Malé RNA a regulace genomu

Transkript

1 Malé RNA a regulace genomu

2 Změna paradigmatu It appears that the genetic programming of humans and other complex organisms has been misunderstood for the past 50 years, due to the assumption that most genetic information is transacted by proteins. John S. Mattick, Množství genů je u metazoí podobné (C. elegans-20 tisíc genů vs. člověk 23 tisíc) + často mají stejnou/podobnou funkci -X komplexita zvířat se velice liší (C. elegansmá 1000 somatických buněk, člověk v komplexních strukturách komplexita nebude v genech kódujících proteiny, ale v jejich regulaci.

3 Všudypřítomná transkripce (pervasive transcription) -Dlouho známé RNAs: rrna, trna, snrna, snorna stabilní, konkrétní funkce spojená se syntézou proteinů -První genomy + první transkriptomy nalezeno množství RNA, která nepatřila k žádnému genu/známému typu RNA šum? -Zlepšení technik 1) potvrzena přítomnost množství ncrnas (non-coding RNA), 2) nalezeny nové typy (bez polya) 50% RNA -Potřeba citlivé metody transkripce velmi nízká/u několika buněk

4 Svět nekódující RNA 1) Dlouhá ncrna (lncrna) -hlavně intronové a mezigenové oblasti, někde známe funkci (Xist, Air, HOTAIR, ) účastní se epigenetických regulací 2) Krátké RNAs (mirna, sirna, pirna, množství krátkých RNA asociovaných s geny) Taft et al. 2009

5 RNAs asociované s geny - PROMPts (promoter upstream transcripts) - tirnas (transcription-initiation RNAs) na místech iniciace transkripce -možná označují/regulují pozici prvního nukleosomu - PASRs (promoter associated srnas) - PALRs (promoter associated lrnas ) - tssa-rnas (transcription start siteassociated RNAs) -TASRs (terminator-associated RNAs ) - splirnas (splice site RNA) -lokalizovaných na 3 hranicích exonů Funkce? Možná udržují chromatin v přístupném stavu transkripci a RNA polymerázu aktivní urychlení nástupu transkripce

6 Objev RNAi Andrew Z. Fire Craig C. Mello Nature 1998 RNAi V roce 2006 udělena Nobelova cena za fyziologii a medicínu 1) reguluje expresi genů (mirna) 2) omezuje šíření mobilních elementů a virů (sirna, pirna) 3) moduluje chromatin (fungování centromer a telomer, formování heterochromatinu exprese genů)

7 Typy RNAi Small interfering RNA (sirna) microrna (mirna) Piwi-interacting RNA (pirna) Jinek a Doudna 2009

8 pirna (PIWI interacting RNA) Krátké RNA interagující s proteiny PIWI -jen u metazoí - transkripce jen v zárodečné linii -funkce: obrana proti mobilním elementům (RNAi a metylace) - inaktivace PIWI mobilita transposonů sterilita (hlavně u samců) - organizace v klastrech - nepotřebují Dicer Siomi et al. 2011

9 pirna a regulace protein kódujících genů Represe Stellate genů v testes drozofily - vyřazení PIWI overexprese Ste tvorba krystalů Ste proteinů sterilita Represe Fasciclinu 3 v ováriích drozofily - vyřazení tj overexprese Fas3 somatické a zárodečné buňky se nepromíchají selhání oogeneze Siomi et al. 2011

10 pirna a hybridní dysgeneze Hybridní dysgeneze u drozofily -reciproká křížení dvou linií (M a P) rozdílné výsledky -samice P + samec M OK -samec P a samice M sterilita - způsobeno pohybem P-elementu po genomu Represor = pirna Příčina HD: matka ukládá do vajíčka pirisc s primární pirna embryo využije k vybudování rezisence proti P-elementu X samice M linie nemají P-element ani příslušnou pirna Siomi et al. 2011

11 mirna (micro RNA) mirnas - malé nekódující molekuly RNA, které postranskripčně regulují expresi genů -Identifikováno >25 tisíc mirnas u různých organismů x u většiny neznáme funkci - Předpokládá se, že regulují expresi 20-30% genů -Jedna mirna může regulovat více genů / jeden gen může být regulován více mirnas - Evolučně konzervované i druhově specifické Př: let-7 - konzervovaný u obratlovců, členovců a nematod -Nalezeny pouze u živočichů, rostlin a virů žádný překryv

12 mirna (micro RNA) -Velká část mirna genů je v klastrech - Savčí mirna často v intronech genů, které regulují (ko-exprese). -Expresní pattern mirna je různý některé kontinuálně, jiné jen někde a někdy -Jsou více abundantní než mrna (až 500x víc) -Malá velikost a jednoduchá sekvence snadná změna, rychlý vývoj a vznik -Cílová sekvence nemusí být 100% komplementární -U člověka dosud objeveno >2000 mirnas, ale pravděpodobně jich je mnohem víc (tkáňová a buněčná specifita).

