % případů). Zpočátku byl vzhled pokožky vyhlazený, jemný, v některých případech se zvýšenou náchylností ke tvorbě hematomů a poranění. V dalším průběhu docházelo k deskvamaci pokožky a rozvoji ichtyosiformní dermatitidy. U některých pacientů byla přítomná hypertrichóza a trichomegalie, ale dominovala alopecie (66% případů), postižení nehtů nebylo zaznamenáno. U nejdéle žijícího pacienta došlo k rozvoji fotosenzitivity a erytrodermie, je přítomná i dentinogenesis imperfecta. Postižení ledvin Nefromegalie byla nejčastějším nálezem na prenatální ultrasonografii. Od raného postnatálního období byla u nejdéle žijícího a dalších 8 postižených, zaznamenána nutnost extrémního parenterálního přívodu tekutin (až ml/kg/den), bez polyurie, společně s hypernatrémií, hypokalémií a hypomagnezémií. Postižení ledvin připomíná inkompletní Fanconiho syndrom. U nejdéle žijícího chlapce byl potvrzen sekundární hyperaldosteronismus, v dalším průběhu se rozvinula proteinurie nefrotické tíže. Výsledky Tabulka Klinické a laboratorní znaky Pacienti ČR a SR Nejdéle žijící pacient Literatura * Počet pacientů 3 Polyhydramnion / + /3 IUGR 6/7 + 3/3 Prematurita Lehká 4/ - 3/3 Střední 8/ + - Těžká 8/ - - Pohlaví 6 Ž/ 4 M M Ž/ M Romské etnikum / + 3/3 Potvrzená homozygotní mutace c.83g A (p.gly48asp) v genu EGFR 6/ + 3/3 Progeroidní rysy 7/ + /3 Absence podkožního tuku 6/7 + /3 Tenká, jemná a průsvitná pokožka 6/ + /3 Opakované kožní infekce 5/ + / Opakované systémové infekce 4/5 + /3 Sepse 9/ + - Kožní projevy Olupování pokožky 9/9 + 3/3 Ichtyóza 7/9 + 3/3 Fotosenzitivita/Erytrodermie / + NA Trichomegalie 6/7 - /3 Alopecie /5 + 3/3 Postižení ledvin Nefromegalie 9/7 + 3/3 Zvýšený přívod tekutin 8/ + NA Polyurie / - NA Iontová Hypernatrémie 3/9 + /3 dysbalance Hypokalémie 7/9 + /3 Hypomagnezémie /3 + /3 Smrt před 6. měsícem věku / - π /3 Zkratky pro Tabulku: ČR Česká republika; SR Slovenská republika; * - Ganetzky et al. 5, Cambell et al. 4; M muž; Ž žena; - krátce postnatálně; NA Není k dispozici; π žijící ( let). Metody U 6 z prezentovaných pacientů byla nalezena jednotná prevalentní mutace c.83g A (p.gly48asp) v homozygotní konstituci v genu EGFR pomocí Illumina HiSeq system (Illumina, USA) a SeqCap EZ Exome Enrichment kit v3. (Roche NimbleGen, USA). Nalezené mutace byly ověřována pomocí Sangerova sekvenování u probanda i rodičů vpřípadě existence vzorku. Geografický výskyt pacientů Závěr Fenotypové projevy pacientů Obr. : Dívka ve stáří den (původně z 3. gestačního týdne) s patrnou lesklou, vyhlazenou pokožkou s absencí podkožního tuku a rozsáhlým podkožním hematomem kalvy a pravého předloktí. Obr. : Měsíční chlapec (původně z 7. gestačního týdne) s patrnou ichtyosiformní dermatitidou a trichomegalií vlasů i obočí. Obr. 3: Měsíční chlapec (původně z 3. gestačního týdne) s patrnou tenkou, vyhlazenou pokožkou s absencí podkožního tuku, fragilitou pokožky s erozemi, trichomegalií vlasů i obočí. Bez postižení nehtů. Obr. 4: Nejdéle žijící pacient, zde ve věku let. Patrné progeroidní rysy, alopecie, absence obočí, ichtyóza, erytrodermie a fotosenzitivita pokožky. Deficit EGFR, je extrémně závažné onemocnění manifestující se předčasným porodem, rekurentními infekty a ichtyosiformní dermatitidou. Prezentujeme největší dosud popsaný soubor celkem pacientů (u 6 byla potvrzena prevalentní homozygotní mutace c.83g A (p.gly48asp) v genu EGFR) s neonatálním či infantilním letálním průběhem na základě rekurentních infektů či sepsí. Součástí souboru je navíc také nejdéle přežívající, nyní 3 letý, pacient, který se manifestoval typickými kožními projevy, dále rozvinul dosud nepopsané těžké renální glomerulární a tubulární postižení, které vedlo k chronické růstové retardaci a jeho včasná adekvátní léčba může pozitivně ovlivnit délku dožití. Je předpokládán významně vyšší výskyt tohoto závažného onemocnění, dosud popsaného výhradně u romského etnika. Tato práce vznikla s podporou: AZV6-393A, RVO-VFN 6465/, SVV 6367, UNCE 464. ÚVOD Neurotransmiterová onemocnění v ČR Neurotransmiterová onemocnění jsou heterogenní skupinou více než vzácných neurometabolických onemocnění na podkladě primárního deficitu jednoho či více neurotransmiterů (NT) z důvodu poruchy jejich syntézy, degradace nebo transportu. Celosvětově je popsáno více než 5 pacientů. (Batllori et al., 6, Opladen et al. 6) Hlavními skupinami NT onemocnění jsou poruchy metabolismu glycinu, serinu, gamma-aminomáselné kyseliny, glutamátu, glutaminu, a zejména pak poruchy metabolismu biogenních aminů dopaminu, serotoninu, norepinephrinu, včetně poruch metabolismu kofaktorů tetrahydrobiopterinu (BH4), vitaminu B6 a folátu (Opladen et al., 6) (Obr. ). Dědičnost je téměř výhradně autozomálně recesivní. Klinické projevy deficitu dopaminu jsou asociovány zejména s motorickými projevy (parkinsonismus, dystonie, jiné mimovolní pohyby, tonusové odchylky, diurnální fluktuace projevů), serotonin je pak spojován s poruchami spánku, vegetativními projevy, teplotní nestabilitou, či behaviorálními poruchami. (Hoffman et al., 995) Klinická manifestace ostatních NT onemocnění je méně specifická a může imitovat řadu jiných onemocnění. VÝSLEDKY Kulhánek J, Martincová O, Pešková K, Chrastina P, Zeman J, Honzík T Klinika dětského a dorostového lékařství. LF UK a VFN, Praha, Česká republika Laboratorní poznámka: Odběr MMM k analýze NT je přísně protokolizován. Koncentrace NT v MMM sleduje rostrokaudální gradient. Některé analyty jsou fotolabilní. Vzorky MMM je nutno transportovat a příp. uchovávat při -7 až -8 C. Obr. (upraveno dle Batllori