Masivně paralelní sekvenování v diagnostice závažných časných epilepsií. DNA laboratoř KDN 2.LF a FN v Motole

Transkript

1 Masivně paralelní sekvenování v diagnostice závažných časných epilepsií DNA laboratoř KDN 2.LF a FN v Motole

2 Financial disclosure (konflikt zájmů) Projekt je v současné době finančně zabezpečen pouze z grantů : AZV (končí k ) a IP FNM (MH CR DRO ) Lidé, kteří se podílejí na řešení projektu: Zaměstnanci FNM a 2.LF UK v rámci IPE, grantové úvazky AZV a IP FNM Od plánujeme diagnostiku provádět v běžném diagnostickém režimu, plus výzkum i nadále v rámci nově podaného grantu AZV + IP FMN+ IPE 2.LF UK

3 Masivně paralelní sekvenování neboli NGS: Můžeme sekvenovat cokoliv chceme (teoreticky jakoukoliv část lidského genomu /jsou i výjimky/) za stále klesající ceny Otázka je: Kterou část chceme přečíst, a jak to vyhodnotíme?

4 Resekvenování práce s referenční sekvencí lidského genomu Q: Kde v procesu může vzniknout chyba? Kdekoliv..

5 Možné zdroje chyb: Velké objemy dat, které jsou zpracovávány různými nástroji Dvě analýzy (s různým nastavením) dojdou k různým výsledkům Testovat algoritmy Vždy používat alespoň dva různé nástroje pro jeden krok analýzy Re-analyzovat negativní výsledek není definitivní

6 Masivně paralelní sekvenování v diagnostice závažných časných epilepsií Je to tak jednoduché? Správná diagnóza Genetika epilepsií = Precision medicine; Cílem je tzv. Community of practice

7 Masivně paralelní sekvenování v diagnostice závažných časných epilepsií Mnohé typy epilepsií mají genetický původ; - dle současných znalostí až 30% těžkých dětských epilepsií je monogenně podmíněných; Panel (2014) WES (2015) WGS (2017)

8 První krok: PANEL - panel obsahuje 112 genů (exony) - výsledky v souhrnu: Počet pacientů Výsledek 55 Kauzální varianta - objasněno 31 VUS - varianty neznámého významu 138 Žádná zajímavá varianta - neobjasněno 224 Celkem Co tyto výsledky znamenají prakticky? Jaký mají tyto výsledky přínos a význam?

9 První krok: PANEL Q1: Jak sestavit dobrý panel? Q2: Výběr pacientů pro vyšetření? Q3: Je opravdu nutné odebírat i rodiče? Q4: U koho je nejvyšší šance na objasnění?

10 První krok: PANEL Q1: Jak sestavit dobrý panel?

11 V kolika genech ze 112 vyšetřovaných byly nalezeny kauzální varianty? (ve 26 genech)

12 Geny s opak. záchytem Geny s jednotl. záchytem

13 Pravidlo 80/20 - Pareto distribution (80/20): More than 80% of all variant are explained by the top 20% genes. (

14 Pravidlo 80/20 Má význam pro: - jak zvolit vhodnou velikost panelu (kolik genů) - menší panel je výhodnější (zachytí většinu) Zároveň: - velká část kauzálních variant jsou privátní mutace, pouze jednotlivé záchyty v daném genu - Sanger nelze použít, menší panel je metodou volby

15 První krok: PANEL Q2: Výběr pacientů pro vyšetření?

16 Výběr pacientů - Pacienty pečlivě vybíráme dle zvolených kritérií a dle stále aktualizovaných zkušeností - Všichni projdou: 1, neurologická konzultace (KDN MUDr. Štěrbová) 2, genetická konzultace (ÚBLG MUDr. Vlčková) - u některých předcházejí jiné testy (Sanger, MLPA, Array CGH)

17 PANEL: U kolika pacientů objasníme příčinu nemoci?

18 Jiné studie - Lindy et al: neselektovaná kohorta, 15% Tzn. Kdybychom neselektovali pro objasnění 55 pacientů bychom museli vyšetřit 367 pacientů (my jsme vyšetřili 224).

19 První krok: PANEL Q3: Je opravdu nutné odebírat i rodiče?

20 AD 37 DeNovo 34 Inherited 1 NotAvailable 2 AR 6 DeNovo 0 Inherited 6 X-linked 12 DeNovo 10 Inherited 2 Celkový počet 55 De novo paradigma

21 Rozdělení dle typu dědičnosti

22 Zásadní studie Nature, 2016: DDD study; WES u 4293 rodin AJHG, Nov 2017: DEE study (CENet); WGS u 197 pacientů

23 De novo paradigma V naprosté většině příčin (>80%) jde o de novo vzniklé mutace. Důsledky pro: - genetické poradenství - analýza dat

24 První krok: PANEL Q4: U koho je nejvyšší šance na objasnění?

25

26 Among patients with epileptic encephalopathies, the highest positive rate was observed in patients with neonatal-onset epileptic encephalopathies (58.3% (Diagnostic exome sequencing provides a molecular diagnosis for a significant proportion of patients with epilepsy Request PDF. Available from: nificant_proportion_of_patients_with_epilepsy [accessed Sep ]).

27 Kazuistika: Jednovaječná dvojčata s novou mutací v genu GABRB3: - epilepsie od 4.dne po narození, epilepsie nereagovala na léčbu - komplexní obtíže: hypotonie, episody hypoventilace, mikrocefalie Vyšetřením panelu genů prokázána mutace v genu GABRB3 de novo vzniklá: 1, Správná diagnóza stanovena ve věku 4 měsíců 2, Je možné stanovit prognózu a vybrat vhodnou léčbu 3, Již nejsou potřebné opakované náročné hospitalizace 4, Pro další potomstvo rodičů možnost genetického poradenství genetická prognóza je příznivá

28 Community of practice Jsme členy Euroepinomics Skupina: Epilepsy Genetics working group má 2 základní otázky: 1, Gene-disease pathogenicity (zda varianty v daném genu způsobují epilepsii) 2, Variant pathogenicity (zda konkrétní varianta v genu, který je již znám pro epilepsii, může způsobovat epilepsii)

29 Další kroky: Celoexomové sekvenování /WES/ Celogenomové sekvenování /WGS/ Pouze ve výzkumném režimu ale výsledky mají diagnostickou relevanci a jsou prováděna vždy pouze na žádost lékaře a na základě informovaného souhlasu pacienta

30 Druhý krok: WES Proč druhý krok? WES nenahrazuje panel, protože: Panel / bp WES/ bp Pokrytí 99,9% 95-98% Hloubka čtení x x Nepokryté oblasti Cca. 50bp Cca. 1mil bp Panel je zlatý standard pro diagnostiku heterogenních onemocnění

31 WES WES proveden u celkem 60 vzorků, z toho u 40 nepříbuzných pacientů: 30x vyšetřován pouze pacient, 10x provedeno jako trio (pacient+oba rodiče)

32 Shrnutí Panel zlatý standard, dostupné vyšetření, zavedeno v rámci řešení grantu, nyní součást rutiny WES - efektivní nástroj pro méně časté, příp. nově popsané příčiny WGS budoucí projekt, důležité pro mezinárodní spolupráci

33 Děkuji za pozornost.