13 Jak funguje mirna Seed oblast interakce s 3 UTR regulovaného genu Behura 2007

14 Cílová sekvence nemusí být 100% (Téměř) přesná komplementarita mirna a mrna štěpenímrna X Přibližná komplementarita zablokování transkripce (mechanismus neznámý) deadenylace degradace Výhoda: regulace mnoha genů (i stovky) jednou mirna najednou + jedna mrna může interagovat se skupinou mirnas komplementární Wienholds a Plasterk 2005

15 mirna a diferenciace buněk mirna jsou klíčové pro diferenciaci buněk i tkání a pro udržení buněk v diferencovaném stavu. Jak to víme? 1) Chybí u jednobuněčných organismů, málo u kmenových buněk 2) Nediferencované nebo málo diferencované buňky nepotřebují mirna k přežití (ESCs u myši, zárodečné buňky) 3) U zebřičky většina mirna během raného vývoje není exprimována x vysoká tkáňově specifická exprese v době diferenciace buněčných typů (př: mir-10, mir-196 v Hox genech, mir-1 ve svalech, mir-181 hematopoéza). 4) Redukce mirna u rakovinných buněk (př: let-7 u rakovin plic) 5) Transfekce HeLa buněk mir-1 (svalově specifická) a mir-124 (mozkově specifická) změní expresní profil buněk na svalové/mozkové.

16 let-7 příklad regulace (pomocí) mirna - U metazoí vysoce konzervovaná -Hlavní regulátor vývoje a diferenciace vraném embryu i dospělci (mozek) -Cílem regulátory buněčného cyklu (např. Rasa Cdk6) - Diferenciační faktory (Notch) indukují transkripci - Pluripotentní faktory (c-myc) inhibují let-7 - let-7 inhibuje LIN-28, c-myc,...) Taft et al. 2009

17 Jak vznikají nové mirnas Výsledná RNA musí tvořit vlásenku -snadné, protože RNA má sklony se do takových útvarů skládat Čili vznik nové mirna je snazší, než vytvořit protein kódující gen. Zdroje nových mirnas: 1) duplikace 2) introny 3) trna, snorna a pseudogeny 4) mobilní elementy 5) de novo 6) antisense transkript

18 Duplikace Jak vznikají nové mirnas - genu, oblasti, genomu vznik rodiny -u člověka v rodinách 1/3 mirnas, myši 38%, drozofily 13% -většina ne-lokálních duplikací u obratlovců je důsledkem duplikace celého genomu Duplikace genu následovaná subfunkcionalizací nebo neofunkcionalizací jsou největším zdrojem nových mirna.

19 Jak vynikají nové mirnas Introny -mirna se vyskytuje vintronech protein-kódujících genů (1/2 lidských, 20% u C. elegans) -dobrý materiál pro vznik vlásenky + není potřeba nový promotor výhodné pro vznik nových mirnas Nové mirnas specifické pro určitou skupinu jsou častěji lokalizované v intronech (intronic exaptation)

20 Jak vynikají nové mirnas Antisense transkripty mirnas -mají schopnost skládat se do vlásenekstačí jen získat novou funkci

21 Jak vynikají nové mirnas Pseudogeny, snornas a trnas -snornas a trnas se mohou účastnit mirna mašinérie obtížné rozlišit co je skutečná mirna) TEs -člověka identifikováno 278 mirnas, které jsou určitě/možná z TEs -více mezi mladšími, méně konzervovanými a linage-specific mirnas - některé mirna možná ve skutečnosti pirnas

22 Jak vynikají nové mirnas Vznik mirna de novo - Velká část genomu se transkribuje mnoho substrátu pro nové mirnas X stovky sekvencí tvoří suboptimální vlásenky potenciální mirnax k tomu potřeba více kroků -Nové mirnas mají náhodné cíle potenciálně fatální -řešení: nejprve slabá časově a prostorově omezená transkripce po vyladění silnější. Konzervované sekvence v genomu jsou transkribovány silněji.