et al., 6) Metabolismus biogenních aminů. Červená pole: enzymatické defekty syntetické dráhy jednotlivých NT. Fialová pole: enzymatické defekty syntetické či regenerační dráhy jejich kofaktoru zelená pole. Modrá pole: analyty stanovované na KDDL. LF UK a VFN v mozkomíšním moku (MMM) v rámci diagnostiky NT onemocnění. Žlutá pole: analyty stanovované v moči v rámci podezření na některou z BH4 deficiencí. BH4 je kofaktorem fenylalaninhydroxylázy (PAH), tyrosinhydroxylázy (TH) a tryptofanhydroxylázy (TPH). Je syntetizován 3 základními enzymy guanosintrifosfát cyclohydroláza (GTPCH), 6- pyruvoyltetrahydropterin syntáza (PTPS) a sepiapterin reduktáza (SR) a regenerován dihydropteridin reduktázou (DHPR). BH4 je kofaktorem při konverzi fenylalaninu na tyrosin (při deficitu BH4 na úrovni autozomálně recesivní-gtpch, PTPS a DHPR tak vzniká hyperfenylalaninémie), tyrosinu na L-DOPA (L- 3,4-dihydroxyfenylalanin) a tryptofanu na 5HTP (5-hydroxytroptofan). L-DOPA a 5HTP jsou přeměněny dekarboxylázou aromatických L-aminokyselin (AADC) na dopamin a serotonin. Při dysfunkci AADC se zvyšuje hladina L-DOPA a 5HTP v MMM, L-DOPA přechází v 3-O-metyldopa (3OMD) obě látky jsou diagnosticky významné. Dopamin je konvertován dopamin beta-hydroxylázou na norepinephin, ten dále na epinephrin. Konečnými stabilními metabolity dopaminu a serotoninu jsou homovanilová (HVA) a 5-hydroxyindoloctová kyselina (5-HIIA) obě detekovatelné v MMM. Okrajově je zachycen i metabolismus GABA s možnými deficity gaba-transaminázy (GABA-T) či succinylsemialdehyd dehydrogenázy (SSAAD). Metabolismus vitaminu B6 může být porušen při deficitu pyridoxiamin-5-fosfát oxidázy s deficitem pyridoxalfosfátu, který rovněž zastává roli kofaktoru. Dědičnost NT onemocnění je autozomálně recesivní, pouze GTPCH může mít i autozomálně dominantní typ dědičnosti a manifestovat se zcela odlišnou symptomatologií. METODIKA Retrospektivní sběr dat pacientů s diagnostikovaným NT onemocněním. Na Klinice dětského a dorostového lékařství. LF UK a VFN byli diagnostikováni a centralizováni pacienti s NT onemocněními. Diagnostický algoritmus zahrnoval novorozenecký screening (NBS) (detekce PTPS, DHPR) a selektivní screening: analýza pterinů v moči, aminokyselin a HVA a 5-HIAA v MMM, enzymatické studie, molekulárně-genetické vyšetření Sangerovým sekvenováním. Ve sledovaném období bylo diagnostikováno pacientů, celkově je sledováno pacientů s NT onemocněním. (Tab. ) P, P, P4 byli zachyceni pomocí NBS. P5 také, následné enzymatické studie však byly falešně negativní. Doba diagnózy je ovlivněna detekcí pomocí NBS (P,P,P4)) či časnou manifestací onemocnění (P8,P9,P). P6 se manifestoval v adolescenci. P3 se narodil před érou NBS. Diagnóza P7 byla opožděna pro koincidenci s postižením perinatální asfyxií maskující klinické projevy NT onemocnění. pacienti s GE (glycinová encefalopatie) zemřeli na základní onemocnění. KDDL je členem mezinárodní iniciativy pro NT onemocnění intd (International Working Group on Neurotransmitter Disorders) a kohorta pacientů je zařazena do intd registru (akt. celosvětově 43 center a 387 pacientů). KDDL se v rámci intd stala ativně participujícím centrem a nyní se ve vedoucí pozici podílí na přípravě doporučení pro diagnostiku a léčbu BH4 deficiencí. KDDL je rovněž aktivním členem podskupiny NOMS (Neuromodulators and Other Small Molecules) v rámci MetabERN (Evropské referenční sítě pro dědičné metabolické poruchy). Tab. Diagnóza Manifestace Klinické projevy - manifestace Diagnóza Klinické projevy - aktuální Terapie Věk P PTPS-D 7M PMR,5M Mírná až střední MR L-DOPA/Carbidopa; 5HTP, BH4 8R P PTPS-D M PMR, hypotonie, epilepsie, dystonie,5m Mírná MR L-DOPA/Carbidopa; 5HTP, BH4, k. listová 8R P3 PTPS-D M PMR, epilepsie, mikrocefalie M Těžká MR L-DOPA/Carbidopa; 5HTP, BH4, k. listová 45R P4 PTPS-D 9M Mírná PMR,5M Mírná PMR L-DOPA/Carbidopa; 5HTP, BH4, k. listová M P5 DHPR-D 5M PMR, hypotonie 7M L-DOPA/Carbidopa; 5HTP, BH4, k. listová 3R P6 AD-GTPCH 3R Končetinová dystonie, status dystonicus 4R Funkční porucha hybnosti + neepileptické záchvaty L-DOPA/Carbidopa 6R P7 TH-D M PMR, hypotonie, dystonie, dyskineze 6R Kvadruspasticita, dystonie, střední MR L-DOPA/Carbidopa, Dopaminový agonista 4,5R P8 GE D Hypotonie, porucha vědomí, respirační smrt v,5m Těžká PMR, hypertonie, epilepsie, Na-benzoát, dextrometorfan insuficience 7M P9 GE D Hypotonie, porucha vědomí, respirační insuficience,5m Těžká PMR, spastická kvadruplegie, hypertonie, epilepsie, Dextrometorfan 5R P GE M n.k. n.k. Težká PMR, epilepsie, ASD Na-benzoát, dextrometorfan R P GE T Hypotonie, porucha vědomí,epilepsie,5m Težká PMR, epilepsie, Na-benzoát, dextrometorfan, ketogenní dieta smrt v 3,5R Diskuze Zkratky: M - měsíc, T- týden, R - rok, PMR - psychomotorická retardace, MR - mentální retardace, ASD - porucha autistického spektra, n.k. - není k dispozici Neurotransmiterová onemocnění jsou integrální součástí diferenciální diagnostiky neurometabolických onemocnění. Diagnostika je založena na analýze mozkomíšního moku. Je nezbytné optimalizovat diagnostický proces NT onemocnění a jejich léčbu. Vyjma přípravy mezinárodních doporučení byl na KDDL recentně zaveden i NGS panel NT onemocnění čítající 6 genů. Je plánováno rozšíření aktivit KDDL v rámci intd a NOMS. Dále budou vyšetřeny (3OMD, 5HTP, HVA, 5-HIAA) uchované vzorky MMM (n ~ 5) pacientů se suspektním či již diagnostikovaným metabolickým onemocněním ke screeningu primárních NT onemocnění či analýze sekundární alterace NT u různých onemocnění. Podpořeno: RVO-VFN6465 a SVV6367.

