VYUŽITÍ CYTOLOGICKÝCH A MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÝCH METOD PŘI DETEKCI NÁDORŮ Definice problematiky Profil přístupů Nádorová heterogenita

Transkript

1 VYUŽITÍ CYTOLOGICKÝCH A MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÝCH METOD PŘI DETEKCI NÁDORŮ Definice problematiky Profil přístupů Nádorová heterogenita

2 Všechny nádory mají genetický podtext, ale některé mají tento podtext větší než jiné. Parafrázováno z Animal Farm - George Orwell

3 NEOPLÁZIE (TUMOR) Růst Diferenciace Funkce Organizace Lokalizace Regulace

4 CYTOLOGIE A MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE Původ Rozvoj Heterogenita Biomarkery Cíle zásahu

5 CYTOLOGIE A MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE Kvantitativně screeningový přístup profilování Kvalitativní individuální přístup

6 METODIKY I 1. Cílené přístupy Real-time PCR Mikroskopie Exprese proteinů, RNA FC 094_wb_jb_ jpg 2. Celkové přístupy FACS PC hmotová spektrometrie HCS

7 METODIKY II 1. Cílené přístupy locus (alelické imbalance) DNA-PCR-Mikrosatelity FISH Microdisekce PCR jedné buňky 2. Celkové přístupy Karyotypování CGH SNPs -Omiky

8 MUTACE Driver mutace: stimulace růstu, rozvoj nádoru, pozitivně selektovány Passenger mutace: biologicky neutrální Výsledky: 921 bázových substitucí 763 passenger mutací 159 driver mutací u 119 (66/210 vzorků nádorů) Greenman et al. (2007) Nature 446:153

9 INTERNATIONAL CANCER GENOME CONSORTIUM 25,000 nádorových genomů Genomická Epigenomická Transkriptomická

10 INTERNATIONAL CANCER GENOME CONSORTIUM Buňky karcinomu plic mutací Buňky melanomu mutací Buňky glioblastomu mutací

11 INTERNATIONAL CANCER GENOME CONSORTIUM

12 INTERNATIONAL CANCER GENOME CONSORTIUM Téměř 750 nádorových linií 1/9 genů - delece 1/100 genů na chromozomu X inaktivace s němým dopadem 1/ 50 genů inaktivace u zdravých subjektů Nádory tolerantnější něž zdravé tkáně

13 PERSONALIZOVANÁ NÁDOROVÁ GENOMIKA

14 EPIGENETICKÉ ZMĚNY U NÁDORŮ Téměř všechny nádory 50% genů (familiární forma) umlčeny u sporadických forem Stochastický výskyt Defekty v epigenetických mechanizmech

15 TYPY EPIGENETICKÝCH ZMĚN DNA metylace Modifikace histonů Dysregulace nekódujících RNA Chromatinová organizace Telomerová stabilita a funkce

16 TP73 INAKTIVACE TSG MLH1 RASSF1 CDKN2A p16 INK4A + p14 ARF HIC1 TP53 BRCA2 cadherin BRCA1 Červená = pouze hypermetylace Zelená = pouze mutace Purpurová = oba mechanizmy HIC1 = hypermetylován u nádorů (častý LOH) Nature Rev 3:415, 2002

17 Nat Rev Cancer 6:866, 2006

18 mirna PROFILOVÁNÍ NOVÝ KLINICKÝ DIAGNOSTICKÝ NÁSTROJ Nat Rev Cancer 6:866, 2006

19

20 NEKÓDUJÍCÍ RNA

21 VNITŘNÍ HETEROGENITA Všechny odlišitelní fenotypické znaky Darwinovská evoluce Genetická heterogenita fenotypická heterogenita Heritabilní fenotypy vs nedědivé fenotypy

22 NEDĚDIVÉ ZDROJE DIVERSITY NÁDOROVÝCH POPULACÍ Nádorové kmenové buňky Fenotypická plasticita Environmentální signály Stochastické buněčně-autonomní mechanizmy?

23 FENOTYPICKÁ PLASTICITA Genotypy rozsah fenotypů (norma reakce) Mikroprostředí nádorů homogenní prostředí

24 FENOTYPICKÁ PLASTICITA v HOMOGENNÍCH PROSTŘEDÍCH Hluk v genové expresi Metastabilní intracelulární signální dráhy Baktérie (viry) perzistence Savčí buňky TRAIL, mofologie motilita

25 DĚDIVÉ ZDROJE DIVERZITY NÁDOROVÝCH BUNĚČNÝCH POPULACÍ Dědičné mutace Makroscopická (lineární) vs mikroskopická stádia (non-lineární) Evoluce mutací stochastický proces Náhodné mutace a výhoda, neutrální a mírná nevýhoda

26 INTRATUMORÁLNÍ KLONÁLNÍ DIVERZITA 1. Buněčná genetická heterogenita 2. Klonální genetická heterogenita genetické odlišnosti amplifikované klonální expanzí - leukémie - prsa - prostata - střevo - mozek - jícen - gynekologické

27 ODEBÍRÁNÍ VZORKŮ Biopsie (50% obsah nádoru sensitivita zachycených heterozygotních změn 25% u NGS) Postchirurgické vzorky Velikost Poměr signal-to-noise Kvantita a kvalita Mikrodisekce malé, homogenní

28 ZDROJE KLONÁLNÍ HETEROGENITY Jackpot mutace Selektivní síly (pozitivní selekce, téměř fixace) Odlišné klony - proliferující neoplastické buňky - parenchyma - stroma - pojivo a cévy Principy ekologie

29 HETEROGENITA METASTÁZ Klonální vztah mezi primárními a metastazujícími nádory? Úroveň heterogenity u metastazujících nádorů?

30 BIOLOGICKÝ DOPAD KLONÁLNÍ HETEROGENITY 1. Klonální diverzita vstup pro selekční tlak 2. Biologické interakce mezi klony 3. Extinkce tumoru a jeho evoluční adaptace (CML)

31 Nejsilnější interakce BIOLOGICKÉ INTERAKCE KOMPETICE Integrovaná tkáň intrinzně a extrinzně nádorově supresivní (senescence, smrt, ztráta kmenovosti, TSG), prostorová organizace SCs malé ostrůvky Ekologický systém Limitované zdroje

32 BIOLOGICKÉ INTERAKCE AMENSALIZMUS Interferenční kompetice Houby - baktérie Bcr-Abl upregulace 24p3 (iron transportér) In vitro a in vivo Primární vs metastatické nádory

33 BIOLOGICKÉ INTERAKCE ANTAGONIZMUS Predace and parasitism

34 BIOLOGICKÉ INTERAKCE KOMENSALIZMUS A MUTUALIZMUS Pozitivní interakce Přežívání a proliferace Experimentálně neprokázáno