23 Jak získají mirnas novou funkci? 1) Přímá mutace v seed oblasti 2) Posun seed oblasti -časté (u 13% mirnas konzervovaných mezi drozofilou a Tribolium castaneum) -mir-100 u Nematostelly má seed posunutý o 1 bázi oproti bilateriím.

24 Jak získají mirnas novou funkci? 3) Výměna ramen -mirna passanger strands považovány za biologicky inertní x mohou být asociované s Argonautem a regulovat expresi genů materiál pro novou mirna -po duplikacimůže dojít k posunu transkripce ve prospěch druhého ramene a tím kzisku nové funkce -častý jev(u mnoha rodin mirna drozofily a háďátka, u 11% ortologů u hmyzu) - je považován za jeden ze základních mechanismů diverzifikace mirna

25 Jak získají mirnas novou funkci? 4) Posun vlásenky (hairpin shifting) = výměna jednoho ramene za jinou sekvenci -mezi členy mirna rodiny -nalezeno u 8 z15 mirna rodin nematod

26 Jak získají mirnas novou funkci? 5) Editing -prováděn adenosin deaminázami (ADARs) změna A na I v dsrna změna cílových sekvencí -byl pozorován(v nervové tkáni) x zřejmě se nejedná o rozšířený jev -těžké odlišit od chyb vsekvenování.

27 Příklad ze života aneb co všechno se může stát po duplikaci úseku s mirna 4 možnostiosudu mirna a genu:

28 Evoluce cílového genu Změna 3 UTR Nevhodná cílová místa mirna jsou odstraněna selekcí x někdy vznikají často opakovaně zkrácení cílové 3 UTR méněprostoru pro vznik cílů mirna -Housekeeper geny (např. geny kódující ribosomální proteiny) mají kratší 3 UTR vs. geny s časově a tkáňově specifickou expresí (např. TFs) mají dlouhé 3 UTR s množstvím cílových míst pro mirna.

29 Evoluce cílového genu Polymorfismus cílové oblasti Polymorfismus vytvoření nebo likvidace cílového místa pro mirnazměna regulace genu. - u člověka důkazy o roli SNPs v cílových místech mirna ve vzniku rakoviny Texel sheep -Texel sheep, plemeno ovcí se silně vyvinutou svalovinou způsobeno vnikem cílového místa pro mir-1 a mir-126 v3 UTR genu pro myostatin.

30 Evoluce cílového genu Cichlidy z jezera Malawi -Stovky druhů zjedné linie během 1 milionu let. -Jejich genomy jsou velice podobné x diverzita morfologie a chování na úrovni obratlovčího řádu. - mirna cílová místa vykazují vyšší množství SNPs -86% cílových míst mirna vykazuje variabilitu mezi hlavními liniemi malawských cichlid. Změny v mirna cílových oblastech jsou důležitým evolučním mechanismem diverzifikace a speciace.

31 mirna jako marker fylogeneze -množství mirnas narůstá během evoluce časté rodiny specifické pro určitou linii - ztráty mirnas vzácné rodiny mirna přítomny u +- všech dceřiných linií -mutace v seed oblasti jsou vzácné mirna je skvělý marker evoluce/příslušnosti k taxonu 2 kola expanze mirna: 1) Bilateria 2) obratlovci Obojí koreluje s nárůstem komplexity Wheeler et al. 2009

32 mirna u předka prvo-a druhoústých

33 Expanze mirna rodin koreluje s narůstáním morfologické komplexity

34 mirna jako marker fylogeneze Podle ESTs jsou Cnidaria a Porifera sesterské taxony x podle molekuláry a morfologie k sobě patří Cnidaria a Bilateria X Cnidaria a Bilateria sdílejí mir-100, který chybí u houbovců, žahavci nemají houbovčí mirnas a houbovci žahavčí.