17 9 GLYKOGENÓZA TYPU VII VZÁCNÁ PŘÍČINA RABDOMYOLÝZY E. Košťálová, H. Vlášková, L. Dvořáková Klinika dětského a dorostového lékařství VFN a. LF UK, Praha Úvod Glykogenóza typu VII (GSD VII, Taruiho nemoc) Vzácná autozomálně recesivně dědičná metabolická myopatie, způsobená deficitem aktivity svalové fosfofruktokinázy (PFKM) na podkladě mutací v genu PFKM. Fosfofruktokináza (PFK) je klíčový enzym v regulaci glykolýzy, katalyzuje fosforylaci fruktoso-6-fosfátu na fruktoso-,6-bisfosfát. Při deficitu PFKM svaly nemohou využít glykogen a glukozu jako zdroj energie. Nejčastější symptomy GSD VII: intolerance cvičení s únavou, bolestí svalů, křečemi ve svalech; ataky rabdomyolýzy s myoglobinurií; pomalu progredující svalová slabost; mírná kompenzovaná hemolytická anemie. Kazuistika RA: V rodině bez neurologické zátěže. Matka má hyperbilirubinémii. Mladší sestra a paternální i maternální babička mají onemocnění štítné žlázy. OA, NO: Z. fyziologické gravidity, poporodní adaptace bez komplikací. Od 3 let je sledována pro sníženou funkci štítné žlázy. Sport: Do 5 let dělala závodně atletiku. Na střední škole sportuje rekreačně.. ataka rabdomyolýzy - věk 6 let 8 měsíců. Po školní tělesné výchově (fitbox) tmavá moč. Týden poté absolvovala školní tělovýchovný kurz únava, bolesti v krku, febrilie, tmavší moč. Hospitalizace: vysoké jaterní testy, hyperbilirubinémie, moč bez hematurie, snížené funkce ledvin, potvrzena infekční mononukleoza, m. Gilbert. Dále nefrologické sledování funkce ledvin na dolní hranici normy, intermitentně malá proteinurie.. ataka rabdomyolýzy za měsíců po. atace. Po školní tělesné výchově (výskoky a lehy): tmavá moč, nemohla se hýbat. Hospitalizace: susp. myoglobinurie, proteinurie, elevace CK, myoglobinu, AST, ALT, bilirubinu, hyperurikémie. Kardiologické vyšetření v normě, sono břicha v normě. V suché krevní kapce odebrané ve. atace rabdomyolýzy byl hraniční nález pro deficit karnitinpalmitoyltransferázy (CPTII) nebo karnitinacylkarnitintranslokázy (CACT). Mutační analýza genu CPTII neprokázala mutaci. Při vyšetření panelu genů pro onemocnění spojená s rabdomyolýzami metodou NGS byla v genu PFKM v homozygotním stavu zjištěna varianta c.94t>c (p.i65t). Přítomnost varianty byla potvrzena Sangerovým sekvenováním. Varianta je klasifikována jako varianta nejasného významu. Všechna kritéria svědčí pro patogenitu varianty a není splněno žádné kritérium pro benigní variantu. V objektivním neurologickém nálezu nebyl a není přítomen myopatický syndrom. Elektromyografické vyšetření provedené za tři měsíce po druhé atace rabdomyolýzy bylo bez jednoznačného myogenního nálezu. Jedenáct měsíců po poslední atace rabdomyolýzy byla přítomna mírná elevace CK, bilirubinu a hyperurikémie. Závěr Podpořeno projektem MZ ČR RVO-VFN6465 Obr.. Molecular basis of PFK deficiency. In classic Tarui disease, the genetic defect involves the M isoform of PFK enzyme, resulting a severe enzyme deficiency in muscle. Erythrocytes that normally have two homotetramers (M4 and L4) and three hybrid isozymes (M3L, ML and ML3), lack the M4 isoform and the hybrid isozymes, and only express the L4 homotetramers, resulting in about 5% of normal PFK activity In: ResearchGate: First description of Phosphofructokinase Deficiency In Spain: Identification Of A Novel Homozygous Missence Mutation In The PFKM Gene Tab.. Vybrané biochemické parametry u pacientky s GSD VII. parametr norma. ataka. ataka 3,5 měsíce po. atace měsíců po. atace CK μkat/l,43-3, nv 5 36,68 3,4 myoglobin μg/l AST μkat/l ALT μkat/l 4-66 nv , -,7 4,43-6,7 4,58,8,6, -,78 3,3-9,55 8,69,6,47 kyselina močová - 34 nv μmol/l bilirubin μmol/l ,4 54,5 U pacientů s atakami rabdomyolýzy po fyzické zátěži a/nebo zvýšením CK s intolerancí cvičení je třeba zvažovat také glykogenózu typu VII. Metody sekvenování nové generace se uplatní zejména při diagnostice dědičných metabolických poruch (DMP), které nemají klinickou symptomatiku typickou pro konkrétní DMP a/nebo nejsou jednoznačně diagnostikovatelné vyšetřením na úrovni metabolitů nebo enzymů.

18 Combined complex I and III deficiency in patient with novel mutation in UQCRC encoding structural subunit of complex III Klinické, biochemické a genetické aspekty Wilsonovy choroby D. Prochazková, S. Pouchlá, M. Dastych3 3.RQHþQi, L. Kolbová, L. Fajkusová 3HGLDWULFNi NOLQLND /pndĝvni IDNXOWD DVDU\NRY\ 8QLYHU]LW\ D )DNXOWQt QHPRFQLFH %UQR &HQWUXP PROHNXOiUQt ELRORJLH D JHQRYp WHUDSLH,+. /pndĝvni IDNXOWD DVDU\NRY\ 8QLYHU]LW\ D )DNXOWQt QHPRFQLFH %UQR 3 GGČOHQt NOLQLFNp ELRFKHPLH )DNXOWQt QHPRFQLFH %UQR Úvod: :LOVRQRYD FKRURED :', MH Y]iFQi DXWRVRPiOQČ UHFHVLYQt SRUXFKD PHWDEROL]PX PČGL ]SĤVREHQi PXWDFHPL Y ATP7B JHQX NWHUê MH ORNDOL]RYiQ QD FKURPR]RPX T D NyGXMH ATP7B SURWHLQ 'H FLW ATP7B YHGH NH VQtåHQt KRGQRW\ FHUXORSODVPLQX &3 Y NUYL SRVWLåHQt MDWHUQtFK KHSDWRF\WĤ L GDOãtFK RUJiQĤ PR]HN RNR OHGYLQ\ 8GiYDQi LQFLGHQFH FKRURE\ þlqt DVL ålyč QDUR]HQêFK GČWt.OLQLFNp SĜt]QDN\ MVRX YHOPL YDULDELOQt RG DV\PSWRPDWLFNêFK IRUHP SĜHV FKURQLFNp SRVWLåHQt MDWHU DNXWQt VHOKiQt MDWHU QHXURSV\FKLDWULFNp SĜt]QDN\ D DNXWQt KHPRO\WLFNRX DQpPLL Metodika: $XWRĜL SUH]HQWXMt ]NXãHQRVWL ]H VRXERUX GČWVNêFK SDFLHQWĤ V :' GLDJQRVWLNRYDQêFK YH ) %UQR YČN PČVtFĤ OHW 'LDJQRVWLND VH RStUi R NRPELQDFL NOLQLFNêFK SĜt]QDNĤ ELRFKHPLFNp PDUNHU\ >KRGQRWD &3 D PČGL Y VpUX &X 6 RGSDG\ PČGL Y PRþL ]D KRGLQ KLVWRORJLFNp Y\ãHWĜHQt MDWHUQt WNiQČ VWDQRYHQt REVDKX PČGL Y MDWHUQt VXãLQČ D '$ DQDOê]X ATP7B JHQX D. Burska, J. Krizova, J. Sladkova, M. Rodinova, H. Hansikova, J. Zeman, M. Tesarova Laboratory for Study of Mitochondrial Disorders, Department of Pediatrics and Adolescent Medicine, First Faculty of Medicine, Charles University and General University Hospital in Prague, Prague, Czech Republic INTRODUCTION Mitochondrial respiratory chain (MRC) is composed of four multiprotein enzyme complexes (CI-IV) and two mobile electron carriers (coenzyme Q and cytochrome c). CIII is a tightly bound symmetrical dimeric structure, closely associated with CI and CIV in its native state, thus forming a diversity of supramolecular assemblies, known as supercomplexes or respirasomes. So far, two family cases with the same UQCRC mutation in gene coding for CIII structural subunit Core (UQCRC) have been reported to lead to CIII deficiency, neonatal lactic acidosis hypoglycemia and hepatocellular insufficiency. By use of whole-exome sequencing, we identified a novel homozygous missence mutation (c.665g>c p. GlyAla) in UQCRC in the patient with psychomotoric delay, encephalomyopathy and lactic acidosis. B A FIGURE. A) Immunoblot analysis of patient (P) and controls (C, C) in fibroblast mitochondria under native conditions. Equal amounts (5 μg) of mitochondrial protein prepared by solubilization using.% n-dodecyl beta-d-maltoside (5 DDM/protein) and dilution of control sample (C) were resolved by BN-PAGE and subjected to Western blot analysis with antibodies specific to NDUFA9 (subunit of CI), ATPalpha (subunit of CV), UQCRC (subunit of CIII), Cox (subunit of CIV). Equal loading was verified using an antibody against the CII subunit SDHA. Positions of the various assembly forms of complex IV (a - e) as well as holoenzyme complexes I-V and III +IV supercomplex are indicated. B, C) Immunoblot analysis of the steady-state levels of selected CIII subunits (B) and Opa isoforms (C) in whole-cell lysates from cultured skin fibroblast samples of affected individual (P) and control (C). Equal amounts of whole-cell lysates (μg - B, μg - C) and dilution of control sample (B) were resolved by SDS-PAGE and subjected to Western blot analysis with antibodies specific to NDUFA9 and NDUFB6 (subunits of CI); SDHA (subunit of CII);UQCRC, UQCRC, UQCRB, UQCRFS, CYC (subunits of CIII); ATPalpha (subunit of CV) and OPA. Equal loading was verified using an antibody against the GAPDH, β-actin or the CII subunit SDHA. Asterisk marks the nonspecific band, which results from antiuqcrfs detection. L- OPA, long isoforms of OPA protein, S-OPA, short isoforms of OPAprotein. Immunoreactive material was visualized by chemiluminescence. Výsledky: 3UYQt SĜt]QDN\ :' VH Y SUĤPČUX REMHYLO\ Y OHWHFK YČNX 9 GČWVNpP YČNX SĜHYDåXMH IRUPD MDWHUQt SUREDQGĤ 6PtãHQRX IRUPRX WM MDWHUQt IRUPRX QHXURORJLFNRX þl SV\FKLDWULFNRX IRUPRX E\OR SRVWLåHQR SUREDQGĤ 3ČW SUREDQGĤ E\OR