35 mirna jako marker fylogeneze Žebernatky (Ctenophora) nejasná fylogenetická pozice -osekvenován genom Mnemiopsis leidyi nemá mirna ani Droshu a Pashu podporuje bazální pozici žebernatek - Trichoplax adherens nemá mirna X má Droshu a Dicer nezávislé ztráty v obou liniích? Maxwell et al. 2013

36 mirna a vývoj lidského mozku Člověk, šimpanz a makak rhezus -Srovnání exprese v různých obdobích postnatálního vývoje ve dvou částech mozku: mozeček (motorika, paměť, řeč) a přední část čelního laloku (abstraktní myšlení, plánování, operační paměť, sociální inteligence) Časově konstantní exprese stejně rychlá evoluce u všech druhů x vývojově omezená exprese - 3-5x rychlejší evoluce u člověka 2x rychlejší v čelním laloku než v mozečku Změna je v trans regulaci (hlavně mirnas), identifikace 3 mirnas regulujících expresi genů v neuronech. mirnas jsou možná zodpovědné za evoluci lidského mozku Somel et al. 2011

37 mirna a rakovina mirna regulují velké množství genů (60% lidských genů?) + účastní se buněčné proliferace, diferenciace, apoptózy a udržování zárodečných buněk deregulace rakovina mirna může způsobit rakovinu dvěma mechanismy: 1) ztrátou funkce selže odbourání transkriptu onkogenu overexprese onkogenu 2) zesílení/zisk funkce odbourání transkriptu tumorsupresorového genu Příčinou může být: 1) změna exprese mirna genu 2) změna processingu mirna 3) změna v cílovém místě

38 mirna a rakovina 1) změna exprese a) změna pozice mirna genu v genomu Translokace onkogenu pod vlivem promotoru mirna up-regulace Př.: mir marker hematopoetických buněk, na 17. chromosomu blízko zlomové bodu, který je často příčinou translokace t(8;17) translokace MYC, ten pod vlivem promotoru mir-142 upregulace MYC vznik agresivní leukemie B buněk b) změna regulace transkripce Cca 1/3 lidských mirna genů člověka v klastrech ko-exprimovány chyba vregulaci jednoho člena ovlivňuje i ostatní geny vklastru.

39 mirna a rakovina c) mutace v regulační oblasti mirna genu Salzman et al. 2013

40 mirna a rakovina 2) změna processingu mirna a) SNPs v mirna mohou inhibovat nebo urychlit processing Příklad: Chronická lymfatická leukémie často delece 13q13.4 (tumor supresory mir-15a a mir-16-1) -SNP v mir-16-1 chyba ve zpracování CLL Salzman et al. 2013

41 mirna a rakovina 2) změna processingu mirna - SNPs v mirna mohou inhibovat nebo urychlit processing Salzman et al. 2013

42 mirna a rakovina 2) změna processingu mirna b) Inhibice biogeneze mirna = vážné defekty vývoje + u mnoha organizmů letální - 27% různých tumorů je hemizygotních pro deleci Diceru -Globální knockdown mirnas vyřazením Diceru a DGCR8 rychlejší rozvoje tumoru -U myší prokázáno, že snížení množství Diceru urychluje růst nádoru - Experimenty s antisense oligonukleotidy na myších a primátech hladinu mirna umíme manipulovat. - mir-143 se účastní diferenciace adipocytů (= tukových buněk) potenciální cílléčby při obezitě a metabolických poruchách. mirna v budoucnu snad diagnostický nástroj a terapeutický cíl nejen proti rakovině.

43 mirna a rakovina 3) změna v cílovém místě - let-7 regulace onkogenů KRAS, MYC a HMGA2 - nízká exprese let-7 u řady rakovin -SNP v 3 UTR KRAS overexprese KRAS riziko vzniku melanomu a rakoviny plic, prsu a vaječníků Salzman et al. 2013

44 O čem to bylo -Většina genomu je transkribovaná X jen malá část jsou protein kódující geny - Nekódující RNA řada podob (lnrna, snrna, mnoho variant) -Nekódující RNA řada funkcí (regulace, modulace chromatinu, boj proti cizí RNA a virům, ) -mirna důležitý regulační prvek (reguluje expresi 20-30% protein kódujících genů) -mirna snazší vznik než protein kódující geny X velmi konzervativní maker fylogeneze -mirna nárůst mirna genů koreluje s nárůstem komplexity + diverzifikace druhů -mirna nutná pro diferenciaci - mirna regulace buněčné proliferace a apoptózy selhání = rakovina

45 Konec