GLDJQRVWLNRYiQR Y UiPFL IDPLO\ VFUHHQLQJX QHMPHQãt PČO PČVtFĤ YČNX ýw\ĝl GtYN\ SRGVWRXSLO\ RUWRWRSLFNRX WUDQVSODQWDFL MDWHU SUR DNXWQt VHOKiQt MDWHU 7ĜL GtYN\ WUSČO\ DNXWQt KHPRO\WLFNRX DQpPLt äigqp GtWČ QHPČOR W]Y.D\VHU )OHLVFKHUĤY SUVWHQHF GHSR]LWD PČGL Y 'HVFHPHWRYČ PHPEUiQČ URKRYN\ 7ĜL QRVLþL SDWRJHQQt VHNYHQþQt YDULDQW\ S + 4 PČOL QHXURORJLF Np SĜt]QDN\ WĜHV G\VDUWULL K\SRPLPLL SRUXFKX NRRUGLQDFH SRK\EX D G\VWRQLL -HGQD SUREDQGND V JHQRW\SHP S + 4 S + 4 WUSt RG þdvqp GRVSČORVWL ELSROiUQt DIHNWLYQt SRUXFKRX 'DOãt SUREDQGND V JHQRW\SHP S + 4 S : ; MH OpþHQD SUR ~]NRVWQRX SRUXFKX HGLiQ KRGQRW &3 Y VpUX þlqlo J O HGLiQ &X 6 þlqlo PRO O HGLiQ &X þlqlo PRO KRG 9 VRXERUX E\OR XUþHQR PXWDQWQtFK DOHO Y ATP7B JHQX UDWH RI PXWDWLRQ GHWHFWLRQ %\O\ GHWHNRYiQ\ GYČ QRYp SDWRJHQQt VHNYHQþQt YDULDQW\ Y ATP7B JHQX >F &!7 S $ 9 F &!7 S $ 9@ D MLå SRSVDQêFK HMþDVWČMãt SDWRJHQQt VHNYHQþQt YDULDQWRX MH F &!$ S + 4 =iyču 3ĜL YþDVQp GLDJQRVWLFH D OpþEČ MH SURJQy]D :LOVRQRY\ FKRURE\ GREUi )DPLO\ VFUHHQLQJ :' XPRåĖXMH ]ifk\w QHPRFL Y SRþiWHþQtP VWiGLX RQHPRFQČQt.RQYHQþQt GLDJQRVWLFNi NULWpULD NWHUi SODWt SUR GRVSČOp SRYãHFKQČ SODWt L SUR GČWL HPXVt EêW YåG\ X QHMPHQãtFK SDFLHQWĤ EUi]HN.D\VHU )OHLVFKHUĤY SUVWHQHF GHSR]LWD PČGL Y 'HVFH PHWRYČ PHPEUiQČ URKRYN\ EUi]HN %LRFKHPLFNi GLDJQRVWLND :LOVRQRY\ FKRURE\ EUi]HN 3UĤND] PČGL Y MiWUHFK N\VH OLQRX UXEHDQR YRGtNRYRX 3Ĝt WRPQRVW þhuqč ]EDUYHQêFK GUREQêFK JUDQXO Y KHSDWRF\WHFK SRX]H ORåLVNRYČ Y QČNWHUêFK X]OHFK FLUKRWLF Nê QRGXOXV QD RSDþQp VWUDQČ VQtPNX MH QHJD WLYQt 7DEXOND ROHNXOiUQČ JHQHWLFNp Y\ãHWĜHQt ATP7B JHQX Y VRXERUX GČWt V :LOVRQRYRX FKRURERX 9êVOHGN\ SĜtPp VHNYHQþQt DQDOê]\ ATP7B JHQX GOH 6DQJHUD FERNANDES, J., SAUDUBRAY, J.M., Van den BERGHE, G.: Inborn Metabolic Diseases: Diagnosis and Treatment. 3rd edition, Springer - Verlag, Berlin - Heidelberg - New York,, s , ISBN X FIGURE. Immunoblot detection of the respiratory supercomplexes in affected individual (P) and control (C, C) fibroblast mitochondria. Equal amounts (3 μg) of mitochondrial protein solubilized with a digitonin:protein ratio of 8 g/g were resolved by BN-PAGE and subjected to Western blot with antibodies raised against NDUFB6 (subunit of CI) - A, Core (subunit of CIII) - B, or with cocktail of these antibodies and Cox (subunit of CIV) - C. The grey color indicates the marked complexes and long exposure. Equal loading was verified using an antibody against the CII subunit SDHA. Immunoreactive material was visualized by chemiluminescence. Positions of the various assembly forms are indicated. I+III+IVn, SC containing CI, CIII and CIV. I+III, SC containing CI and CIII. III +IV, SC containing CIII and CIV. I, complex I. III, complex III dimer. IV, complex IV. IV, complex IV dimer. Subcomplexes that contain NDUFB6 and Core are indicated as subndufb6 and subcore. C RESULTS A In the fibroblast mitochondria of the patient, we found severe combined CI and CIII deficiency ( Fig. A ) which very likely resulted from severe reduction in UQCRC levels (Fig. B). The decreased level of UQCRC was accompanied by markedly reduced levels of selected structural subunits except for normal level of CYC compared to control (Fig. B). The overall amount of OPA was virtually normal, but the pattern of S-OPA isoforms was changed, when compared to control (Fig. C).The supercomplex migration patterns hinted that combined CI and CIII deficiency arose from CIII depletion, because only CIII was depleted at the level of CIII-containing supercomplex structures as well as at the level of free CIII form (Fig. ). When the supercomplex migration patterns are compared with overall steady state levels o f t h e i n d i v i d u a l re s p i rato r y c h a i n complexes, we can see that substantial decrease in CI-III-IV containing supercompelx structures ( Fig. ) was accompanied by significant decrease in overall amount of CI but normal overall steady-state level and assembly of CIV in patient mitochondria compared to control (Fig. A). B C CONCLUSIONS Our study on novel mutation of UQCRC further expands the phenotypic spectrum of human disease caused by a core protein abnormality and supports the importance of CIII for stability of CI. Supported by AZV A, AZV NV9-7-49, Progres Q6/LF, Progres Q3/LF, RVO-VFN6465.

19 3 4 Prvý detský pacient s geneticky potvrdeným deficitom LAL na Slovensku , 4, 5 Charakteristika ochorenia: Deficit lyzozomálnej kyslej lipázy (Lysosomal acid lipase-lal D) je autozomálne recesívne genetické ochorenie s progredujúcim charakterom a zlou prognózou. Dôsledkom deficitu LAL dochádza k hromadeniu esterov cholesterolu a triacylglycerolov v lyzozómoch peene a makrofágoch iných orgánov a následne k ich poškodeniu. Súasne dochádza k zvýšenej endogénnej tvorbe cholesterolu. LAL D= klinické kontinuum príznakov typov: chronický CESD (cholesterol ester storage disease) a fatálna Wolmanova choroba PRÍZNAKY: hepatopatia - pretrvávajúca elevácia aminotransferáz, steatóza peene (progreduje do fibrózy, mikronodulárnej cirhózy a hepatálneho zlyhania), hepato/splenomegália, dyslipidémia s prevahou závanejšej hypercholesterolémie (vedie k predasnej ateroskleróze s jej komplikáciami) DIAGNOSTIKA: stanovenie enzymatickej aktivity v krvi/v suchej kvapke krvi grant firmy Alexion, potvrdenie diagnózy sekvennou analýzou LIPA génu LIEA: enzymatická substituná terapia Sebelipase alfa + symptomatická Th Kazuistika pacienta: 8 a pol roný chlapec bol odoslaný so závanou hypercholesterolémiou a hepatopatiou. ola vylúená familiárna hypercholesterolémia (vítane DNA analýzy apoproteínu a LDL receptora) a rozsiahla diferenciálna diagnostika neviedla k zisteniu príiny hepatopatie. Suspekcia na LAL deficit bola vyslovená v r.5, avšak a dostupnos jej diagnostiky viedla k stanoveniu diagnózy, vítane molekulárno-genetického potvrdenia vo veku 6 rokov. RA: Rodiia zdraví. Z matkinej strany exitus na infarkt stará matka v 65 r., starý otec v 7 r. Lipidový profil matky v norme. RA zo strany otca nedostupná. OA: Z. gravidity, nekomplikovaný pôrod v 4 týdni, pôr. hmotnos 6g/ 5 cm, prechodná hypoglykémia, hyperbilirubinémia max 77 umol/l primeraný somatický a psychomotorický vývoj 9. mes.: neurol. vyšetrenie pre hypotóniu, pri lab. vyšetrení mierna elevácia AST,ALT,ALP, i, GT v norme. GIT vyšetrenie: hepar, slezina v norme. Alergia na bielkovinu kravského mlieka, atopický ekzém, hepatopathia ns. V Th Silymarin a diéta. mes: diea prospieva, úprava alergie, mierny pokles transamináz, hypercholesterolémia. 4r: hospitalizácia : Inf. odd. DFN: akútna gastroenetritída, parainf. hepatopathia, hypercholesterolémia. : mierna hepatomegália -do 4 mm, homogénna, zrnitejšia štruktúra. Dispenzár negujú. V liebe Silymarin. Cca,5 r nedostupný 8,5 r.: hospitalizácia na inf. odd. DFN: akútna gastroenetritída, parainf. hepatopathia, hypercholesterolémia, asténia. Od 8,5 r dispenzár v metab. amb DFN, pre intermitentné bolesti brucha chirurg.vyšetrenie,5 r: Th Ezetimib s poklesom cholesterolu a LDL o 5, následne len diéta a bylinkové aje. SG karitíd: bilat. zhrubnutie IT,5 r: KDaD DFN: Hepatopathia ns, DLP sek., steatorhea, reaktivácia EV infekcie (viedla k zrušeniu biopsie), SG hepatomegalia 4 mm, zmieš. echogenita, chudobná cievna, kresba, splenomegália x4 mm. Asténia. a pol r: Chitotriozidáza. DNA suspekcia na LAL defict. 3,5 r. Asténia, ale zlepšené prosievanie a lab. výsledky. Odber na LAL SKK, zníená aktivita LAL=, nmol/punch/h (noma,-,) 4 r. kontrolný odber SKK- identický defict LAL 6 r.: Definitívne potvrdenie dg DNA analýzou = zloený heterozygot pre varianty c.894g>a a c.75c>t (zatia nepopísaný v HGD) v LIPA géne. Plánuje sa μkat/l mmol/l Dynamika enzýmov roky Dynamika lipidov roky Tg HDL LDL chol AST ALT GT ALP ZÁVER Nízke medicínske povedomie o deficite LAL vedie k jeho poddiagnostikovaniu, o om svedí aj naša kazuistika a celkovo nízky poet zachytených LAL D v SR. Diagnostika je pred rozvojom komplikácií komplikovaná nešpecificitou príznakov, ktoré sa prekrývajú s nálezmi u iných, astejších príin DLP a hepatopathie. vítane pomerne benígnych stavov, ako NAFLD a metabolický syndróm pri obezite.

20 5 6 Glutárová acidúria. typu- vedľajší nález pri výraznej ketóze alebo manifestácia metabolickej poruchy? F. Mičev, D. Maceková, A. Hlavatá, R. Górová 3, V. Podolcová, M. Prídavok, C. Šebová, M. Ostrožlíková Pracovisko klinickej biochémie a Centra dedičných metabolických porúch, NÚDCH, Bratislava; Detská klinika LF UK a NÚDCH, Bratislava; 3 Chemický ústav, Prírodovedecká fakulta UK, Bratislava Úvod: Glutárová acidúria. typu (GA, OMIM 367) je autozómovo recesívne dedičné ochorenie spôsobené deficitom enzýmu glutaryl- CoA dehydrogenázy (GCDH) a vedie k hromadeniu kyseliny glutárovej (GA), 3-hydroxyglutárovej (3OHGA), glutakónovej a glutarylkarnitínu (C5DC) Obr.. Zvýšená exkrécia GA bola popísaná aj pri iných stavoch a dedičných metabolických poruchách (DMP) Na našom pracovisku sme za obdobie predchádzajúcich 3,5 roka zaznamenali prechodný záchyt metabolitov kompletnej GA v moči a v práci analyzujeme tieto prípady. Metodika: V súbore sú 4 pacienti ( chlapci a dievčatá) vo veku -8 rokov s doteraz nezistenou DMP, ktorí boli prijatí na Detskú kliniku NÚDCH pre komplikovanú gastritídu a gastroenteritídu. Retrospektívne sme zhodnotili ich klinické a laboratórne nálezy s využitím zdravotnej dokumentácie a laboratórneho informačného systému. Organické kyseliny v moči sme vyšetrovali metódou GC-MS a vyšetrenie profilu acylkarnitínov v suchej kvapke krvi (ACC v SKK) FIA-MS/MS poskytol Chemický ústav UK. Tabuľka č. Klinické charakteristiky pacientov s obrazom GA (n=4) Pacientka (8 rokov) Pacient (3 roky) Pacientka 3 ( roky) Pacient 4 (5 rokov) Frekvencia príznaku Vracanie 4/4 Dehydratácia 4/4 Metabolická acidóza 4/4 Bolesti brucha 4/4 Nechutenstvo 4/4 Febrility 4/4 Hypoglykémia - - /4 Znížený rast - - /4 Porucha vedomia /4 Výrazná ketónúria Opakovaná epizóda ketózy bez GA 4/4 - - Výsledky: Klinické a laboratórne nálezy 4 pacientov sú zhrnuté v Tab. a Tab.. V profile ACC v SKK sa ani u jedného pacienta nezaznamenal zvýšený C5DC vo forme C5DC+COH. U dvoch pacientov sa opakoval stav s miernejšou ketózou, avšak profil GA v moči už nebol prítomný. Tabuľka č. Laboratórne nálezy pacientov s obrazom GA (n=4, výsledky, stredné hodnoty a intervaly) Organické kyseliny v moči ACC v SKK Glutarát 3OHGlutarát Glutakonát Laktát Acetoacetát 3OHButyrát C5DC+COH Pacientka ,76 Pacient ,38 Pacientka ,5 Pacient ,59 Mean ,8 Median ,635 min-max ,38-,59 RH referenčná hodnota, DL detekčný limit, ACC acylkarnitíny, C5DC+COH glutarylkarnitín+3-hydroxydekanoylkarnitín Záver: Kompletná exkrécia metabolitov GA v organických kyselinách moču bez súčasnej detekcie vzostupu markera choroby v SKK sa vyskytla u detí s komplikovaným priebehom gastritídy a gastroenteritídy s výraznou ketózou. Existencia variabilných stupňov akumulácie metabolitov GA vyžaduje ďalšie testovanie metabolitov poruchy (GA, 3OHGA v sére a ich kvantifikáciu, C5DC v moči). Potvrdenie DMP je možné iba dôkazom mutácií v géne GCD alebo zníženej aktivity enzýmu GCDH []. Stúpajúci počet manifestných laboratórnych nálezov pre GA môže súvisieť s častejšou indikáciou vyšetrenia organických kyselín ošetrujúcimi lekármi. /4 Obr. Metabolizmus lyzínu a tryptofánu pri GA RH <,4 mmol/mol krea <, mmol/mol krea pod DL <86 mmol/mol krea <,6 mmol/mol krea <3,6 mmol/mol krea <,5 μmol/l SKK Kazuistika Chlapec odoslaný pre nízky vzrast vo veku 8rokov Subj.- sťažuje sa na bolesti dolných končatín spí dobre, chuť do jedla dobrá,dominantný negativistický, hyperaktivny navštevuje r. ZŠ, integrovaný? Obj. 8,5 r., hmotnosť,9 kg, 5.percentil výška cm, + 4,5 cm za 3 mes SDS -,85, cm pod 3 percentil dysmorfia, faciálna stigmatizácia postava asymetrická, dysproporcionálna zväčšený predozadný priemer hlava makrocefalia, caput kvadratum plochý koreň nosa, hypertelorizmus, krátky krk skrátený súdkovitý hrudník, pectus carinatus, deformovaný v oblasti sterna deformované predlaktie, pedes planovalgi, genua valga, skrátenie predkolenia, kontraktúry prstov rúk, hyperlordóza lumbálnej chrbtice, široká panva koža čistá, chudobné palmárne flekčné ryhy na rukách jazva s hojením per sek.- stav po 3 operáciach chrbtice (3, 4,5) sval. tonus a turgor v norme. neurologicky orientačne v norme, oči: skléry anikterické, uši, nos: bez zápalu dýchanie bilaterárne počuteľné AS pravidelná, kardiálne kompenzovaný brucho v niveau, priehmatné, hepatosplenomegália genitál chlapčenský, puberta Tanner, testes bilaterálne v skróte DG E343 Nízky vzrast - cm pod 3 perc. s asymetriou postavy Q789 Systémová skeletárna dysplázia v.s. kongenitálna spondyloepifyzeálna dysplázia (kyfóza Th-L prechodu a spondylolistéza Th -L, somatická stigmatizácia, genua valga, bilaterálne deformita predlaktí) St. p. op. korekcii deformity chrbtice Th Kostrové symptómy Kostné deformity Krátky trup Deformácie hrudníka Poruchy vývoja zubov Genua valga Hyperlaxnosť kĺbov Kompresia miechy Nízky vzrast Abnormálna chôdza Od jednej diagnózy k druhej Szökeová A., Čiljaková M., Vojtková J., Hlavatá A.,,Bánovčin P. Klinika detí a dorastu, Jesseniova Lekárska Fakulta Univerzity Komenského Martin Detská klinika LF UK a Národný ústav detských chorôb Bratislava MPS IVA AR porucha spôsobená nedostatkom lyzozomálneho enzýmu, N - acetylgalaktozamín-6-sufát sulfatázy (GALNS). akumuláciia glykozaminoglykánov (GAG), chondroitín-6-sulfátu (C6S) a keratan sulfátu (KS) Príznaky a príznaky Morquia A nie sú ľahko viditeľné pri narodení, Klinika v -3r. GAG sa hromadia v tkanivách, kostiach a hlavných orgánoch. nahromadenie GAG spôsobuje vážne problémy, vrátane srdcových ochorení, kostrových abnormalít, zraku a straty sluchu, ťažkostí s dýchaním a skorej smrti Neskeletálne symptómy Problémy s dýchaním Problémy so srdcovými chlopňami Problémy s očami Strata sluchu Svalová slabosť, únava Poruchy prehĺtania Zväčšená pečeň, slezina Osobná anamnéza. dieťa z II.gravidity, pôrod v 4 t.t., popôrodná adaptácia dobrá, AS 9/9, pôrodná váha- 33g, dĺžka 5cm somatická stigmatizácia- drápovité držanie prstov rúk kamptodaktýlia, papučkovité edémy dolných končatín novorodenecký skríning inak v norme kojený polroka, prospieval, po jedle občas pogrciaval. očkovaný podľa poradne chorobnosť - od roka častá nádcha- takmer stále pokašliava, Operácie: 8/3, 3/4 adenotómia, 4, 5 kyphosis congenita, skolióza Th-L prechodu MR vyšetrenie chrbtice natívne a postkontrastne: T,Tciss3d,Tpd,STIR Chrbtica zachytená v rozsahu C3-S5. V celom zachytenom rozsahu telá stavcov znížené a relatívne predĺžené so zvýšeným signálom v ich centrálnej zóne - dysplázia stavcov. Blokové postavenie Th chrbtice s napriamenou kyfózou, v úrovni Th/L je gibbus, spinálny kanál je v tejto časti zúžený na 8-9 mm v AP. Užší je v C-Th prechode. Telo stavca L má rozšírený AP rozmer, ventrálne je znížené s oslabeným sýtením po k.l. - parciálna hemivertebra s dyspláziou. Naznačene dorzálne hemivertebra aj L a L3. Blokové postavenie tiel stavcov L, s ich dorzálnym vyklenutím do spinálneho kanála o mm za L3 a o 4mm za Th respektívne listéza Th ventrálne oproti L o 4mm. Záver: Generalizované zmeny skeletu chrbtice svedčia pre dyspláziu (v.s. spondyloepyfyzeálna dysplázia) Nová DG Mukopolysacharidóza IVA syndróm Morquio A deficit enzýmu N-acetylgalactosamine-6-sulfate sulfatázy postihnutie telesnej schránky dieťaťa bez postihnutia CNS a intelektu koniec rastu v 8roku, The genetic diagnosis of Mucopolysaccharidosis type IVA is confirmed. Interpretation: The first GALNS variant an in intron, c.+g>a, has been previously described as disease-causing se-cau by Laradi, 6 (HGMD Professional PMID: ). The detected variant is classified as pathogenic (class ) according to CentoMD and the ACMG recommendations. The second GALNS variant in exon, c.74c>t p.(arg39cys), has been previously described as disease-causing by Ogawa, 995 (HGMD Professional PMID: ). The detected variant is classified as pathogenic (class ) according to CentoMD and the ACMG recommendations name of gene/ enzyme/biomarker galactosamine-6- sulfate sulfatase GALNS result reference interpretation method,4 μmol/l/h, μmol/l/h pathologic liquid chromatography mass spectrometry heterozygous variants c.+g>a c.74c>t p.(arg39cys) NM_33544., NM_5.4 Súčasnosť pathologic tolerancia liečby dobrá bolesti DK menej výrazné, zlepšený spánok NGS-Illumina USG: hepar + cm, x8x5 mm, lien + cm, 83x64x37 mm bez lož. zmien neurologické vyšetrenie: porucha statodynamiky chrbtice, globalny hypot. sy, hypermob. sy, porucha chodze očné vyšetrenie: hypermetropia gr. min o.,u, astigmatizmus, znižená transparencia rohovky bilaterálne kardiologické vyšetrenie : kompenzovaný, TI nevýznamná ORL vyšetrenie : OAE nevýbavné, AABR l.sin do 6 db vyhovel, l.dx nevyhovel denzitometria: DXA L4 -,3 Hip -,,L4 -,3 Hip -,5 Z skore - 4, Hospitalizácia Endokrinologické vyšetrenie : dg nízky vzrast cm pod 3 percentil Glukagónový test, Inzulinový test: v oboch testoch potvrdený deficit RH Denzitometria:9.9.3 Z-skóre chrbtica: -3, Z-skóre chrbtica: L4: -8,6 Genetické vyšetrenie 3 - Cytogenetika: karyotyp 46 XY molekulárno- genetické vyšetrenie : analýza SHOX génu a FGFR3 génu, COLAm TRAPPC/ SEDL/- negat v géne COLAl zistený variant c. 43G-A p. / Gly 45Ser / na q 3., význam nejednoznačný, zaznamenaný u ľudí s achondrogenezou, hypochondrogenezou, podľa rôznych algoritmov potenciálne kauzálny variant / PolyPhen, Provean / - realizovaný odber u matky aj otca je jedinou enzýmovou substitučnou terapiou (ERT) pracuje na bunkovej úrovni na obnovenie funkcie buniek môže pomôcť zlepšiť vytrvalosť meranú 6-minútovým testom chôdze (6MWT) ERT liečba Liečba hematopoetickými kmeňovými bunkami (HSCT). Génová terapia Terapia ERT Elosulfáza alfa (Vimizim, BioMarin Pharmaceutical, Inc.) schválená FDA vo februári 4 týždenne intravenózne infúzie mg / kg Prognóza International Morquio A investigational team Literatúra: [] Barić I. et al. Diagnosis and management of glutaric aciduria type I. J Inher Metab Dis. (998) [] Coughlin C. R. Glutaric acidemia type I: Diagnosis and management. ebook: Bernstein L. at al. Nutrition Management of Inherited Metabolic Diseases. Springer (5):3-9 Táto štúdia bola finančne podporená v rámci OP Výskum a vývoj ITMS 6486 a ITMS 647

21 POZNÁMKY

22 POZNÁMKY